CN105745218B - 去除残留细胞培养杂质 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于从蛋白质制备物中去除残留杂质的方法。这类方法包括在非沉淀条件下向包含感兴趣的蛋白质和细胞污染物的溶液中加入阴离子去污剂并将该溶液通过离子交换柱。

Description

去除残留细胞培养杂质
相关申请
本国际专利申请要求2013年11月15日提交的美国临时申请61/904,747和2013年12月20日提交的欧洲申请13199257.0的优先权，其内容在此通过引用全文纳入本文。
发明领域
本发明涉及在宿主细胞中生产蛋白质及其改善的纯化方法。
背景技术
已经预先描述了用于在细胞培养物中生产疫苗和其它生物制剂的各种方法。如果使用连续细胞系来进行生产，则存在细胞系的残留DNA可能有致癌性的风险。因此需要从感兴趣的治疗性蛋白质中破坏并去除残留DNA。对于病毒疫苗，FDA最近推荐低于10ng/剂的DNA的量和低于200个碱基对的片段尺寸(《工业指南：用于生产针对感染性适应症的病毒疫苗的细胞基质和其它生物材料的表征和资质》(Guidance of Industry.Characterizationand Qualification of Cell Substrates and other Biological Materials Used inthe Production of Viral Vaccines for Infections Disease Indications).FDA/CBER2010年2月；可从以下下载：http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/vaccines/ucm202439.pdf)。
已经描述了几种用于从细胞培养衍生的疫苗中去除残留DNA的方法。美国专利5,948,410描述了用于从细胞培养物中生产流感疫苗的方法，其中DNA酶处理与使用CTAB的裂解步骤结合。WO 2007/052163描述了用于从细胞培养物中生产流感疫苗的方法，其中使用β-丙内酯(BPL)来灭活病毒并降解残留DNA。然后，例如，通过用CTAB处理来裂解病毒。然后从病毒制备物中去除片段化的DNA。无论如何，仍然需要进一步改进从流感病毒制备物或从连续细胞系中产生的其它感兴趣产物中去除残留细胞DNA。
US 2012-0101262中已经公开了辛酸与离子交换色谱联用来从细胞培养物中产生的抗体中去除细胞DNA。然而，US 2012-0101262需要在诱导残留DNA沉淀并污染蛋白质(具体是低pH下)的条件下使用辛酸。然后，可分离沉淀物和感兴趣的蛋白质，并且后者通过离子交换色谱进一步纯化。
本领域已经描述了使用辛酸或辛酸盐从细胞培养物中去除杂质和聚集体的多种其它方法。Steinbuch(Steinbuch,M.等，Arch.Biochem.Biophys.134:279-94(1969))描述了通过对其中无包膜和包膜病毒的辛酸盐沉淀从人血浆中回收IgG。美国专利7,553,938描述了通过在pH 4.6至约4.95下加入辛酸根或庚酸根离子从起始溶液中纯化抗体并且将该溶液过滤通过至少一种阴离子交换树脂。美国专利5,886,154描述了从人血浆中纯化抗体的过程，包括在pH 3.8至4.5下悬浮抗体，之后在pH 5.0至5.2下加入辛酸以沉淀污染蛋白质和脂质，同时抗体保留在溶液中。抗体纯化中采用辛酸，因为短脂肪酸与α球蛋白和β球蛋白在酸性pH下形成不溶性复合物，其中γ球蛋白不易于沉淀(Chanutin等，1960)。因此，可易于分离γ球蛋白。但是，这些公开都没有教导或启示使用阴离子去污剂来在防止本文所述的沉淀的条件下从病毒蛋白质中去除残留DNA。
发明内容
本发明涉及制备蛋白质及其改善的纯化方法。具体地，本发明提供了从合适宿主(例如，宿主细胞)中产生的蛋白质产物中去除细胞污染如残留核酸的方法。因此，本发明也包括通过这类方法制备的相关组合物。
本发明因此包括增加从细胞培养物中产生的生物产品的产率、纯度和/或安全性的方法。通过本发明的方法制备的生物产品可包括，但不限于：生物药物、蛋白质、多糖、病毒抗原和抗体。在一个具体方面中，本发明提供了基本没有残留DNA的生物产品。
发明人已经惊讶地发现通过向包含蛋白质和细胞DNA的溶液中加入阴离子去污剂，之后进行包括离子交换基质的纯化步骤显著改善了对包含源自细胞培养物的蛋白质和DNA的样品的纯化。待解决的问题可能涉及在带正电的离子交换基质中从感兴趣的蛋白质中分离带负电的DNA杂质的低效。可以假定次级相互作用在减少阴离子交换色谱吸附带负电的DNA杂质的能力上起到作用。本发明现在通过用阴离子去污剂溶液接触残留DNA并通过在阴离子交换基质上吸附来处理残留DNA实现了富集的产物及其增加的产率。发明人意外地发现本发明也去除了流感病毒核蛋白。通过本发明实现的污染物的高效去除能有更高的产品产率，因为可增加孵育和感染次数使得可以得到更高量的感兴趣蛋白质。本发明也包括以下认识，即如果在阴离子去污剂如脂肪酸去污剂(例如，辛酸钠)存在下通过离子交换色谱纯化病毒制备物，可实现从细胞培养物中产生的流感病毒中特别有效地去除残留DNA。
令人惊讶地，发明人也已经发现本文所述的方法基本去除流感病毒核蛋白(NP)。优选地，如果需要去除NP，本发明并不限于源自细胞培养物的流感病毒，但也可应用于在鸡蛋中产生的流感病毒。
与本领域所述的方法不同(参见上述“背景”)，本发明在不沉淀感兴趣的蛋白质或DNA的条件下采用阴离子去污剂。根据本发明，通过阴离子交换色谱从污染DNA/蛋白质中分离来制备感兴趣的蛋白质。通过使用本文所述的方法，可显著降低样品中杂质(例如，残留DNA)的量。可使用本发明来从含在宿主细胞，如细胞培养物中产生的一种或多种感兴趣蛋白质的任意样品中去除残留细胞DNA。
因此，本发明提供了一种用于从包含在宿主细胞，如细胞培养物中产生的感兴趣蛋白质的样品中去除残留细胞DNA的方法，包括在非沉淀条件下向包含感兴趣的蛋白质的溶液中添加阴离子去污剂并且将该溶液通过离子交换基质以去除残留细胞DNA。本发明的方法并不受到特定感兴趣蛋白的限制。可按照本发明纯化的蛋白质的非限制性示例包括，但不限于：治疗性蛋白质、抗原(例如，免疫原性蛋白质)、抗体或其片段。
根据本发明，可经过本发明提供的方法的合适起始物质可以是包含感兴趣蛋白质的溶液。该溶液可以是粗制细胞或组织制备物、部分纯化的制备物、细胞在其中生长的培养基、或细胞培养上清等，但可能含有需要去除的残留细胞污染物。
