CN114868736A - 一种胰岛细胞稳定液及其制备方法和用途 - Google Patents

一种胰岛细胞稳定液及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种胰岛细胞稳定液及其制备方法和用途，属于生物领域。本发明胰岛细胞稳定液由如下质量浓度的组分组成：4‑羟乙基哌嗪乙磺酸1～10g/L、NaCl 1～10g/L、NaHCO31～10g/L、KCl 0.1～1g/L、MgCl20.09～1g/L、CaCl20.1～1g/L、烟酰胺1～10g/L、L‑谷氨酰胺0.1～1g/L、牛血清白蛋白0.5～10g/L，余量为水。本发明胰岛细胞稳定液对胰岛细胞有稳定、保护作用。在对体外胰岛细胞进行研究时，使用本发明胰岛细胞稳定液可以减少体外环境对胰岛细胞的影响，使结果更加准确、可靠。本发明还提供了一种利用该胰岛细胞稳定液配制高低糖溶液体外验证胰岛细胞分泌胰岛素功能的方法，该方法操作方便快捷、重复性和可靠性高，有利于体外证胰岛细胞分泌胰岛素功能，具有良好的应用前景。

Description

一种胰岛细胞稳定液及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种胰岛细胞稳定液及其制备方法和用途。
背景技术
胰岛细胞是人体内重要的一种细胞，调节人体中血糖含量。胰岛细胞包括胰岛B细胞、胰岛A细胞、胰岛D细胞和胰岛PP细胞。其中胰岛B细胞是含量最多的，约占胰岛细胞的60％～80％，其功能为分泌胰岛素。胰岛素是由胰脏内的胰岛B细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。缺乏胰岛B细胞或者胰岛B细胞分泌胰岛素功能下降，会导致血糖升高形成高血糖症。随着胰岛素持续分泌不足，血糖长期处于较高水平，就会导致糖尿病。
随着生活节奏加快、人们饮食习惯的改变，糖尿病成为继肿瘤、心脑血管疾病之后第三大影响人类生活质量和健康的慢性疾病。据统计，目前我国糖尿病成人患病率为10.9％。世界卫生组织预计到2030年，全世界范围内糖尿病患者的人数将达到5.92亿。由于患糖尿病的原因之一是胰岛细胞分泌胰岛素的功能下降，导致胰岛素分泌不足，如果能在前期对胰岛细胞分泌胰岛素功能进行验证，有望在糖尿病形成之前提前干预，预防糖尿病形成。而在糖尿病患病后对胰岛细胞分泌胰岛素功能进行验证，也有利于搞清楚糖尿病形成原因。可见，验证胰岛细胞分泌胰岛素功能在预防和治疗糖尿病中有重要作用。但是胰岛细胞不能冻存，且体外不能长时间存活，因此限制了体外对胰岛细胞的研究。目前，缺少可以使胰岛细胞在体外保持良好活性的胰岛细胞稳定液，如果能够研究一种胰岛细胞稳定液，在体外对胰岛细胞进行保护，保持胰岛细胞的体外活性，这将有利于对胰岛细胞的研究。
此外，目前验证胰岛细胞分泌胰岛素功能的方法主要是体内IVTGG实验，这种方法需要在不同时间点采血看血糖及胰岛素分泌功能，操作比较复杂。亟需一种新的体外验证胰岛细胞分泌胰岛素功能的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种胰岛细胞稳定液及其制备方法和用途。
本发明提供了一种胰岛细胞稳定液，它由如下质量浓度的组分组成：4-羟乙基哌嗪乙磺酸1～10g/L、NaCl 1～10g/L、NaHCO3 1～10g/L、KCl 0.1～1g/L、MgCl2 0.09～1g/L、CaCl2 0.1～1g/L、烟酰胺1～10g/L、L-谷氨酰胺0.1～1g/L、牛血清白蛋白0.5～10g/L，余量为水。
进一步地，前述的胰岛细胞稳定液由如下质量浓度的组分组成：4-羟乙基哌嗪乙磺酸5.9～6g/L、NaCl 6.7～6.8g/L、NaHCO3 2～2.1g/L、KCl 0.3～0.4g/L、MgCl2 0.09～0.2g/L、CaCl2 0.2～0.3g/L、烟酰胺1.2～1.3g/L、L-谷氨酰胺0.2～0.3g/L、牛血清白蛋白1～2g/L，余量为水。
