CN117517284B - 口蹄疫灭活疫苗热稳定剂及其筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种口蹄疫灭活疫苗热稳定剂及其筛选方法。其中,所述热稳定剂包括:磷酸盐缓冲液、蔗糖和氯化镁;所述方法包括:采用差示扫描荧光法对抗原的预筛热稳定剂进行筛选处理,得到目标热稳定剂;所述抗原是以抗原液的形式提供的;所述抗原在所述抗原液的浓度为5μg/mL‑40μg/mL。根据本发明实施例的方法,能够有效地将适合抗原的热稳定剂筛选出来。并且,筛选得到的热稳定剂能够提高口蹄疫灭活疫苗的熔解温度,使得口蹄疫灭活疫苗能够在高温条件下或者长时间低温储存过程中保持稳定和耐受,不会轻易变性或裂解,并且其免疫效力不受影响,进而降低运输和保藏口蹄疫灭活疫苗的成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体地,本发明涉及口蹄疫灭活疫苗热稳定剂及其筛选方法。
背景技术
热稳定剂是指用于提高疫苗在高温条件下的稳定性的物质或技术。这些热稳定剂可以保护疫苗中的活性成分,防止其失活或降解,从而确保疫苗在储存和运输过程中的效力不受温度变化的影响。
口蹄疫灭活疫苗是一种用于预防口蹄疫病毒感染的疫苗。口蹄疫是一种高度传染性的病毒性疾病,主要影响偶蹄类动物,如牛、猪、羊和山羊等。该病由口蹄疫病毒引起,可导致口蹄疫流行,造成严重的经济损失和动物福利问题。口蹄疫灭活疫苗是使用灭活的口蹄疫病毒作为抗原、通过化学或物理方法使病毒失去活性制备得到的,但该病毒仍能激发动物产生免疫反应。口蹄疫灭活疫苗具有较高的安全性,因为灭活的病毒无法复制和引起疾病,但仍能诱导免疫系统产生免疫应答。然而,口蹄疫灭活疫苗在生产、存储和输送过程中可能面临热敏感性的问题。
因此,亟需开发一种筛选口蹄疫灭活疫苗的热稳定剂的方法,以筛选获得一种口蹄疫灭活疫苗的热稳定剂,提高口蹄疫灭活疫苗在高温条件下的稳定性和耐受性。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
发明人发现口蹄疫灭活疫苗在高温条件下或者长时间低温储存过程中,疫苗的活性成分会变性或降解,降低疫苗的效力。为了克服这一问题,发明人建立了一种筛选口蹄疫灭活疫苗的热稳定剂的方法,该筛选方法优化了口蹄疫灭活疫苗的抗原浓度和荧光染料的稀释倍数。因此,通过建立的筛选口蹄疫灭活疫苗热稳定剂的方法,发明人能够有效地从大量的待筛热稳定剂中筛选出能够提高口蹄疫灭活疫苗熔解温度的热稳定剂。并且,发明人发现筛选出的口蹄疫灭活疫苗热稳定剂能够将口蹄疫灭活疫苗的熔解温度从常规的50.6℃提高到60.4℃。在高温条件下,这种热稳定剂能够保持口蹄疫灭活疫苗的稳定性和耐受性,防止其轻易变性或裂解,从而确保疫苗的免疫效力不受影响。
基于此,本发明的第一个方面,本发明提出了一种筛选热稳定剂的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:采用差示扫描荧光法对抗原的预筛热稳定剂进行筛选处理,得到目标热稳定剂;所述抗原是以抗原液的形式提供的;所述抗原在所述抗原液的浓度为5μg/mL-40μg/mL。根据本发明实施例的方法,能够有效地将适合抗原的热稳定剂筛选出来。并且,筛选得到的热稳定剂能够提高口蹄疫灭活疫苗的熔解温度,使得口蹄疫灭活疫苗能够在高温条件下或者长时间低温储存过程中保持稳定和耐受,不会轻易变性或裂解,并且其免疫效力不受影响,进而降低运输和保藏口蹄疫灭活疫苗的成本。
