CN114904006B - 一种口蹄疫抗原热稳定性保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种口蹄疫抗原热稳定性保护剂及其制备方法和应用。所述的口蹄疫抗原热稳定性保护剂，是由以下按照重量百分数计的各组分组成：氯化钠0.05％～0.15％、氯化镁0.12％～0.13％、磷酸二氢钠0.5％～0.55％、葡萄糖0.05％～0.15％、精氨酸0.01％～0.015％、氯化钙0.15％～0.20％，余量为注射用水，pH值为8.0。研究表明，本发明的口蹄疫抗原热稳定性保护剂，具有能够延长疫苗在较高温度环境下的保存时间、在FMD灭活疫苗运输、储存、免疫等极端环境下避免有效抗原含量降解的优点，解决了口蹄疫抗原或疫苗在保存过程中有效抗原含量降低的技术难题，延长了在机体内有效抗原的释缓时间，提升了疫苗的免疫效果，更大限度的维持了抗体水平，从而提高了产品的保护期限，有利于工业化大规模生产的使用。

Description

一种口蹄疫抗原热稳定性保护剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种热稳定性保护剂及其制备方法和应用，特别涉及一种用于口蹄疫灭活病毒和疫苗的热稳定性保护剂及其制备方法和应用，本发明属于兽医学技术领域。
背景技术
口蹄疫(foot-and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and mouthdisease virus，FMDV)引起的一种重要经济动物疫病，主要感染偶蹄动物如牛、山羊、绵羊和猪。FMDV包含7个血清型，分别为A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3，属于一类动物传染病，特点是传播速度快、低死亡率和高感染率，给动物产品、经济和国际贸易造成严重的损害，被称为“政治经济病”。世界动物卫生组织总结百年防控经验，倡导免疫仍然是防控口蹄疫的关键技术手段。
我国是猪、牛、羊的养殖大国，每年饲养量达18亿头以上，每年疫苗耗资40多亿元。但由于我国的规模化生产技术起步较晚，关键装备严重依赖进口，关键技术受到垄断，致使高效疫苗的产品质量受到严重影响。
经过同行几十年的不懈努力，目前我国口蹄疫疫苗生产关键技术已赶超国际水平，比如首创了基因改造的疫苗种毒、设计制造了适应于动物细胞规模化培养的全自动装备、创建了病毒规模化全悬浮培养和抗原浓缩纯化生产工艺，解决了有效抗原产能低、纯度低等影响疫苗质量的技术难题，打破了国外技术壁垒和垄断。然而，口蹄疫灭活疫苗中的有效成分完整病毒粒子(146S)是重要的免疫抗原，它的含量、完整性、稳定性决定了疫苗的免疫效果。口蹄疫病毒是无囊膜病毒，对温度、酸碱度等物理、化学物质比较敏感，如果保存不当、pH值变化或温度升高的状态下，完整病毒146S容易裂解，完整的口蹄疫病毒粒子一旦裂解，疫苗的免疫效果将大幅度降低。因此，FMDV灭活病毒液和疫苗的的稳定保存在规模化疫苗生产、运输、储存等过程中面临着极大挑战。因此抗原或疫苗在保存过程中的不稳定性会直接影响疫苗免疫效力，不但增加疫苗的成本，而且严重影响我国口蹄疫的防疫计划。
因此，针对上述问题，本发明发明人进行了口蹄疫灭活病毒抗原的热稳定性研究，获得了一种成本低且易产业化生产的新型FMDV抗原热稳定性保护剂，为提高猪牛等家畜口蹄疫疾病的防控水平和效率提供了新的技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对FMD病毒抗原具有良好稳定性的保护剂，该保护剂可作为一种口蹄疫灭活病毒抗原重悬介质，同时在37℃条件下具有明显延缓146S降解的作用。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明的一种口蹄疫抗原热稳定性保护剂，其由以下按照重量百分数计的各组分组成：氯化钠0.05％～0.15％、氯化镁0.12％～0.13％、磷酸二氢钠0.5％～0.55％、葡萄糖0.05％～0.15％、精氨酸0.01％～0.015％、氯化钙0.15％～0.20％，余量为注射用水，pH值为8.0。
其中，优选的，所述的口蹄疫抗原热稳定性保护剂由以下按照重量百分数计的各组分组成：氯化钠0.1％、氯化镁0.12％、磷酸二氢钠0.53％、葡萄糖0.1％、精氨酸0.012％、氯化钙0.18％，余量为注射用水，pH值为8.0。
其中，优选的，所述的口蹄疫抗原热稳定性保护剂由以下按照重量百分数计的各组分组成：氯化钠0.15％、氯化镁0.125％、磷酸二氢钠0.5％、葡萄糖0.13％、精氨酸0.01％、氯化钙0.15％，余量为注射用水，pH值为8.0。
进一步的，本发明还提出了所述的口蹄疫抗原热稳定性保护剂在制备口蹄疫疫苗中的用途。
其中，优选的，所述的口蹄疫疫苗为口蹄疫灭活疫苗。
更进一步的，本发明还提出了一种口蹄疫灭活疫苗，所述的疫苗中含有本发明所述的口蹄疫抗原热稳定性保护剂。
其中，优选的，所述的灭活疫苗通过以下方法制备得到：
向FMDV灭活抗原中添加终浓度为7.0％w/w的PEG-6000，置4℃，在磁力搅拌器过夜搅拌，离心机4000rpm在4℃下离心1h，离心结束，弃上清，用1/2-1/3本发明所述的口蹄疫抗原热稳定性保护剂重悬沉淀，浓缩纯化后，充分混匀，得到抗原液；将高压灭菌的206佐剂和抗原液置32℃的水浴锅中，待达到设定温度后，先加206佐剂于无菌烧杯中，按质量比1:1加入抗原液混合，350rpm搅拌5min，充分混匀，乳化成双相型(W/O/W)油乳剂疫苗，即得。