进一步地，前述的胰岛细胞稳定液由如下质量浓度的组分组成：4-羟乙基哌嗪乙磺酸6g/L、NaCl 6.7g/L、NaHCO3 2g/L、KCl 0.4g/L、MgCl2 0.1g/L、CaCl2 0.3g/L、烟酰胺1.2g/L、L-谷氨酰胺0.3g/L、牛血清白蛋白1g/L，余量为水。
进一步地，所述胰岛细胞稳定液的pH值为7.3-7.5。
本发明还提供了一种制备前述的胰岛细胞稳定液的方法，它包括如下步骤：
1)按照质量浓度将各组分溶解于水中；
2)调节pH为7.3-7.5，灭菌，即得；
优选地，步骤2)中，所述灭菌为使用0.22μm过滤器过滤灭菌。
本发明还提供了前述的胰岛细胞稳定液在体外保存胰岛细胞中的用途。
本发明还提供了前述的胰岛细胞稳定液在体外验证胰岛细胞分泌胰岛素功能中的用途。
本发明还提供了一种体外验证胰岛细胞分泌胰岛素功能的方法，它包括如下步骤：
(1)利用前述的胰岛细胞稳定液溶解葡萄糖，分别配制高糖溶液和低糖溶液；所述高糖溶液是浓度为16.8～30mM的葡萄糖溶液；所述低糖溶液是浓度为2～5mM的葡萄糖溶液；
(2)将胰岛细胞团在低糖溶液中平衡后，在低糖溶液中培养，进行低糖刺激，低糖刺激后取出胰岛细胞团，培养液待检测；
(3)将步骤(2)中取出的胰岛细胞团在高糖溶液中培养，进行高糖刺激，高糖刺激后取出胰岛细胞团，培养液待检测；
(4)分别检测低糖刺激和高糖刺激培养液中胰岛素含量，计算胰岛素释放指数；
(5)胰岛素释放指数大于1，说明胰岛细胞合格，分泌胰岛素功能无问题；
优选地，
所述高糖溶液是浓度为28mM的葡萄糖溶液；所述低糖溶液是浓度为2.8mM的葡萄糖溶液。
进一步地，
步骤(1)中，所述葡萄糖为D-(+)-葡萄糖；
和/或，步骤(2)中，所述低糖刺激为在37℃5％CO2条件下培养1～5h；
和/或，步骤(3)中，所述高糖刺激为在37℃5％CO2条件下培养1～5h；
和/或，步骤(4)中，所述检测胰岛素含量采用酶联免疫方法检测；
和/或，步骤(4)中，所述胰岛素释放指数的计算方法为高糖刺激培养液OD值除以低糖刺激培养液OD值。
进一步地，
步骤(4)中，所述酶联免疫方法检测的波长为450nm。
本发明中，质量浓度是溶质的质量除以溶液总体积，单位为g/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种胰岛细胞稳定液，该胰岛细胞稳定液对胰岛细胞有稳定、保护作用，用于体外保存胰岛细胞时可以维持胰岛细胞的活性，避免胰岛细胞在体外功能受损。在对体外胰岛细胞进行研究时，使用本发明胰岛细胞稳定液可以减少体外环境对胰岛细胞的影响，使结果更加准确、可靠。本发明还提供了一种利用该胰岛细胞稳定液配制高低糖溶液体外验证胰岛细胞分泌胰岛素功能的方法，该方法操作方便快捷、重复性和可靠性高，有利于体外证胰岛细胞分泌胰岛素功能，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为胰岛素标准品的标准曲线，其中，X值表示标准品浓度，Y值表示OD值。
图2为胰岛素标准品的标准曲线方程。
图3为265号猪胰岛细胞染色结果。
图4为1357号猪胰岛细胞染色结果。
图5为242号猪胰岛细胞染色结果。
图6为200号猪胰岛细胞染色结果。
图7为krebs液培养后的胰岛细胞染色结果。
图8为本发明胰岛细胞稳定液培养后的胰岛细胞染色结果。
具体实施方式
除另有说明外，本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1、本发明胰岛细胞稳定液的配制
本发明胰岛细胞稳定液的配方如表1所示。
表1.本发明胰岛细胞稳定液的配方
原料 用量
4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)粉末 2.978g
NaCl 3.361g
NaHCO<sub>3</sub> 1.006g
KCl 0.1864g
MgCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O 0.1017g
CaCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O 0.1838g