本发明的第二个方面,本发明提出了一种热稳定剂。根据本发明的实施例,所述热稳定剂包括:磷酸盐缓冲液(PBS)、蔗糖和氯化镁;所述热稳定剂是通过本发明的第一个方面筛选获得的;在所述热稳定剂中,所述磷酸盐缓冲液的浓度为1-50mM,所述蔗糖的浓度为1-80g/L,所述氯化镁的浓度为1-50mM。根据本发明实施例的热稳定剂,能够显著提高口蹄疫灭活疫苗的熔解温度。因此,采用上述热稳定剂制备的口蹄疫灭活疫苗,能够保证口蹄疫灭活疫苗在高温条件下或长时间低温储存过程中保持稳定和耐受,不会轻易变性或裂解,从而保持其免疫效力,同时也降低了运输和保藏口蹄疫灭活疫苗的成本。
本发明的第三个方面,本发明提出了一种口蹄疫灭活疫苗。根据本发明实施例的口蹄疫灭活疫苗包括:口蹄疫病毒;本发明第一方面所述的方法筛选得到的热稳定剂或者本发明第二方面所述的热稳定剂。根据本发明实施例的口蹄疫灭活疫苗,其熔解温度显著提高,能够在高温条件下能够稳定存在,不会变性或降解,并且其免疫效力不受影响,从而降低运输和保藏口蹄疫灭活疫苗的成本。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1为DSF检测的原理示意图。
图2为实施例1中DSF检测体系构建(筛选染料最佳稀释倍数和最佳抗原含量)的结果图。
图3为实施例1中(A型毒株)抗原缓冲液单因素筛选结果图:(A)磷酸盐缓冲液、HEPES、Tris-HCl溶液中口蹄疫灭活疫苗抗原的Tm值检测结果图,(B)TBS、TK及水溶液中口蹄疫灭活疫苗抗原的Tm值检测结果图(对照组为100mM磷酸盐缓冲液)。
图4为实施例1中(A型毒株)各类稳定剂单因素筛选结果图:(A)20g/L糖类及其他稳定剂溶液中口蹄疫灭活疫苗抗原的Tm值检测结果图,(B)50g/L糖类及其他稳定剂溶液中口蹄疫灭活疫苗抗原的Tm值检测结果图,(C)1 mM各类金属离子溶液中口蹄疫灭活疫苗抗原的Tm值检测结果图,(D)2 mM各类金属离子溶液中口蹄疫灭活疫苗抗原的Tm值检测结果图。
图5为实施例1中磷酸盐缓冲液、蔗糖、氯化镁浓度对A型口蹄疫灭活疫苗抗原(Re-A/WH/09株)的交互影响结果图。
图6为实施例3中(A型毒株)稳定性实验检测结果图:左图为乳化前剩余抗原含量随时间的变化结果图,右图为乳化后,剩余抗原含量随时间的变化结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
在本发明中,术语“包含”或“包括”为开放式表达,即包括本发明所指明的内容,但并不排除其他方面的内容。
在本发明中,术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生,并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况,以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本发明中,术语“差示扫描荧光法”(Differential Scanning Fluorimetry,DSF)是一种用于筛选热稳定剂的方法。该方法基于分子的热稳定性和结构变化对荧光信号的影响对热稳定剂进行筛选。在DSF方法中,一种被称为荧光探针的分子会与目标抗原结合,形成复合物。荧光探针通常与抗原相互作用,并受到其结构和环境的影响。当样品受到不同温度的加热时,荧光探针会发生结构变化,从而引起荧光信号的变化。DSF方法中,染料与蛋白质或与内部核酸结合取决于用的是哪种染料。SYPRO Orange对蛋白质表面疏水区域具有较高的特异性和敏感性,蛋白热变性过程伴随疏水部分的暴露,疏水部分便能与SYPROOrange结合引发荧光信号的变化。GelRed和SYBR Green II主要与内部核酸分子相结合后引发荧光信号增强,可反映口蹄疫病毒粒子裂解过程中病毒RNA的释放(其中,本发明实施例选用的是SYBR Green II染料,SYBR Green II染料主要与内部核酸结合)。