CN109620962A - 一种疫苗稀释剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学领域，具体公开了一种疫苗稀释剂，其原料包括注射用水和聚合物，可选地加入免疫增强剂。所述疫苗稀释剂的制备方法为称取原料放入不锈钢高压反应器底部，放入磁子，密闭后，反应器放入带有磁力搅拌的水浴中，设定水浴温度，开启单缸注射泵充二氧化碳至实验所需压力，停止冲压，关闭反应器阀门，保持其内部压力不变，设定搅拌速率。在水浴中恒温放置一定时间反应后，卸压，即得。本发明提供的超临界二氧化碳处理后的稀释剂组合，易于疫苗的工业化生产，安全有效。本发明中所制成稀释剂既可以应用于活疫苗的抗原，也可以应用于灭活疫苗抗原或合成肽疫苗抗原。

Description

一种疫苗稀释剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及免疫学领域，具体地说，涉及一种疫苗稀释剂。
背景技术
疫苗稀释剂，是指对疫苗进行稀释后，用于机体免疫的试剂。
疫苗稀释剂的作用是十分重要的，不仅仅是对疫苗进行稀释，还可以起到保护疫苗、提高疫苗免疫效果的作用。
而疫苗的种类、来源和生产工艺等，都会对稀释剂的选择产生一定的影响。由于生产厂家、免疫效果等的差异，使得疫苗在实际应用过程中，对于稀释倍数、稀释方法以及稀释剂的要求也存在着很大的不同，如果随意选择，不仅无法起到良好的稀释效果，还可能会产生不良反应。
目前动物疫苗在进行稀释时，往往都是使用去离子水或生理盐水或PBS缓冲液对疫苗进行稀释后为动物接种，往往导致免疫效果不理想或者免疫失败。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种疫苗稀释剂及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种疫苗稀释剂，其原料包括注射用水与环糊精、改性淀粉、聚己内酯、聚富马酸-癸二酸、壳聚糖、甘露聚糖、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆系列、聚乳酸-羟乙酸、聚交联丙烯酸酯、肽聚糖、聚羟丁酸、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇中的一种或几种组合；
其制备方法如下：
将原料放入高压反应器底部，放入磁子，密闭反应器，并将其放入带有磁力搅拌的水浴中，设定水浴温度32至50℃，开启单缸注射泵充二氧化碳至实验所需压力7.3至15MPa，停止冲压，关闭反应器阀门，保持其内部压力不变，设定搅拌速率200至2000转/分；在水浴中恒温放置反应10至120分钟后，卸压，即得稀释剂。
进一步作为优选，疫苗稀释剂的原料为(1)～(3)中的一种：
(1)注射用水、环糊精、壳聚糖和聚乙二醇；
(2)注射用水、聚己内酯、聚富马酸-癸二酸和水溶性淀粉；
(3)注射用水、甘露聚糖、肽聚糖、聚乳酸-羟乙酸和聚羟丁酸。
在上述优选方案的基础上，进一步对其原料及其质量百分比进行优化，具体为(1)～(3)中的一种：
(1)注射用水90％、环糊精4％、壳聚糖4％和聚乙二醇2％；
(2)注射用水90％、聚己内酯3％、聚富马酸-癸二酸3％和水溶性淀粉4％；
(3)注射用水90％、甘露聚糖3％、肽聚糖1％、聚乳酸-羟乙酸1％和聚羟丁酸5％。
经试验验证，使用本发明所提供的疫苗稀释剂稀释疫苗，能够有效提高疫苗的免疫效果。
第二方面，本发明在上述疫苗稀释剂的基础上，进一步引入免疫增强剂，以求更好的稀释后疫苗的免疫效果。
具体为，一种疫苗稀释剂，其原料包括注射用水，免疫增强剂，以及环糊精、改性淀粉、壳聚糖、甘露聚糖、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乳酸-羟乙酸(PLGA)、聚交联丙烯酸酯和聚乙二醇中的一种或几种组合；
其制备方法如下：
将原料放入高压反应器底部，放入磁子，密闭后，反应器放入带有磁力搅拌的水浴中，设定水浴温度30至40℃，开启单缸注射泵充二氧化碳至实验所需压力8至15MPa，停止冲压，关闭反应器阀门，保持其内部压力不变，设定搅拌速率200至2000转/分。在水浴中恒温放置反应10至120分钟后，卸压，即得稀释剂。
