CN109200282A - 一种羊痘灭活疫苗及其生产方法 - Google Patents

一种羊痘灭活疫苗及其生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109200282A
CN109200282A CN201811404272.2A CN201811404272A CN109200282A CN 109200282 A CN109200282 A CN 109200282A CN 201811404272 A CN201811404272 A CN 201811404272A CN 109200282 A CN109200282 A CN 109200282A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vaccine
sheep
sheep pox
cell
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811404272.2A
Other languages
English (en)
Inventor
陈小云
杜吉革
王磊
王静文
张敏
薛麒
朱真
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Institute of Veterinary Drug Control
Original Assignee
China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Institute of Veterinary Drug Control filed Critical China Institute of Veterinary Drug Control
Priority to CN201811404272.2A priority Critical patent/CN109200282A/zh
Publication of CN109200282A publication Critical patent/CN109200282A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24211—Parapoxvirus, e.g. Orf virus
    • C12N2710/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及一种羊痘灭活疫苗及其制备方法。本发明采用山羊痘病毒AV41株接种BHK‑21细胞，收获培养物，经浓缩、纯化、BEI灭活后，按一定比例加入适宜佐剂混合乳化制成。用于预防山羊痘和绵羊痘。采用本发明提出的悬浮培养BHK‑21细胞生产羊痘灭活疫苗，较原绵羊睾丸细胞制备的活疫苗具有明显的优势，即解决了目前羊痘活疫苗生产过程中面临的绵羊睾丸来源困难的问题，又避免了原代细胞携带外源病毒的生物安全风险，且所制备的疫苗不存在羊痘活疫苗易引起羔羊死亡、母羊流产等安全隐患。此外，本疫苗可经颈部皮下或肌肉注射免疫，解决了羊痘活疫苗需皮内免疫，在临床使用过程中难以操作的难题。

Description

一种羊痘灭活疫苗及其生产方法
技术领域
本发明涉及一种羊痘灭活疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。
背景技术
养羊业与国民经济的发展和人民生活水平的提高关系十分密切，特别是进入21世纪后，我国养羊业得到快速发展，成果显著，养羊业在国民经济中的比重也逐年提高。根据联合国粮农组织(FAO)数据，2013年，中国大陆地区的绵羊养殖量即达1.91亿头，山羊1.83亿头，合计3.74亿头。2014年，中国大陆地区的绵羊养殖量为2.02亿头，山羊1.88亿头，合计3.90亿头。虽然我国养羊数量位居世界首位，但与养羊业发达的国家相比，疫病防控水平较薄弱，这在一定程序上制约了我国养羊业的发展。
羊痘是世界动物卫生组织(OIE)规定必须报告的传染病之一，羊痘病毒(Capripoxviruses)属于痘病毒科山羊痘病毒属。羊痘是由绵羊痘和山羊痘引起的一种接触性传染病，呈流行性。它的特征是在全身皮肤、粘膜上出现典型的痘疹，病羊发热并有较高的死亡率，其中羔羊的发病致死率可高达100％，妊娠母羊常发生流产。本病主要通过呼吸道感染，在冬末春初流行，大多数绵羊山羊生产国均有流行。非洲、亚洲大部分国家报道该病的发生。这些疫病一旦发生，病情迅猛，传播性强，死亡率高，损失极大，国际上始终都对这类烈性疫病高度重视，严加防范。我国近3年的羊痘疫情时有发生，给我国养羊业造成重大损失。
