CN107217032A - 一种用于ins‑1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒 - Google Patents

一种用于ins‑1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN107217032A
CN107217032A CN201710644370.2A CN201710644370A CN107217032A CN 107217032 A CN107217032 A CN 107217032A CN 201710644370 A CN201710644370 A CN 201710644370A CN 107217032 A CN107217032 A CN 107217032A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mol
kit
cell
ins
igf
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710644370.2A
Other languages
English (en)
Inventor
肖泽玺
祝加和
李超
江泉
李秋圆
陈晨
刘媛媛
李献更
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yinhai Shanghai Saint Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Yinhai Shanghai Saint Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yinhai Shanghai Saint Biotechnology Co Ltd filed Critical Yinhai Shanghai Saint Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201710644370.2A priority Critical patent/CN107217032A/zh
Publication of CN107217032A publication Critical patent/CN107217032A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/16—Magnesium; Mg chelators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于INS‑1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒，所述试剂盒配方的组成为：氨基酸类2.5×10‑5mol/L～1.1×10‑3mol/L，维生素类3.7×10‑9mol/L～1.9×10‑4mol/L，谷胱甘肽3.0×10‑6mol/L，无机盐类4.0×10‑4mol/L～1.03×10‑1mol/L，D‑葡萄糖1.1×10‑2mol/L，其他化合物5.0×10‑5mol/L～1.0×10‑2mol/L，占试剂盒体积百分比为5％的胎牛血清；其中，所述其他化合物为酚红1.3×10‑5mol/L、HEPES1.0×10‑2mol/L、Na‑pyruvate 1.0×10‑3mol/L、2‑mercaptoethanol5.0×10‑5mol/L、IGF‑1 1.0×10‑5mol/L和IGF‑2 1.0×10‑5mol/L；本发明试剂盒细胞倍增时间更短、扩增效率高、收获细胞量较常规培养方式更多且细胞的形态更为稳定。

Description

一种用于INS-1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒
技术领域
本发明属于试剂盒技术领域，尤其是涉及一种用于INS-1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒。
背景技术
细胞试剂盒既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。细胞试剂盒是人工模拟细胞在体内生长的营养环境，是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。试剂盒主要包括天然细胞试剂盒、合成细胞试剂盒和无血清细胞试剂盒等。