相较于现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明获得的口蹄疫抗原热稳定性保护剂，溶解性良好、易于配制和操作简便；
2、本发明获得的口蹄疫抗原热稳定性保护剂，既可以作为一种重悬FMDV抗原的介质，又具有能提高FMDV抗原的热稳定性的作用；
3、使用本发明的口蹄疫抗原热稳定性保护剂保存FMDV抗原样，在4℃条件下保存63天基本不降解，在37℃条件下，保存21天，降解率为零，在30天以内146S含量都维持较高的水平；
4、使用本发明的口蹄疫抗原热稳定性保护剂保存疫苗样，在4℃条件下，保存98天基本不降解，在37℃条件下，保存21天，降解率为零，30天以内146S含量都维持一个较高的水平；
5、使用本发明的口蹄疫抗原热稳定性保护剂配制疫苗接种实验动物猪，通过液相阻断ELISA抗体检测试剂盒检测抗体水平。结果表明，抗体效价随免疫天数增加而升高，接种120天后抗体效价还维持一个较高水平。同时，未发现机体出现不良反应。
6、本发明填补了口蹄疫灭活病毒保护剂作为一种重悬介质具有抑制146S降解作用的空白，为口蹄疫灭活病毒热稳定性提供了一种新方法，避免FMD灭活疫苗在运输、储存过程中有效含量降解的优点，解决了动物免疫后有效抗原含量降低等技术难题，为保证FMD灭活疫苗质量提供了技术支撑。
附图说明
图1为AS17001-PBS抗原样在37℃下液相峰型比较结果图；
图2为AS17001-保护剂抗原样在37℃下液相峰型比较结果图；
图3为AS17001-PBS抗原样和AS17001-保护剂抗原样在4℃和37℃下保存7天146S含量变化趋势图；
图4为AS17001-保护剂抗原样在37℃下保存146S含量变化趋势图；
图5为AS17001-保护剂疫苗样在4℃和37℃下保存146S含量变化趋势图；
图6为FMD O型灭活疫苗与PBS处理抗原抗体效价结果比较图；
图7为AS17002-PBS抗原样和AS17002-保护剂抗原样在4℃和37℃下保存7天146S含量变化趋势图；
图8为AS17002-保护剂抗原样在37℃下保存146S含量变化趋势图；
图9为AS17002-保护剂疫苗样在4℃和37℃下保存146S含量变化趋势图；
图10为FMDA型双价灭活疫苗与PBS处理抗原抗体效价结果比较图；
图11为口蹄疫灭活疫苗生产工艺流程图；
图12为5批中试疫苗在4℃和37℃条件下146S含量随时间的变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1口蹄疫抗原热稳定性保护剂的配方筛选
1保护剂配方的筛选
1.1试验方法
保护剂配方的筛选关键在于选择对FMDV病毒抗原结构无影响、具有热稳定性保护作用及接种动物后无明显不适或副反应。本发明采用正交设计试验筛选保护剂配方：
15-25℃条件下，试验通过筛选易溶解、对FMDV抗原结构无破坏性和无毒性、并具有热稳定性作用的化学试剂。采用正交试验设计L18(37)，以溶液pH值、氯化钠、氯化镁、磷酸氢二钠、葡萄糖、精氨酸和氯化钙组分浓度为考察因素，以FMDV抗原在37℃条件下146S降解为零时保存的天数为评价指标，因子水平见表1。用HPSEC方法检测146S含量，上样分析条件：流动相，50mM磷酸盐+50mM氯化钠(pH值7.10)；流速，0.3mL/min；上样体积，10μL，运行时间，40min。
表1保护剂配方筛选因子水平表
1.2结果
1.2.1正交试验设计保护剂配方确定
通过正交设计试验L18(37)，以溶液pH值、氯化钠、氯化镁、磷酸氢二钠、葡萄糖和精氨酸和氯化钙组分浓度为考察因素，以FMDV抗原在37℃条件下146S降解为零时保存的天数为评价指标，分析结果见表2。
表2保护剂配方筛选正交试验分析结果
通过以上实验结果，A1B2C3D3E2F3为最优组合，F组分对总离子浓度影响较小，差异不显著，故而舍弃，6种组分浓度如下：
配制方法为：以上6种组分按任何顺序加入烧杯中，加注射用水使其充分溶解，定容至1000mL，用5mol/L氢氧化钠调节混合液的pH值至8.0。
实施例2口蹄疫抗原热稳定性保护剂对FMDV O型病毒抗原和疫苗热稳定性检测
1口蹄疫抗原热稳定性保护剂的配制
按实施例1筛选的配方，称取试剂，浓度如下：
将以上6种组分按任何顺序加入烧杯中，加注射用水使其充分溶解，定容至1000mL，用5mol/L氢氧化钠调节混合液的pH值至8.0。
2BHK-21细胞制备
复苏细胞1支，静置培养于T100细胞方瓶，传2～3代，待细胞生长到致密单层，用胰蛋白酶消化，补加适量细胞培养液移至1000mL三角瓶，37℃恒温箱悬浮培养2～3代，细胞密度达2.5×106个/mL以上，活率达92.0％以上，转移至5L生物反应器培养，设定培养参数：温度：36.5℃，pH值：7.15，搅拌转速：85rpm/min，DO值：55.0％，以上参数自动控制，每24小时取样观察一次。当细胞密度大于2.5×106个/mL，活率大于92.0％时停止培养，降温至4～8℃保存备用。
3FMDV O型毒种的制备：
