CN117925508A - 一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方 - Google Patents

一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方 Download PDF

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CN117925508A CN202410141152.7A CN202410141152A CN117925508A CN 117925508 A CN117925508 A CN 117925508A CN 202410141152 A CN202410141152 A CN 202410141152A CN 117925508 A CN117925508 A CN 117925508A
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朱延文
陈丹丹
黄培泽
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Abstract

本发明公开了一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方，基于高糖DMEM培养基，包括L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺二肽，解决常规基础培养基中L‑谷氨酰胺分解产物氨对细胞培养的的毒性问题，L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺二肽缓慢分解，可保证培养基中L‑谷氨酰胺始终维持较低的浓度水平；解决常规培养基因L‑谷氨酰胺分解，而不能长期储存的问题，L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺二肽性质相对稳定，改进后的培养基，有效期可长达3年，极大地方便了流通环节；用L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺二肽替代L‑谷氨酰胺培养基适用于贴壁和悬浮哺乳动物细胞的培养，几乎无需适应；在细胞培养基领域，为使用者提供了高性价比的新选择。

Description

一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方
技术领域
本发明涉及细胞培养技术技术领域，具体为一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方。
背景技术
细胞培养基是一种提供细胞生长和繁殖所需的营养物质、生长因子和环境条件的培养液。它模拟了细胞在体内的生长环境，为细胞的体外培养和研究提供了必要的条件。细胞培养基技术是细胞生物学和生物工程领域的重要组成部分。
细胞培养技术广泛应用于科学研究、生物制药、疫苗生产等领域，特别是在生物制药领域，由于其可以替代残忍和昂贵的动物实验，并且可以进行高通量实验以提供充分的临床前数据，因此被大规模使用。
细胞培养基是医药行业发展的基础，广泛应用于生物制药研发和生产各个环节。细胞培养基技术包括配方优化、血清替代物的研发、培养条件的优化等方面。通过对细胞的营养需求、生长因子、细胞因子等的深入研究，不断优化培养基的配方。同时，为了解决传统血清的问题，研究人员致力于开发无血清培养基和血清替代物，以提高细胞培养的效果和安全性。此外，优化培养条件如pH值、温度、气体组成等也是细胞培养基技术的重要方面。
细胞培养基的研究和生产在国内外都非常活跃。中国的医药培养基行业正在快速发展，国内企业在市场上占据一定份额，并取得了快速的发展。全球细胞培养基市场也在稳步增长，不断涌现出新的技术和产品。
传统的细胞培养技术是以基础培养基(Basal media)和胎牛血清混合配制成的完全培养基为营养来源和生长的液体环境，控制环境洁净度、温度、气体供给等因素来完成的。基础培养基是由几十种成分按不同的量配合而成，包括氨基酸、无机盐、缓冲剂和其他一些特定成分。
基础培养基配方中的一种成分L-谷氨酰胺，是“必需氨基酸”的一种，是基础培养基的必需成分，也是主要的不稳定成分。在水溶液中持续分解，不仅造成自身作为一种营养成分的逐渐损失，而且分解的产物氨，对于细胞是有毒性的。这是基础培养基必须在冷藏条件下储存，并且不能长期储存的主要原因。