天然细胞试剂盒是人们早期采用的细胞试剂盒，直接取自于动物组织提取液或体液，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。营养价值高，但成分复杂，差异大、不稳定，来源也受到限制。水解乳蛋白和胶原是两种较好的天然试剂盒，富含氨基酸。血清是天然试剂盒中最有效和最常用的试剂盒，但其组成成分复杂，其中一些成分与功能不明确。合成细胞试剂盒是用化学成分明确的试剂配制的试剂盒，组分稳定，主要包括糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类等。自1950年199细胞试剂盒问世以来，合成细胞试剂盒发展至今已有几十种，除了沿用半个世纪的基础合成细胞试剂盒之外，近年来还出现了营养成分更加丰富的低血清细胞试剂盒。由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞试剂盒也不同，在动物细胞培养中最常用基础细胞试剂盒有6～7种，如BME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI1640、M199等。由于天然试剂盒的一些营养成分不能被合成细胞试剂盒完全代替，因此一般需在合成细胞试剂盒中添加5％～10％的小牛血清。小牛血清的加入对细胞培养非常有效，但小牛血清的成分复杂，这对培养产物的分离纯化和检测会带来一定的不便，为减少小牛血清的影响，开发了营养成分更加丰富的低血清细胞试剂盒，可以将小牛血清的使用量降低到1～3％。
现有用于INS-1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒主要使用成分明确的PRMI1640试剂盒，然而该试剂盒会导致细胞状态下降、甚至是死亡；必须添加血清及其他的添加物才行；这些添加物的成分并不明确，未见专利论文报道且ATCC并未收录
发明内容
本发明为了克服现有技术的缺陷，目的在于提供了一种用于INS-1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒，该试剂盒细胞倍增时间更短、扩增效率高、收获细胞量较常规培养方式更多且细胞的形态更为稳定。
为了实现上述目的，本发明取的技术方案如下：
一种用于INS-1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒，所述试剂盒配方的组成为：PRMI164培养基80％，氨基酸类2.5×10-5mol/L～1.1×10-3mol/L，维生素类3.7×10-9mol/L～1.9×10-4mol/L，谷胱甘肽3.0×10-6mol/L，无机盐类4.0×10-4mol/L～1.03×10-1mol/L，D-葡萄糖1.1×10-2mol/L，其他化合物5.0×10-5mol/L～1.0×10-2mol/L，占试剂盒体积百分比为5％的胎牛血清；其中，所述其他化合物为酚红1.3×10-5mol/L、HEPES 1.0×10-2mol/L、Na-pyruvate 1.0×10-3mol/L、2-mercaptoethanol 5.0×10-5mol/L、IGF-1 1.0×10-5mol/L和IGF-2 1.0×10-5mol/L。
优选的，所述氨基酸为L-精氨酸1.1×10-3mol/L、L-天冬酰胺1.7×10-3mol/L、L-天冬氨酸1.5×10-4mol/L、L-半胱氨酸2.1×10-4mol/L、L-谷氨酸1.4×10-4mol/L、L-谷氨酰胺4.1×10-3mol/L、甘氨酸1.3×10-4mol/L、L-组氨酸9.7×10-5mol/L、L-羟脯胺酸1.5×10- 4mol/L、L-异亮氨酸3.8×10-4、L-亮氨酸3.8×10-4、L-赖氨酸HCL 2.2×10-4mol/L、L-甲硫氨酸1.0×10-4mol/L、L-苯丙氨酸9.1×10-5mol/L、L-脯氨酸1.7×10-4mol/L、L-丝氨酸2.9×10-4mol/L、L-苏氨酸1.7×10-4mol/L、L-色氨酸2.5×10-5mol/L、L-酪氨酸1.1×10-4mol/L和L-缬氨酸1.7×10-4mol/L中的一种或多种。
优选的，所述维生素类为P-氨苯甲酸7.30×10-6mol/L、生物素8.20×10-7mol/L、氧化胆碱2.10×10-5mol/L、叶酸2.30×10-6mol/L、1-肌醇1.9×10-4mol/L、烟酰胺8.2×10- 6mol/L、D-偏多酸钙1.1×10-6mol/L、吡哆醇4.9×10-6mol/L、核黄素5.3×10-7mol/L、硫胺素3.0×10-6mol/L和维生素B12 3.7×10-9mol/L中的一种或多种。
优选的，所述无机盐类为KCl 5.3×10-3mol/L、MgSO4 4.0×10-4mol/L、NaCl 1.03×10-1mol/L、NaHCO3 2.3×10-2mol/L、Na2HPO4 5.6×10-3mol/L中的一种或多种。
与现有的技术相比，本发明具有以下优点：
本发明所提供的INS-1细胞试剂盒中添加了多种其他化合物，其中，酚红为酸碱指示剂，PH对细胞的生长影响显著、HEPES为缓冲盐，对细胞无毒且能平衡培养体系的PH、Na-pyruvate是能源物质为细胞提供能量、2-mercaptoethanol为强还原剂，能保护细胞免受氧化损伤、IGF-1IGF-2生长因子，能够促进细胞增殖，因此，本发明试剂盒细胞倍增时间更短、扩增效率高、收获细胞量较常规培养方式更多且细胞的形态更为稳定。
附图说明：
图1本发明实施例1和对比例1-2不同培养体系INS-1细胞生长曲线图；
图2本发明实施例1和对比例1-2不同培养体系培养INS-1细胞峰值图；
图3本发明实施例1和对比例1-2不同培养体系INS-1细胞培养扩增倍数图；
图4本发明实施例1和对比例1-2不同培养体系INS-1细胞细胞活率图；