以上三种荧光染料与蛋白或核酸结合后,其荧光信号强度与温度都呈现一定的线性关系,以此绘制的温度对应蛋白质荧光强度的DSF一阶导数曲线的过渡中点,即样品的熔解温度(Tm),具体检测原理参见图1。通过测量荧光信号的变化,可以判断哪些化合物具有热稳定性并能够保护目标抗原的结构。因此,差示扫描荧光法是一种常用的方法,可用于筛选热稳定剂。它通过测量荧光信号的变化来评估化合物对目标抗原的热稳定性,从而帮助筛选出具有热稳定性的化合物作为疫苗的成分。这种方法在疫苗研发和质量控制中具有重要的应用价值。
本发明提出了一种筛选热稳定剂的方法,热稳定剂,口蹄疫灭活疫苗,下面将分别对其进行详细描述。
筛选热稳定剂的方法
本发明的第一个方面,本发明提出了一种筛选热稳定剂的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:采用差示扫描荧光法对抗原的预筛热稳定剂进行筛选处理,得到目标热稳定剂;所述抗原是以抗原液的形式提供的;所述抗原在所述抗原液的浓度为5μg/mL-40μg/mL。根据本发明实施例的方法,能够有效地将热稳定剂筛选出来。当抗原在所述抗原液的浓度为5μg/mL-40μg/mL时筛选出的热稳定剂能够提高口蹄疫灭活疫苗的熔解温度,使得口蹄疫灭活疫苗能够在高温条件下或者长时间低温储存过程中保持稳定和耐受,不会轻易变性或裂解,并且其免疫效力不受影响,进而降低运输和保藏口蹄疫灭活疫苗的成本。本发明的筛选热稳定剂的方法采用了差示扫描荧光法,该方法具有可靠性和高效性。通过对抗原进行筛选处理,可以筛选出适用于口蹄疫灭活疫苗的热稳定剂,为口蹄疫防控和畜牧业的发展提供了一种实用的方法。
因此,本发明的筛选热稳定剂的方法具有重要的应用价值,可用于口蹄疫灭活疫苗的生产和质量控制,同时也为口蹄疫灭活疫苗的运输和保藏提供了可行的解决方案,带来经济效益和社会效益。
根据本发明的实施例,所述抗原选自口蹄疫灭活疫苗。
根据本发明的实施例,所述抗原液包括抗原、以及磷酸盐缓冲液和HEPES、Tris-HCl中的至少之一。
根据本发明的实施例,所述抗原在抗原液的浓度为30μg/mL。
根据本发明的实施例,所述目标热稳定剂包括磷酸盐缓冲液、蔗糖和氯化镁。
根据本发明的实施例,在所述热稳定剂中,所述磷酸盐缓冲液的浓度为1-50mM,所述蔗糖的浓度为1-80g/L,所述氯化镁的浓度为1-50mM。
根据本发明的实施例,所述磷酸盐缓冲液的浓度为1-30mM,所述蔗糖溶液的浓度为40-60g/L,所述氯化镁溶液的浓度为1-30mM。
根据本发明的实施例,所述磷酸盐缓冲液的浓度为15-30mM,所述蔗糖的浓度为45-55g/L,所述氯化镁的浓度为20-30mM。
根据本发明的实施例,所述筛选处理是通过如下方式进行的:将所述预筛热稳定剂与所述抗原进行接触处理;将接触处理产物进行加热处理,获得到所述目标热稳定剂。
根据本发明的实施例,所述加热处理的温度为20℃~100℃。由此,可进一步提高热稳定剂筛选的准确性,得到的热稳定剂可进一步提高口蹄疫灭活疫苗的熔解温度,使得口蹄疫灭活疫苗能够在高温条件下或者长时间低温储存过程中保持稳定和耐受,不会轻易变性或裂解,并且其免疫效力不受影响,进而降低运输和保藏口蹄疫灭活疫苗的成本。
根据本发明的实施例,所述加热处理的温度为25℃~95℃。
根据本发明的实施例,所述加热处理的时间为1min~80min。
根据本发明的实施例,所述加热处理的时间为1min~70min。
根据本发明的实施例,所述差示扫描荧光法中的荧光染料选自SYBR Green Ⅱ荧光染料、SYPRO Orange荧光染料和GelRed荧光染料中的至少之一。