排出5L生物反应器上清液，加入病毒维持液，按5.0％病毒含量接种FMDV O型毒种。病毒培养参数：温度：37.0℃，pH值：7.4，搅拌转速：65rpm/min，DO值：65.0％，进行自动控制，待溶氧变化率为零，细胞病变率大于90.0％时，收获病毒液。
4FMDV抗原的制备：
分别向收获的病毒液加入灭活剂BEI，使终浓度为0.002mol/L，30℃连续灭活28小时，灭活期间，每4小时搅拌1次，每次30分钟，灭活结束后，迅速加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为2％，充分混合，命名为AS17001，迅速降温置4～8℃保存。
向1000mL的FMDV抗原添加终浓度为7.0％的PEG-6000，置4℃，在磁力搅拌器过夜搅拌，离心机4000rpm/min在4℃下离心1h，离心结束，弃上清，分别用500mL口蹄疫抗原热稳定性保护剂和500mLPBS(pH值9.0)重悬沉淀，对抗原进行2倍的浓缩纯化，充分混匀，得到两种抗原液，分别命名为AS17001-保护剂和AS17001-PBS，置4～8℃保存。
5FMDV疫苗制备
将高压灭菌的206佐剂和抗原液AS17001-保护剂和AS17001-PBS置32℃的水浴锅中，待达到设定温度后，先加206佐剂于无菌烧杯中，按质量比1:1加入抗原液混合，用高剪切匀浆机搅拌5min，充分混匀，乳化成双相型(W/O/W)油乳剂疫苗。
6FMDV抗原、疫苗热稳定性检测
将FMDV抗原、疫苗分别置于4℃冷藏柜和37℃恒温箱中，分别在0h、24h、48h、72h、96h、120h、144和168h取样，通过HPSEC方法检测146S含量，连续监测7天，进一步检测，直到在37℃条件下146S降解为零。疫苗用破乳剂破乳后取水相，所有样品分析之前用0.22μm针头过滤器过滤，液湘上样分析条件：流动相：50mM磷酸盐+50mM氯化钠(pH值7.10)；流速：0.3mL/min；上样体积：10μl；仪器设备：WatersACQUITYUPLC H-CLASS超高效液相色谱仪。
7FMDV抗原、疫苗热稳定性检测结果
AS17001-PBS疫苗样品在37℃条件下放置7天，连续检测结果表明，146S含量在24h内已经全部降解，见图1和图3；而AS17001-保护剂疫苗样品在37℃条件下放置7天，连续检测结果表明，146S含量基本维持稳定，未发生明显的降解，见图2和图3。继续对在37℃条件下的AS17001-保护剂疫苗样品进行监测观察，结果表明，在30天以内146S含量都维持较高的水平，降解率为1.11％，之后缓慢降解，第63天彻底降解，见图4和表3。
表3 AS17001-保护剂抗原样和AS17001-PBS抗原样在不同温度下对146S含量影响结果
AS17001-保护剂疫苗样品分别置4℃和37℃条件下，在4℃条件下，保存98天基本不降解，在37℃条件下，保存21天，降解率为零，30天以后开始降解，保存98天彻底降解完，见图5。
8抗体检测结果
分别用保护剂和常规PBS配制口蹄疫O型灭活疫苗并接种实验动物猪，口蹄疫O型ELISA抗体检测试剂盒检测抗体，结果表明抗体水平随接种后天数增加而增加，接种后120天还维持较高水平，同时，机体未出现明显的副反应。与常规生产疫苗比较，对机体产生更高效和持久的免疫应答，能更有效抵抗FMDV的感染，见图6。
实施例3口蹄疫抗原热稳定性保护剂对FMDVA型病毒抗原和疫苗热稳定性检测
1口蹄疫抗原热稳定性保护剂的配制
按实施例1筛选的配方，称取试剂，浓度如下：
将以上6种组分按任何顺序加入烧杯中，加注射用水使其充分溶解，定容至1000mL，用5mol/L氢氧化钠调节混合液的pH值至8.0。
2BHK-21细胞制备
复苏细胞1支，静置培养于T100细胞方瓶，传2～3代，待细胞生长到致密单层，用胰蛋白酶消化，补加适量细胞培养液移至1000mL三角瓶，37℃恒温箱悬浮培养2～3代，细胞密度达2.5×106个/mL以上，活率达92.0％以上，转移至5L生物反应器培养，设定培养参数：温度：36.5℃，pH值：7.15，搅拌转速：85r/min，DO：55.0％，以上参数自动控制，每24小时取样观察一次。当细胞密度大于2.5×106个/mL，活率大于92.0％时停止培养，降温至4～8℃保存备用。
3FMDVA型毒种的制备
排出5L生物反应器上清液，加入病毒维持液，按5.0％病毒含量接种FMDVA型毒种。病毒培养参数：温度：37.0℃，pH值：7.35，搅拌转速：65r/min，DO值：65.0％，进行自动控制，待溶氧变化率为零，细胞病变率大于90.0％时，收获病毒液。
4、FMDV抗原的制备
分别向收获的病毒液加入灭活剂BEI，使终浓度为0.002mol/L，30℃连续灭活28小时，灭活期间，每4小时搅拌1次，每次30分钟，灭活结束后，迅速加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为2％，充分混合，命名为AS17002，迅速降温置4～8℃保存。
向800mLFMDV抗原添加终浓度为7.0％PEG-6000，置4℃，在磁力搅拌器过夜搅拌，离心机5000rpm在4℃下离心1h，离心结束，弃上清，分别用400mL保护剂和400mLPBS(pH值9.0)重悬沉淀，使抗原进行2倍浓缩纯化，充分混匀，得到两种抗原液，分别命名为AS17002-保护剂和AS17002-PBS，置4～8℃保存。
5FMDV疫苗制备