图5本发明实施例1和对比例1-2不同培养体系INS-1细胞克隆形成率图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
一种用于INS-1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒，所述试剂盒配方的组成为：L-精氨酸1.1×10-3mol/L，P-氨苯甲酸7.30×10-6mol/L，谷胱甘肽3.0×10-6mol/L，KCl 5.3×10- 3mol/L，D-葡萄糖1.1×10-2mol/L，酚红1.3×10-5mol/L、HEPES 1.0×10-2mol/L、Na-pyruvate 1.0×10-3mol/L、2-mercaptoethanol 5.0×10-5mol/L、IGF-1 1.0×10-5mol/L和IGF-2 1.0×10-5mol/L，占试剂盒体积百分比为5％的胎牛血清。
实施例2
一种用于INS-1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒，所述试剂盒配方的组成为：L-天冬酰胺1.7×10-3mol/L，生物素8.20×10-7mol/L，谷胱甘肽3.0×10-6mol/L，MgSO4 4.0×10- 4mol/L，NaCl 1.03×10-1mol/L，D-葡萄糖1.1×10-2mol/L，酚红1.3×10-5mol/L，HEPES 1.0×10-2mol/L，Na-pyruvate 1.0×10-3mol/L，2-mercaptoethanol 5.0×10-5mol/L，IGF-11.0×10-5mol/L和IGF-2 1.0×10-5mol/L，占试剂盒体积百分比为5％的胎牛血清。
实施例3
一种用于INS-1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒，所述试剂盒配方的组成为：L-天冬氨酸1.5×10-4mol/L、L-半胱氨酸2.1×10-4mol/L，氧化胆碱2.10×10-5mol/L，叶酸2.30×10- 6mol/L，谷胱甘肽3.0×10-6mol/L，NaCl 1.03×10-1mol/L，NaHCO3 2.3×10-2mol/L，D-葡萄糖1.1×10-2mol/L，酚红1.3×10-5mol/L，HEPES 1.0×10-2mol/L，Na-pyruvate 1.0×10- 3mol/L，2-mercaptoethanol 5.0×10-5mol/L，IGF-1 1.0×10-5mol/L和IGF-2 1.0×10- 5mol/L，占试剂盒体积百分比为5％的胎牛血清。
实施例4
一种用于INS-1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒，所述试剂盒配方的组成为：L-组氨酸9.7×10-5mol/L，L-羟脯胺酸1.5×10-4mol/L，1-肌醇1.9×10-4mol/L，烟酰胺8.2×10-6mol/L，D-偏多酸钙1.1×10-6mol/L，谷胱甘肽3.0×10-6mol/L，NaHCO3 2.3×10-2mol/L，Na2HPO45.6×10-3mol/L，D-葡萄糖1.1×10-2mol/L，酚红1.3×10-5mol/L，HEPES 1.0×10-2mol/L，Na-pyruvate 1.0×10-3mol/L，2-mercaptoethanol 5.0×10-5mol/L，IGF-1 1.0×10-5mol/L和IGF-2 1.0×10-5mol/L，占试剂盒体积百分比为5％的胎牛血清。
实施例5
一种用于INS-1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒，所述试剂盒配方的组成为：L-脯氨酸1.7×10-4mol/L，L-丝氨酸2.9×10-4mol/L，L-苏氨酸1.7×10-4mol/L，L-色氨酸2.5×10- 5mol/L，L-酪氨酸1.1×10-4mol/L，吡哆醇4.9×10-6mol/L，核黄素5.3×10-7mol/L，硫胺素3.0×10-6mol/L，维生素B12 3.7×10-9mol/L，谷胱甘肽3.0×10-6mol/L，KCl 5.3×10-3mol/L，Na2HPO4 5.6×10-3mol/L，D-葡萄糖1.1×10-2mol/L，酚红1.3×10-5mol/L，HEPES 1.0×10-2mol/L，Na-pyruvate 1.0×10-3mol/L，2-mercaptoethanol 5.0×10-5mol/L，IGF-1 1.0×10-5mol/L和IGF-2 1.0×10-5mol/L，占试剂盒体积百分比为5％的胎牛血清。
实施例6
一种用于INS-1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒，所述试剂盒配方的组成为：L-苏氨酸1.7×10-4mol/L，L-色氨酸2.5×10-5mol/L，P-氨苯甲酸7.30×10-6mol/L，1-肌醇1.9×10- 4mol/L，烟酰胺8.2×10-6mol/L，谷胱甘肽3.0×10-6mol/L，KCl