根据本发明实施例的方法,在加热过程中,溶液中蛋白质随着温度升高而发生去折叠化,内部的核酸因外部衣壳蛋白结构逐渐展开而暴露,所用的SYBR Green II染料会与溶液中暴露的核酸相结合,其荧光信号强度与温度呈现一定的线性关系,以此可绘制温度对应荧光强度的DSF曲线,其一阶导数曲线的过渡中点即样品的熔解温度(Tm),采用SYBRGreen Ⅱ作为染料能使DSF检测的灵敏度提高,以及不受蛋白杂质的影响,从而有效地将热稳定剂筛选出来,提高筛选热稳定剂的灵敏度。其中,需要解释说明的是,“DSF一阶导数图谱极大值”是指根据本发明实施例的方法绘制的温度对应荧光信号强度的DSF曲线是一条先升高后降低的曲线,其一阶导数曲线也是一条先升高后降低的曲线,因此有一个曲线最高点,曲线最高点对应的温度即是样品的熔解温度(Tm),即是DSF一阶导数图谱极大值。
根据本发明的实施例,所述SYBR Green Ⅱ荧光染料的稀释倍数为200~10000倍。根据本发明实施例的方法,SYBR Green Ⅱ荧光染料的稀释倍数为200~10000倍能使DSF一阶导数图谱极大值进一步提高,以及进一步提高检测的灵敏度,从而进一步有效地将热稳定剂筛选出来,进一步提高筛选热稳定剂的灵敏度。
根据本发明的实施例,所述SYBR Green Ⅱ荧光染料的稀释倍数为400~600倍。根据本发明实施例的方法,SYBR Green Ⅱ荧光染料的稀释倍数为400~600倍能使DSF一阶导数图谱极大值达到最大范围,以及更进一步提高检测的灵敏度,从而更进一步有效地将热稳定剂筛选出来,更进一步提高筛选热稳定剂的灵敏度。
热稳定剂
本发明的第二个方面,本发明提出了一种热稳定剂。根据本发明的实施例,所述热稳定剂包括:磷酸盐缓冲液、蔗糖和氯化镁,所述热稳定剂是通过本发明第一方面所述的方法筛选获得的,所述磷酸盐缓冲液的浓度为1-50mM,所述蔗糖的浓度为1-80g/L,所述氯化镁的浓度为1-50mM。由此,可进一步提高口蹄疫灭活疫苗的熔解温度,从而保证口蹄疫灭活疫苗在高温条件下或长时间低温储存过程中保持稳定和耐受,不会轻易变性或裂解,从而保持其免疫效力,同时也降低了运输和保藏口蹄疫灭活疫苗的成本。
根据本发明实施例的热稳定剂,磷酸盐缓冲液、蔗糖和氯化镁三种成分具有协同作用,尤其是针对口蹄疫病毒,采用上述热稳定剂和口蹄疫病毒制备的口蹄疫灭活疫苗,能够有效提高口蹄疫灭活疫苗的熔解温度。并且,热稳定剂能够保证口蹄疫灭活疫苗在高温条件下或长时间低温储存过程中保持稳定和耐受,不会轻易变性或裂解,从而保持其免疫效力,同时也降低了运输和保藏口蹄疫灭活疫苗的成本。因此,该热稳定剂不仅具有实际应用的可行性,而且为口蹄疫灭活疫苗的生产和储存过程提供了一种简单、经济且可靠的解决方案,其对于口蹄疫防控和畜牧业的发展具有重要意义。
根据本发明的实施例,在所述热稳定剂中,所述磷酸盐缓冲液的浓度为1-30mM,所述蔗糖溶液的浓度为40-60g/L,所述氯化镁溶液的浓度为1-30mM。由此,能够进一步显著提高口蹄疫灭活疫苗的熔解温度,从而进一步保证口蹄疫灭活疫苗在高温条件下或长时间低温储存过程中保持稳定和耐受,不会轻易变性或裂解,从而保持其免疫效力,同时也进一步降低了运输和保藏口蹄疫灭活疫苗的成本。
根据本发明的实施例,在所述热稳定剂中,所述磷酸盐缓冲液的浓度为15-30mM,所述蔗糖的浓度为45-55g/L,所述氯化镁的浓度为20-30mM。由此,能够更进一步显著提高口蹄疫灭活疫苗的熔解温度。从而可更进一步保证口蹄疫灭活疫苗在高温条件下或长时间低温储存过程中保持稳定和耐受,不会轻易变性或裂解,从而保持其免疫效力,同时也更进一步降低了运输和保藏口蹄疫灭活疫苗的成本。
根据本发明的实施例,在所述热稳定剂中,所述磷酸盐缓冲液的浓度为20mM,所述蔗糖的浓度为50g/L,所述氯化镁的浓度为25mM。由此,能够更进一步显著提高口蹄疫灭活疫苗的熔解温度。从而可更进一步保证口蹄疫灭活疫苗在高温条件下或长时间低温储存过程中保持稳定和耐受,不会轻易变性或裂解,从而保持其免疫效力,同时也更进一步降低了运输和保藏口蹄疫灭活疫苗的成本。