目前，我国羊群中羊痘感染的状况仍非常普遍，疫苗免疫是我国防控羊痘的主要手段。目前我国广泛应用的山羊痘活疫苗，经过长期的临床实践检验，发现还存在如下3项主要不足，一是生产种毒存在一定的残余毒力，易引起羔羊死亡、母羊流产，存在较大的安全隐患；二是需采用原代绵羊睾丸细胞制备疫苗，生产过程中面临绵羊睾丸来源困难的问题，且存在原代细胞携带外源病毒的生物安全风险；三是需皮内免疫，在临床使用过程中难以操作。
本发明提出的悬浮培养BHK-21细胞生产羊痘灭活疫苗，较原羊痘活疫苗具有明显的优势，即解决了目前羊痘活疫苗生产过程中面临的绵羊睾丸来源困难的问题，又避免了原代细胞携带外源病毒的生物安全风险，且所制备的疫苗不存在引起羔羊死亡、母羊流产等安全隐患。此外，本疫苗可经颈部皮下或肌肉注射免疫，解决了羊痘活疫苗需皮内免疫，在临床使用过程中难以操作的难题。
发明内容
本发明目的在于制备出采用BHK-21细胞悬浮培养工艺生产的羊痘灭活疫苗，用于预防山羊痘和绵羊痘。
本发明技术方案
1.一种羊痘灭活疫苗，其特征在于所述灭活疫苗含有采用悬浮培养BHK-21细胞生产的山羊痘病毒抗原。
2.本发明所述羊痘灭活疫苗，其特征在于所述羊痘抗原生产毒株为山羊痘病毒AV41株。
3.本发明所述羊痘灭活疫苗，其特征在于所述生产用BHK-21细胞采用纯悬浮培养工艺，培养过程中无需添加载体。
4.本发明所述羊痘灭活疫苗的制备方法，其特征在于用所述山羊痘病毒AV41株作为疫苗生产毒株，接种BHK-21细胞，收获培养物，经浓缩、纯化、BEI灭活后，按一定比例加入适宜佐剂混合乳化制成羊痘灭活疫苗，用于预防山羊痘和绵羊痘。
本发明具体实施方式
1.羊痘灭活疫苗的制备
(1)生产和检验用毒种生产用毒种为山羊痘病毒AV41株，检验用毒种为山羊痘病毒AV40株，均由中国兽医药品监察所制备并提供(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p150)。
(2)生产用细胞制备从液氮罐中取出BHK-21细胞，迅速置36～37℃水浴解冻，转入装有MEM培养液的无菌离心管中，以800r/min离心5min，用含2％血清的MEM培养液重悬细胞后转入细胞摇瓶，置37℃恒温振荡培养箱中，以160～200r/min振荡培养，当摇瓶细胞密度达到不低于2×106个/ml时，将摇瓶中细胞按0.5×106个/ml的密度注入到一级反应器，并采用同样方法逐级放大到二级反应器，反应器搅拌速度为60～100r/min，溶氧(DO)40％～60％，pH值7.0～7.4，温度为36～37℃，培养48～72小时。
(3)生产用毒种制备当生物反应器细胞密度达2×106个/ml以上、活率90％以上时，按2％～8％的比例接种病毒液，调整反应器搅拌速度为60～100r/min，溶氧(DO)40％～60％，pH值7.0～7.4，36～37℃培养，定时取样观察细胞病变，当细胞活率低于20％时收获培养物，注明毒种名称、批号、代次、收获日期，置-20℃以下保存，作为生产用悬浮细胞毒种。
(4)制苗用病毒液的制备当生物反应器内细胞密度达到2×106个/ml以上时，按2％～8％的比例接种AV41株悬浮细胞毒。接种后，调整反应器搅拌速度为60～100r/min，溶氧(DO)40％～60％，pH值7.0～7.4，36～37℃悬浮培养，定时取样观察，若48～72小时内悬浮细胞出现死亡、崩解、破碎，活率低于20％时停止培养，收获培养物。将收获的病毒液经1.0μm的滤芯过滤后，采用30万截留分子量(MW)超滤浓缩系统浓缩10倍(v/v)，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)将浓缩后的病毒液稀释至原体积，即为制苗用病毒液。
(5)灭活将BEA粉加入已灭菌的0.2mol/L的氢氧化钠溶液中，充分溶解，使BEA浓度为0.2mol/L，置37℃水浴中，每隔10～15min振摇一次，使BEA充分环化1小时后，终止环化，产生二乙烯亚胺(BEI)，最终浓度为0.2mol/L。向检验合格的羊痘病毒液中加入BEI溶液至终浓度为0.004mol/L，升温至30℃时开始计算灭活时间，温度保持在30±1℃，灭活28小时，其间2～4小时搅拌一次，每次10～15min。灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液，使终浓度为1％，充分搅拌均匀，置2～8℃保存备用。
(6)疫苗配制将水相(矿物油佐剂)和油相(山羊痘病毒AV41株灭活病毒液)分别预热到相同温度，再按质量比(水相:油相＝1:1)真空进料至乳化罐中，进完料后循环搅拌至水相与油相充分混合，再通过均质机乳化成双相油乳剂疫苗。乳化后取样进行检验，合格后分装。
2.羊痘灭活疫苗的检验
(1)性状
外观淡粉红色或乳白色略带粘滞性乳状液。
剂型水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。
稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15min，管底析出的水相应不超过0.5ml。
黏度按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
(2)装量检查按《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2015，以下称《中国兽药典》)附录进行检查，应符合规定。
(3)无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
(4)安全检验用3～6月龄的健康易感山羊2只，各颈部两侧肌肉注射疫苗4.0ml，每侧2.0ml，连续观察14日，应不出现由疫苗引起的局部或全身不良反应。
(5)效力检验选取健康易感山羊7只，其中5只各颈部皮下或肌肉注射疫苗2.0ml，另2只不接种作为对照。免疫后21日，所有山羊各胸腹侧皮内分两点注射山羊痘强毒AV40株病毒液1.0ml(含103.0ID50)，0.5ml/点，连续观察15日。对照山羊应全部发病，免疫山羊应至少保护4只。
本发明涉及生物材料资源信息
山羊痘病毒(Goatpox virus)AV41株为生产用毒种，山羊痘病毒为AV40株检验用毒种，均由中国兽医药品监察所制备并提供(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录(第二版)，中国农业科学技术出版社，2002年，p150)。
本发明的积极意义
本发明涉及一种羊痘灭活疫苗及其制备方法。本发明采用山羊痘病毒AV41株接种BHK-21细胞，收获培养物，经浓缩、纯化、BEI灭活后，按一定比例加入适宜佐剂混合乳化制成。用于预防山羊痘和绵羊痘。采用本发明提出的悬浮培养BHK-21细胞生产羊痘灭活疫苗，较原绵羊睾丸细胞制备的活疫苗具有明显的优势，即解决了目前羊痘活疫苗生产过程中面临的绵羊睾丸来源困难的问题，又避免了原代细胞携带外源病毒的生物安全风险，且所制备的疫苗不存在羊痘活疫苗易引起羔羊死亡、母羊流产等安全隐患。此外，本疫苗可经颈部皮下或肌肉注射免疫，解决了羊痘活疫苗需皮内免疫，在临床使用过程中难以操作的难题。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明要求保护的技术方案构成限制。
实施例1
——疫苗制备及检验
按照确定的生产工艺，制备了3批羊痘灭活疫苗，现将结果报告如下。
1.材料
(1)细胞 生产用细胞为BHK-21悬浮细胞株，该细胞株为本所保藏(参见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录，中国农业科学技术出版社，2008年，p147)。
(2)病毒 羊痘病毒AV41株和AV40株。
(3)油佐剂 Montanide ISA 201佐剂，法国SEPPIC公司生产。
(4)实验动物 3月龄健康易感内蒙古绒山羊，无传染病、皮肤病和寄生虫感染。免疫前采血测定羊痘病毒中和抗体效价，选取中和抗体效价≤1:4的羊用于试验。
(5)主要设备 CelliGen 310生物反应器购自美国NBS公司；小型0.45μm、1.0μm过滤系统购自美国PALL公司；JMCD WF100型超滤系统，为北京紫荆嘉地贸易有限公司产品；XD-101型倒置生物显微镜购自德国LEICA公司；乳化器购自上海弗鲁克科技发展有限公司。
2.抗原制备与检验
(1)细胞制备
从液氮罐中取出BHK-21细胞，迅速置36～37℃水浴解冻，转入装有无血清培养基的无菌离心管中，以800r/min离心5min，用无血清培养液重悬细胞后转入细胞摇瓶，置37℃恒温振荡培养箱中，以160～200r/min振荡培养，当摇瓶细胞密度达到不低于2×106个/ml时，将摇瓶中细胞按0.5×106个/ml的密度注入到一级反应器，并采用同样方法逐级放大到二级反应器，反应器搅拌速度为60～100r/min，溶氧(DO)40％～60％，pH值7.0～7.4，温度为36～37℃，培养72～96小时。
(2)病毒繁殖
当生物反应器细胞密度达2×106/ml以上、活率90％以上时，按2％～10％的比例接种病毒液，调整反应器搅拌速度为60～100r/min，溶氧(DO)40％～60％，pH值7.0～7.4，36～37℃培养，定时取样观察细胞病变，当细胞病变达到80％以上时收获培养物，注明毒种名称、批号、代次、收获日期，置-20℃以下保存，作为生产用悬浮细胞毒种。