5.3×10-3mol/L，NaHCO3 2.3×10-2mol/L，Na2HPO4 5.6×10-3mol/L，D-葡萄糖1.1×10-2mol/L，酚红1.3×10-5mol/L，HEPES 1.0×10-2mol/L，Na-pyruvate 1.0×10-3mol/L，2-mercaptoethanol 5.0×10-5mol/L，IGF-1 1.0×10-5mol/L和IGF-2 1.0×10-5mol/L，占试剂盒体积百分比为5％的胎牛血清。
对比例1
一种用于INS-1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒，所述试剂盒配方的组成为：L-精氨酸1.1×10-3mol/L，P-氨苯甲酸7.30×10-6mol/L，谷胱甘肽3.0×10-6mol/L，KCl 5.3×10- 3mol/L，D-葡萄糖1.1×10-2mol/L，占试剂盒体积百分比为5％的胎牛血清。
对比例2
对比例2为DMEM+5％胎牛血清，其中DMEM成分如下：
注：绝大多数浓度采用摩尔浓度，并以科学计数法表示，如3.0E-2＝3.0×10-2＝30mmol/l。给出的分子质量是母体化合物的分子质量；虽然一些配方中使用相应盐或含水化合物，但摩尔浓度仍是相同的同名及缩略词：AMP，腺苷单磷酸；生物素＝维生素H；钙化醇＝维生素D2；FAD，黄素腺嘌呤二核苷酸；硫辛酸；甲萘醌＝维生素K3；myo-肌醇＝1-肌醇；烟碱＝烟酰胺；烟碱酸＝烟酸；吡哆醇＝维生素B6；硫胺素＝维生素B1；α-生育酚＝维生素E；视黄醇＝维生素A1；TPN，三磷酸比多核苷酸；UTP，尿苷三磷酸；维生素B12＝钴胺素
本发明对实施例1和对比例1-2的试剂盒进行性能试验：
(1)不同培养体系INS-1细胞生长曲线：以一万个细胞接种于12孔细胞培养板(Corning)，各方案各接种8孔，连续一周每天计数；将细胞计数结果绘制成曲线，见说明书附图1；其中实施例1配方细胞数量从第三天开始明显要高于对比例1与对比例2；
(2)不同培养体系培养INS-1细胞峰值：以一万个细胞接种于12孔细胞培养板(Corning)，各方案各接种8孔，连续一周每天计数得出该培养体系的峰值，见说明书附图2；其中实施例1配方明显优于对比例1与对比例2，实施例1的峰值明显高于对比例1与对比例2；
(3)不同培养体系INS-1细胞培养扩增倍数与倍增时间：
见说明书附图3：其中专利配方实施例1明显优于对比例1与对比例2，细胞的扩增倍数实施例1明显高于对比例1与对比例2。
表1：INS-1不同培养体系的细胞倍增时间
各培养体系细胞倍增时间的计算方法依据2015版中国药典的描述进行。按生长曲线计算细胞的倍增时间。取细胞峰值前一天的细胞计数(Y)、接种细胞数(X)及生长时间(T)计算。
倍增时间＝T/A A＝log2Y/X(细胞的倍增时间不应超过20小时)
其中专利配方实施例1明显优于对比例1与对比例2，实施例1倍增时间为14.55h明显短于对比例1的18.13h与对比例2的37.43h。
(4)不同培养体系INS-1细胞细胞活率：
表2：INS-1不同培养体系的细胞活率
培养体系 1天 2天 3天 4天 5天 6天 7天
实施例1细胞活率： 100.0％ 99.8％ 99.6％ 99.4％ 98.7％ 98.2％ 95.6％
对比例1细胞活率： 100.0％ 98.2％ 97.7％ 97.6％ 96.1％ 95.1％ 92.5％
对比例2细胞活率： 100.0％ 85.6％ 72.1％ 61.8％ 54.2％ 27.5％ 19.5％
由说明书附图4与表2其中专利配方实施例1明显优于对比例1与对比例2，实施例1(专利配方+5％胎牛血清)的细胞活率在达到峰值之前一直保持在98％以上峰值后的活率下降十分缓慢，说明该培养体系十分适宜INS-1细胞的培养；对比例1(RPMI1640+5％胎牛血清)的细胞活率在达到峰值之前一直保持在95％以上峰值后的活率下降缓慢，该培养体系较适宜INS-1细胞的培养；对比例2(DMEM+5％胎牛血清)的细胞活率很低且一直在下降峰值后的活率下降更为剧烈，该培养体系不适宜INS-1细胞的培养。
(5)不同培养体系INS-1细胞克隆形成率
克隆率形成率的测定依据2015版中国药典，按有限稀释法将细胞稀释至每50ul全培含1个活细胞的浓度，按每孔1个细胞(50ul)接种于96孔细胞培板在显微镜下拍照，每板至少接种60孔，于37℃、5％二氧化碳培养，定期观察细胞克隆生长情况，培养1周后计数每孔中的细胞克隆数，在显微镜下拍照并计算克隆率，应不低于70％。
克隆形成率＝A/B×100％(式中A为细胞克隆数；B为接种细胞的总孔数)
由说明书附图5其中专利配方实施例1明显优于对比例1与对比例2，实施例1(专利配方+5％胎牛血清)的克隆形成率为98.6％，说明该培养体系非常适宜INS-1细胞的克隆培养；对比例1(RPMI1640+5％胎牛血清)的克隆形成率为78％，说明该培养体系比较适宜INS-1细胞的克隆培养；对比例2(DMEM+5％胎牛血清)的克隆形成率仅为1％，说明该培养体系不能用于INS-1细胞的克隆培养。
应当指出，以上所述具体实施方式可以使本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。因此，本领域技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或者等同替换；而一切不脱离本发明的精神和技术实质的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明专利的保护范围当中。