进一步地，所述免疫增强剂优选自黄芪多糖、紫雏菊提取物、皂甙、咪喹莫特和聚肌苷酸-聚胞苷酸中的一种或几种。
进一步作为优选方案，疫苗稀释剂的原料为(1)～(3)中的一种：
(1)注射用水、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆407和皂甙Quil-A；
(2)注射用水、聚己内酯、泊洛沙姆188和黄芪多糖；
(3)注射用水、聚乳酸-羟乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、壳聚糖和咪喹莫特。
在上述优选方案的基础上，进一步对其原料及其质量百分比进行优化，具体为(1)～(3)中的一种：
(1)注射用水89.9％、聚乙烯吡咯烷酮9％、泊洛沙姆407 1％和皂甙Quil-A0.1％；
(2)注射用水89.9％、聚己内酯6％、泊洛沙姆188 4％和黄芪多糖0.1％；
(3)注射用水89.98％、聚乳酸-羟乙酸7％、聚乙烯吡咯烷酮2％、壳聚糖1％和咪喹莫特0.02％。
第三方面，本发明提供了前述不含免疫增强剂的疫苗稀释剂/含有免疫增强剂的疫苗稀释剂在制备动物疫苗方面的应用。
在此基础上，本发明提供一种动物疫苗，由本发明所述的疫苗稀释剂参与制备得到。具体可表现为，使用本发明所述疫苗稀释剂配制稀释剂，将市售符合标准猪瘟细胞苗活疫苗抗原，按照标准比例进行稀释后，即得。
进一步地，欲稀释的疫苗为本领域任意常用的疫苗，本发明对此不另作限定，可选地，所述疫苗可含有活疫苗抗原或灭活疫苗抗原或合成肽疫苗抗原等。
本发明提及到的百分含量如无特殊说明，均指质量百分含量；涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种动物疫苗的稀释剂，具有免疫增强作用，疫苗接种后达到很好的免疫效果。
目前在疫苗稀释剂的生产中大多采用液体或固体溶解，灭菌后直接使用，本发明提供一种应用超临界技术对稀释剂产品进行预处理后，再除菌后制备成稀释剂产品，方法简单，制成的稀释剂免疫效果良好。超临界流体是指超临界温度和临界压力状态下的高密度流体。超临界流体具有许多独特的性质，如粘度小、密度、扩散系数、溶剂化能力等性质随温度和压力变化十分敏感：粘度和扩散系数接近气体，而密度和溶剂化能力接近液体。超临界流体具有气体和液体的双重特性，其粘度与气体相似，但扩散系数比液体大得多，其密度和液体相近。超临界二氧化碳是目前研究最广泛的流体之一，因为它具有以下几个特点：CO2临界温度为31.26℃，临界压力为72.9atm，临界条件容易达到；CO2化学性质不活泼，无色无味无毒，安全性好；价格便宜，纯度高，容易获得。由于超临界二氧化碳临界温度近于常温临界压力不高，化学惰性，不污染环境使其成为绿色介质，而超临界流体的热力学活性可通过压力的改变加以控制，这样就为控制材料形貌和性能提供了一种灵活可调的途径。利用超临界流体对聚合物进行溶胀塑化改性处理后，材料体积增大，孔洞也逐渐扩展，高分子骨架结构打通，并将溶解于二氧化碳中的物质携带输运到聚合物基体中去的能力，对聚合物在多尺度结构水平上进行修饰和调控，达到对聚合物性能可控“剪裁”的目的，产生微米或纳米尺寸的微孔网络，并导致其基本物性的变化，例如聚合物的表面张力、结晶行为和流变行为等。本发明提供的超临界二氧化碳处理后的稀释剂组合，易于疫苗的工业化生产，安全有效。本发明中所制成稀释剂既可以应用于活疫苗的抗原，也可以应用于灭活疫苗抗原或合成肽疫苗抗原。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
原料及质量百分比如下：
1、注射用水溶液 90％；
2、聚合物组合：
环糊精 4％；
壳聚糖 4％；
聚乙二醇4000 2％。
制备方法：
称取上述注射用水溶液和聚合物组合放入不锈钢高压反应器底部，放入磁子，密闭后，反应器放入带有磁力搅拌的水浴中，设定水浴温度32至50℃，开启单缸注射泵充二氧化碳至实验所需压力7.3至15MPa，停止冲压，关闭反应器阀门，保持其内部压力不变，设定搅拌速率200至2000转/分。在水浴中恒温应用超临界二氧化碳处理反应10至120分钟后，卸压，打开反应器，取出即得稀释剂。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于：
原料及质量百分比如下：