因此我们需要提出一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方，解决常规基础培养基中L-谷氨酰胺分解产物氨对细胞培养的的毒性问题，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽缓慢分解，可保证培养基中L-谷氨酰胺始终维持较低的浓度水平；解决常规培养基因L-谷氨酰胺分解，而不能长期储存的问题，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽性质相对稳定，改进后的培养基，有效期可长达3年，极大地方便了流通环节；用L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽替代L-谷氨酰胺培养基适用于贴壁和悬浮哺乳动物细胞的培养，几乎无需适应；在细胞培养基领域，为使用者提供了高性价比的新选择，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方，基于高糖DMEM培养基，按质量组分计，包括氨基酸1750-2000份、无机盐10000-12000份、维生素25-35份和其他组分4000-5000份，所述氨基酸包括L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和辅助氨基酸，所述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的分子量为217、浓度为800-100mg/L、摩尔浓度为3.687-4.608mM，所述其他组分包括葡萄糖、酚红；
在水溶液中不会自发降解的所述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽在细胞培养过程中，肽酶逐渐释放，培养基中的二肽逐渐水解，将L-谷氨酰胺连续释放到培养基中，且L-谷氨酰胺保持低浓度水平，培养的细胞获得有效的能量代谢和高生长量。
优选的，所述辅助氨基酸包括甘氨酸、L-盐酸精氨酸、L-盐酸胱氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-左旋蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-左旋色氨酸、L-酪氨酸二钠盐二水合物、L-缬氨酸。
优选的，按质量组分计，所述氨基酸包括甘氨酸25-35份、L-盐酸精氨酸80-90份、L-盐酸胱氨酸58-68份、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽800-100份、L-盐酸组氨酸37-47份、L-异亮氨酸95-115份、L-亮氨酸95-115份、L-盐酸赖氨酸140-150份、L-左旋蛋氨酸25-35份、L-苯丙氨酸60-70份、L-丝氨酸37-47份、L-苏氨酸85-105份、L-左旋色氨酸10-20份、L-酪氨酸二钠盐二水合物100-110份、L-缬氨酸90-100份；
所述无机盐包括氯化钙180-220份、硝酸铁0.05-0.15份、硫酸镁92-102份、氯化钾380-420份、碳酸氢钠3600-3800份、氯化钠6300-6500份、磷酸钠一碱100-150份；
所述维生素包括氯化胆硷3-5份、D-泛酸钙3-5份、叶酸3-5份、无旋光肌醇6-8份、烟酰胺3-5份、盐酸吡哆醇3-5份、核黄素0.3-0.5份、盐酸硫胺素3-5份；
所述其他组分包括葡萄糖4400-4600份、酚红12-18份。
优选的，按质量组分计，所述氨基酸包括甘氨酸25份、L-盐酸精氨酸80份、L-盐酸胱氨酸58份、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽800份、L-盐酸组氨酸37份、L-异亮氨酸95份、L-亮氨酸95份、L-盐酸赖氨酸140份、L-左旋蛋氨酸25份、L-苯丙氨酸60份、L-丝氨酸37份、L-苏氨酸85份、L-左旋色氨酸10份、L-酪氨酸二钠盐二水合物100份、L-缬氨酸90份；
所述无机盐包括氯化钙180份、硝酸铁0.05份、硫酸镁92份、氯化钾380份、碳酸氢钠3600份、氯化钠6300份、磷酸钠一碱100份；
所述维生素包括氯化胆硷3份、D-泛酸钙3份、叶酸3份、无旋光肌醇6份、烟酰胺3份、盐酸吡哆醇3份、核黄素0.3份、盐酸硫胺素3份；
所述其他组分包括葡萄糖4400份、酚红12份。
优选的，将上述氨基酸、无机盐、维生素和其他组分与1L的水溶液混合后，各组分的浓度分别为：
甘氨酸25mg/L、L-盐酸精氨酸80mg/L、L-盐酸胱氨酸58mg/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽800mg/L、L-盐酸组氨酸37mg/L、L-异亮氨酸95mg/L、L-亮氨酸95mg/L、L-盐酸赖氨酸140mg/L、L-左旋蛋氨酸25mg/L、L-苯丙氨酸60mg/L、L-丝氨酸37mg/L、L-苏氨酸85mg/L、L-左旋色氨酸10mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物100mg/L、L-缬氨酸90mg/L；
氯化钙180mg/L、硝酸铁0.05mg/L、硫酸镁92mg/L、氯化钾380mg/L、碳酸氢钠3600mg/L、氯化钠6300mg/L、磷酸钠一碱100mg/L；
氯化胆硷3mg/L、D-泛酸钙3mg/L、叶酸3mg/L、无旋光肌醇6mg/L、烟酰胺3mg/L、盐酸吡哆醇3mg/L、核黄素0.3mg/L、盐酸硫胺素3mg/L；