将高压灭菌的206佐剂和抗原液AS17002-保护剂和AS17002-PBS置32℃的水浴锅中，待达到设定温度后，先加206佐剂于无菌烧杯中，按质量比1:1加入抗原液混合，350rpm搅拌5min，充分混匀，乳化成双相型(W/O/W)油乳剂疫苗。
6FMDV抗原、疫苗热稳定性检测
将FMDV抗原、疫苗分别置于4℃冷藏柜和37℃恒温箱中，分别在0h、24h、48h、72h、96h、120h、144和168h取样，通过HPSEC方法检测146S含量，连续监测7天，直到在37℃条件下146S降解为零。疫苗用破乳剂破乳后取水相，所有样品分析之前用0.22μm针头过滤器过滤，液湘上样分析条件：流动相：50m M磷酸盐+50m M氯化钠(pH值7.10)；流速：0.3mL/min；上样体积：10μL；仪器设备：WatersACQUITYUPLC H-CLASS超高效液相色谱仪。
7FMDV抗原、疫苗热稳定性检测结果
AS17002-保护剂样在37℃条件下放置7天，连续检测结果表明，146S含量基本维持稳定，未发生明显的降解，见图7。继续对在37℃条件下进行监测观察，结果表明，在30天以内146S含量都维持较高的水平，降解率为零，之后缓慢降解，第84天彻底降解，见图8和表4。
表4 AS17002-保护剂抗原样和AS17002-PBS抗原样在不同温度下对146S含量影响结果
AS17002-保护剂疫苗样在4℃和37℃下保存，在4℃条件下，保存176天，基本不降解，在37℃条件下，保存50天146S基本不降解，之后开始降解，176天降解为零，见图9。
8抗体检测结果
分别用保护剂和常规PBS配制口蹄疫A型灭活疫苗并接种实验动物猪，用口蹄疫A型ELISA抗体检测试剂盒检测抗体，抗体水平随接种后天数增加而增加，接种后120天还维持较高水平，同时，机体未出现明显的副反应。与常规生产疫苗比较，对机体产生更高效和持久的免疫应答，能更有效抵抗FMDV的感染，见图10。
实施例4口蹄疫抗原热稳定性保护剂的规模化应用
中农威特生物科技股份有限公司根据《口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株)制造及检验试行规程》，生产二价疫苗(口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株))5批，具体如下：
分别在14L、100L、500L和3000L生物反应器连续四级扩大悬浮培养BHK-21细胞，待细胞密度大于2.5×106个/mL，活率大于92.0％。在3000L生物反应器中分别接种Re-O/MYA98/JSCZ/2013株(BF13SF1)和Re-A/WH/09株(BF13SF1)悬浮培养细胞毒，各生产5批病毒液，每批约160万mL，灭活后的病毒抗原添加终浓度为7.0％w/w的PEG-6000，置4℃，搅拌过夜，离心机4000rpm在4℃下离心1h，离心结束，弃上清，用1/2-1/3保护剂重悬沉淀，浓缩纯化后，充分混匀，得到抗原液；将高压灭菌的206佐剂和抗原液按质量比1:1加入抗原液混合，按照要求进行乳化(搅拌温度32℃，转速120rpm用高剪切匀浆机搅拌)，乳化成双相型(W/O/W)油乳剂疫苗，即得。
连续生产5批疫苗，按拟定的质量标准进行成品检验，均符合质量标准。并进行稳定性监测，监测期内146S稳定性良好。
1材料和设备
1.1BHK-21细胞取自中农威特生物科技股份有限公司建立的悬浮培养BHK-21细胞工作细胞库，批号为BHK-21/W/S-201201，经放大培养检验合格后，用于病毒的增殖。
1.2毒种
1.2.1Re-O/MYA98/JSCZ/2013株毒种种子批，批号为FMD/Re-O/MYA98/JSCZ/2013-201501/15005；Re-A/WH/09株毒种种子批，批号为FMD/Re-A/WH/09-201501/15006。
1.2.2制苗用毒种为750L生物反应器悬浮培养细胞毒，Re-O/MYA98/JSCZ/2013株批号为Re-O/MYA98/JSCZ/2013-BF13SF1-ZS2016001；Re-A/WH/09株批号为Re-A/WH/09-BF13SF1-ZS2016001。
1.3培养基低血清培养基MD611，购自清大天一；自主研发MEmL611-030，委托宜兴赛尔公司加工；MEM，购自Hyclone公司。
1.4新生牛血清购自合格供应商，按照中农威特生物科技股份有限公司新生牛血清内控质量标准检验合格后使用。
1.5胰蛋白酶购自美国生命技术(Lifetech)公司，检验合格后，用细胞分散液配制成0.25％胰蛋白酶溶液，过滤除菌后备用。
1.6检验用培养基硫乙醇酸盐培养基(T·G)、酪胨琼脂培养基(G·A)、葡萄糖蛋白胨培养基(G·P)购自中海动物保健科技公司，经检验合格后使用。
1.7BEA(二溴乙胺氢溴酸盐，M.W.204.90)，购自美国Sigma-Aldrich公司。
1.8蛋白油佐剂Montanide ISA 206VG油佐剂，购自法国SEPPIC公司，按照中农威特生物科技股份有限公司206佐剂内控质量标准检验合格后使用。
1.9试剂PEG-6000(Fluka或德国进口分装)，NaHCO3(国产分析纯)。
1.10口蹄疫抗原热稳定性保护剂的配制
按实施例1筛选的配方，称取试剂，浓度如下：
将以上6种组分按任何顺序加入烧杯中，加注射用水使其充分溶解，定容至1000mL，用5mol/L氢氧化钠调节混合液的pH值至8.0。