口蹄疫灭活疫苗
本发明的第三个方面,本发明提出了一种口蹄疫灭活疫苗。根据本发明实施例的口蹄疫灭活疫苗包括:口蹄疫病毒;本发明第一方面所述的热稳定剂或通过本发明第二方面所述的方法筛选得到的热稳定剂。根据本发明实施例的口蹄疫灭活疫苗,其熔解温度显著提高,能够在高温条件下能够稳定存在,不会变性或降解,并且其免疫效力不受影响,从而降低运输和保藏口蹄疫灭活疫苗的成本。
根据本发明的实施例,所述口蹄疫病毒选自A型毒株;所述口蹄疫病毒灭活前的效价为7.0~8.5 TCID50;所述口蹄疫病毒和热稳定剂的体积比值为(0.8~1.2):(1.4~1.8)。根据本发明实施例的口蹄疫灭活疫苗,口蹄疫病毒选自A型毒株,所述口蹄疫病毒灭活前的效价为7.0~8.5 TCID50,所述口蹄疫病毒和热稳定剂的体积比值为(0.8~1.2):(1.4~1.8),其熔解温度显著提高,显著增加其在高温条件下的稳定性,并且其免疫效力不受影响,从而降低运输和保藏口蹄疫灭活疫苗的成本。
根据本发明的实施例,所述口蹄疫病毒和热稳定剂的体积比值为(0.8~1.2):(1.4~1.8),例如0.8:1.8、0.8:1.7、0.8:1.6、0.9:1.6、1:1.6或其任意两个比值之间的范围值,如(0.8~1):(1.6~1.8)、(0.9~1):(1.6~1.8)、(0.9~1):(1.6~1.7)。
根据本发明的实施例,所述口蹄疫病毒选自A型毒株;所述口蹄疫病毒灭活前的效价为7.5~8.0 TCID50;所述口蹄疫病毒和热稳定剂的体积比值为(1:1.6)。根据本发明的实施例,所述口蹄疫病毒选自A型毒株;所述口蹄疫病毒灭活前的效价为7.5~8.0 TCID50;所述口蹄疫病毒和热稳定剂的体积比值为(1:1.6)。根据本发明实施例的口蹄疫灭活疫苗,口蹄疫病毒选自A型毒株,所述口蹄疫病毒和热稳定剂的体积比值为(1:1.6),其熔解温度显著提高,能够在高温条件下能够稳定存在,不会变性或降解,并且其免疫效力不受影响,从而降低运输和保藏口蹄疫灭活疫苗的成本。
根据本发明的实施例,所述A型毒株包括Re-A/WH/09株。根据本发明实施例的口蹄疫灭活疫苗,口蹄疫病毒为Re-A/WH/09株,其熔解温度显著提高,能够在高温条件下能够稳定存在,不会变性或降解,并且其免疫效力不受影响,从而降低运输和保藏口蹄疫灭活疫苗的成本。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:构建筛选口蹄疫灭活疫苗热稳定剂的方法
本实施例构建了筛选口蹄疫灭活疫苗热稳定剂的方法,具体实验步骤如下:
(1)筛选荧光染料的最佳稀释倍数
取适量200 mM HEPES、400 mM Tris-HCl及100 mM磷酸盐缓冲液溶液,将A型(Re-A/WH/09株)口蹄疫灭活疫苗抗原(146S)浓度稀释为30 μg/mL,并各取100 μL上述抗原液(缓冲液和抗原的混合物)于另一EP管中,将SYBR Green Ⅱ(索莱宝)按照200、500、1000、2000、5000、10000倍的稀释倍数分别取适量染料于上述EP管中,并于漩涡震荡装置上充分混匀后获得SYBR Green Ⅱ染料加抗原液的混合物,各取20 μLSYBR Green Ⅱ染料加抗原液的混合物加入到96孔板中,设置3个重复,覆盖光学封板膜后将表1所示的样品1~18以1℃/min的速率从25℃加热至95℃并获取样品1~18的导数图谱极大值;如图2(左)所示,当SYBR Green Ⅱ稀释倍数为500倍时,一阶导数图谱极大值达到最大,检测灵敏度较高。
表1
(2)筛选最佳抗原的检测含量