葡萄糖4400mg/L、酚红12mg/L。
优选的，按质量组分计，所述氨基酸包括甘氨酸35份、L-盐酸精氨酸90份、L-盐酸胱氨酸68份、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽100份、L-盐酸组氨酸47份、L-异亮氨酸115份、L-亮氨酸115份、L-盐酸赖氨酸150份、L-左旋蛋氨酸35份、L-苯丙氨酸70份、L-丝氨酸47份、L-苏氨酸105份、L-左旋色氨酸20份、L-酪氨酸二钠盐二水合物110份、L-缬氨酸100份；
所述无机盐包括氯化钙220份、硝酸铁0.15份、硫酸镁102份、氯化钾420份、碳酸氢钠3800份、氯化钠6500份、磷酸钠一碱150份；
所述维生素包括氯化胆硷5份、D-泛酸钙5份、叶酸5份、无旋光肌醇8份、烟酰胺5份、盐酸吡哆醇5份、核黄素0.5份、盐酸硫胺素5份；
所述其他组分包括葡萄糖4600份、酚红18份。
优选的，将上述氨基酸、无机盐、维生素和其他组分与1L的水溶液混合后，各组分的浓度分别为：
甘氨酸35mg/L、L-盐酸精氨酸90mg/L、L-盐酸胱氨酸68mg/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽100mg/L、L-盐酸组氨酸47mg/L、L-异亮氨酸115mg/L、L-亮氨酸115mg/L、L-盐酸赖氨酸150mg/L、L-左旋蛋氨酸35mg/L、L-苯丙氨酸70mg/L、L-丝氨酸47mg/L、L-苏氨酸105mg/L、L-左旋色氨酸20mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物110mg/L、L-缬氨酸100mg/L；
氯化钙220mg/L、硝酸铁0.15mg/L、硫酸镁102mg/L、氯化钾420mg/L、碳酸氢钠3800mg/L、氯化钠6500mg/L、磷酸钠一碱150mg/L；
氯化胆硷5mg/L、D-泛酸钙5mg/L、叶酸5mg/L、无旋光肌醇8mg/L、烟酰胺5mg/L、盐酸吡哆醇5mg/L、核黄素0.5mg/L、盐酸硫胺素5mg/L；
葡萄糖4600mg/L、酚红18mg/L。
优选的，按质量组分计，所述氨基酸包括甘氨酸30份、L-盐酸精氨酸84份、L-盐酸胱氨酸63份、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽868份、L-盐酸组氨酸42份、L-异亮氨酸105份、L-亮氨酸105份、L-盐酸赖氨酸146份、L-左旋蛋氨酸30份、L-苯丙氨酸66份、L-丝氨酸42份、L-苏氨酸95份、L-左旋色氨酸16份、L-酪氨酸二钠盐二水合物104份、L-缬氨酸94份；
所述无机盐包括氯化钙200份、硝酸铁0.1份、硫酸镁97.67份、氯化钾400份、碳酸氢钠3700份、氯化钠6400份、磷酸钠一碱125份；
所述维生素包括氯化胆硷4份、D-泛酸钙4份、叶酸4份、无旋光肌醇7.2份、烟酰胺4份、盐酸吡哆醇4份、核黄素0.4份、盐酸硫胺素4份；
所述其他组分包括葡萄糖4500份、酚红15份。
优选的，将上述氨基酸、无机盐、维生素和其他组分与1L的水溶液混合后，各组分的浓度分别为：
甘氨酸30mg/L、L-盐酸精氨酸84mg/L、L-盐酸胱氨酸63mg/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽868mg/L、L-盐酸组氨酸42mg/L、L-异亮氨酸105mg/L、L-亮氨酸105mg/L、L-盐酸赖氨酸146mg/L、L-左旋蛋氨酸30mg/L、L-苯丙氨酸66mg/L、L-丝氨酸42mg/L、L-苏氨酸95mg/L、L-左旋色氨酸16mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物104mg/L、L-缬氨酸94mg/L；
氯化钙200mg/L、硝酸铁0.1mg/L、硫酸镁97.67mg/L、氯化钾400mg/L、碳酸氢钠3700mg/L、氯化钠6400mg/L、磷酸钠一碱125mg/L；
氯化胆硷4mg/L、D-泛酸钙4mg/L、叶酸4mg/L、无旋光肌醇7.2mg/L、烟酰胺4mg/L、盐酸吡哆醇4mg/L、核黄素0.4mg/L、盐酸硫胺素4mg/L；
葡萄糖4500mg/L、酚红15mg/L。
优选的，将上述氨基酸、无机盐、维生素和其他组分与1L的水溶液混合后，各组分的摩尔浓度分别为：
甘氨酸0.400mM、L-盐酸精氨酸0.398mM、L-盐酸胱氨酸0.201mM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽4.000mM、L-盐酸组氨酸0.200mM、L-异亮氨酸0.802mM、L-亮氨酸0.802mM、L-盐酸赖氨酸0.798mM、L-左旋蛋氨酸0.201mM、L-苯丙氨酸0.400mM、L-丝氨酸0.400mM、L-苏氨酸0.798mM、L-左旋色氨酸0.078mM、L-酪氨酸二钠盐二水合物0.398mM、L-缬氨酸0.803mM；