2方法
2.1口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株)生产工艺流程示意图，见图11。
2.2病毒液的制备
2.2.1Re-O/MYA98/JSCZ/2013株病毒液的制备
排出3000L生物反应器上清液，加入病毒维持液，按MOI值1:10毒种含量进行接种，毒种批号：Re-O/MYA98/JSCZ/2013-BF13SF1-ZS2016001，毒价107.50LD50/0.2mL。病毒培养参数为，温度：37.0℃，pH值：7.5，搅拌转速：60r/min，DO值：65.0％，进行自动控制。待溶氧变化率为零，细胞病变率达95.0％以上时，收获病毒液，进行病毒含量测定和无菌检验，连续生产5批。
2.2.2Re-A/WH/09株病毒液的制备
选取毒种批号为Re-A/WH/09-BF13SF1-ZS2016001，毒价107.33LD50/0.2mL的悬浮培养细胞毒，按MOI值1:100毒种含量进行接种，采用2.3.1项方法制备疫苗用病毒液，连续生产5批，取样进行病毒含量测定和无菌检验。
2.3病毒液检验
2.3.1LD50测定将2个毒株病毒液分别用pH值7.6～7.8的MEM溶液作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8和10-94个稀释度，各接种2～3日龄乳鼠4只，每只颈背部皮下注射0.2mL病毒液，同时设健康对照乳鼠4只(每窝2只)，每只颈背部皮下注射0.2mL MEM溶液，逐日观察7日，记录乳鼠的发病死亡情况，按照Reed-muench法计算LD50。
2.3.2无菌检验按《中国兽药典》(三部)(2010年版)附录进行检验。
2.4灭活病毒抗原的制备
2.4.1BEI制备无菌条件下称取BEA 20.49g，加0.2mol/L无菌NaOH溶液至1000mL，充分溶解，37℃水浴1小时，每15分钟振摇一次。此时BEA环化为BEI，其浓度为0.1mol/L。
2.4.2病毒液灭活将除菌过滤的BEI溶液加入纯化后的病毒液中(BEA终浓度为0.003mol/L)，充分搅匀后倒罐，待温度升至26℃时开始计时，灭活24小时，期间每隔200分钟搅拌一次。计时结束后，再次将BEI溶液加入病毒液中(BEA终浓度为0.0015mol/L)，充分搅匀，待温度升至26℃时开始计时，灭活24小时，期间每隔200分钟搅拌一次。灭活结束后，迅速加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为2％，充分混合，取样进行安全性检验和无菌检验，迅速降温至2～8℃保存。
2.5灭活病毒抗原的纯化将2个毒株的灭活病毒抗原分别进行切向流超滤，再经终浓度为7％PEG-6000(W/V)处理后，加口蹄疫抗原热稳定性保护剂重悬沉淀，进行2倍浓缩纯化，充分混匀，得到两种灭活病毒抗原液，取样进行146S含量、总蛋白含量和内毒素含量测定。
2.6灭活病毒抗原检验
2.6.1安全性检验分别取2个毒株灭活后的抗原液于颈背部皮下接种2～3日龄乳鼠8只，每只0.2mL，设空白对照乳鼠2只，连续观察7日。
2.6.2无菌检验按《中国兽药典》(三部)(2010年版)附录进行检验。
2.7灭活病毒抗原纯化后检验
2.7.1146S含量测定按附注2方法测定灭活病毒抗原146S含量。
2.7.2内毒素检测按《农业部公告第2078号》方法进行内毒素测定。
2.7.3总蛋白含量按《农业部公告第2078号》方法进行总蛋白含量测定。
2.8中试疫苗的配制与乳化
2.8.1水相用口蹄疫抗原热稳定性保护剂分别将Re-O/MYA98/JSCZ/2013株和Re-A/WH/09株抗原配成每毫升146S含量均不少于2.0μg，等量混合，配制疫苗前混合抗原批号分别命名为B1、B2、B3、B4、B5。
2.8.2油相Montanide ISA206 VG。
2.8.3水相与油相配比水相与油相＝46︰54(V/V)的比例配比。
2.8.4乳化在无菌条件下，在2000L乳化罐高压蒸汽灭菌疫苗佐剂，分别将水相与高压灭菌的206佐剂进行水浴加热并升温至31.0℃±1.0℃，350rpm搅拌混合抗原(水相)按规定比例缓慢加入乳化罐中，搅拌乳化约20min，使抗原与佐剂充分混合，乳化成双相型(W/O/W)油乳剂疫苗，制备5批口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株)，按质量标准进行成品检测。
2.9产品检验
2.9.1物理性状
2.9.1.1外观肉眼观察乳剂颜色和状态。
2.9.1.2剂型将试制的每批疫苗，缓慢滴入静止的冷水表面，根据Mckercher P.D.等的判定标准判定乳剂剂型。
2.9.1.3黏度检验按《中国兽药典》(三部)(2010年版)附录进行检验。
2.9.1.4稳定性检验吸取疫苗10mL加至离心管中，以3000r/min离心15分钟，记录管底的水相析出量。
2.9.2无菌检验按《中国兽药典》(三部)(2010年版)附录进行检验。
2.9.3内毒素含量按《农业部公告第2078号》进行内毒素测定。
2.9.4总蛋白含量按《农业部公告第2078号》进行总蛋白含量测定。
2.9.5装量检查按《中国兽药典》(三部)(2010年版)附录进行检查。
2.9.6安全检验