取适量200 mM HEPES、400 mM Tris-HCl及100 mM磷酸盐缓冲液溶液,将A型口蹄疫灭活疫苗抗原(Re-A/WH/09株)浓度分别稀释为5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL,每个浓度取100 μL上述抗原液(缓冲液和抗原的混合物)于另一EP管中,并取适量SYBR Green Ⅱ使染料稀释倍数为500倍并充分混匀获得稀释500倍的SYBR Green Ⅱ染料加抗原液的混合物,各取20 μL稀释500倍的SYBR Green Ⅱ染料加抗原液的混合物于96孔板中,设置3个重复,覆盖光学封板膜后将表2所示的样品19~30以1℃/min的速率从25℃加热至95℃并获取样品19~30的Tm值;如图2(右)所示,当A型口蹄疫灭活疫苗抗原(Re-A/WH/09株)浓度为30 μg/mL时,100 mM磷酸盐缓冲液溶液中的Tm值较高,约为56.9 ℃。
表2
(3)单因素筛选缓冲液类型及浓度
首先,取10-400mM磷酸盐缓冲液、10-400mM HEPES、10-400mM Tris-HCl、TBS(50mM Tris-HCl+100 mM NaCl)、TK(200 mM Tris-HCl+300 mM KCl)缓冲液与常用佐剂ISA206充分乳化后,观察乳液静置稳定性的实验,得出10-100mM磷酸盐缓冲液、10-200mMHEPES、10-400mM Tris-HCl、TBS(50 mM Tris-HCl+100 mM NaCl)、TK(200 mM Tris-HCl+300 mM KCl)可使乳液稳定。
其次,根据本实施例步骤(1)(2)获得的DSF检测体系和上述乳化实验结果,取适量10、20、50、100 mM磷酸盐缓冲液溶液,10、20、50、100、200 mM HEPES溶液,10、20、50、100、200、400 mM Tris-HCl溶液,TBS(50 mM Tris-HCl+100 mM NaCl),TK(200 mM Tris-HCl+300 mM KCl)缓冲液将A型口蹄疫灭活疫苗抗原(Re-A/WH/09株)浓度稀释为30 μg/mL并充分混匀,设水为空白对照组,各取100 μL于另一EP管中,每管取适量SYBR Green Ⅱ使染料稀释倍数为500倍并充分混匀,随后各取20μL于96孔板中,设置3个重复,覆盖光学封板膜后进行DSF检测并获取样品34~48的Tm值。
结果如图3(A)和图3(B)所示,在100 mM范围内,以磷酸盐缓冲液溶液中的A型口蹄疫灭活疫苗抗原(Re-A/WH/09株)的Tm值最高,为56.9℃,且具有显著差异(P<0.05),可将其作为配制A型口蹄疫灭活疫苗稳定剂的底液。
表3
(4)配制各类稳定剂溶液
以100 mM磷酸盐缓冲液为底液,分别配制50、100、200 mM的精氨酸、赖氨酸、甘氨酸及组氨酸溶液,20g/L和50g/L的山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖溶液、PEG 6000、PEG 8000溶液、Tween 20及Tween 80溶液,1 mM和2 mM的氯化钾、氯化钠、氯化镁、氯化钙、硫酸镍、硫酸铜、硫酸锌、氯化铵、氯化钡溶液,3%和1%的水解乳蛋白、牛血清白蛋白溶液,并用0.22 μm滤膜过滤,4℃保存备用;
(5)单因素筛选各类稳定剂类型及浓度