氯化钙1.802mM、硝酸铁0.002mM、硫酸镁0.814mM、氯化钾5.333mM、碳酸氢钠44.0480mM、氯化钠110.345mM、磷酸钠一碱0.906mM；
氯化胆硷0.029mM、D-泛酸钙0.008mM、叶酸0.009mM、无旋光肌醇0.040mM、烟酰胺0.328mM、盐酸吡哆醇0.019mM、核黄素0.001mM、盐酸硫胺素0.012mM；
葡萄糖25.000mM、酚红0.040mM。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明解决常规基础培养基中L-谷氨酰胺分解产物氨对细胞培养的的毒性问题，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽缓慢分解，可保证培养基中L-谷氨酰胺始终维持较低的浓度水平；
2、本发明解决常规培养基因L-谷氨酰胺分解，而不能长期储存的问题，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽性质相对稳定，改进后的培养基，有效期可长达3年，极大地方便了流通环节；
3、本发明用L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽替代L-谷氨酰胺培养基适用于贴壁和悬浮哺乳动物细胞的培养，几乎无需适应；
4、本发明在细胞培养基领域，为使用者提供了高性价比的新选择。
附图说明
图1为本发明L-谷氨酰胺和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺从培养基到培养细胞的受控输送示意图；
图2为本发明AM1培养基培养细胞3天后的效果图；
图3为本发明L1培养基培养细胞3天后的效果图；
图4为本发明L2培养基培养细胞3天后的效果图；
图5为本发明AM1培养基培养细胞6天后的效果图；
图6为本发明L1培养基培养细胞6天后的效果图；
图7为本发明L2培养基培养细胞6天后的效果图；
图8为本发明三种培养基培养细胞6天的细胞活性的示意图；
图9为本发明三种培养基培养细胞的活细胞密度示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
请参阅图1-9，本发明提供一种技术方案：一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方，基于高糖DMEM培养基，按质量组分计，包括氨基酸1750-2000份、无机盐10000-12000份、维生素25-35份和其他组分4000-5000份，所述氨基酸包括L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和辅助氨基酸，所述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的分子量为217、浓度为800-100mg/L、摩尔浓度为3.687-4.608mM，所述其他组分包括葡萄糖、酚红；
在水溶液中不会自发降解的所述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽在细胞培养过程中，肽酶逐渐释放，培养基中的二肽逐渐水解，将L-谷氨酰胺连续释放到培养基中，且L-谷氨酰胺保持低浓度水平，培养的细胞获得有效的能量代谢和高生长量。
开发出用L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽替代L-谷氨酰胺的培养基，适用于以L-谷氨酰胺为必须氨基酸来源的细胞培养，并能长期保存。
用L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(L-Alanyl-L-Glutamine)替代L-谷氨酰胺(L-Glutamine)培养基适用于贴壁和悬浮哺乳动物细胞的培养，细胞无需适应即可生长。
所述辅助氨基酸包括甘氨酸、L-盐酸精氨酸、L-盐酸胱氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-左旋蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-左旋色氨酸、L-酪氨酸二钠盐二水合物、L-缬氨酸。
按质量组分计，所述氨基酸包括甘氨酸25份、L-盐酸精氨酸80份、L-盐酸胱氨酸58份、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽800份、L-盐酸组氨酸37份、L-异亮氨酸95份、L-亮氨酸95份、L-盐酸赖氨酸140份、L-左旋蛋氨酸25份、L-苯丙氨酸60份、L-丝氨酸37份、L-苏氨酸85份、L-左旋色氨酸10份、L-酪氨酸二钠盐二水合物100份、L-缬氨酸90份；
所述无机盐包括氯化钙180份、硝酸铁0.05份、硫酸镁92份、氯化钾380份、碳酸氢钠3600份、氯化钠6300份、磷酸钠一碱100份；