2.9.6.1用小动物检验用体重350～450g的豚鼠2只，各皮下注射疫苗2.0mL；用体重18～22g小鼠5只，各皮下注射疫苗0.5mL。逐日观察7日。观察记录试验小动物是否出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部反应或全身不良反应。
2.9.6.2用猪检验用30～40日龄健康易感仔猪2头，各两侧耳根后肌肉分点注射疫苗4mL，每侧2mL，逐日观察14日。观察记录试验猪是否出现口蹄疫症状或由接种疫苗引起的异常反应。
2.9.7效力检验
2.9.7.1用体重40kg左右的健康易感猪30头，将待检疫苗分为1头份(2mL)、1/3头份(0.67mL)、1/9头份(0.22mL)3个剂量组，每一剂量组分别于耳根后肌肉注射10头猪。接种28日后，每个剂量组随机分为两个小组，每小组5头，两个攻毒组各设条件相同的对照猪2头，一组每头猪耳根后肌肉注射A/GDMM/2013株乳鼠毒2mL(含103ID50)；另一组每头猪耳根后肌肉注射O/MYA98/BY/2010株乳鼠毒2mL(含103ID50)。连续观察10日，对照猪均应至少有一蹄出现水泡或溃疡。免疫猪出现任何口蹄疫症状即判为不保护，出现发病猪后要及时进行隔离。根据免疫猪的保护数，按Reed-Muench法计算被检疫苗的PD50。
2.9.7.2总146S病毒含量检测随机抽取成品疫苗(疫苗量不少于100mL)，破乳后收集水相并充分混合，取14mL水相，用10％三氯乙烯预处理后，按7％(W/V)的量加入PEG-6000，以10000r/min离心1h，沉淀物用PBS液重悬至1.0mL，冷藏过夜后依次加至15％～45％线性蔗糖梯度管的顶部，以35000r/min、10℃超速离心2.5h后，用紫外分光光度计连续测定各级分的OD 259nm值，根据相关公式计算水相中完整口蹄疫病毒粒子146S含量。
2.10疫苗稳定性监测
将2.8.4乳化的疫苗分装于15mL离心管中各10mL，分别置于4℃和37℃条件下，并于0d、7d、14d、28d、35d、42d、63d、90d、120d、150、180d取样，通过HPSEC方法检测146S含量，进一步检测：37℃条件下146S降解为零。4℃连续监测180天。
3结果
3.1病毒液培养结果
分别取Re-O/MYA98/JSCZ/2013株(BF13SF1)和Re-A/WH/09株(BF13SF1)悬浮培养细胞毒接种于3000L生物反应器悬浮培养BHK-21细胞，细胞病变及病毒收获时间见表5。
表5病毒培养结果
在3000L生物反应器悬浮培养的BHK-21细胞，细胞密度3.0×106～3.7×106个/mL，活率93.0％～96.5％。Re-O/MYA98/JSCZ/2013株病毒液收获时间13～15h，细胞病变率95.0～97.0％；Re-A/WH/09株病毒液收获时间12～15h，细胞病变率95.0～97.0％。
3.2病毒液检测结果
分别对Re-O/MYA98/JSCZ/2013株和Re-A/WH/09株5批病毒液进行病毒含量测定和无菌检验，结果见表6。
表6病毒液病毒含量和无菌检验结果
注：“—”表示阴性，“+”表示阳性。
Re-O/MYA98/JSCZ/2013株5批病毒液，每0.2mL的病毒液病毒含量为107.50LD50～107.67LD50，无菌检验合格；Re-A/WH/09株病毒液，每0.2mL的病毒液病毒含量为107.33LD50～107.67LD50，无菌检验合格。
3.3灭活病毒抗原检验结果
对2个毒株5批抗原液分别进行安全性检验和无菌检验，结果见表7。
表7 2个毒株5批抗原安全性检验和无菌检验结果
注：“—”表示阴性，“+”表示阳性。
表7结果表明，Re-O/MYA98/JSCZ/2013株5批抗原分别接种乳鼠进行安全性检验，全部乳鼠均未出现口蹄疫症状和死亡，病毒灭活合格，无菌检验合格；Re-A/WH/09株5批抗原分别接种乳鼠进行安全性检验，全部乳鼠均未出现口蹄疫症状和死亡，病毒灭活合格，无菌检验合格。
3.4灭活病毒抗原纯化结果
对2个毒株5批灭活病毒抗原进行纯化处理，纯化后抗原收获量结果见表8。
表8灭活病毒抗原纯化后收获量结果
3.4灭活病毒抗原纯化后检验结果
对2个毒株5批抗原液分别进行146S含量测定、总蛋白含量和内毒素含量测定，结果见表9。
表9 2个毒株5批抗原146S含量、总蛋白含量和内毒素含量测定结果
表9结果表明，Re-O/MYA98/JSCZ/2013株5批抗原，146S含量10.80～12.05μg/mL，内毒素含量2.5～5.0EU/mL，总蛋白含量555～640μg/mL；Re-A/WH/09株5批抗原，146S含量12.05～14.70μg/mL，内毒素含量为5.0EU/mL，总蛋白含量520～610μg/mL。
3.5抗原配比
2个毒株5批抗原配苗前配比结果见表10。
表10配苗前混合抗原结果
3.6疫苗乳化分装
按水相与油相(V︰V)配比46︰54，乳化配制5批疫苗，抗原量、佐剂量和疫苗量结果见表11，每瓶分装50mL，粘贴产品标识签，置2～8℃保存。
表11 5批疫苗生产统计
3.7中试产品检验结果
3.7.1物理性状检验详见表12。
表12 5批中试产品物理性状检验结果
/>
3.7.2无菌检验详见表13。
表13 5批中试产品无菌检验结果
注：“—”表示阴性，“+”表示阳性。
3.7.3内毒素含量、总蛋白含量和装量检测结果详见表14。