以100 mM磷酸盐缓冲液为对照组,取适量上述(4)各类溶液将A型口蹄疫灭活疫苗抗原(Re-A/WH/09株)浓度稀释为30μg/mL并充分混匀,各取100 μL上述抗原液(缓冲液和抗原的混合物)于另一EP管中,每管取适量SYBR Green Ⅱ使染料稀释倍数为500倍并充分混匀获得稀释500倍的SYBR Green Ⅱ染料加抗原液的混合物,随后各取20μL稀释500倍的SYBR Green Ⅱ染料加抗原液的混合物于96孔板中,设置3个重复,覆盖光学封板膜后进行DSF检测并获取表4中样品49~100的Tm值;如图4所示,结果显示(本实施例示例性展示样品49~88的结果)蔗糖对A型口蹄疫灭活疫苗抗原(Re-A/WH/09株)具有极显著的稳定作用(P<0.001),为58.6℃,氯化镁及氯化钙溶液均可明显提高A型口蹄疫灭活疫苗抗原(Re-A/WH/09株)的Tm值,且随着溶液浓度的增加,稳定作用越明显。
表4
样品 | 稳定剂类型及浓度 |
样品49 | 20 g/L山梨醇 |
样品50 | 20 g/L甘露醇 |
样品51 | 20 g/L蔗糖 |
样品52 | 20 g/L海藻糖 |
样品53 | 20 g/L葡萄糖溶液 |
样品54 | 20 g/L PEG 6000 |
样品55 | 20 g/L PEG 8000 |
样品56 | 20 g/L Tween 20 |
样品57 | 20 g/L Tween 80 |
样品58 | 50 g/L山梨醇 |
样品59 | 50 g/L甘露醇 |
样品60 | 50 g/L蔗糖 |
样品61 | 50 g/L海藻糖 |
样品62 | 50 g/L葡萄糖溶液 |
样品63 | 50 g/L PEG 6000 |
样品64 | 50 g/L PEG 8000 |
样品65 | 50 g/L Tween 20 |
样品66 | 50 g/L Tween 80 |
样品67 | 3%水解乳蛋白(LA) |
样品68 | 1%水解乳蛋白(LA) |
样品69 | 3%牛血清白蛋白(BSA) |
样品70 | 1%牛血清白蛋白(BSA) |
样品71 | 1 mM氯化钾 |
样品72 | 1 mM氯化钠 |
样品73 | 1 mM氯化镁 |
样品74 | 1 mM氯化钙 |
样品75 | 1 mM硫酸镍 |
样品76 | 1 mM硫酸铜 |
样品77 | 1 mM硫酸锌 |
样品78 | 1 mM氯化铵 |
样品79 | 1 mM氯化钡 |
样品80 | 2 mM氯化钾 |
样品81 | 2 mM氯化钠 |
样品82 | 2 mM氯化镁 |
样品83 | 2 mM氯化钙 |
样品84 | 2 mM硫酸镍 |
样品85 | 2 mM硫酸铜 |
样品86 | 2 mM硫酸锌 |
样品87 | 2 mM氯化铵 |
样品88 | 2 mM氯化钡 |
样品89 | 50mM的精氨酸 |
样品90 | 100mM的精氨酸 |
样品91 | 200mM的精氨酸 |
样品92 | 50mM的赖氨酸 |
样品93 | 100mM的赖氨酸 |
样品94 | 200mM的赖氨酸 |
样品95 | 50mM的甘氨酸 |
样品96 | 100mM的甘氨酸 |
样品97 | 200mM的甘氨酸 |
样品98 | 50mM的组氨酸 |
样品99 | 100mM的组氨酸 |
样品100 | 200mM的组氨酸 |
(6)Box-Behnken响应面筛选实验(多因素筛选)
基于上述(5)单因素筛选试验的结果,选择20-100mM磷酸盐缓冲液、0-50g/L蔗糖、0-50 mM氯化镁为三因素三水平并设计Box-Behnken方案,随后利用实施例1(1)(2)所述方法(DSF检测体系)对该17种方案进行检测。结果如表5及图5所示,在17种设计方案中,最佳配比为20mM磷酸盐缓冲液,50g/L蔗糖,25mM氯化镁,Tm值最高为60.2℃,相比于100 mM磷酸盐缓冲液溶液中A型口蹄疫灭活疫苗抗原(Re-A/WH/09株)的Tm值(56.9℃)提高3℃。说明该稳定剂对A型口蹄疫灭活疫苗抗原(Re-A/WH/09株)具有明显的稳定效果。同时ANOVA统计分析结果显示该model显著,Lack of Fit不显著,R2为0.9444,Adjusted R2与Redicted R2相差小于0.2,表明该模型数据可行且显著。