感兴趣的蛋白质可在合适的宿主细胞系统中生长并且可通过本领域已知的常规分离技术从细胞杂质中纯化或澄清。任选地，可在将蛋白质通过离子交换基质之前，优选在加入阴离子去污剂之前进行其它步骤。例如，可首先从细胞培养杂质中纯化感兴趣的蛋白质以产生已澄清的溶液。从本发明的方法获得的洗脱液或流出液可经过其它处理步骤，如纯化感兴趣的蛋白质并配制成疫苗。在本发明的一些实施方式中，通过使包含感兴趣的蛋白质和细胞培养杂质的溶液在非沉淀条件下接触阴离子去污剂溶液并使该溶液通过离子交换基质来向澄清的溶液中加入阴离子去污剂。非沉淀条件是没有明显的蛋白质或DNA的沉淀发生的条件。
因此，本发明适于产生病毒蛋白质。可在用病毒感染的合适宿主(如培养细胞)中产生感兴趣的病毒蛋白质。在一些实施方式中，病毒蛋白质产生的方法可包括病毒颗粒的裂解，其一般包括使用裂解剂或另一种去污剂。在一些实施方式中，本文所述的方法中使用的阴离子去污剂不是裂解剂或者用于裂解方法中的去污剂。
或者或另外，本发明提供了一种通过在非沉淀条件下在阴离子去污剂存在下使包含蛋白质、细胞DNA的溶液通过离子交换基质并且在离子交换基质上吸附基本上所有细胞DNA来减少残留细胞DNA的方法。在优选的方面中，阴离子去污剂不是裂解剂或用于该方法中的另一种去污剂。可在将蛋白质和细胞DNA通过离子交换基质之前，优选在加入阴离子去污剂之前进行其它步骤。例如，可用裂解剂裂解病毒并且可从包含裂解的病毒的细胞培养碎片中分离蛋白质以产生已澄清的溶液。通过本发明产生的获自离子交换基质的洗脱液或流出液可经过其它处理步骤，如进一步纯化病毒蛋白质并配制成疫苗。
本发明特别适用于制备病毒蛋白质用于疫苗生产。在另一个实施方式中，本发明提供了用于从包含在细胞培养物中产生的病毒蛋白质的样品中去除残留细胞DNA的方法，该方法包括在非沉淀条件下向包含感兴趣的蛋白质的溶液中加入阴离子去污剂，使该溶液通过离子交换基质，残留细胞DNA由此结合至离子交换树脂。在优选的方面中，阴离子去污剂不是裂解剂或用于该方法中的另一种去污剂。任选地，可在通过离子交换基质之前，优选在加入阴离子去污剂之前进行其它步骤。例如，可首先用裂解剂裂解病毒，然后从细胞培养碎片中分离裂解的病毒以产生已澄清的溶液。通过本发明产生的获自离子交换基质的洗脱液或流出液可经过其它处理步骤，如进一步纯化病毒蛋白质并配制成疫苗。
用于源自细胞培养物的生物产品的特别有效的纯化方法使得可能最佳去除杂质如宿主细胞DNA，同时实现产物的最大产率。为此，本发明提供了基本没有杂质并且富集免疫原性蛋白质的产品。根据本发明，可通过以下过程从预期产物中去除源自宿主细胞如细胞培养的残留DNA和杂质：经过包含阴离子去污剂的溶液，随后处理通过离子交换基质。
因此，本发明提供了制备包含源自细胞培养物的感兴趣蛋白质的疫苗组合物的方法，该方法包括在非沉淀条件下向包含感兴趣蛋白质的溶液中加入脂肪酸去污剂(如下定义)并在离子交换基质上处理感兴趣蛋白质。本发明还可用于生物药物疫苗产品。
在优选的方面中，本发明提供了用于生产包含来自源自细胞培养物的病毒的免疫原性蛋白质的流感病毒疫苗组合物的方法，包括在非沉淀条件下向包含免疫原性蛋白质的溶液中加入脂肪酸去污剂并在离子交换基质上处理免疫原性蛋白质。免疫原性蛋白质包括获自已经灭活和裂解剂的流感病毒的血凝素、神经氨酸酶和核蛋白。可在离子交换基质上处理免疫原性蛋白质之前，优选在加入脂肪酸去污剂之前进行其它步骤。例如，可首先用裂解剂裂解流感病毒，然后从细胞培养碎片中分离裂解的病毒以产生已澄清的溶液。通过本发明产生的获自离子交换基质的洗脱液或流出液可经过其它处理步骤，如进一步纯化病毒蛋白质并配制成疫苗。在优选的方面中，脂肪酸去污剂不是裂解剂或用于该方法中的另一种去污剂。
如上所述，本发明也包括令人惊讶的发现，即本文所述的方法基本去除了流感病毒核蛋白(NP)。优选地，如果需要去除NP，本发明并不限于源自细胞培养物的流感病毒，但也可应用于在鸡蛋中产生的流感病毒。
因此，本发明提供可一种用于从感兴趣的蛋白质去除病毒核蛋白的方法。在非沉淀条件下向包含病毒核蛋白的溶液中加入阴离子去污剂。在一些实施方式中，阴离子去污剂不是裂解剂或用于该方法中的另一种去污剂。然后，核蛋白可结合至离子交换基质以产生包含感兴趣蛋白质的洗脱液(或流出液)，其基本没有病毒核蛋白和细胞DNA。在一些实施方式中，用于本发明的合适阴离子去污剂溶液不包括脱氧胆酸盐、月桂基硫酸钠、或其组合。
因此，本发明提供了一种用于从源自细胞培养物或含胚鸡蛋的流感病毒制备物中去除流感病毒核蛋白的方法，包括在非沉淀条件下向病毒制备物加入阴离子去污剂，并且通过阴离子交换基质处理病毒制备物，核蛋白由此结合至阴离子交换基质。可在离子交换基质上处理病毒制备物之前，优选在加入阴离子去污剂之前进行其它步骤。例如，可首先用裂解剂裂解流感病毒，然后从细胞培养碎片中分离裂解的病毒以产生已澄清的溶液。通过本发明产生的获自离子交换基质的洗脱液或流出液可经过其它处理步骤，如进一步纯化病毒蛋白质并配制成疫苗。在优选的方面中，阴离子去污剂不是裂解剂或用于该方法中的另一种去污剂。
本发明提供了通过本发明的方法产生的流感病毒疫苗，其基本没有残留DNA和核蛋白。可将流感病毒疫苗配制成亚病毒粒子颗粒形式，例如，HA或NA蛋白质可以是纯化的亚基蛋白质或结合至流感病毒结构的部分。
附图说明
图1提供了比较使用不同的离液剂在TMAE和SARTOBIND Q上处理的HA蛋白质的产率百分比的柱状图。
图2提供了比较来自用或不用作为去污剂的辛酸盐运行的色谱的样品的变性凝胶。
图3提供了比较用不同量的辛酸盐运行的从离子交换基质回收的DNA/蛋白质比率的柱状图。
图4提供了用不同量的辛酸盐运行的从离子交换基质回收的蛋白质的产率百分比。
图5提供了用于获得基于细胞培养物的亚基流感病毒疫苗的下游过程，如Onions等，2010中所述。
某些实施方式的详述
感兴趣的蛋白质
可使用本发明的方法来从残留宿主细胞污染物，如细胞DNA中纯化源自宿主细胞来源(如细胞培养物)的任何感兴趣的蛋白质。本文所述的现代病毒生产方法与重组蛋白质或单克隆抗体生产的生物处理有许多共同处。因此，在具体方面中，使用该方法来纯化感兴趣的蛋白质，例如，治疗性蛋白质、免疫原性蛋白质或抗原、抗体或其片段，其在宿主细胞，如真核(例如，哺乳动物、禽类、昆虫、植物、真菌等)细胞培养物和原核(例如，细菌)细胞培养物、其细胞裂解物、澄清体(例如，澄清的细胞培养上清)、或动物来源的蛋白质混合物或提取物中生成。
在某些实施方式中，该方法包括从含一种或多种感兴趣的蛋白质的混合物(宿主细胞衍生的制备物，例如，细胞培养物，细胞裂解物、澄清体等)中有效去除宿主细胞污染物(例如，杂质)。在一些实施方式中，本文所述方法的合适起始材料包括宿主细胞衍生的制备物(如样品溶液和细胞裂解物)，其包含一种或多种感兴趣的蛋白质和对于预定目的而言不希望的量的残留宿主细胞污染物。在一些实施方式中，这类起始材料是粗细胞裂解物。在一些实施方式中，这类起始材料是包含分泌的蛋白质的细胞培养上清(例如，宿主细胞在其中生长的细胞培养基)。在一些实施方式中，这类起始材料表现为经部分纯化的形式。
因此，本发明的一个方面提供了用于从在合适系统，如细胞培养物中产生的包含感兴趣的蛋白质的样品中去除残留细胞DNA的方法，包括以下步骤：在非沉淀条件下向包含感兴趣的蛋白质的溶液中加入至少一种阴离子去污剂；将溶液通过离子交换剂之，残留细胞DNA由此结合至离子交换基质，以从残留DNA中分离感兴趣的蛋白质(例如，在洗脱液或流出液中)；并且，任选地，进一步纯化感兴趣的蛋白质并将其配制成产品。在一些实施方式中，所得的纯化的感兴趣的蛋白质适用于制备药物组合物。因此，这类蛋白质可配制成药物产品，如生物治疗剂和疫苗。
因此，本文所述的方法可用于制备在合适宿主中产生的病毒蛋白质。在一些实施方式中，这类病毒蛋白质是适用于疫苗生产的病毒免疫原性蛋白质(即，病毒抗原)。
适用于本发明的免疫原性蛋白质可源自作为疫苗靶标的任意病毒。免疫原性蛋白质可配制为灭活(或杀死的)病毒，减毒病毒，裂解的病毒制剂，纯化的亚基制剂，分离、纯化或源自病毒的病毒蛋白质，以及病毒样颗粒(VLP)。
如果在疫苗生产期间要使用裂解步骤，裂解剂可不同于本文所述方法的阴离子去污剂。优选地，在离子交换色谱之前加入裂解剂或裂解步骤，残留细胞DNA结合在该色谱上或在其上从感兴趣的蛋白质中分离。
本发明的免疫原性蛋白质是病毒抗原，其优选包括在其生命周期的至少一个阶段中暴露于病毒表面的表位。病毒可以是未包膜的，或者，优选包膜的。病毒优选是RNA病毒，并且更优选ssRNA病毒。它们可具有正义，或优选地，反义基因组。它们的基因组可以是非分段的，或优选地分段的。本发明的优选病毒包括包含病毒抗原如神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)蛋白质的流感病毒。
病毒培养物
本发明提供了制备流感病毒，以及在处理病毒抗原用于生产疫苗期间去除生成的残留DNA或杂质的方法。因此，本发明提供了一种用于从流感病毒制备物中去除核蛋白的方法。流感病毒可在宿主中培养并且进行纯化步骤以分离并纯化NA和HA蛋白质。因此，本发明的一个方面涉及用于从包含感兴趣的病毒蛋白质的制备物中去除流感病毒核蛋白(NP)的方法，包括裂解获自细胞培养物或鸡蛋的病毒制备物，在非沉淀条件下使病毒制备物接触阴离子表面活性剂并且通过离子交换基质处理制备物，核蛋白由此结合至阴离子交换树脂，并且任选地还包括进一步纯化病毒蛋白质并将其配制成疫苗。
培养宿主可以是适于产生可用于给予人的疫苗的细胞或含胚鸡蛋。已被批准用于疫苗生产的合适细胞的非限制性示例包括MDCK细胞、CHO细胞、Vero细胞和
Figure BDA0000990999660000081
细胞。对于包括使用鸡蛋的本发明的实施方式，也可在鸡蛋中增殖病毒。目前培养流感病毒用于疫苗的标准方法采用含胚SPF鸡蛋，由鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒。也可通过鸡蛋对病毒传代并随后在细胞培养物中增殖，反之亦然。例如，在GB 1498261中描述了用于用于纯化在含胚鸡蛋中培养的疫苗产品的纯化方法。
该细胞优选在无血清情况下培养以避免常见污染源。本领域技术人员已知用于真核细胞培养的各种无血清培养基，例如，伊可夫氏(Iscove's)培养基、超CHO培养基(BW公司(BioWhittaker))、EX-CELL(JRH生物科学公司(JRH Biosciences))。此外，可用无蛋白培养基，例如，PF-CHO(JRH生物科学公司)。另外，用于复制的细胞也可在常规含血清培养基中(例如，含0.5％-10％胎牛血清的MEM或DMEM培养基)培养。
可以在贴壁或悬浮培养的细胞中培养病毒。可采用微载体培养。在一些实施方式中，细胞可能适合悬浮培养。悬浮物可使用任何本领域已知的任意方法来澄清。澄清步骤用于从样品中去除细胞、细胞碎片和宿主细胞杂质。在一些实施方式中，通过一个或多个离心步骤来进行澄清。可通过本领域已知的常规方法来进行样品的离心。例如，可使用约1x10- 8m/s的标准化负荷和约5,000x g至约15,000x g的重力来进行离心。
纯化
在另一个方面，可通过一种或多种深度过滤技术来澄清悬浮物。深度过滤是指使用以依次排列的孔径缩小的一系列滤器从溶液中去除颗粒的方法。深度滤器三维基质产生供样品通过的迷宫样路径。深度滤器的主要保留机制依赖于机制深度中的随机吸附和机械包封。在多个方面中，滤膜或片可以是伤口棉、聚丙烯、人造丝纤维、纤维玻璃、烧结的金属、瓷、硅藻土、或其他已知组分。在某些方面中，包含深度滤膜的组合物可经化学处理以赋予带正电性，即阳离子电荷，使得滤器能够捕获带负电的颗粒，如DNA、宿主细胞蛋白质、或聚集体。
本发明所述方法还包括收获和分离病毒或从细胞培养物生成的蛋白质。分离病毒或蛋白质期间，通过标准方法如分离、过滤或超滤从所述培养基中分离细胞。之后按照本领域技术人员充分已知的方法如梯度离心、过滤、沉淀、色谱等浓缩病毒或蛋白质，然后纯化。根据本发明，优选在纯化期间或之后对病毒进行灭活。可在纯化过程中任何点用例如β-丙内酯或甲醛进行病毒灭活。
可在本发明的步骤中使用本领域技术人员可用的任何深度过滤系统。在一个具体实施方式中，可用来自密理博公司(Millipore Corporation)的MILLISTAK+Pod深度滤器系统，X0HC基质来完成通过深度过滤的澄清和纯化。在另一个方面中，可用来自3M纯化公司的ZETA PLUS深度滤器来完成深度过滤步骤。
疫苗生产
疫苗通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可基于完整病毒颗粒、“裂解的”病毒颗粒或基于纯化的表面抗原。抗原也可以病毒体形式存在。可使用本发明制造任意这些类型的疫苗。特别适于制备流感病毒疫苗，然而，其一般包含可检测量的残留DNA和核蛋白。这类流感疫苗包括或病毒，全病毒克隆或裂解病毒体流感疫苗。在疫苗配制成亚病毒粒子形式的情况中，可发现裂解的病毒形式的病毒抗原，其中病毒脂质包膜已经溶解或破坏，或以一种或多种纯化的病毒蛋白质的形式。
另外，疫苗可包括完整病毒，例如，活减毒完整病毒，灭活的完整病毒等。用于灭活或杀死病毒以破坏其感染哺乳动物细胞的能力的方法是本领域已知的。这类方法包括化学和物理手段。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种试剂处理：去污剂、甲醛、福尔马林、BPL、和UV光。用于灭活的其他化学方法包括使用亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)或其任意组合处理。其他病毒灭活的方法是本领域已知的，例如二元乙胺、乙酰基乙烯亚胺或γ射线辐射。优选地，用BPL灭活病毒。
可用烷化剂来灭活残留DNA，该烷化剂将DNA切割成足够小的部分使其不能编码功能性蛋白质。优选地，降解的残留细胞培养物DNA的长度小于500个碱基对。更优选地，降解的残留细胞培养物DNA的长度小于200个碱基对。优选地，本发明中使用烷化剂如β-丙内酯(BPL)提供了减少聚集和污染的额外益处。具有减少聚集的疫苗制剂也可具有改善的免疫原性。US 2009-0304729教导了使用烷化剂处理功能性残留DNA。在组合使用阴离子去污剂和离子交换色谱之前，可通过用阳离子去污剂如CTAB沉淀来去除片段化的残留DNA，如Onions等(2010；Biologicals,38(5):544-551)中所述。Onions的整个下游方法示于图5。在一些实施方式中，本发明可用作Onions方法的部分。
裂解病毒，如流感病毒的方法是本领域所熟知的，例如，参见国际专利公开WO 02/28422、WO 02/067983、WO 02/074336、WO 01/21151等。使用具破坏性浓度的裂解剂破坏或片段化完整病毒来裂解病毒，无论该病毒有感染性(野生型或减毒的)或无感染性(例如，灭活的)。裂解剂一般包括能够破坏并溶解脂质膜的试剂，一般具有与亲水性头部附连的疏水性尾部。优选的裂解剂是十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。这种破坏导致病毒蛋白质的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如阳离子)表面活性剂，如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N,N-二烷基-葡糖酰胺、6-O-(N-庚甲酰)-甲基-α-D-葡萄糖苷(Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、三正丁基磷酸酯、塞弗伦(Cetavlon)、十四烷基三甲铵盐、脂质转染试剂、脂质体转染试剂(lipofectamine)和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性剂，如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。
一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且裂解可在病毒体初始纯化期间进行(例如在蔗糖密度梯度溶液中)。因此，裂解过程可包括：澄清含病毒体的材料(以去除非病毒体物质)，浓缩收获的病毒体(例如使用吸附方法，如CaHPO4吸附)，从非病毒体材料中分离全病毒体，用裂解剂在密度梯度离心步骤中裂解病毒体(例如，用含有裂解剂如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)，然后过滤(例如超滤)以去除不需要的物质。可将裂解病毒体重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。
“基本没有残留DNA”的组合物(如疫苗)是指一种组合物或制剂，其中可检测到低于10ng/0.5ml的小于200个碱基对的残留DNA片段，如毛细管电泳所确定(参见，例如，WO2009/118420)。本发明的组合物中残留DNA的总量优选低于20ng/ml，例如≤10ng/ml、≤5ng/ml、≤1ng/ml、≤100pg/ml、≤10pg/ml等。
因此，用于测量残留DNA的试验一般会是已验证的试验(《工业指南：生物分析方法验证》(Guidance for Industry:Bioanalytical Method Validation).美国健康与人类服务部食品和药物管理局，药物评估和研究中心(CDER)兽药中心(CVM)2001年5月；Lundblad(2001)Biotechnology and Applied Biochemistry 34:195-197)。可采用三种DNA定量的主要技术：杂交方法，如Southern印迹或slot印迹(Ji等，(2002)Biotechniques.32:1162-7)；免疫试验方法，如THRESHOLD系统(Briggs(1991)J Parenter Sci Technol.45:7-12)；和定量PCR(Lahijani等，(1998)Hum Gene Ther.9:1173-80)。本领域技术人员熟悉这些方法，尽管各方法的准确特征可能取决于多种因素，如例如杂交探针的选择、引物的选择和/或用于扩增的引物等。
在另一个方面中，本发明提供了用于制备具有降低核蛋白(NP)水平的流感病毒疫苗组合物的方法。优选地，核蛋白占疫苗中总流感病毒蛋白质质量的不到15％，例如小于<12％、<10％、<8％、<7％、<6％、<5％、<4％、<3％、<2％、或<1％。该疫苗可包含小于3μg NP/10μg HA，小于2.5μg NP/10μg HA，小于2μg NP/10μg HA，小于1.5μg NP/10μg HA，小于1μgNP/10μg HA，小于0.5μg NP/10μg HA或小于0.1μg NP/10μg HA。更优选地，疫苗基本没有NP。这理解为具有低于0.1μg NP/10μg HA。在一些实施方式中，本发明提供的方法可实现制备物中NP量至少减少10倍，例如与经过本发明所述的纯化方法的起始材料相比，流出液(或洗脱液)中NP的量减少至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少75倍、或至少100倍。
测定组合物中蛋白质含量的方法是本领域技术人员已知的。然而，由于NP和NA的分子量基本相同(约60kD)，其通常在非还原胶中共迁移。经典的SDS凝胶电泳可能因此不是测定NP含量的适当方法(参见Chaloupka等，1996,Eur J Clin Microbiol InfectDis.1996年2月；15(2):121-7)。一种测定疫苗批次中NP含量的方法是双向电泳以及后续的密度分析。然而，优选使用同位素标记的合成肽进行同位素稀释质谱，参见，例如Williams等，Vaccine 30(2012)2475–2482。该方法使用采用同位素稀释的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)以及多重反应监测(MRM)。该方法通过代表分析物蛋白质的化学计量比形式的样品蛋白水解消化来量化靶向肽释放。稳定的同位素标记的参考肽插入样品中作为内部标准品(IS)。通过比较同位素比较的参考肽与内源性靶肽的峰区域来实现NP的定量。该方法允许同时定量多种蛋白质，前提是对各特定的靶标而言均包含标记的肽。
或者，使用无标记物质谱(LC/MSE)进行定量，优选四极-飞行时间(Q-Tof)质谱(Getie-Kebtie等，(2013):Influenza and Other Respiratory Viruses 7(4),521–530)。出于此，LC/MS分析期间低碰撞能量与高碰撞能力的交替扫描被用于获得单次实验中的蛋白质性质和含量。基于实验数据进行量化，其显示对于任何给定蛋白质，LC/MSE所测量的三个最强胰蛋白酶肽的平均信号强度在给定浓度下保持恒定，这与蛋白质类型和大小无关。由于信号强度与浓度成比例，所有可估计混合物中任何蛋白质的含量。
本发明还包括基于细胞培养物(优选哺乳动物或禽类细胞)中生长的病毒的流感病毒疫苗，由此疫苗的片段尺寸小于200个碱基对的残留细胞DNA的量低于5ng/剂(例如，低于4ng、低于3ng、低于2ng或低于1ng/剂)，并且由此该疫苗含有低于1μg NP/10μg HA、低于0.5μg NP/10μg HA、或低于0.1μg NP/10μg HA。更优选地，疫苗基本没有NP。这理解为具有低于0.1μg NP/10μg HA。具体地，流感病毒疫苗含有的片段尺寸小于200个碱基的残留DNA低于1ng/剂，并且包含低于0.5μg NP/10μg HA。该疫苗最优选不含含汞防腐剂和抗生素。该疫苗最优选是四价季节性或单价大流行疫苗，其含有的片段尺寸小于200个碱基对的残留细胞DNA的量低于1ng/剂和含有低于0.5μg NP/10μg HA。
可例如通过以下方法获得这类疫苗制备物，其是特别优选的实施方式：用于生产流感病毒疫苗的方法，其中进行以下步骤：流感病毒在细胞培养物中生长，例如，在MDCK悬浮细胞中(WO 1997/037000)。通过0.45微米过滤和CS色谱收获、纯化和浓缩病毒。在加入去污剂(如聚山梨酯，例如
Figure BDA0000990999660000131
80)之后，用BPL处理病毒制备物。之后用CTAB裂解病毒。在超速离心和吸附步骤之后，病毒蛋白质制备物经离子交换色谱(使用TMAE或Sartobind Q作为树脂)。在辛酸钠(对于Sartobind为50mM；对于TMAE为100mM)和氯化钠(对于Sartobind为400mM，并且对于TMAE为200mM)存在下进行色谱。之后，通过合适的手段，如超滤浓缩蛋白质制备物。蛋白质可能任选地掺混其它病毒制备物(在三价或四价季节性疫苗的情况中)，并且任选地经无菌过滤、填充和包装。本发明因此包括可通过该方法获得的流感病毒疫苗。
对技术人员而言，测量残留宿主细胞DNA含量并不表示对该方法的限制或限定特征。相反，实施例中的这些数据支持本发明的实质：用于生成病毒颗粒的大规模方法，其产生高度纯化的产物，可用于临床和商业环境中。可注意到在最终产物中实现特定DNA水平的重要性是产品特异性的。使用连续细胞系产生的用于人类胃肠外使用的病毒产品需要最严格的纯度标准，但是，即使在该情况中，目标也可能在100pg/剂至10ng/剂(使用动物细胞作为生产生物制品的体外基质的WHO要求(WHO Requirements for the Use of AnimalCells as in vitro Substrates for the Production of Biologicals)生物物质要求号50(Requirements for Biological Substances No.50)，WHO技术报告系列号878,1998)或更高间变化，并且可能根据产品的指示调节。
去污剂
本发明使用的阴离子去污剂是以额外物质加入用于进行离子交换的去污剂。因此，去污剂本身并不通过离子交换方法去除或沉淀通过基材处理的物质，但作用是与残留DNA和/或病毒或病毒蛋白质，尤其是HA亚基的疏水区相互作用。在一些实施方式中，用于本发明的阴离子去污剂排除了脱氧胆酸盐和/或月桂基硫酸钠。
在优选的实施方式中，使用一种或多种阴离子去污剂。在优选的实施方式中，使用脂肪酸去污剂(如下文定义)。在特别优选的实施方式中，使用8碳脂肪酸。例如，在一些实施方式中，使用辛酸(例如，辛酸钠)。
在一个方面，向具有感兴趣的蛋白质的溶液中加入阴离子去污剂溶液。如果用于病毒制备物，优选在病毒灭活或裂解之后加入阴离子去污剂，由此可在裂解步骤之前或之后进行灭活。在一个方面中，在离子交换步骤期间或之前加入阴离子去污剂。与未经处理的残留DNA清除相比，加入阴离子去污剂显著改善至少10％、20％、30％、40％或50％的残留DNA清除。市售可得的阴离子去污剂的列表可发现于，例如：http://www.sigmaaldrich.com/life-science/biochemicals/biochemical-products.html？TablePage＝14572921。
优选的阴离子去污剂是胆酸盐、脱氧胆酸盐、1-癸烷磺酸盐、和月桂基硫酸盐。其它合适的去污剂包括十六烷基溴化吡啶鎓、烷基苄基二甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵、十六烷基氯化铵、和鸟氨酰基-半胱氨酰-十四烷基酰胺。
在一些实施方式中，合适的阴离子去污剂是脂肪酸去污剂。在本发明的内容中，脂肪酸去污剂被理解为脂肪酸的盐，尤其是选自C4-C18碳链，优选C6-C10碳链，例如C6、C8和C10的羧基脂肪酸。优选地，脂肪酸是线性饱和的。在一些实施方式中，合适的脂肪酸去污剂是辛酸钠或辛酸的类似盐。如本文所述，在中性pH下加入辛酸盐(辛酸钠)已经显示改善的蛋白质回收率并且防止蛋白质聚集或非特异性结合。在某些实施方式中，包含感兴趣的蛋白质(如抗体或其片段、抗原、治疗性蛋白质、毒素、肽等)的辛酸溶液的终浓度具有25mM至300mM，优选50mM至250mM，特别优选75mM至200mM的合适去污剂浓度。该浓度可以是约25mM、约50mM、约75mM、约100mM、约125mM、约150mM、约175mM、200mM、约250mM或约300mM，取决于离子交换树脂或色谱条件。本领域技术人员将能够确定最合适的脂肪酸去污剂并凭经验阐述脂肪酸去污剂的浓度以制备溶液。例如，已知具有低级碳链的羧酸去污剂将具有较低的去污剂性质，而高级碳链将具有降低的溶解性。一般而言，由于破坏任何疏水相互作用和更多地减少杂质，较高的去污剂浓度似乎在流感病毒的不同毒株之间提供更强的过程，如图2所示。然而，重要的是，脂肪酸去污剂的量以一定量存在并在一定pH下以防止溶液中的蛋白质和残留DNA沉淀。
在另一个方面中，包含蛋白质的溶液的pH维持在蛋白质、核蛋白和残留DNA没有(或以不明显的量)发生沉淀的pH下。例如，对于辛酸，是中性pH。本领域技术人员可凭经验易于确定防止蛋白质沉淀所需的最优pH。优选地，混合物的最终pH应保持在约7.0至9.0。在一些实施方式中，混合物的最终pH保持在约7.2至7.5，例如约7.2-7.4，约7.2-7.3，约7.3-7.5，约7.4-7.5。在一些实施方式中，混合物的最终pH保持大于或等于约7(如约7-9，例如，约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0等)。在一些实施方式中，包含蛋白质、残留DNA和辛酸盐的溶液的pH不应降低至约6.0或更低(例如，约5、4和3)。可在向样品中加入阴离子去污剂(例如，辛酸盐)之前和/或之后调节pH。在一些实施方式中，可在加入阴离子去污剂(例如，辛酸盐)之前调节混合物的pH。通常，可使用任何本领域认可的酸或缓冲剂来改变或调节混合物的pH，包括，例如，含磷酸盐和含tris的缓冲剂。
本发明的方法也可用于经部分纯化的蛋白质样品以通过在防止混合物中蛋白质沉淀的条件下将混合物与阴离子去污剂溶液接触并将混合物通过离子交换基质来进一步去除DNA或不需要的杂质。本发明的方法将宿主细胞DNA污染物有效去除至如WHO对于连续细胞系所推荐的<10ng DNA/剂的浓度，并将核蛋白去除至低于0.5μg NP/10μg HA的浓度。在一个具体方面中，由SDS-PAGE确定的通过本发明去除的核蛋白的量为至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％和90％。
包含阴离子去污剂的溶液中的蛋白质和残留DNA的组合物经进一步处理以回收所需产物。在阴离子去污剂存在下，残留DNA更好地吸附在阴离子交换膜上。令人惊讶的是，如发明人通过对吸附汇集液的电泳分析所鉴定，在阴离子交换膜上也捕获了流感病毒核蛋白。发明人鉴定当与阴离子去污剂溶液接触时，核蛋白与残留DNA一起移动。该发现之前尚未显示并且产生基本没有残留DNA的富集的流感病毒产物。
因此，在通过用阴离子去污剂处理含污染物的样品(例如，细胞培养物和澄清的体混合物)去除残留宿主细胞污染物和按照本文所述的后续纯化步骤之后，该样品可含有不超过约10000ng/mg(例如，不超过约10000、5000、1000、500、200、100、50、25或10ng/mg)的蛋白质污染物。在一些实施方式中，这类蛋白质污染物包括不超过约10000ng/mg核蛋白，例如，不超过约10000、5000、1000、500、200、100、50、25或10ng/mg核蛋白。
因此，包含残留DNA和核蛋白的任何流感病毒产物可通过与阴离子去污剂溶液接触而富集HA和NA蛋白质，并通过离子交换基质处理。本领域技术人员将能够将本发明的方法应用于从细胞培养物或鸡蛋培养物中生成的流感病毒产物。
色谱
本发明可以商业规模的处理技术使用，其利用离子交换色谱来产生大量的最后产品。已知在大规模制备期间，残留DNA和病毒颗粒或病毒蛋白质之间的结合亲和性的影响可在病毒颗粒浓缩期间被进一步复合，因为DNA可能在病毒颗粒聚集期间被物理捕获。一旦DNA特异性或非特异性结合至病毒，或被病毒或蛋白质的聚集体捕获，如本领域所述使用离子交换基质作为一种用于有效去除DNA的手段而言变得相对低效。因此，本发明涉及通过用阴离子去污剂溶液和/或由盐缓冲剂在色谱基质上提供的合适离子强度或浓度纯化来去除残留DNA的纯化方法。
阴离子Q膜色谱胶囊可包含Mustang Q膜色谱胶囊(来自波乐公司(PallCorporation))或Sartobind Q(强碱性阴离子交换膜，来自Sartorius Stedim生物技术公司)。可使用与适于形成阴离子交换树脂的固相附连的任何带正电配体，如季铵基团。市售可得的阴离子交换树脂包括来自应用生物系统公司(Applied Biosystems)的DEAE纤维素，POROS.PI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50，来自萨托瑞斯公司(Sartorius)的SARTOBIND.Q，MONO Q、MINI Q、Source 15Q和30Q、Q、DEAE和ANX SEPHAROSE.FAST FLOW,QSEPHAROSE高效，QAE SEPHADEX.和FAST Q SEPHAROSE(GE医疗公司(GE Healthcare))，来自特鲁利贝克(J.T.Baker)的WP PEI、WP DEAM、WP QUAT，来自柏楉实验室公司(BioChromLabs Inc.)的HYDROCELL DEAE和HYDROCELL QA，来自伯乐公司(Bio-Rad)的UNOSPHERE Q、MACRO-PREP DEAE和MACRO-PREP High Q，来自波乐技术公司(Pall Technologies)的陶瓷HyperD Q、陶瓷HyperD DEAE、TRISACRYL M和LS DEAE、Spherodex LS DEAE、QMA SPHEROSILLS、QMA SPHEROSIL M和MUSTANG Q，来自陶氏液体分离公司(Dow Liquid Separations)的DOWEX细目强碱I型和II型阴离子树脂和DOWEX MONOSPHERE 77，弱碱阴离子，来自密理博公司(Millipore)的INTERCEPT Q膜、MATREX CELLUFINE A200、A500、Q500、和Q800，来自EMD公司的FRACTOGEL EMD TMAE、FRACTOGEL.EMD DEAE和FRACTOGEL EMD DMAE，来自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)的I型和II型AMBERLITE弱碱阴离子交换器、I型和II型DOWEX弱和强阴离子交换器、I型和II型DIAION弱和强阴离子交换器、DUOLITE，来自东曹公司(Tosoh)的TSKgel Q和DEAE 5PW和5PW-HR、TOYOPEARL SUPERQ-650S、650M和650C、QAE-550C和650S、DEAE-650M和650C，来自沃特曼公司(Whatman)的QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、EXPRESS-Ion D和EXPRESS-Ion Q。
以流出模式进行离子交换基质上的色谱分离。用于色谱捕获步骤的具体方法，包括使样品流过柱、洗涤和洗脱，取决于使用的具体柱和树脂，并且一般由生产商提供或是本领域已知的。
在一个替代的方面中，也可在色谱步骤期间调节离子强度。可从溶液中存在的所有离子的摩尔浓度和电荷数确定缓冲溶液的离子强度。可使用以下公式计算离子强度I：
Figure BDA0000990999660000181
其中ci是离子i的摩尔浓度(mol·dm-3)，zi是该离子的电荷数，并且对溶液中的所有离子取总和。一般而言，1:1电解质如NaCl，离子强度等于其分子浓度，而多价离子对溶液中离子强度贡献更多，例如，2:2电解质MgSO4的离子强度是NaCl的4倍。
优选的离子强度将优化去除不需要的残留DNA与同时以低价的方式保持高病毒或蛋白质产率并保留病毒抗原性之间的平衡。
本领域技术人员将能够根据，例如，样品特征、色谱基质性质和分离效率来设计色谱分离程序。优选在处于或接近中性pH，如约7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7和7.8的pH下提供盐水缓冲剂。pH不应该降至低于约6，因为在阴离子去污剂(例如，脂肪酸去污剂)存在下感兴趣的蛋白质可能丧失其活性，聚集或沉淀。合适的缓冲剂(例如，氯化钠缓冲剂)的浓度可以是约100mM和1M，如100mM、150mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM和1M。最优盐浓度取决于使用的离子交换色谱树脂。本领域技术人员可易于通过常规测试确定最优盐浓度。对于TMAE树脂，最佳氯化钠浓度是约300mM，对于SARTOBIND Q该浓度超过400mM(对于使用辛酸盐作为去污剂；参见以下实施例)。
本文所用术语“色谱”是指一种方法，其中通过将混合物渗滤通过吸附剂，将混合物中的感兴趣的溶质(例如感兴趣的蛋白质)与混合物中的其它溶质分离，在该方法的特定缓冲条件中，吸附剂由于溶质的性质(如pI、疏水性、尺寸和结构)更强或更弱地吸附或滞留溶质。在本发明的方法中，可使用色谱在从混合物中去除沉淀物之后再去除污染物，混合物包括但不限于细胞培养物或澄清的细胞培养上清。
本文所用术语“杂质”一般是指残留宿主细胞DNA、空病毒颗粒、聚集的蛋白质或除了产物的指定组分以外的物质。
本发明内容中使用的“处理”或“处理的”是指在包含细胞副产物和碎片、胶态颗粒、大生物分子和高细胞密度的起始材料或澄清之后进行的一个或多个下游步骤。处理步骤中使用的技术包括分离、纯化、浓缩、离心、过滤、配制、灭活、裂解和用于无菌生物产品的各种分析操作。“处理的”也可描述将样品流过或通过色谱柱、树脂、膜、滤器或其它机制的步骤，并且可包括通过各机制的连续流以及在各机制之间暂停或停止的流。
除非另有明确说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的工艺不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。在有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将组合与第三种组分合并等。
术语“离子交换材料”是指带负电(例如，阳离子交换树脂)或带正电(例如，阴离子交换树脂)的固相。在一个实施方式中，可通过将一个或多个带电荷的配体(或吸附剂)附连至固相，例如共价连接来提供电荷。或者或另外，电荷可以是固相的固有性质(例如，在二氧化硅的情况中，其整体带负电)。
因此，本发明包括但不限于以下实施方式：
1.一种方法，包括使含有感兴趣的蛋白质和阴离子去污剂的第一溶液在非沉淀条件下经过离子交换基质，以获得含有所述感兴趣的蛋白质的第二溶液，其中所述第二溶液含有比所述第一溶液少的残留细胞污染物。
2.如实施方式1所述的方法，其特征在于，所述第一溶液选自下组：细胞或组织裂解液、细胞培养物、细胞培养上清、血浆、和经部分纯化的蛋白质溶液。
3.如前述实施方式中任一项所述的方法，其特征在于，所述感兴趣的蛋白质选自：治疗性蛋白质、免疫原性蛋白质(例如，病毒抗原)、和抗体或其抗原结合片段。
4.如前述实施方式中任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子去污剂选自：脂肪酸去污剂。
5.如前述实施方式中任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子去污剂不同于蛋白质纯化方法中使用的任何其它去污剂。
6.如前述实施方式中任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子去污剂不包括脱氧胆酸盐和/或月桂基硫酸钠。
7.如前述实施方式中任一项所述的方法，其特征在于，所述离子交换基质包括碱性阴离子交换膜。
8.如前述实施方式中任一项所述的方法，其特征在于，所述非沉淀条件包括处于或接近中性pH。
9.如前述实施方式中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二溶液是洗脱液。
10.如前述实施方式中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括进一步纯化的步骤。
11.如前述实施方式中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括进行无菌过滤的步骤。
12.如前述实施方式中任一项所述的方法，其特征在于，所述方案还包括将所述感兴趣的蛋白质配制成药物组合物的步骤。
13.如前述实施方式中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括进行无菌过滤的步骤。
14.如实施方式12或13所述的方法，其特征在于，所述药物组合物是预防性组合物、治疗性组合物、或其组合。
15.如实施方式12-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
16.如实施方式12-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述药物组合物还包含佐剂。
17.如实施方式12-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述药物组合物包装成无菌封闭系统的步骤。
18.如实施方式17所述的方法，其特征在于，所述无菌封闭系统选自：药瓶、注射器和容器。
19.如实施方式17或18所述的方法，其特征在于，所述无菌封闭系统是塑料或玻璃。
20.如实施方式17-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述无菌封闭系统包括硅化表面。
21.如实施方式12-20中任一项所述的药物组合物在制备用于给予有需要的对象的药物中的用途。
22.如实施方式12-20中任一项所述的药物组合物，用作给予对象的药物。
23.一种方法，包括向对象给予如实施方式12-20中任一项所述的药物组合物。
24.每剂包含不超过5ng的残留DNA和不超过1.0μg核蛋白的病毒疫苗。
25.如实施方式24所述的病毒疫苗，其每剂包含不超过1ng的残留DNA和不超过0.5μg核蛋白。
26.如实施方式24所述的病毒疫苗，其每剂包含不超过1ng的残留DNA和不超过0.1μg核蛋白。
27.如实施方式24-26中任一项所述的病毒疫苗，其特征在于，所述病毒疫苗是流感病毒疫苗。
28.如实施方式24-27中任一项所述的病毒疫苗，所述病毒疫苗还包含佐剂。
29.如实施方式28所述的病毒疫苗，其特征在于，所述佐剂选自下组：铝佐剂、水包油佐剂、病毒体和Toll-样受体(TLR)激动剂。
还通过以下实施例说明本发明，这些实施例不应构成限制。
实施例
H5N1病毒在MDCK悬浮细胞中增殖、收获并处理，如Onions等，2010所述。裂解的病毒制备物经过使用SARTOBIND Q(萨托瑞斯公司)或FRACTOGEL TMAE(EMD密理博)膜的离子交换色谱。对于TMAE发现的最优盐浓度确定为约300mM，而对于SARTOBIND Q发现的最优浓度大于400mM。用不同去污剂和离液剂进行制备。除了pH 7.2的精氨酸组合物以外，最终组合物的pH是7.5。由Picogreen评估DNA减少并且由BCA试验评估蛋白质产率。总之，SARTOBINDQ在DNA减少中比TMAE表现更好；然而，与仅NaCl相比，使用辛酸盐的所有运行显示增加的DNA减少。在SARTOBINDQ膜上用50mM辛酸盐和400mM NaCl可得到强效结果。由于精氨酸与BCA试验的干扰，精氨酸的BCA值可能不精确。由于DNA去除不充分，没有进一步研究精氨酸的产率。这些条件的BCA和DNA数据示于图3和4。
进一步通过RP-HPLC检验来自以下三种运行的样品的HA含量：(i)对照-50mM磷酸盐，300mM NaCl，pH 7.5；(ii)50mM磷酸盐，100mM辛酸钠，200mM NaCl，pH 7.5；(iii)50mM磷酸盐，100mM辛酸钠，500mM NaCl，pH 7.5。这些运行被认为是检验的条件的最佳情况。较高的辛酸盐浓度基于以下观点视作在毒株之间提供更强的处理，即较高浓度的辛酸盐将更有效地破坏任何疏水性相互作用并且总体使杂质减少的更多。RP-HPLC的产率经计算并绘于图1。
来自这三种运行的材料和通过SDS-PAGE分析并可见于图2。由于蛋白质浓度低，样品在凝胶上运行之前需要样品制备。样品经浓缩2.5倍以确保蛋白质浓度足够高到可通过SDS-PAGE观察到。使用15mL Amicon ULTRA SPIN Tub和10,000MWCO膜来浓缩样品。吸附汇集液也可在缓冲剂中稀释并浓缩2.5倍以确保低分子量污染物在浓缩过程期间不损失。这通过比较标记吸附和吸附，浓缩的泳道证明。可通过比较对照运行和含辛酸盐的运行看到纯度的显著差异。与仅用NaCl来优化产率性能的运行相比，辛酸盐运行中的核蛋白明显减少。
这些实验已经成功地显示，二级相互作用，像自然中的疏水性，在AEX色谱吸附带负电的杂质DNA的能力下降中起到作用。不希望受到理论限制，向吸附汇集液中加入辛酸盐可能破坏这种疏水性相互作用并且使得DNA和核蛋白结合至膜或树脂。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和构思内。
参考上述单个部分中的本发明的各种特征和实施方式在合适时应用于其他部分，细节上作必要的修改。因此，合适时，一个部分中专有的特征可与其他部分中专有的特征组合。
在说明书，包括权利要求书中，在上下文允许时，“包括”或其变体如“包含”或“含有”旨在包括所述的一个或多个元素(例如，整数)，而不必然排除任何其它元素(例如，整数)。
本领域技术人员应了解或能够确定采用常规实验即可获得本文所述的本发明具体实施方式的许多等同形式。这类等同形式应包含在所附权利要求书的范围内。

Claims (5)

1.一种从包含感兴趣的流感病毒蛋白质的制备物中去除流感病毒核蛋白的方法，其中病毒蛋白质包括血凝素HA，所述方法包括以下步骤：
a. 裂解从细胞培养物或鸡蛋中衍生的病毒制备物，
b. 在非沉淀条件下向所述病毒制备物加入辛酸或辛酸盐，所述辛酸或辛酸盐以25mM–500 mM的浓度存在，其中没有明显的蛋白质或DNA的沉淀发生，其中所述病毒制备物和辛酸或辛酸盐的混合物的最终pH在7.0至9.0；和
c. 使所述病毒制备物通过离子交换基质，其中所述离子交换基质是Sartobind Q或Fractogel TMAE，从中所述核蛋白结合至所述离子交换基质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
a)澄清步骤；
b)浓缩步骤；
c)深度过滤步骤；和/或
d)在离子交换步骤之前的灭活步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辛酸盐是辛酸钠。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述灭活步骤包括用BPL灭活。
5.权利要求1-4任一方法的用途，用于制备药物组合物。
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