当生物反应器内细胞密度达到2×106/ml以上时，按2％～8％的比例接种AV41株悬浮细胞毒。接种后，36～37℃悬浮培养，定时取样观察，若48～72小时内悬浮细胞出现死亡、崩解、破碎，活率小于20％时停止培养，收获培养物，取样进行无菌检验和病毒含量测定。收获细胞培养物，经1.0μm的滤芯过滤后，采用30万截留分子量(MW)超滤浓缩系统浓缩10倍(v/v)，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)将浓缩后的病毒液稀释至原体积，即为制苗用病毒液。
(3)抗原检验
1)无菌检验 取少量收获的病毒液，进行无菌检验，应无菌生长。
2)毒价测定 取少量收获的病毒液，用MEM营养液作10倍系列稀释，取取10-3、10-4、10-53个稀释度，加至96孔细胞培养板，每孔100μl，每个稀释度接8孔。每孔加入含10％小牛血清MEM培养液的MDBK细胞悬液100μl(该细胞株为本所保藏，参见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录，中国农业科学技术出版社，2008年，p155)，同时设正常细胞对照8孔，置37℃含5％CO2的培养箱中培养3～4日，观察细胞病变，记录细胞病变孔数，按Reed-Muench法计算TCID50。每毫升病毒含量应≥105.0TCID50。
(4)灭活
将BEA粉加入已灭菌的0.2mol/L的氢氧化钠溶液中，充分溶解，使BEA浓度为0.2mol/L，置37℃水浴中，每隔10～15min振摇一次，使BEA充分环化1小时后，终止环化，产生二乙烯亚胺(BEI)，最终浓度为0.2mol/L。向检验合格的羊痘病毒液中加入BEI溶液至终浓度为0.004mol/L，升温至30℃时开始计算灭活时间，温度保持在30±1℃，灭活28小时，其间2～4小时搅拌一次，每次10～15min。灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液，使终浓度为1％，充分搅拌均匀，置2～8℃保存备用。
(5)半成品检验
将制备的3批半成品抗原液，分别检测进行灭活前病毒含量检验、无菌检验、灭活检验，结果表明，3批次制备的半成品病毒滴度均大于在105.0TCID50，无菌检验均合格(表1)。
表1羊痘病毒抗原制备及检验结果
(6)疫苗配制
将水相(矿物油佐剂)和油相(山羊痘病毒AV41株灭活病毒液)分别预热到相同温度，再按质量比(水相:油相＝1:1)真空进料至乳化罐中，进完料后循环搅拌至水相与油相充分混合，再通过均质机乳化成双相油乳剂疫苗。乳化后取样进行检验，合格后分装。
(7)成品检验
3批经BEI完全灭活后的抗原制备成疫苗后，经性状检验呈乳白色略带粘滞性乳状液，剂型为水包油包水型，稳定性和粘度均符合规定；，装量检查均符合规定；无菌检验结果表明，3批疫苗均无菌生长，产品符合标准(表2、表3)。
表2 3批羊痘灭活疫苗(AV41株，悬浮培养)实验室制品性状检验结果
表3 3批羊痘灭活疫苗(AV41株，悬浮培养)实验室制品装量检查和无菌检验结果
将实验室试制的3批疫苗进行安全性和效力检验，其中安检山羊为3月龄的健康易感山羊。用羊进行的效力检验，采用1岁龄健康易感山羊。结果显示，3批疫苗均安全。用羊进行效力检验对照羊2/2发病，免疫羊均5/5保护，表明疫苗符合成品效力检验标准。
表4 3批羊痘灭活疫苗(AV41株，悬浮培养)实验室制品安全检验和效力检验结果
实施例2
——与同类制品比较研究报告
为了比较羊痘灭活疫苗(AV41株，悬浮培养)与同类制品在安全性、效力及免疫产生期等方面差异，取试制的3批羊痘灭活疫苗(AV41株，悬浮培养)制品和国产同类制品，比较两种疫苗接种的安全性和效力(免疫后21日攻毒保护率)。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验疫苗 3批山羊痘灭活疫苗：批号为201601、201602和201603(各30瓶)，由本实验室制备。
1.1.2对照疫苗 山羊痘活疫苗，批号为1605001，由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂生产。
1.1.3羊痘病毒攻毒用强毒株 AV40株，F3代，1.0g/支，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。
1.1.4实验动物 试验用山羊，12月龄左右健康易感山羊，品种为内蒙古绒山羊，均购自甘肃省景泰县山羊养殖户，均无传染病、皮肤病和寄生虫感染。未免疫过羊痘疫苗，免疫前采血测定羊痘病毒中和抗体效价，选取中和抗体效价≤1:4的羊用于试验。
1.2方法
1.2.1安全检验 将实验室试制的3批山羊痘灭活疫苗(批号为201601、201602和201603)分别以2.0ml/侧×2侧/只，皮下接种1岁龄山羊，同时取中牧实业股份有限公司兰州生物药厂的同类制品(山羊痘活疫苗1605001)按2头份/只，尾根皮内接种1岁龄山羊，观察10日，是否出现局部和全身反应。试验分组见表5。