烟酰胺(Nicotinamide) 0.61g
L-谷氨酰胺水溶液(浓度为200mM) 5mL
牛血清白蛋白(BSA) 0.5000g
去离子水 补充至0.5L
通过计算，本发明胰岛细胞稳定液中各原料组分的质量浓度如下：4-羟乙基哌嗪乙磺酸为5.956g/L、NaCl为6.722g/L、NaHCO3为2.012g/L、KCl为0.373g/L、MgCl2为0.095g/L、CaCl2为0.278g/L、烟酰胺为1.22g/L、L-谷氨酰胺为0.292g/L、牛血清白蛋白为1g/L。
测定胰岛细胞稳定液的pH值，如果pH值不在7.3-7.5范围，可用1NNaOH或1N HCl调节胰岛细胞稳定液的pH值至7.3-7.5。使用0.22μm过滤器过滤灭菌上述胰岛细胞稳定液。
如果原料成分的分子量与表中不一致，可根据最终的原料浓度重新计算所需要的剂量。
实施例2、本发明体外验证胰岛细胞分泌胰岛素功能的方法
(一)试剂配制以胰岛细胞培养
1、胰岛细胞稳定液的配制方法如实施例1所述。
2、胰岛细胞团按照本领域常规方法制备(张伟杰,Schrezenmeir J.成年猪胰岛的分离与纯化[J].中华器官移植杂志,2000,021(006):341-343.)。
3、高糖/低糖溶液的配制
(1)280mM葡萄糖储备溶液的配制
280mM葡萄糖储备溶液的配方如表2所示，将表2用量的D-(+)-Glucose(葡萄糖)溶于胰岛细胞稳定液中，混合均匀，即得。
表2.280mM葡萄糖储备溶液的配方
原料 用量
D-(+)-Glucose 2.5g
胰岛细胞稳定液 50ml
(2)28mM葡萄糖储备溶液的配制(高糖)
28mM葡萄糖储备溶液的配方如表3所示，将表3用量的280mM葡萄糖储备溶液溶于胰岛细胞稳定液中，混合均匀，即得。
表3.28mM葡萄糖储备溶液的配方
原料 用量
280mM葡萄糖储备溶液 1mL
胰岛细胞稳定液 9ml
(3)2.8mM葡萄糖储备溶液的配制(低糖)
2.8mM葡萄糖储备溶液的配方如表4所示，将表4用量的28mM葡萄糖储备溶液溶于胰岛细胞稳定液中，混合均匀，即得。
表4.2.8mM葡萄糖储备溶液的配方
原料 用量
28mM葡萄糖储备溶液 1mL
胰岛细胞稳定液 9ml
(二)体外糖刺激
取一个24孔板，用A、B、C三排，A1、A2、A3、B1、B2、B3、A4、A5、A6都加入2.8mM葡萄糖储备溶液，C1、C2、C3加入的是28mM葡萄糖储备溶液；其中A、B、C各孔加入1ml储备溶液；
往A4、A5、A6三孔中各放入一个直径12mm，孔径12μm的筛网，放置于37℃培养箱中培养1h，作为平衡；在这平衡的1h中，吸取约400IEQ胰岛细胞团至1.5ml EP管中，等胰岛细胞团自然沉淀后，用宽口的移液枪头分两次每次200μl吸取底部的胰岛细胞团，放到另一个1.5ml EP管中；
用宽口的移液枪取三份胰岛细胞团(每份100μl，约100IEQ)，添加到A4、A5、A6三孔中的筛网(Insert)内，用过火的镊子提起筛网，用无菌纱布吸干筛网下的溶液，再将筛网及连同刚才装里面的胰岛细胞团分别装到A1、A2、A3三个孔中，用2.8mM葡萄糖储备溶液让细胞适应15min；取出筛网及胰岛细胞团，用无菌纱布吸干溶液，再分别装到B1、B2、B3三个孔中，放置于37℃5％CO2低糖刺激1h；
1h后用酒精棉擦过的镊子取出筛网，将B1、B2、B3孔中的低糖溶液转移至1.5ml的EP管中标记LC1、LC2、LC3，-20℃长期保存或4℃作短暂保存，然后从底部用无菌纱布吸干溶液，将筛网和胰岛细胞团放至C1、C2、C3三个孔，开始进行高糖刺激，放置于37℃5％CO2培养1h；
高糖刺激孵育1h后取出胰岛细胞团及筛网，弃去；将高糖刺激后的溶液全部取出至1.5ml EP管中，标记HD1、HD2、HD3，-20℃长期保存或4℃作短暂保存。
(三)猪胰岛素样品的酶免Elisa
采用常规猪胰岛素Elisa试剂盒检测胰岛素含量，方法如下：
1、先用PBS将上述低糖刺激和高糖刺激得到的样品稀释成40倍稀释；
