CN111610334A - 一种基于细胞大小过滤识别肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于细胞大小过滤（ISET）识别肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞的方法，尤其对通过物理方法捕获、细胞形态学识别困难的循环肿瘤细胞，属于分子生物学技术领域。本发明采用细胞免疫化学法检测疑似CTC上CD45和CD31是否表达以排除白细胞和内皮细胞。本发明可相对准确识别多种不同癌症患者外周血中循环肿瘤细胞，该技术属于微创，并能够实时动态检测。本发明提供的方法，能够更加精准的检测CTC，降低检测CTC的假阳性率，提高特异性，对临床应用CTC检测评估病情及疗效具有重要临床指导意义。

Description

一种基于细胞大小过滤识别肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞的 方法
技术领域
本发明涉及一种基于细胞大小过滤（ISET）识别肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞的方法，尤其对通过物理方法捕获、细胞形态学识别困难的循环肿瘤细胞，利用CD45和CD31细胞免疫化学法进行检测，属于分子生物学技术领域。
背景技术
CTCBIOPSY®检测系统是依据细胞大小来分离CTCs，然后采用瑞氏-吉姆萨染色的方法对滤膜上的细胞进行染色。该方法在严格按照SOP操作要求下检出的细胞可分为以下几类：CTC、血细胞、异形细胞、裸核细胞，根据细胞形态学标准可以区分典型CTC、血细胞、内皮细胞及裸核细胞，但在检测过程中发现的异形细胞及疑似CTC细胞利用CTC形态学判断标准（Hoffman标准）难以定性，该类细胞无法明确区分是CTC还是其他异常细胞，亟待一种识别方法。
CD45分子在所有白细胞上都有表达，称为白细胞共同抗原（leukocyte commonantigen,LCA),其高水平（>106个分子/细胞）表达在淋巴细胞以及除了红细胞和血小板之外的其它所有的造血细胞上。
CD31又称为血小板-内皮细胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesionmolecule-1 ，PECAM-1/CD31)，分子量为130kDa，其结构属于免疫球蛋白超家族成员，在清除体内老化的中性粒细胞过程中发挥重要作用。CD31存在于血小板、中性粒细胞、单核细胞和某些类型的T细胞表面，以及内皮细胞间紧密连接处。在免疫组化中，CD31 是主要用于证明内皮细胞组织的存在，用于评估肿瘤血管生成，这可能意味着一个快速增长的肿瘤的程度。恶性血管内皮细胞通常也保留抗原，所以，CD31 免疫组织化学方法还可以用于证明血管瘤和 血管肉瘤。它还可证明在小淋巴细胞和淋巴细胞性淋巴瘤，但CD31并非他们特异的标志分子。现有技术中，尚未有通过基于细胞大小过滤（ISET）识别肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞的相关记载。
发明内容
循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。
为了相对准确识别基于细胞大小过滤（ISET）原理的CTCBIOPSY®系统检测的循环肿瘤细胞，本发明是一种运用细胞免疫化学技术检测疑似CTC上CD45和CD31是否表达以排除白细胞和内皮细胞的识别方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种基于细胞大小过滤识别肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞的方法，所述方法采用细胞免疫化学法检测疑似CTC上CD45和CD31是否表达以排除白细胞和内皮细胞。
进一步的，该方法具体包括以下步骤：
（1）采集中晚期癌症患者外周血：自肘正中静脉采集外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样加入稀释液进行10倍稀释， 稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；
（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；
（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；
（5）运用细胞免疫化学技术检测CTC上CD45和CD31表达情况。
进一步的，所述稀释液是由1mmol/L EDTA+0.1% BSA+0.1%海藻糖+0.2%聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物组成，所述基础液为Tris-HCl缓冲剂。
进一步的，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。
本发明所述细胞免疫化学技术检测CTC上CD45和CD31表达情况的具体过程如下：
（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；
（2）滴加100μl 0.1% Triton X-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；