表14 5批中试产品内毒素含量、总蛋白含量和装量检测结果
表14可以看出，5批中试产品内毒素含量均小于5.0EU/头份；每1mL疫苗总蛋白含量均不高于315μg；每批疫苗样品装量均大于50mL。
3.7.4安全性检验详见表15。
表15 5批中试产品安全性检验结果
3.7.5效力检验
3.7.5.1免疫效力试验5批中试产品免疫效力试验结果详见表16、表17。
表16 O/MYA98/BY/2010株对5批疫苗免疫猪的攻毒保护试验结果
表17 A/GDMM/2013株对5批疫苗免疫猪的攻毒保护试验结果
从表16、表17可以看出，5批中试疫苗免疫猪后，用O/MYA98/BY/2010毒株攻毒，每头份疫苗所含PD50分别为11.84、10.81、10.32、13.97、13.59；用A/GDMM/2013毒株攻毒，每头份疫苗所含PD50分别为13.59、11.84、11.84、10.32、10.81。
3.7.5.2总146S病毒含量检测详见表18。
表18 5批中试产品总146S病毒含量检测结果
表18可以看出，5批疫苗每头份疫苗146S含量分别为14.10μg、13.15μg、12.55μg、14.50μg和12.80μg
3.8大规模生产疫苗的稳定性检测
大规模生产制备的样品在37℃条件下，146S含量在28天以内基本维持稳定，未发生明显的降解。继续对在37℃条件下的疫苗样品进行监测观察，结果表明，在28-35天以内146S含量都维持较高的水平，降解率为13.68～15.8％，之后缓慢降解，第63天彻底降解，见图12和表19，与实施例2和3的结果相符。
大规模生产制备的样品在4℃条件下，180天内146S含量都维持较高的水平，降解率小于2％。
表19 5批中试产品不同条件放置下146S含量随时间变化结果
/>
4结论
BHK-21细胞经14L、100L、500L和3000L生物反应器连续四级放大悬浮培养后，在3000L规模生物反应器中分别接种Re-O/MYA98/JSCZ/2013株(BF13SF1)和Re-A/WH/09株(BF13SF1)悬浮细胞毒种进行病毒培养，分别收获5批病毒液，Re-O/MYA98/JSCZ/2013株病毒液，每0.2mL病毒液病毒含量>107.00LD50，无菌检验合格；Re-A/WH/09株病毒液，每0.2mL病毒液病毒含量>107.00LD50，无菌检验合格。收获的5批病毒液经灭活后纯化，用口蹄疫抗原热稳定性保护剂重悬沉淀。纯化后的灭活病毒抗原：Re-O/MYA98/JSCZ/2013株5批抗原，其146S含量10.80～12.05μg/mL，内毒素含量2.5～5.0EU/mL，总蛋白含量555～640μg/mL；Re-A/WH/09株5批抗原，其146S含量12.05～14.70μg/mL，内毒素含量为5.0EU/mL，总蛋白含量520～610μg/mL。2个毒株每批抗原等量混合，混合抗原与ISA 206佐剂按体积比46︰54混合乳化，制备5批疫苗，按操作规程分装，规格为50mL/瓶，每批产品分别分装128.50万mL、124.75万mL、133.0万mL、128.0万mL和125.00万mL。5批中试疫苗剂型均为W/O/W，稳定性良好；无菌生长；每头份疫苗内毒素含量均小于5.0EU；装量均大于50mL；每1mL疫苗总蛋白含量均不高于315μg；每头份疫苗146S含量分别为14.10μg、13.15μg、12.55μg、14.50μg和12.80μg；安全检验所有试验动物均安全；免疫效力介于10.32～13.97个PD50/头份。
将5批中试疫苗分别放置在4℃和37℃条件下跟踪检测疫苗中146S含量：37℃，前28天146S含量基本维持稳定，28-35天，146s有降解趋势，35天以后开始大幅度降解，60天降解为0；4℃，180天内146S含量都维持较高的水平，降解率小于2％，这与实施例2和3的结果一致，说明该发明能够放大，实现规模化应用。并且不会因为机体温度使疫苗有效成分发生降解，保证了有效成分在机体内的含量和质量，延长了抗体在机体内的释缓时间，从而能引起一个长而持久的免疫效果。同时，也给FMDV抗原、疫苗运输以及在极端环境条件下接种动物疫苗提供了保障。
大规模应用从以上结果可以看出，本发明的口蹄疫抗原热稳定性保护剂具有明显延缓146S降解的作用，使其在37℃条件下具有很好的热稳定性。另外，本发明的保护剂易于配制、溶解性好，既可作为重悬FMD灭活病毒的介质，又是一种FMD灭活病毒在溶液和疫苗中热稳定性的保护剂，也给FMDV抗原、疫苗运输以及在极端环境条件下接种动物疫苗提供了保障。

Claims (7)

1.一种口蹄疫抗原热稳定性保护剂，其特征在于，由以下按照重量百分数计的各组分组成：氯化钠0.05％～0.15％、氯化镁0.12％～0.13％、磷酸二氢钠0.5％～0.55％、葡萄糖0.05％～0.15％、精氨酸0.01％～0.015％、氯化钙0.15％～0.20％，余量为注射用水，pH值为8.0。
2.如权利要求1所述的口蹄疫抗原热稳定性保护剂，其特征在于，由以下按照重量百分数计的各组分组成：氯化钠0.1％、氯化镁0.12％、磷酸二氢钠0.53％、葡萄糖0.1％、精氨酸0.012％、氯化钙0.18％，余量为注射用水，pH值为8.0。
3.如权利要求1所述的口蹄疫抗原热稳定性保护剂，其特征在于，由以下按照重量百分数计的各组分组成：氯化钠0.15％、氯化镁0.125％、磷酸二氢钠0.5％、葡萄糖0.13％、精氨酸0.01％、氯化钙0.15％，余量为注射用水，pH值为8.0。