2、标准品梯度稀释：加入标准品/样本稀释液(SR1)1ml至冻干胰岛素标准品中，静置15分钟待其完全溶解后轻轻混匀(浓度为1000pmol/L)，然后在其余七管中各加入500μL标准品/样本稀释液(SR1)，按照以下浓度进行2倍稀释：250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.905、0pmol/L进行稀释。250pmol/L为标准曲线最高点浓度，标准品/样本稀释液(SR1)作为标准曲线的零点(0pmol/L)。复溶过的标准品原液(1000pmol/L)未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装，并将其贮存在-20～-80℃冰箱；
3、实验前30min，拿出试剂盒，恢复至室温，加入标准品/样本前，清洗板3次并甩干；
4、加入100μl标准品及检测样本至反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育60min，60min后拍板、洗板4次；
5、加入100μl生物素化抗体工作液至反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育60min，60min后拍板、洗板4次；
6、加入100μl酶结合物工作液至反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育30min，30min后拍板、洗板5次；
7、加入100μl显色底物至反应孔中，封板后于37℃避光显色15min；
8、加入50μl终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值(5分钟内)。
(四)结果判断
1、用酶标仪450nm波长测定OD值。选择双波长检测，参考波长为630nm。如不能进行双波长检测，请用450nm的OD测定值减去630nm的OD测定值；
2、计算标准品、样品的平均OD值：每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值；
3、以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用软件绘制标准曲线，样品中Insulin(胰岛素)含量可通过对应OD值由标准曲线换算出相应的浓度；
4、若标本OD值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数；
(五)结果计算
1、根据标准品算出样品的浓度值，把每组样品平均，三组分别计算出胰岛素释放指数(SI数值)。
2、最后的计算结果是本次实验的胰岛细胞糖刺激胰岛素释放指数SI＝(SI1+SI2+SI3)/3。
3、SI数值大于1说明胰岛细胞合格，分泌胰岛素功能无问题。
(六)结果
1、胰岛素标准品的标准曲线测试结果
不同浓度胰岛素标准品OD值如表5所示。标准曲线和方程分别如图1和图2所示。
表5.不同浓度胰岛素标准品OD值
标曲浓度(pmol/L) 250 125 62.5 31.25 15.63 7.81 3.9 0.000
标曲OD值 1.83 0.937 0.361 0.152 0.075 0.056 0.048 0.049
2、体外验证胰岛细胞分泌胰岛素功能的结果
按照本领域常规方法分别从265号猪、1357号猪、242号猪、200号猪提取培养胰岛细胞团。按照上述方法检测并计算SI值。结果如表6～9所示。
表6.265号猪高糖刺激及低糖刺激结果
高糖刺激OD值 1.153 0.868 0.963 低糖刺激OD值 0.36 0.208 0.31
浓度(pmol/L) 149.4 117.6 128 浓度(pmol/L) 62.1 41.8 55.6
SI1＝149.4/62.1＝2.4
SI2＝117.6/41.8＝2.8
SI3＝128/55.6＝2.3
SI＝(SI1+SI2+SI3)/3＝2.5
结果说明：265号猪SI数值大于1，说明其胰岛细胞合格，分泌胰岛素功能无问题。
表7.1357号猪高糖刺激及低糖刺激结果