1、注射用水溶液 90％；
2、聚合物组合：
聚己内酯 3％；
聚富马酸-癸二酸 3％；
水溶性淀粉 4％。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：
原料及质量百分比如下：
1、注射用水溶液 90％；
2、聚合物组合：
实施例4
原料及质量百分比如下：
1、注射用水溶液 89.9％；
2、聚合物组合：
聚乙烯吡咯烷酮 9％；
泊洛沙姆407 1％；
3、免疫增强剂：
皂甙Quil-A 0.1％。
制备方法：
称取上述注射用水溶液和聚合物组合放入不锈钢高压反应器底部，加入免疫增强剂，放入磁子，密闭后，反应器放入带有磁力搅拌的水浴中，设定水浴温度30至45℃，开启单缸注射泵充二氧化碳至实验所需压力8至15MPa，停止冲压，关闭反应器阀门，保持其内部压力不变，设定搅拌速率200至2000转/分。在水浴中恒温放置反应10至120分钟后，卸压，打开反应器，取出即得稀释剂。
实施例5
本实施例与实施例4的区别在于：
原料及质量百分比如下：
1、注射用水溶液 89.9％；
2、聚合物组合：
聚己内酯 6％；
泊洛沙姆188 4％；
3、免疫增强剂：
黄芪多糖 0.1％。
实施例6
本实施例与实施例4的区别在于：
原料及质量百分比如下：
1、注射用水溶液 89.98％；
2、聚合物组合：
聚乳酸-羟乙酸(PLGA) 7％；
聚乙烯吡咯烷酮 2％；
壳聚糖 1％；
3、免疫增强剂：
咪喹莫特 0.02％。
实施例7
本实施例用于说明含有本发明所述稀释剂的动物疫苗。
本实施例以猪瘟疫苗为例，制备方法具体如下：
将实施例1所述的原料，按比例称取放入不锈钢高压反应器底部，放入磁子，密闭后，反应器放入带有磁力搅拌的水浴中，设定水浴温度45℃，开启单缸注射泵充二氧化碳至实验所需压力至12MPa，停止冲压，关闭反应器阀门，保持其内部压力不变，设定搅拌速率800转/分。在水浴中恒温应用超临界二氧化碳处理反应60分钟后，卸压，打开反应器，取出用滤膜过滤除菌即得稀释剂。
用上述稀释剂将市售符合标准猪瘟细胞苗活疫苗抗原，按照标准比例进行稀释后，制备成猪瘟活疫苗实验组A。
实施例8
本实施例用于说明含有本发明所述稀释剂的动物疫苗。
本实施例以猪瘟疫苗为例，制备方法具体如下：
将实施例6所述的原料，按比例称取放放入不锈钢高压反应器底部，加入免疫增强剂，放入磁子，密闭后，反应器放入带有磁力搅拌的水浴中，设定水浴温度40℃，开启单缸注射泵充二氧化碳至实验所需压力10MPa，停止冲压，关闭反应器阀门，保持其内部压力不变，设定搅拌速率1000转/分。在水浴中恒温放置反应60分钟后，卸压，打开反应器，取出用滤膜过滤除菌即得稀释剂。
用上述稀释剂将市售符合标准猪瘟细胞苗活疫苗抗原，按照标准比例进行稀释后，制备成猪瘟活疫苗实验组B。
用上述稀释剂将市售符合标准猪瘟细胞灭活疫苗抗原，按照实验组B的标准比例进行稀释后，制备成猪瘟灭活疫苗实验组C。
实验例1
本实验例用于说明含有本发明所述处理后稀释剂的动物疫苗的指标检测，相关说明如下：
1.无菌检测
酪胨10g，肉浸液1000ml，氯化钠5g，15～20g琼脂，取酪胨和氯化钠，琼脂加入肉浸液内，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。接种制备的实验组和对照组疫苗与培养基后经30～35℃培养48小时，观察结果均无菌。
2.动物免疫评价
评价内容如下：动物接种疫苗后无异常反应，在规定的时间采血分离血清，检测血清抗体效价。
实验组A：本发明实施例7的猪瘟活疫苗；
实验组B：本发明实施例8的猪瘟活疫苗；
实验组C：本发明实施例8的猪瘟灭活疫苗；
对照组A：对市售同样抗原同样比例进行混合，按照标配抗原稀释剂混合，制备成疫苗；
对照组B：对市售灭活抗原按照实验组C同样比例用PBS缓冲液进行混合稀释，制备成疫苗；
空白对照组：不注射任何疫苗。
a.动物安全性试验
每组疫苗用体重350～450g的豚鼠2只，每只皮下注射实验组和对照组ml：用体重18～22g的小白鼠5只，每只皮下注实验组和对照组疫苗0.5ml。连续观察7日，观察均无异常临床反应。
b.抗体检测
按照规程要求进行动物免疫：