4.权利要求1-3任一项所述的口蹄疫抗原热稳定性保护剂在制备口蹄疫疫苗中的用途。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的口蹄疫疫苗为口蹄疫灭活疫苗。
6.一种口蹄疫灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗中含有权利要求1-3任一项所述的口蹄疫抗原热稳定性保护剂。
7.如权利要求6所述的灭活疫苗，其特征在于，通过以下方法制备得到：
向口蹄疫病毒灭活抗原中添加终浓度为7.0％w/w的PEG-6000，置4℃，在磁力搅拌器过夜搅拌，离心机4000rpm在4℃下离心1h，离心结束，弃上清，用权利要求1-3任一项所述的口蹄疫抗原热稳定性保护剂重悬沉淀，浓缩纯化后，充分混匀，得到抗原液；将高压灭菌的206佐剂和抗原液置32℃的水浴锅中，待达到设定温度后，先加206佐剂于无菌烧杯中，按质量比1:1加入抗原液混合，350rpm搅拌5min，充分混匀，乳化成双相型W/O/W油乳剂疫苗，即得。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117517284B (zh) * 2023-12-29 2024-04-09 天信和(苏州)生物科技有限公司 口蹄疫灭活疫苗热稳定剂及其筛选方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4049494A (en) * 1975-09-04 1977-09-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Vaccine production process
CN1413732A (zh) * 2002-06-19 2003-04-30 中国农业科学院兰州兽医研究所 口蹄疫病毒抗原稀释技术
CN105906711A (zh) * 2016-05-03 2016-08-31 中农威特生物科技股份有限公司 一种抗o型和a型口蹄疫病毒卵黄抗体的制备方法、产品及其用途
CN106109414A (zh) * 2016-07-28 2016-11-16 金宇保灵生物药品有限公司 一种口蹄疫疫苗稀释液及其制备方法与应用
CN109106948A (zh) * 2018-09-19 2019-01-01 天康生物股份有限公司 一种口蹄疫抗原保护剂及其应用
CN109628411A (zh) * 2018-12-26 2019-04-16 内蒙古金源康生物工程有限公司 一种fmd抗原增强培养基及其制备方法与应用
CN109820834A (zh) * 2018-12-24 2019-05-31 内蒙古必威安泰生物科技有限公司 一种口蹄疫灭活病毒的保护剂及微胶囊疫苗的制备方法
WO2022003200A1 (en) * 2020-07-03 2022-01-06 pHOxgen Limited Reduction of viral infections

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4049494A (en) * 1975-09-04 1977-09-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Vaccine production process
CN1413732A (zh) * 2002-06-19 2003-04-30 中国农业科学院兰州兽医研究所 口蹄疫病毒抗原稀释技术
CN105906711A (zh) * 2016-05-03 2016-08-31 中农威特生物科技股份有限公司 一种抗o型和a型口蹄疫病毒卵黄抗体的制备方法、产品及其用途
CN106109414A (zh) * 2016-07-28 2016-11-16 金宇保灵生物药品有限公司 一种口蹄疫疫苗稀释液及其制备方法与应用
CN109106948A (zh) * 2018-09-19 2019-01-01 天康生物股份有限公司 一种口蹄疫抗原保护剂及其应用
CN109820834A (zh) * 2018-12-24 2019-05-31 内蒙古必威安泰生物科技有限公司 一种口蹄疫灭活病毒的保护剂及微胶囊疫苗的制备方法
CN109628411A (zh) * 2018-12-26 2019-04-16 内蒙古金源康生物工程有限公司 一种fmd抗原增强培养基及其制备方法与应用
WO2022003200A1 (en) * 2020-07-03 2022-01-06 pHOxgen Limited Reduction of viral infections

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
一种提高口蹄疫抗原和灭活疫苗热稳定性缓冲液的研制;武永淑 等;中国兽医科学;第52卷(第09期);第1130-1136页 *
保护剂及其在口蹄疫疫苗中的研究进展;李正丰 等;生物技术通报(03);第6-10页 *

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