高糖刺激OD值 0.246 0.2 0.22 低糖刺激OD值 0.072 0.069 0.07
浓度(pmol/L) 47.1 40.2 43.4 浓度(pmol/L) 14.3 13.3 13.6
SI1＝47.1/14.3＝3.3
SI2＝40.2/13.3＝3
SI3＝43.4/13.6＝3.2
SI＝(SI1+SI2+SI3)/3＝3.17
结果说明：1357号猪SI数值大于1，说明其胰岛细胞合格，分泌胰岛素功能无问题。
表8.242号猪高糖刺激及低糖刺激结果
高糖刺激OD值 1.679 1.904 1.828 低糖刺激OD值 1.644 1.974 1.753
浓度(pmol/L) 222.7 265 250 浓度(pmol/L) 217 280.5 235.5
SI1＝222.7/217＝1.03
SI2＝265/280.5＝0.94
SI3＝250/235.5＝1.06
SI＝(SI1+SI2+SI3)/3＝1.01
结果说明：242号猪SI数值大于1，说明其胰岛细胞合格，分泌胰岛素功能无问题。
表9.200号猪高糖刺激及低糖刺激结果
高糖刺激OD值 2.526 2.323 2.46 低糖刺激OD值 2.59 2.236 1.85
浓度(pmol/L) 497 387.5 454.6 浓度(pmol/L) 547.5 354.5 253.9
SI1＝497/547.5＝0.9
SI2＝387.5/354.5＝1.1
SI3＝454.6/253.9＝1.8
SI＝(SI1+SI2+SI3)/3＝1.27
结果说明：200号猪SI数值大于1，说明其胰岛细胞合格，分泌胰岛素功能无问题。
实验结束后将各号猪的胰岛细胞通过PI和FDA染色，观察染色结果。PI染死细胞呈现红色，FDA染活细胞呈现绿色。图3～6为糖刺激后细胞活性图，其中，265号猪胰岛细胞染色结果如图3所示。1357号猪胰岛细胞染色结果如图4所示。242号猪胰岛细胞染色结果如图5所示。200号猪胰岛细胞染色结果如图6所示。四头猪胰岛细胞染色均呈现大面积的绿色，说明它们的胰岛细胞活性均很好。胰岛细胞活性越好，其对糖刺激反应越好，分泌胰岛素功能就没有问题。染色结果与体外分泌胰岛素功能验证结果一致，猪的胰岛细胞活性好，分泌胰岛素功能无问题。实验结果说明本发明验证方法准确、有效。如果胰岛细胞稳定液不能保持胰岛细胞的活性，体外胰岛细胞大量死亡，呈红色的细胞数量会很多，而胰岛细胞死亡会立刻释放胰岛素，从而影响实验结果，使染色结果与分泌胰岛素功能的结果出现矛盾。
上述结果说明本发明胰岛细胞稳定液对胰岛细胞有稳定、保护作用，可以维持胰岛细胞在体外的活性，减少胰岛细胞损伤。使用本发明胰岛细胞稳定液配制高低糖溶液验证胰岛细胞分泌胰岛素功能时可以避免体外环境对胰岛细胞的影响，使验证结果更加准确。
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
试验例1、本发明胰岛细胞稳定液对胰岛细胞的活性影响
1、本发明胰岛细胞稳定液的配制方法如实施例1所述。
2、胰岛细胞团按照本领域常规方法制备(张伟杰,Schrezenmeir J.成年猪胰岛的分离与纯化[J].中华器官移植杂志,2000,021(006):341-343.)。
3、胰岛细胞稳定液对照组(krebs液)的配方如表10所示。
表10.krebs液的配方
原料 用量
4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)粉末 2.978g
NaCl 3.361g
NaHCO<sub>3</sub> 1.006g
KCl 0.1864g
MgCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O 0.1017g
CaCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O 0.1838g
牛血清白蛋白(BSA) 0.5000g
去离子水 补充至0.5L