所述维生素包括氯化胆硷3份、D-泛酸钙3份、叶酸3份、无旋光肌醇6份、烟酰胺3份、盐酸吡哆醇3份、核黄素0.3份、盐酸硫胺素3份；
所述其他组分包括葡萄糖4400份、酚红12份。
将上述氨基酸、无机盐、维生素和其他组分与1L的水溶液混合后，各组分的浓度分别为：
甘氨酸25mg/L、L-盐酸精氨酸80mg/L、L-盐酸胱氨酸58mg/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽800mg/L、L-盐酸组氨酸37mg/L、L-异亮氨酸95mg/L、L-亮氨酸95mg/L、L-盐酸赖氨酸140mg/L、L-左旋蛋氨酸25mg/L、L-苯丙氨酸60mg/L、L-丝氨酸37mg/L、L-苏氨酸85mg/L、L-左旋色氨酸10mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物100mg/L、L-缬氨酸90mg/L；
氯化钙180mg/L、硝酸铁0.05mg/L、硫酸镁92mg/L、氯化钾380mg/L、碳酸氢钠3600mg/L、氯化钠6300mg/L、磷酸钠一碱100mg/L；
氯化胆硷3mg/L、D-泛酸钙3mg/L、叶酸3mg/L、无旋光肌醇6mg/L、烟酰胺3mg/L、盐酸吡哆醇3mg/L、核黄素0.3mg/L、盐酸硫胺素3mg/L；
葡萄糖4400mg/L、酚红12mg/L。
实施例2
与实施例1相同之处不再赘述，不同的是：
按质量组分计，所述氨基酸包括甘氨酸35份、L-盐酸精氨酸90份、L-盐酸胱氨酸68份、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽100份、L-盐酸组氨酸47份、L-异亮氨酸115份、L-亮氨酸115份、L-盐酸赖氨酸150份、L-左旋蛋氨酸35份、L-苯丙氨酸70份、L-丝氨酸47份、L-苏氨酸105份、L-左旋色氨酸20份、L-酪氨酸二钠盐二水合物110份、L-缬氨酸100份；
所述无机盐包括氯化钙220份、硝酸铁0.15份、硫酸镁102份、氯化钾420份、碳酸氢钠3800份、氯化钠6500份、磷酸钠一碱150份；
所述维生素包括氯化胆硷5份、D-泛酸钙5份、叶酸5份、无旋光肌醇8份、烟酰胺5份、盐酸吡哆醇5份、核黄素0.5份、盐酸硫胺素5份；
所述其他组分包括葡萄糖4600份、酚红18份。
将上述氨基酸、无机盐、维生素和其他组分与1L的水溶液混合后，各组分的浓度分别为：
甘氨酸35mg/L、L-盐酸精氨酸90mg/L、L-盐酸胱氨酸68mg/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽100mg/L、L-盐酸组氨酸47mg/L、L-异亮氨酸115mg/L、L-亮氨酸115mg/L、L-盐酸赖氨酸150mg/L、L-左旋蛋氨酸35mg/L、L-苯丙氨酸70mg/L、L-丝氨酸47mg/L、L-苏氨酸105mg/L、L-左旋色氨酸20mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物110mg/L、L-缬氨酸100mg/L；
氯化钙220mg/L、硝酸铁0.15mg/L、硫酸镁102mg/L、氯化钾420mg/L、碳酸氢钠3800mg/L、氯化钠6500mg/L、磷酸钠一碱150mg/L；
氯化胆硷5mg/L、D-泛酸钙5mg/L、叶酸5mg/L、无旋光肌醇8mg/L、烟酰胺5mg/L、盐酸吡哆醇5mg/L、核黄素0.5mg/L、盐酸硫胺素5mg/L；
葡萄糖4600mg/L、酚红18mg/L。
实施例3
与与实施例1和实施例2相同之处不再赘述，不同的是：
按质量组分计，所述氨基酸包括甘氨酸30份、L-盐酸精氨酸84份、L-盐酸胱氨酸63份、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽868份、L-盐酸组氨酸42份、L-异亮氨酸105份、L-亮氨酸105份、L-盐酸赖氨酸146份、L-左旋蛋氨酸30份、L-苯丙氨酸66份、L-丝氨酸42份、L-苏氨酸95份、L-左旋色氨酸16份、L-酪氨酸二钠盐二水合物104份、L-缬氨酸94份；
所述无机盐包括氯化钙200份、硝酸铁0.1份、硫酸镁97.67份、氯化钾400份、碳酸氢钠3700份、氯化钠6400份、磷酸钠一碱125份；
所述维生素包括氯化胆硷4份、D-泛酸钙4份、叶酸4份、无旋光肌醇7.2份、烟酰胺4份、盐酸吡哆醇4份、核黄素0.4份、盐酸硫胺素4份；
所述其他组分包括葡萄糖4500份、酚红15份。
将上述氨基酸、无机盐、维生素和其他组分与1L的水溶液混合后，各组分的浓度分别为：
甘氨酸30mg/L、L-盐酸精氨酸84mg/L、L-盐酸胱氨酸63mg/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽868mg/L、L-盐酸组氨酸42mg/L、L-异亮氨酸105mg/L、L-亮氨酸105mg/L、L-盐酸赖氨酸146mg/L、L-左旋蛋氨酸30mg/L、L-苯丙氨酸66mg/L、L-丝氨酸42mg/L、L-苏氨酸95mg/L、L-左旋色氨酸16mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物104mg/L、L-缬氨酸94mg/L；