Claims (4)

1.一种用于INS-1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒配方的组成为：氨基酸类2.5×10-5mol/L～1.1×10-3mol/L，维生素类3.7×10-9mol/L～1.9×10-4mol/L，谷胱甘肽3.0×10-6mol/L，无机盐类4.0×10-4mol/L～1.03×10-1mol/L，D-葡萄糖1.1×10-2mol/L，其他化合物5.0×10-5mol/L～1.0×10-2mol/L，占试剂盒体积百分比为5％的胎牛血清；其中，所述其他化合物为酚红1.3×10-5mol/L、HEPES 1.0×10-2mol/L、Na-pyruvate 1.0×10-3mol/L、2-mercaptoethanol 5.0×10-5mol/L、IGF-1 1.0×10-5mol/L和IGF-2 1.0×10-5mol/L。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述氨基酸为L-精氨酸1.1×10-3mol/L、L-天冬酰胺1.7×10-3mol/L、L-天冬氨酸1.5×10-4mol/L、L-半胱氨酸2.1×10-4mol/L、L-谷氨酸1.4×10-4mol/L、L-谷氨酰胺4.1×10-3mol/L、甘氨酸1.3×10-4mol/L、L-组氨酸9.7×10-5mol/L、L-羟脯胺酸1.5×10-4mol/L、L-异亮氨酸3.8×10-4、L-亮氨酸3.8×10-4、L-赖氨酸HCL 2.2×10-4mol/L、L-甲硫氨酸1.0×10-4mol/L、L-苯丙氨酸9.1×10-5mol/L、L-脯氨酸1.7×10-4mol/L、L-丝氨酸2.9×10-4mol/L、L-苏氨酸1.7×10-4mol/L、L-色氨酸2.5×10- 5mol/L、L-酪氨酸1.1×10-4mol/L和L-缬氨酸1.7×10-4mol/L中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述维生素类为P-氨苯甲酸7.30×10- 6mol/L、生物素8.20×10-7mol/L、氧化胆碱2.10×10-5mol/L、叶酸2.30×10-6mol/L、1-肌醇1.9×10-4mol/L、烟酰胺8.2×10-6mol/L、D-偏多酸钙1.1×10-6mol/L、吡哆醇4.9×10-6mol/L、核黄素5.3×10-7mol/L、硫胺素3.0×10-6mol/L和维生素B12 3.7×10-9mol/L中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述无机盐类为KCl 5.3×10-3mol/L、MgSO4 4.0×10-4mol/L、NaCl 1.03×10-1mol/L、NaHCO3 2.3×10-2mol/L、Na2HPO4 5.6×10-3mol/L中的一种或多种。
CN201710644370.2A 2017-07-31 2017-07-31 一种用于ins‑1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒 Pending CN107217032A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710644370.2A CN107217032A (zh) 2017-07-31 2017-07-31 一种用于ins‑1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710644370.2A CN107217032A (zh) 2017-07-31 2017-07-31 一种用于ins‑1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107217032A true CN107217032A (zh) 2017-09-29

Family

ID=59954526

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710644370.2A Pending CN107217032A (zh) 2017-07-31 2017-07-31 一种用于ins‑1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107217032A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114868736A (zh) * 2022-03-08 2022-08-09 四川中科奥格生物科技有限公司 一种胰岛细胞稳定液及其制备方法和用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1560236A (zh) * 2004-03-11 2005-01-05 中国人民解放军第二军医大学 一种细胞培养试剂及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1560236A (zh) * 2004-03-11 2005-01-05 中国人民解放军第二军医大学 一种细胞培养试剂及其用途