测定krebs液的pH值，如果pH值不在7.3-7.5范围，可用1N NaOH或1N HCl调节krebs液的pH值至7.3-7.5。使用0.22μm过滤器过滤灭菌上述krebs液。
4、分别使用本发明胰岛细胞稳定液和krebs液保存培养同一批次的胰岛细胞2h，然后通过PI和FDA染色，观察染色结果，PI染死细胞呈现红色，FDA染活细胞呈现绿色。图7为krebs液培养后的细胞染色结果，图8为本发明胰岛细胞稳定液培养后的细胞染色结果。由图7和图8可知：krebs液保存培养胰岛细胞后，死细胞数量显著增加，胰岛细胞活性显著降低；而本发明胰岛细胞稳定液保存培养胰岛细胞后，胰岛细胞仍然保持很好的活性，死细胞数量少。可见，本发明胰岛细胞稳定液能够保持胰岛细胞体外活性，减少胰岛细胞在体外功能受损。
综上，本发明提供了一种胰岛细胞稳定液，该胰岛细胞稳定液对胰岛细胞有稳定、保护作用，用于体外保存胰岛细胞时可以维持胰岛细胞的活性，避免胰岛细胞在体外功能受损。在对体外胰岛细胞进行研究时，使用本发明胰岛细胞稳定液可以减少体外环境对胰岛细胞的影响，使结果更加准确、可靠。本发明还提供了一种利用该胰岛细胞稳定液配制高低糖溶液体外验证胰岛细胞分泌胰岛素功能的方法，该方法操作方便快捷、重复性和可靠性高，有利于体外证胰岛细胞分泌胰岛素功能，具有良好的应用前景。

Claims (10)

1.一种胰岛细胞稳定液，其特征在于：它由如下质量浓度的组分组成：4-羟乙基哌嗪乙磺酸1～10g/L、NaCl 1～10g/L、NaHCO3 1～10g/L、KCl 0.1～1g/L、MgCl2 0.09～1g/L、CaCl2 0.1～1g/L、烟酰胺1～10g/L、L-谷氨酰胺0.1～1g/L、牛血清白蛋白0.5～10g/L，余量为水。
2.根据权利要求1所述的胰岛细胞稳定液，其特征在于：它由如下质量浓度的组分组成：4-羟乙基哌嗪乙磺酸5.9～6g/L、NaCl 6.7～6.8g/L、NaHCO32～2.1g/L、KCl 0.3～0.4g/L、MgCl2 0.09～0.2g/L、CaCl2 0.2～0.3g/L、烟酰胺1.2～1.3g/L、L-谷氨酰胺0.2～0.3g/L、牛血清白蛋白1～2g/L，余量为水。
3.根据权利要求2所述的胰岛细胞稳定液，其特征在于：它由如下质量浓度的组分组成：4-羟乙基哌嗪乙磺酸6g/L、NaCl 6.7g/L、NaHCO3 2g/L、KCl 0.4g/L、MgCl2 0.1g/L、CaCl2 0.3g/L、烟酰胺1.2g/L、L-谷氨酰胺0.3g/L、牛血清白蛋白1g/L，余量为水。
4.根据权利要求1～3任一项所述的胰岛细胞稳定液，其特征在于：所述胰岛细胞稳定液的pH值为7.3-7.5。
5.一种制备权利要求1～4任一项所述的胰岛细胞稳定液的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)按照质量浓度将各组分溶解于水中；
2)调节pH为7.3-7.5，灭菌，即得；
优选地，步骤2)中，所述灭菌为使用0.22μm过滤器过滤灭菌。
6.权利要求1～4任一项所述的胰岛细胞稳定液在体外保存胰岛细胞中的用途。
7.权利要求1～4任一项所述的胰岛细胞稳定液在体外验证胰岛细胞分泌胰岛素功能中的用途。
8.一种体外验证胰岛细胞分泌胰岛素功能的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)利用权利要求1～4任一项所述的胰岛细胞稳定液溶解葡萄糖，分别配制高糖溶液和低糖溶液；所述高糖溶液是浓度为16.8～30mM的葡萄糖溶液；所述低糖溶液是浓度为2～5mM的葡萄糖溶液；
(2)将胰岛细胞团在低糖溶液中平衡后，在低糖溶液中培养，进行低糖刺激，低糖刺激后取出胰岛细胞团，培养液待检测；
(3)将步骤(2)中取出的胰岛细胞团在高糖溶液中培养，进行高糖刺激，高糖刺激后取出胰岛细胞团，培养液待检测；
(4)分别检测低糖刺激和高糖刺激培养液中胰岛素含量，计算胰岛素释放指数；
(5)胰岛素释放指数大于1，说明胰岛细胞合格，分泌胰岛素功能无问题；
优选地，