氯化钙200mg/L、硝酸铁0.1mg/L、硫酸镁97.67mg/L、氯化钾400mg/L、碳酸氢钠3700mg/L、氯化钠6400mg/L、磷酸钠一碱125mg/L；
氯化胆硷4mg/L、D-泛酸钙4mg/L、叶酸4mg/L、无旋光肌醇7.2mg/L、烟酰胺4mg/L、盐酸吡哆醇4mg/L、核黄素0.4mg/L、盐酸硫胺素4mg/L；
葡萄糖4500mg/L、酚红15mg/L。
将上述氨基酸、无机盐、维生素和其他组分与1L的水溶液混合后，各组分的摩尔浓度分别为：
甘氨酸0.400mM、L-盐酸精氨酸0.398mM、L-盐酸胱氨酸0.201mM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽4.000mM、L-盐酸组氨酸0.200mM、L-异亮氨酸0.802mM、L-亮氨酸0.802mM、L-盐酸赖氨酸0.798mM、L-左旋蛋氨酸0.201mM、L-苯丙氨酸0.400mM、L-丝氨酸0.400mM、L-苏氨酸0.798mM、L-左旋色氨酸0.078mM、L-酪氨酸二钠盐二水合物0.398mM、L-缬氨酸0.803mM；
氯化钙1.802mM、硝酸铁0.002mM、硫酸镁0.814mM、氯化钾5.333mM、碳酸氢钠44.0480mM、氯化钠110.345mM、磷酸钠一碱0.906mM；
氯化胆硷0.029mM、D-泛酸钙0.008mM、叶酸0.009mM、无旋光肌醇0.040mM、烟酰胺0.328mM、盐酸吡哆醇0.019mM、核黄素0.001mM、盐酸硫胺素0.012mM；
葡萄糖25.000mM、酚红0.040mM。
高糖DMEM培养基成分中，用L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(L-Alanyl-L-Glutamine)替代L-谷氨酰胺(L-Glutamine)，其他成分保持不变。在原高糖DMEM培养基配方中，L-谷氨酰胺(L-Glutamine)的分子量为146，浓度为564mg/L，摩尔浓度为4mM，在新高糖DMEM培养基配方中，必需氨基酸L-谷氨酰胺(L-Glutamine)被替换为L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(L-Alanyl-L-Glutamine)，其分子量为217，浓度为868mg/L，摩尔浓度为4mM，其他成分保持不变。
本方案的新高糖DMEM培养基配方详情见下表：
以丙酰谷培养基AM1101、某品牌培养基L1、L2为研究对象，选取人胚肾细胞293T细胞株为实验材料，培养基中添加10％胎牛血清(上海源培,LOT：C430812)。培养基中初次接种细胞密度为6.3×106VC/mL，将培养方瓶置于CO2恒温培养箱进行恒温37℃、通5％ CO2培养，每24小时进行采样、镜检和台盼蓝染色计数，连续6天检测细胞形态，并计算活细胞密度和细胞活性。
三种培养基培养细胞的效果见图2-图7，三种培养基培养细胞的细胞活性见图8，三种培养基培养细胞的活细胞密度见图9。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方，基于高糖DMEM培养基，按质量组分计，包括氨基酸1750-2000份、无机盐10000-12000份、维生素25-35份和其他组分4000-5000份，其特征在于：所述氨基酸包括L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和辅助氨基酸，所述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的分子量为217、浓度为800-100mg/L、摩尔浓度为3.687-4.608mM，所述其他组分包括葡萄糖、酚红；
在水溶液中不会自发降解的所述L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽在细胞培养过程中，肽酶逐渐释放，培养基中的二肽逐渐水解，将L-谷氨酰胺连续释放到培养基中，且L-谷氨酰胺保持低浓度水平，培养的细胞获得有效的能量代谢和高生长量。
2.根据权利要求1所述的一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方，其特征在于：所述辅助氨基酸包括甘氨酸、L-盐酸精氨酸、L-盐酸胱氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-左旋蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-左旋色氨酸、L-酪氨酸二钠盐二水合物、L-缬氨酸。