用7～8周龄20～30公斤猪瘟抗体阴性断奶仔猪27头，分成六组，其中实验组A，B，C和对照组A，B组每组5头，空白组2头，实验组和对照组每头后肌肉接种本发明提供的疫苗，每头份剂量为1毫升，空白组不接种，为空白对照。各组均隔离饲养观察。分别在免疫后1周，2周，3周，4周，5周采血，分离血清，采用猪瘟病毒间接ELISA抗体检测法测定血清中猪瘟抗体效价。空白对照组全部为阴性，本发明提供的稀释剂活疫苗组的OD值均高于对照组A，且在免疫后一周即出现较高抗体，灭活疫苗组的OD值远高于PBS缓冲液组，且能维持较高水平。具体数据如表1所示。
表1 本动物免疫评价结果(抗体OD值)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种疫苗稀释剂，其特征在于，其原料包括注射用水与环糊精、改性淀粉、聚己内酯、聚富马酸-癸二酸、壳聚糖、甘露聚糖、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆系列、聚乳酸-羟乙酸、聚交联丙烯酸酯、肽聚糖、聚羟丁酸、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇中的一种或几种组合；
其制备方法如下：
将原料放入高压反应器底部，放入磁子，密闭反应器，并将其放入带有磁力搅拌的水浴中，设定水浴温度32至50℃，开启单缸注射泵充二氧化碳至实验所需压力7.3至15MPa，停止冲压，关闭反应器阀门，保持其内部压力不变，设定搅拌速率200至2000转/分；在水浴中恒温放置反应10至120分钟后，卸压，即得稀释剂。
2.根据权利要求1所述的疫苗稀释剂，其特征在于，其原料为：注射用水、环糊精、壳聚糖和聚乙二醇；或为注射用水、聚己内酯、聚富马酸-癸二酸和水溶性淀粉；或为注射用水、甘露聚糖、肽聚糖、聚乳酸-羟乙酸和聚羟丁酸。
3.根据权利要求2所述的疫苗稀释剂，其特征在于，其原料及其质量百分比为：注射用水90％、环糊精4％、壳聚糖4％和聚乙二醇2％；或为注射用水90％、聚己内酯3％、聚富马酸-癸二酸3％和水溶性淀粉4％；或为注射用水90％、甘露聚糖3％、肽聚糖1％、聚乳酸-羟乙酸1％和聚羟丁酸5％。
4.一种疫苗稀释剂，其特征在于，其原料包括注射用水，免疫增强剂，以及环糊精、改性淀粉、壳聚糖、甘露聚糖、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乳酸-羟乙酸(PLGA)、聚交联丙烯酸酯和聚乙二醇中的一种或几种组合；
其制备方法如下：
将原料放入高压反应器底部，放入磁子，密闭后，反应器放入带有磁力搅拌的水浴中，设定水浴温度30至40℃，开启单缸注射泵充二氧化碳至实验所需压力8至15MPa，停止冲压，关闭反应器阀门，保持其内部压力不变，设定搅拌速率200至2000转/分，在水浴中恒温放置反应10至120分钟后，卸压，即得稀释剂。
5.根据权利要求4所述的疫苗稀释剂，其特征在于，所述免疫增强剂选自黄芪多糖、紫雏菊提取物、皂甙、咪喹莫特和聚肌苷酸-聚胞苷酸中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的疫苗稀释剂，其特征在于，其原料为注射用水、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆407和皂甙Quil-A；或为注射用水、聚己内酯、泊洛沙姆188和黄芪多糖；或为注射用水、聚乳酸-羟乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、壳聚糖和咪喹莫特。
7.根据权利要求6所述的疫苗稀释剂，其特征在于，其原料及其质量百分比为：注射用水89.9％、聚乙烯吡咯烷酮9％、泊洛沙姆4071％和皂甙Quil-A0.1％；或为注射用水89.9％、聚己内酯6％、泊洛沙姆188 4％和黄芪多糖0.1％；或为注射用水89.98％、聚乳酸-羟乙酸7％、聚乙烯吡咯烷酮2％、壳聚糖1％和咪喹莫特0.02％。
8.权利要求1～7任意一项所述的疫苗稀释剂在制备动物疫苗方面的应用。
9.一种动物疫苗，其特征在于，由权利要求1～7任意一项所述的疫苗稀释剂参与制备得到。
10.根据权利要求9所述的动物疫苗，其特征在于，所述疫苗含有活疫苗抗原或灭活疫苗抗原或合成肽疫苗抗原。
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