所述高糖溶液是浓度为28mM的葡萄糖溶液；所述低糖溶液是浓度为2.8mM的葡萄糖溶液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
步骤(1)中，所述葡萄糖为D-(+)-葡萄糖；
和/或，步骤(2)中，所述低糖刺激为在37℃5％CO2条件下培养1～5h；
和/或，步骤(3)中，所述高糖刺激为在37℃5％CO2条件下培养1～5h；
和/或，步骤(4)中，所述检测胰岛素含量采用酶联免疫方法检测；
和/或，步骤(4)中，所述胰岛素释放指数的计算方法为高糖刺激培养液OD值除以低糖刺激培养液OD值。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述酶联免疫方法检测的波长为450nm。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2113199A (en) * 1998-01-12 1999-07-26 Betagene, Inc. Media for neuroendocrine cells
CN101974488A (zh) * 2010-06-21 2011-02-16 西北农林科技大学 一种永生化的猪胰腺干细胞系及其构建与分化方法
CN102197802A (zh) * 2011-03-25 2011-09-28 中国人民解放军南京军区福州总医院 一种胰岛冻存保护剂及其使用方法
CN102433300A (zh) * 2011-11-25 2012-05-02 厚朴生物科技（苏州）有限公司 一种人胰岛来源的胰腺干细胞系的构建及向胰岛素分泌细胞分化的方法
CN107217032A (zh) * 2017-07-31 2017-09-29 上海银海圣生物科技有限公司 一种用于ins‑1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒
CN109030804A (zh) * 2018-08-16 2018-12-18 青岛大学 葡萄糖刺激的胰岛素分泌测定模型
CN109619089A (zh) * 2018-12-27 2019-04-16 湖南赛诺生物科技股份有限公司 一种胰岛细胞低温保存液及其使用方法
CN112868641A (zh) * 2021-01-21 2021-06-01 立沃生物科技（深圳）有限公司 一种胰岛细胞的冻存方法、复苏方法及重构方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2113199A (en) * 1998-01-12 1999-07-26 Betagene, Inc. Media for neuroendocrine cells
CN101974488A (zh) * 2010-06-21 2011-02-16 西北农林科技大学 一种永生化的猪胰腺干细胞系及其构建与分化方法
CN102197802A (zh) * 2011-03-25 2011-09-28 中国人民解放军南京军区福州总医院 一种胰岛冻存保护剂及其使用方法
CN102433300A (zh) * 2011-11-25 2012-05-02 厚朴生物科技（苏州）有限公司 一种人胰岛来源的胰腺干细胞系的构建及向胰岛素分泌细胞分化的方法
CN107217032A (zh) * 2017-07-31 2017-09-29 上海银海圣生物科技有限公司 一种用于ins‑1大鼠胰岛细胞培养的试剂盒
CN109030804A (zh) * 2018-08-16 2018-12-18 青岛大学 葡萄糖刺激的胰岛素分泌测定模型
CN109619089A (zh) * 2018-12-27 2019-04-16 湖南赛诺生物科技股份有限公司 一种胰岛细胞低温保存液及其使用方法
CN112868641A (zh) * 2021-01-21 2021-06-01 立沃生物科技（深圳）有限公司 一种胰岛细胞的冻存方法、复苏方法及重构方法

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