（3）滴加100μl 0.3% H2O2，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；
（4）滴加100μl CD45（人）和CD31（人）一抗，室温孵育2h（或4℃过夜），PBS洗2min×3次；
（5）滴加100μl山羊抗人 IgG/HRP，室温下孵育20min，PBS洗2min×3次；
（6）滴加100μl DAB显色液，室温下孵育并随时在显微镜下观察显色情况；
（7）显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；
（8）盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；
（9）75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱水，晾干，中性树脂封固。
（10）光学显微镜下镜检。
进一步的，所述脱色液为：95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1混匀。
本发明所使用的膜过滤分离肿瘤细胞装置，包括滤器、血样容器、废液缸和铁架台，所述铁架台设有底座、立架和支架，所述血样容器通过支架设置于铁架台上部，血样容器的下方为滤器，滤器通过输液器联通至废液缸，废液缸设置于底座上。
所述滤器包括滤器上口、滤膜、载滤膜平台和滤器下口，滤膜置于载滤膜平台上；滤器上口接血样容器，滤器下口通过输液器接废液缸。
所述滤膜为疏水材料制成，其上均匀布满口径为8微米的滤孔。
本发明通过CTCBIOPSY®检测系统获得的滤膜进行染色，观察并图像采集细胞形态学鉴定的CTC及疑似CTC和异形细胞，然后通过白细胞表面共同抗原CD45及CD31的免疫细胞化学染色，区分CTC和血源性及内皮细胞，以此降低CTCBIOPSY®检测CTC的假阳性率，提高特异性，更精准检测CTC，对临床应用CTC检测评估病情及疗效具有重要临床指导意义。
本发明的有益效果是：
（1）通过该检测技术方法，可相对准确识别多种不同癌症患者外周血中循环肿瘤细胞，该技术属于微创，并能够实时动态检测。
（2）本发明提供的方法，能够更加精准的检测CTC，降低检测CTC的假阳性率，提高特异性，对临床应用CTC检测评估病情及疗效具有重要临床指导意义。
附图说明
图1为本发明的膜过滤装置结构示意图；
图2为本发明膜过滤装置的滤器的结构示意剖视图；
图3为本发明膜过滤装置的滤器滤膜的结构示意图；
图4为肝癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图（A）和外周血循环肿瘤细胞CD45和CD31染色图像（B）；
图5为肾癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图（A）和外周血循环肿瘤细胞CD45和CD31染色图像（B）；
图6为肺癌患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图（A）和外周血循环肿瘤细胞CD45和CD31染色图像（B）；
图7为循环肿瘤细胞影像图和免疫组化结合的判定标准。
图中：1铁架台、2血样容器、3滤器、4输液器、5废液缸、6滤器上口、7滤膜、8载滤膜平台、9滤器下口、10滤孔、11底座、12立架、13支架。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明阐述如下。
运用此技术方法分离获取并鉴定8例肿瘤患者（同时检测8例正常人样本做阴性对照）外周血循环肿瘤细胞的实施例。
一、利用膜过滤装置分离获取中晚期肿瘤患者外周血中的CTC
自肘正中静脉采集空腹8-12小时的空腹血5ml，用45ml稀释液(成分：1mmol/L EDTA+0.1% BSA+0.1%海藻糖+0.2%聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物组成，所述基础液为Tris-HCl缓冲剂)稀释外周血，然后加入3ml的4%多聚甲醛固定稀释后的血样10分钟；
在固定的间期，组装膜过滤装置：如附图1、图2、图3所示，该过滤装置由滤器3、滤膜7、血样容器2、废液缸5、铁架台1构成；
用10mlPBS润湿滤器3，然后将固定好的外周血样加入到膜过滤装置的血样容器2中，使其依靠重力自然过滤，CTC被截留在滤膜7上；
肿瘤细胞直径一般大于15微米，而血细胞（包括红细胞、白细胞）直径一般小于8微米，因此当含有CTC的外周血经过滤后，血细胞因直径小于滤孔10能够被滤过，而CTC因直径大于滤孔10被截留在滤膜7上。
过滤结束后，从过滤装置中取下滤器3，打开并移走滤器上口6，将将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入B液，1ml，染色2min，纯水1ml,PBS缓冲液将滤器3冲洗干净，用眼科镊子取下滤膜7，细胞面朝上，放置在载玻片上；
将滤膜干燥后在显微镜下观察,确定是否存在CTC。
通过观察，8例健康志愿者均未查到CTC；除1例肿瘤患者未检测到CTC外，其余7例均检测到CTC，且CD45和CD31表达均阴性（表1），本次检测阳性率为87.5%。
表1 实施例CTC检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
二、运用免疫细胞化学技术检测CTC上CD45和CD31表达情况
将载玻片上载有CTC的滤膜7从载玻片上取下，置于95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1混匀的脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；滴加100μl 0.1% Triton X-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；滴加100μl 0.3% H2O2，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；滴加100μl CD45和CD31（人）一抗，室温孵育2h（或4℃过夜），PBS洗2min×3次；滴加100μl山羊抗人IgG/HRP，室温（18~26℃）孵育20min，PBS洗2min×3次；滴加100μl DAB显色液，室温（18~26℃）孵育并随时在显微镜下观察显色情况（一般为3～10min，时间不能超过10min）；显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱水，晾干，中性树脂封固；光学显微镜下镜检，细胞病理学专家阅片，根据细胞膜着色程度判定CD45和CD31表达情况。然后通过白细胞表面共同抗原CD45及CD31的免疫细胞化学染色，区分CTC和血源性及内皮细胞，以此降低CTCBIOPSY®检测CTC的假阳性率，提高特异性，更精准检测CTC，对临床应用CTC检测评估病情及疗效具有重要临床指导意义。
图4-6中，A为肿瘤患者外周血分离获取的循环肿瘤细胞影像图，其细胞核异型性，核质比大于0.8，细胞致敬大于15μm，核深染且着色不均匀或者细胞和染色质边移，或异常核分裂，判定为CTC阳性；B为CD45及CD31的免疫细胞化学染色，其中，细胞膜周围出现棕黄色，判定为阳性，通过免疫组化的判定标准，排除CTC；具体判定标准如图7所示。

Claims (6)

1.一种基于细胞大小过滤识别肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述方法采用细胞免疫化学法检测疑似CTC上CD45和CD31是否表达以排除白细胞和内皮细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）采集中晚期癌症患者外周血：自肘正中静脉采集外周血5ml；
（2）外周血样预处理：将采集的外周血样加入稀释液进行10倍稀释， 稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25%；
（3）利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血CTC：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；
（4）过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液过滤完全后加入B液1ml，染色2min，纯水1ml冲洗2次，取下滤膜，放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC；
（5）运用细胞免疫化学技术检测CTC上CD45和CD31表达情况。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述稀释液是由1mmol/L EDTA+0.1% BSA+0.1%海藻糖+0.2%聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物组成，所述基础液为Tris-HCl缓冲剂。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述染色液A为DAB染色液；所述染色液B为苏木素染色液。
5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞免疫化学技术检测CTC上CD45和CD31表达情况的具体过程如下：
（1）脱色：将带有CTC的滤膜从载玻片上取下，置于脱色液中浸泡4-6小时，脱去CTC染色液；
（2）滴加100μl 0.1% Triton X-100，室温孵育15min，DI水洗2min×3次；
（3）滴加100μl 0.3% H2O2，室温孵育10min，PBS洗2min×3次；
（4）滴加100μl CD45（人）和CD31（人）一抗，室温孵育2h（或4℃过夜），PBS洗2min×3次；
（5）滴加100μl山羊抗人 IgG/HRP，室温下孵育20min，PBS洗2min×3次；
（6）滴加100μl DAB显色液，室温下孵育并随时在显微镜下观察显色情况；
（7）显色完成后，弃掉DAB显色液，流水冲洗5min，苏木素染色5min；
（8）盐酸酒精分化8秒，自来水返蓝5min；
（9）75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脱水，晾干，中性树脂封固。
（10）光学显微镜下镜检。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述脱色液为：95%酒精与100%二甲苯按容积比1:1混匀。
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