表5:(A型毒株)稳定剂的三因素三水平Box-Behnken设计方案
实施例2:效果验证
选取已知稳定性较差的O/Mya98/BY株口蹄疫灭活疫苗为研究对象进行效果验证,本实施例的检测方法与实施例1(6)中的方法相同,以20mM磷酸盐缓冲液,50g/L蔗糖,25mM氯化镁作为O/Mya98/BY株口蹄疫灭活疫苗的热稳定剂检测O/Mya98/BY株口蹄疫灭活疫苗的熔解温度(Tm)。结果如表6所示,当以20mM磷酸盐缓冲液,50g/L蔗糖,25mM氯化镁作为O/Mya98/BY株口蹄疫灭活疫苗的热稳定剂时,O/Mya98/BY株口蹄疫灭活疫苗的熔解温度Tm为35℃。
表6:O型毒株的热稳定剂
实施例3:稳定性实验
用上述实施例1(6)中筛选的热稳定剂(20 mM磷酸盐缓冲液、50 g/L蔗糖、25 mM氯化镁)溶液将A型口蹄疫灭活疫苗抗原(Re-A/WH/09株)浓度稀释为30 μg/mL,并以100 mM磷酸盐缓冲液溶液为对照,设置乳化前与乳化后两组样品,每组设置6管,每管1 mL,在37℃培养箱中放置30天并间隔一定时间取出一管利用高压凝胶色谱进行剩余抗原含量的检测。如图6(左)所示,与对照组相比,储存30天后,实验组抗原含量剩余33%,对照组已几乎全部裂解,含量低至检测值下限,说明该稳定剂可显著降低口蹄疫灭活疫苗抗原在溶液中的裂解速率(P<0.05),具有较好的稳定作用。如图6(右)所示,储存一段时间后,破乳后进行检测,与对照组相比,储存30天后,对照组口蹄疫灭活疫苗抗原已全部裂解,实验组剩余抗原含量约为38%,明显高于对照组,说明该热稳定剂一定程度上可降低乳液中口蹄疫灭活疫苗抗原的裂解速率,提高口蹄疫灭活疫苗抗原的热稳定性。这表明本发明筛选的热稳定剂(20 mM磷酸盐缓冲液、50 g/L蔗糖、25 mM氯化镁)对溶液中及乳液中的口蹄疫灭活疫苗具有较好的稳定作用,在保障口蹄疫病毒防控方面有巨大潜力。
对比例
从实施例1(5)中的单因素的筛选结果中可得知,50g/L蔗糖和50g/L葡萄糖对A型口蹄疫灭活疫苗抗原热稳定性的结果相似。基于此,本实施例以20mM磷酸盐缓冲液,50g/L葡萄糖,25mM氯化镁作为A型口蹄疫灭活疫苗抗原(Re-A/WH/09株)的热稳定剂,用本实施例1(1)(2)中的DSF方法进行检测。从实验结果中可得知20mM磷酸盐缓冲液,50g/L 葡萄糖,25mM 氯化镁这一配比作为A型口蹄疫灭活疫苗抗原的热稳定剂时,实际的Tm值比20mM磷酸盐缓冲液,50g/L蔗糖,25mM氯化镁这一配比作为的A型口蹄疫灭活疫苗抗原的热稳定剂的Tm值(60.2℃)低。说明20mM磷酸盐缓冲液,50g/L蔗糖,25mM氯化镁比20mM磷酸盐缓冲液,50g/L葡萄糖,25mM氯化镁更适合作为A型口蹄疫灭活疫苗抗原(Re-A/WH/09株)的热稳定剂。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (1)
1.一种口蹄疫灭活疫苗,其特征在于,包括:
A型口蹄疫病毒;
热稳定剂,所述热稳定剂包括磷酸盐缓冲液、蔗糖和氯化镁;
在所述热稳定剂中,所述磷酸盐缓冲液的浓度为20mM,所述蔗糖的浓度为50g/L,所述氯化镁的浓度为25mM;
所述A型口蹄疫病毒灭活前的效价为7.0~8.5TCID50;
所述A型口蹄疫病毒和热稳定剂的体积比值为(0.8~1.2):(1.4~1.8);
所述A型口蹄疫病毒包括Re-A/WH/09株。
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