3.根据权利要求2所述的一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方，其特征在于：按质量组分计，所述氨基酸包括甘氨酸25-35份、L-盐酸精氨酸80-90份、L-盐酸胱氨酸58-68份、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽800-100份、L-盐酸组氨酸37-47份、L-异亮氨酸95-115份、L-亮氨酸95-115份、L-盐酸赖氨酸140-150份、L-左旋蛋氨酸25-35份、L-苯丙氨酸60-70份、L-丝氨酸37-47份、L-苏氨酸85-105份、L-左旋色氨酸10-20份、L-酪氨酸二钠盐二水合物100-110份、L-缬氨酸90-100份；
所述无机盐包括氯化钙180-220份、硝酸铁0.05-0.15份、硫酸镁92-102份、氯化钾380-420份、碳酸氢钠3600-3800份、氯化钠6300-6500份、磷酸钠一碱100-150份；
所述维生素包括氯化胆硷3-5份、D-泛酸钙3-5份、叶酸3-5份、无旋光肌醇6-8份、烟酰胺3-5份、盐酸吡哆醇3-5份、核黄素0.3-0.5份、盐酸硫胺素3-5份；
所述其他组分包括葡萄糖4400-4600份、酚红12-18份。
4.根据权利要求3所述的一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方，其特征在于：按质量组分计，所述氨基酸包括甘氨酸25份、L-盐酸精氨酸80份、L-盐酸胱氨酸58份、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽800份、L-盐酸组氨酸37份、L-异亮氨酸95份、L-亮氨酸95份、L-盐酸赖氨酸140份、L-左旋蛋氨酸25份、L-苯丙氨酸60份、L-丝氨酸37份、L-苏氨酸85份、L-左旋色氨酸10份、L-酪氨酸二钠盐二水合物100份、L-缬氨酸90份；
所述无机盐包括氯化钙180份、硝酸铁0.05份、硫酸镁92份、氯化钾380份、碳酸氢钠3600份、氯化钠6300份、磷酸钠一碱100份；
所述维生素包括氯化胆硷3份、D-泛酸钙3份、叶酸3份、无旋光肌醇6份、烟酰胺3份、盐酸吡哆醇3份、核黄素0.3份、盐酸硫胺素3份；
所述其他组分包括葡萄糖4400份、酚红12份。
5.根据权利要求4所述的一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方，其特征在于：将上述氨基酸、无机盐、维生素和其他组分与1L的水溶液混合后，各组分的浓度分别为：
甘氨酸25mg/L、L-盐酸精氨酸80mg/L、L-盐酸胱氨酸58mg/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽800mg/L、L-盐酸组氨酸37mg/L、L-异亮氨酸95mg/L、L-亮氨酸95mg/L、L-盐酸赖氨酸140mg/L、L-左旋蛋氨酸25mg/L、L-苯丙氨酸60mg/L、L-丝氨酸37mg/L、L-苏氨酸85mg/L、L-左旋色氨酸10mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物100mg/L、L-缬氨酸90mg/L；
氯化钙180mg/L、硝酸铁0.05mg/L、硫酸镁92mg/L、氯化钾380mg/L、碳酸氢钠3600mg/L、氯化钠6300mg/L、磷酸钠一碱100mg/L；
氯化胆硷3mg/L、D-泛酸钙3mg/L、叶酸3mg/L、无旋光肌醇6mg/L、烟酰胺3mg/L、盐酸吡哆醇3mg/L、核黄素0.3mg/L、盐酸硫胺素3mg/L；
葡萄糖4400mg/L、酚红12mg/L。
6.根据权利要求5所述的一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方，其特征在于：按质量组分计，所述氨基酸包括甘氨酸35份、L-盐酸精氨酸90份、L-盐酸胱氨酸68份、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽100份、L-盐酸组氨酸47份、L-异亮氨酸115份、L-亮氨酸115份、L-盐酸赖氨酸150份、L-左旋蛋氨酸35份、L-苯丙氨酸70份、L-丝氨酸47份、L-苏氨酸105份、L-左旋色氨酸20份、L-酪氨酸二钠盐二水合物110份、L-缬氨酸100份；
所述无机盐包括氯化钙220份、硝酸铁0.15份、硫酸镁102份、氯化钾420份、碳酸氢钠3800份、氯化钠6500份、磷酸钠一碱150份；
所述维生素包括氯化胆硷5份、D-泛酸钙5份、叶酸5份、无旋光肌醇8份、烟酰胺5份、盐酸吡哆醇5份、核黄素0.5份、盐酸硫胺素5份；
所述其他组分包括葡萄糖4600份、酚红18份。
7.根据权利要求6所述的一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方，其特征在于：将上述氨基酸、无机盐、维生素和其他组分与1L的水溶液混合后，各组分的浓度分别为：