表5实验室3批制品和国内同类制品的安全检验分组(山羊)
注：“—”表示未注射。
1.2.2免疫产生期试验
将实验室试制的3批山羊痘灭活疫苗(批号为201601、201602和201603)分别以2.0ml/只，颈部皮下接种1岁龄山羊，同时取中牧实业股份有限公司兰州生物药厂生产的同类制品按1头份/只，尾根内侧皮内接种1岁龄山羊，接种后14日和21日攻毒，试验分组见表6。
表6实验室3批制品和国产同类制品的免疫产生期试验分组
1.2.3本动物攻毒保护试验
分别以2.0ml/只的剂量，经颈部肌肉接种1岁龄山羊，同时取中牧实业股份有限公司兰州生物药厂生产的同类制品(山羊痘活疫苗)按1头份/只(1.0ml)的剂量，经尾根内侧皮内注射接种1岁龄山羊，进行两种制品安全性和效力比较。
免疫21日后，免疫羊与对照羊同时以山羊痘强毒AV40株，进行皮内注射，0.5ml/点×2点/只(含1000个最小发痘量)，临床观察15日。
表7攻毒试验操作方法
2.结果
2.1安全检验
3批实验室制品和中牧实业股份有限公司兰州生物药厂生产的同类制品对试验山羊注射当日均有压痛，次日后消失，无其它局部和全身反应，见表4。
表8实验室制品和同类制品注射山羊7日内局部反应以及体温、心跳数和呼吸数测定结果
注：“/”表示未注射疫苗，“—”表示正常。
2.2免疫产生期试验，见表9。
表9 3批实验室制品和国产同类制品的免疫产生期测定结果
从表5可以看出，接种3批制品和中牧实业股份有限公司兰州生物药厂生产的同类制品后第14日，所有山羊攻毒保护达到4/5以上，第21日攻毒保护达到5/5；攻毒对照组山羊2/2发病。
3.结论
实验室3批制品安全性、效力及免疫产生期与商品化的同类制品(山羊痘活疫苗)基本一致。

Claims (4)

1.一种羊痘灭活疫苗，其特征在于所述灭活疫苗含有采用悬浮培养BHK-21细胞生产的山羊痘病毒抗原。
2.如权利要求1所述羊痘灭活疫苗，其特征在于所述羊痘病毒抗原生产毒株为山羊痘病毒CVCC AV41株。
3.如权利要求1所述羊痘灭活疫苗，其特征在于所述生产用BHK-21细胞采用纯悬浮培养工艺，培养过程中无需添加载体。
4.如权利要求1所述羊痘灭活疫苗的制备方法，其特征在于用所述山羊痘病毒CVCCAV41株作为疫苗生产毒株，接种BHK-21细胞，收获培养物，经浓缩、纯化、BEI灭活后，按一定比例加入适宜佐剂混合乳化制成羊痘灭活疫苗用于山羊和绵羊。
CN201811404272.2A 2018-11-23 2018-11-23 一种羊痘灭活疫苗及其生产方法 Pending CN109200282A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811404272.2A CN109200282A (zh) 2018-11-23 2018-11-23 一种羊痘灭活疫苗及其生产方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811404272.2A CN109200282A (zh) 2018-11-23 2018-11-23 一种羊痘灭活疫苗及其生产方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109200282A true CN109200282A (zh) 2019-01-15

Family

ID=64994064

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811404272.2A Pending CN109200282A (zh) 2018-11-23 2018-11-23 一种羊痘灭活疫苗及其生产方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109200282A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014167582A2 (en) * 2013-03-31 2014-10-16 Ella Foundation Vaccine composition for prophylaxis in ruminants
CN104958760A (zh) * 2015-03-27 2015-10-07 中牧实业股份有限公司 一种山羊痘灭活疫苗及其制备方法
WO2016030912A1 (en) * 2014-08-29 2016-03-03 Biovet Private Limited A bluetongue vaccine and methods of manufacture thereof