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEEPIKA WALPITA ET AL.: "A Human Islet Cell Culture System for High-Throughput Screening", 《JOURNAL OF BIOMOLECULAR SCREENING》 *
侯兰新等: "《动物细胞培养技术教程》", 30 September 2009 *
林海等: "大鼠胰岛细胞的分离培养与鉴定", 《肝胆胰外科杂志》 *
邢小娟: "成年大鼠类胰岛干细胞分离培养的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *
马乐好等: "《微生物培养基实用手册》", 31 March 2006, 吉林科学技术出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114868736A (zh) * 2022-03-08 2022-08-09 四川中科奥格生物科技有限公司 一种胰岛细胞稳定液及其制备方法和用途
CN114868736B (zh) * 2022-03-08 2022-12-09 四川中科奥格生物科技有限公司 一种胰岛细胞稳定液及其制备方法和用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Evans et al. Studies of nutrient media for tissue cells in vitro I. A protein-free chemically defined medium for cultivation of strain L cells
US20230115507A1 (en) Agent for accelerating growth of pluripotent stem cells
US4657866A (en) Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
CN101864393B (zh) 一种用于Vero细胞微载体培养的无动物来源成分无血清培养基
CN105420182A (zh) 一种无血清的脐带间充质干细胞培养基
CN101988047B (zh) 一种低成本的昆虫细胞无血清培养基
CN106635953B (zh) 无血清无蛋白细胞培养基
CN105112363B (zh) 一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法
Kane et al. Factors affecting blastocyst expansion of rabbit zygotes and young embryos in defined media
CN104450607A (zh) 用于hek293细胞悬浮生长的全化学成分培养基及培养方法
CN104140949A (zh) 囊胚培养液及其制备方法
Ham et al. Critical adjustment of cysteine and glutamine concentrations for improved clonal growth of WI-38 cells
CN104357379A (zh) 干细胞培养基
CN105454220A (zh) 一种胎盘保存方法、胎盘保存液及其制备方法
Sato et al. Media for culture of mammalian cells
WO2001016294A2 (en) Metal binding compounds and their use in cell culture medium compositions
CN107217032A (zh) 一种用于ins‑1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒
CN101914485A (zh) 一种无血清大豆蛋白肽动物细胞培养基的配制方法
US6767741B1 (en) Metal binding compounds and their use in cell culture medium compositions
CN105087460A (zh) 一种st细胞培养基
CN103409370B (zh) 一种用于淋巴细胞培养的培养基及应用
CN106561632A (zh) 用于脂肪干细胞的冻存液及其制备方法以及培养基
CN105695393B (zh) 一种mdck细胞无血清培养基及其用途和制备
Megha et al. An improvised medium for axenic cultivation of Acanthamoeba spp.
CN105316282A (zh) 一种达氏鲟精原细胞培养液及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170929