甘氨酸35mg/L、L-盐酸精氨酸90mg/L、L-盐酸胱氨酸68mg/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽100mg/L、L-盐酸组氨酸47mg/L、L-异亮氨酸115mg/L、L-亮氨酸115mg/L、L-盐酸赖氨酸150mg/L、L-左旋蛋氨酸35mg/L、L-苯丙氨酸70mg/L、L-丝氨酸47mg/L、L-苏氨酸105mg/L、L-左旋色氨酸20mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物110mg/L、L-缬氨酸100mg/L；
氯化钙220mg/L、硝酸铁0.15mg/L、硫酸镁102mg/L、氯化钾420mg/L、碳酸氢钠3800mg/L、氯化钠6500mg/L、磷酸钠一碱150mg/L；
氯化胆硷5mg/L、D-泛酸钙5mg/L、叶酸5mg/L、无旋光肌醇8mg/L、烟酰胺5mg/L、盐酸吡哆醇5mg/L、核黄素0.5mg/L、盐酸硫胺素5mg/L；
葡萄糖4600mg/L、酚红18mg/L。
8.根据权利要求7所述的一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方，其特征在于：按质量组分计，所述氨基酸包括甘氨酸30份、L-盐酸精氨酸84份、L-盐酸胱氨酸63份、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽868份、L-盐酸组氨酸42份、L-异亮氨酸105份、L-亮氨酸105份、L-盐酸赖氨酸146份、L-左旋蛋氨酸30份、L-苯丙氨酸66份、L-丝氨酸42份、L-苏氨酸95份、L-左旋色氨酸16份、L-酪氨酸二钠盐二水合物104份、L-缬氨酸94份；
所述无机盐包括氯化钙200份、硝酸铁0.1份、硫酸镁97.67份、氯化钾400份、碳酸氢钠3700份、氯化钠6400份、磷酸钠一碱125份；
所述维生素包括氯化胆硷4份、D-泛酸钙4份、叶酸4份、无旋光肌醇7.2份、烟酰胺4份、盐酸吡哆醇4份、核黄素0.4份、盐酸硫胺素4份；
所述其他组分包括葡萄糖4500份、酚红15份。
9.根据权利要求8所述的一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方，其特征在于：将上述氨基酸、无机盐、维生素和其他组分与1L的水溶液混合后，各组分的浓度分别为：
甘氨酸30mg/L、L-盐酸精氨酸84mg/L、L-盐酸胱氨酸63mg/L、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽868mg/L、L-盐酸组氨酸42mg/L、L-异亮氨酸105mg/L、L-亮氨酸105mg/L、L-盐酸赖氨酸146mg/L、L-左旋蛋氨酸30mg/L、L-苯丙氨酸66mg/L、L-丝氨酸42mg/L、L-苏氨酸95mg/L、L-左旋色氨酸16mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物104mg/L、L-缬氨酸94mg/L；
氯化钙200mg/L、硝酸铁0.1mg/L、硫酸镁97.67mg/L、氯化钾400mg/L、碳酸氢钠3700mg/L、氯化钠6400mg/L、磷酸钠一碱125mg/L；
氯化胆硷4mg/L、D-泛酸钙4mg/L、叶酸4mg/L、无旋光肌醇7.2mg/L、烟酰胺4mg/L、盐酸吡哆醇4mg/L、核黄素0.4mg/L、盐酸硫胺素4mg/L；
葡萄糖4500mg/L、酚红15mg/L。
10.根据权利要求9所述的一种可提高培养效果和延长保质期的细胞培养基配方，其特征在于：将上述氨基酸、无机盐、维生素和其他组分与1L的水溶液混合后，各组分的摩尔浓度分别为：
甘氨酸0.400mM、L-盐酸精氨酸0.398mM、L-盐酸胱氨酸0.201mM、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽4.000mM、L-盐酸组氨酸0.200mM、L-异亮氨酸0.802mM、L-亮氨酸0.802mM、L-盐酸赖氨酸0.798mM、L-左旋蛋氨酸0.201mM、L-苯丙氨酸0.400mM、L-丝氨酸0.400mM、L-苏氨酸0.798mM、L-左旋色氨酸0.078mM、L-酪氨酸二钠盐二水合物0.398mM、L-缬氨酸0.803mM；
氯化钙1.802mM、硝酸铁0.002mM、硫酸镁0.814mM、氯化钾5.333mM、碳酸氢钠44.0480mM、氯化钠110.345mM、磷酸钠一碱0.906mM；
氯化胆硷0.029mM、D-泛酸钙0.008mM、叶酸0.009mM、无旋光肌醇0.040mM、烟酰胺0.328mM、盐酸吡哆醇0.019mM、核黄素0.001mM、盐酸硫胺素0.012mM；
葡萄糖25.000mM、酚红0.040mM。
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