CN106222131A (zh) * 2016-08-16 2016-12-14 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系及其在羊痘病毒分离培养和增殖中的用途
CN106282129A (zh) * 2016-08-12 2017-01-04 金宇保灵生物药品有限公司 用bhk21‑c13传代细胞制备耐热型山羊痘弱毒活疫苗的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014167582A2 (en) * 2013-03-31 2014-10-16 Ella Foundation Vaccine composition for prophylaxis in ruminants
WO2016030912A1 (en) * 2014-08-29 2016-03-03 Biovet Private Limited A bluetongue vaccine and methods of manufacture thereof
CN104958760A (zh) * 2015-03-27 2015-10-07 中牧实业股份有限公司 一种山羊痘灭活疫苗及其制备方法
CN106282129A (zh) * 2016-08-12 2017-01-04 金宇保灵生物药品有限公司 用bhk21‑c13传代细胞制备耐热型山羊痘弱毒活疫苗的方法
CN106222131A (zh) * 2016-08-16 2016-12-14 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种羔羊睾丸支持细胞自然传代细胞系及其在羊痘病毒分离培养和增殖中的用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102908615B (zh) 副猪嗜血杆菌病三价灭活疫苗及制备方法
CN104530232A (zh) 鸭病毒性肝炎精制蛋黄抗体的制备方法
CN104958760A (zh) 一种山羊痘灭活疫苗及其制备方法
CN107137704A (zh) 一种鸭2型腺病毒灭活疫苗
CN105031638A (zh) 一种鸡新城疫、禽流感和传染性法氏囊三联灭活疫苗
CN109679927A (zh) 猪塞内加谷病毒、猪塞内加谷病毒灭活疫苗的制备方法、猪塞内加谷病毒灭活疫苗和应用
CN105535958B (zh) 一种鸡新城疫病毒、传染性支气管炎、禽腺病毒三联灭活疫苗
CN108452298A (zh) 一种用spf鸡胚细胞生产黄热病减毒活疫苗的工艺
CN102727883B (zh) 猪繁殖与呼吸综合征与猪瘟二联疫苗及其用途
CN111808826B (zh) 猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株及其应用
CN106492210A (zh) 山羊传染性胸膜肺炎灭活疫苗及其生产方法
CN109453371A (zh) 一种羊痘、山羊传染性胸膜肺炎二联灭活疫苗及其生产方法
CN106310247B (zh) 小鹅瘟灭活疫苗的制备方法及其制备的灭活疫苗
CN105148262B (zh) 一种副猪嗜血杆菌五价灭活疫苗的制备方法
CN114904006B (zh) 一种口蹄疫抗原热稳定性保护剂及其制备方法和应用
CN104388396B (zh) 猪伪狂犬病毒毒株及由其制备的灭活疫苗和应用
CN109200282A (zh) 一种羊痘灭活疫苗及其生产方法
CN113957007B (zh) 一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗
CN103789272B (zh) H9亚型禽流感病毒分离株以及由其制得的疫苗组合物
RU2549434C2 (ru) Способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки
CN104474542A (zh) 一种二联灭活疫苗制备方法
CN102139104A (zh) 鸡新城疫、禽流感(h9亚型)、传染性法氏囊病三联灭活疫苗的生产方法
CN105582535A (zh) 猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法及其制品
CN108743932A (zh) 一种预防鸭呼肠孤病毒的灭活疫苗制备方法
CN107137705B (zh) 猪伪狂犬gE基因缺失病毒灭活疫苗的生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190115

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication