CN1477973A - 裂解有包膜病毒制品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含裂解有包膜病毒制品的疫苗制剂，其中病毒为RSV或PIV，制备这样的制剂的方法，和这样的制剂在预防或者治疗疾病中的用途。

Description

裂解有包膜病毒制品
本发明涉及新的疫苗制剂，制备这样的疫苗的方法和这样的疫苗在预防或者治疗疾病中的用途。本发明尤其涉及包含裂解有包膜病毒(split enveloped virus)制品的疫苗。
有包膜病毒是一种其中病毒核心由含有病毒蛋白的富含脂质的外壳(outer coat)围绕的病毒。
在一个具体实施方案中，本发明的疫苗制剂的裂解有包膜病毒来源于呼吸道合胞病毒(RSV)或者副流感病毒(PIV)。通过举例，具体讨论RSV。
人呼吸道合胞病毒为副粘病毒科的成员并引起下呼吸道疾病，特别是在幼儿和婴儿中。最新报道提示RSV也是成人，特别是老年人的重要病原体。
RSV为具有15222个核苷酸的非-节段、负链核糖核酸(RNA)基因组的有包膜病毒，其编码11个信使RNAs，每种编码单一的多肽。11种蛋白中有三种为跨膜表面蛋白：G(附着)、F(融合)和SH蛋白。一种蛋白是病毒体基质蛋白(M)，三种蛋白是核苷酸的成分(N、P和L)，两种蛋白是非结构蛋白(NS1和NS2)。存在两个另外的蛋白M2-1和M2-2。存在RSV的两个抗原性不同的亚组，称为亚组A和B。已经测定得自这些亚组的毒株的特征性质，其主要差别在于G蛋白上，而F蛋白保守。
呼吸道合胞病毒(RSV)以季节性爆发的方式发生，在温带气候的冬天和在亚热带气候(warmer climate)的雨季期间达到高峰。
RSV为儿童的严重的下呼吸道疾病的主要病因。据估计，40-50％患有支气管炎的住院儿童和25％患有肺炎的住院儿童是因为RSV感染的直接结果而住院。主要的RSV感染通常发生在一岁以下的婴幼儿；95％的两岁儿童具有感染后的血清学证据，100％的成年群体更是如此。
在婴儿和幼儿中，从上呼吸道至下呼吸道的感染进程中大约40％的病例和临床表现属于支气管炎或肺炎。2-6个月龄的儿童处于发生RSV感染(主要是呼吸衰竭)的严重表现的最高危险中；然而，患有潜在的心脏病或肺病的任何年龄的儿童、早产儿和免疫力受损的儿童还处于严重并发症等的危险中。
症状再感染发生在一生中并且变得日益明显的是RSV也是重要的成人病原体，尤其是老年人。
RSV感染在成人中的诊断数字几乎肯定是低估的，部分是由于它被认为是儿童的感染。结果，未寻找成人体内的病毒的证据以解释呼吸道疾病。另外，在得自个体的鼻分泌物中难以鉴定RSV，因为对大多数成人而言，这些个体对病毒具有某种程度的部分免疫力。当RSV感染时，年轻人到中年人一般发展为持续的感冒样综合征。老年个体可以发展为长期的呼吸综合征，后者实质上不能与具有上呼吸道症状(可伴随有下呼吸道受累，包括肺炎)的流感区别。住院的老年人群具有特别的意义，因为他们包括大量的聚集在一起的易感个体。感染通过这样的群体的传播难以控制，他们中的许多人具有多种医学问题，这些问题可以促使他们易患更加严重的疾病。另外，评价作为成人和社区健康老年人住院原因的RSV感染的影响的最近研究报告进一步指出在这些群体中的严重下呼吸道疾病中RSV感染的重要作用。RSV已被鉴定为引起导致成人住院的严重下呼吸道疾病的四种最常见病原体之一。也已证实在老年人中，严重的RSV感染不局限于护理室或爆发的情况。当然，RSV感染是在居住于社区的老年患者中严重疾病的可以预测的病因。与甲型流感的住院相似，与RSV感染相关的那些人与实际的发病率有关，如由延长的留院观察、特别护理住院率和高的换气(ventilatory)支持率证明的那样。
这些研究指明能够预防RSV感染在婴儿、成人和老年人例如社区健康和住院老年人中的严重并发症的有效疫苗的医学和经济需求。相似的考虑同样适用于PIV。
本发明提供了包含裂解有包膜病毒制品的疫苗制剂，其中病毒为呼吸道合胞病毒或者副流感病毒。
合适地，疫苗制剂还包含药学上可接受的赋形剂。
本发明的疫苗制剂源于能够被裂解的有包膜病毒。有包膜病毒可以衍生自广泛来源，包括来自人或动物源的病毒。病毒合适地为RSVA、RSVB、PIV1、PIV2或者PIV3。当病毒属于动物来源时，来源优选为牛。当病毒属于动物来源例如牛来源时，病毒优选为重组病毒。
本发明的疫苗制剂任选包含另一种选自以下的裂解病毒：流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、肺炎后病毒(metapneumovirus)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、登革热病毒、黄热病病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒、风疹病毒、东方型、西方型和委内瑞拉型马脑炎病毒及人免疫缺陷病毒。
本发明的疫苗制剂任选包含抗原或来自与所述裂解制品组合的病原体的抗原，以提供对抗疾病的另外的保护。合适的抗原(它不需要来自裂解制品)包括例如得自任何以上列出的病毒和引起呼吸道疾病的病原体，例如肺炎链球菌的抗原。
本发明的疫苗制剂优选在释药(delivery)后能够刺激抑制有包膜病毒的保护性免疫反应。
通过用具有破裂浓度的裂解剂，裂解或者分裂整个病毒，包括感染性的(野生型或减毒型)或非感染性的(例如灭活的)病毒，进行病毒的裂解，所述裂解剂通常为(但不是必须为)表面活性剂。待裂解的病毒也可以是嵌合重组病毒，具有得自一种以上不同病毒的免疫原性的元件。破裂导致所有的病毒蛋白完全或者部分溶解，而这种溶解改变病毒的完整性。
通过使PIV或RSV病毒与本发明的裂解剂接触，以完全破裂病毒的包膜，可以合适地得到裂解病毒。其它的病毒蛋白优选为完全或者部分溶解的。裂解后完整性的丧失使得病毒成为非感染性的，其可以通过合适的体外滴定分析法评价。一旦破碎，病毒包膜蛋白通常不再与整个完整的病毒体结合。其它的病毒蛋白优选被完全或者部分地溶解，因此与裂解后的整个完整的病毒体不结合，或者仅仅部分结合。
如在此描述的，在蔗糖垫层(cushion)实验中，用蛋白质印迹(Western Blot)分析和电子显微镜目测观察，裂解剂对病毒包膜和病毒蛋白的作用可以伴随有裂解的病毒和病毒蛋白的迁移。
本发明的裂解疫苗的制备可以另外包括除去裂解剂和某些或者大部分病毒脂质物质的步骤。裂解有包膜病毒的制备方法还可以包括多种不同的过滤和/或其它的分离步骤，例如超速离心、超滤、区带离心和层析的多种组合步骤，任选灭活步骤，例如用甲醛或者β-丙醇酸内酯或UV处理，后者可以在裂解前或者裂解后进行。裂解过程可以作为分批工艺、连续工艺或者半连续工艺进行。
本发明的裂解疫苗通常包含膜碎片和膜包膜蛋白以及非膜蛋白，例如在明显的整个病毒体不存在下的病毒基质蛋白和核蛋白。本发明的裂解疫苗通常包含大多数或者所有的病毒结构蛋白，尽管当它们在整个病毒中出现时不必为相同的比例。优选的裂解病毒制品包括至少一半的病毒结构蛋白的成分，优选包括所有的这样的蛋白。另一方面，亚单位疫苗必须由一种或者几种高纯化病毒蛋白组成。例如，亚单位疫苗可包含纯化病毒表面蛋白，已知后者在接种疫苗后起激发所需的中和病毒抗体的作用。
在本发明中，可以使用多种裂解剂例如非离子型和离子型表面活性剂以及多种其它的试剂。在本发明的内容中有用的裂解剂的实例包括：
1.胆汁酸及其衍生物。胆汁酸包括胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、石胆酸、熊去氧胆酸、猪脱氧胆酸和衍生物，像前述的胆酸的糖-、牛磺-、酰胺基丙基-1-丙磺基-、酰胺基丙基-2-羟基-1-丙磺基衍生物或者N，N-双(3D葡糖酸酰胺基丙基)脱氧胆酰胺(deoxycholamide)。具体的实例为脱氧胆酸钠-NaDOC。
2.非离子型表面活性剂例如octoxynols(TritonTM系列)、聚氧乙烯醚例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween 80TM)，及通式(I)的聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯：
              (I)HO(CH2CH2O)n-A-R其中n为1-50，A为键或-C(O)-，R为C1-50烷基或苯基C1-50烷基，及它们中的两个或者更多个的组合。具体的实例为：Tween80TM、TritonX-100TM和laureth9；
3.烷基糖苷或烷硫基糖苷，其中烷基链介于C6-C18之间，一般介于C8-C14之间，糖部分为任何戊糖或己糖或其具有不同的键的组合，像1-＞6、1-＞5、1-＞4、1-＞3、1-2。烷基链可以是饱和、不饱和和/或分支的；
4.以上3的衍生物，其中一或更多个羟基，优选6-位羟基被修饰，像酯、乙氧基化物、硫酸酯、醚、碳酸酯、磺基琥珀酸酯、羟乙磺酸酯、乙醚羧酸酯、季铵化合物；
5.酰基糖，其中酰基链介于C6-C18之间，一般介于C8-C12之间，糖部分为任何戊糖或己糖或其具有不同的键的组合，像1-＞6、1-＞5、1-＞4、1-＞3、1-2。酰基链可以是饱和的、不饱和的和/或分支的；
6.结构R-N，N-(R1，R2)-3-氨基-1-丙磺酸酯的磺基甜菜碱，其中R为介于C6-C18之间，一般介于C8-C16之间的任何烷基链或芳基烷基链。烷基链R可以是饱和的、不饱和的和/或分支的。R1和R2烷基链介于C1-C4之间，一般为C1；
7.结构R-N，N-(R1，R2)-甘氨酸的甜菜碱，其中R为介于C6-C18之间，一般介于C8-C16之间的任何烷基链。烷基链可以是饱和的、不饱和的和/或分支的。R1和R2为介于C1-C4之间，一般为C1的烷基链；
8.结构R-(-O-CH2-CH2-)n-OH的聚氧乙烯烷基醚，其中R为介于C6-C20之间，一般介于C8-C14之间的任何烷基链。烷基链可以是饱和的、不饱和的和/或分支的。n介于5-30之间，一般介于8-25之间；
9.结构R-(N-R1)-葡糖酰胺的N，N-二烷基-葡糖酰胺(glucamide)，其中R为介于C6-C18之间，一般介于C8-C12之间的任何烷基链。烷基链可以是饱和的、不饱和的和/或分支的或者环状的。R1和R2为介于C1-C6之间，一般为C1的烷基链。可以用戊糖或者己糖修饰糖部分；
10.Hecameg：(6-O-(N-庚基-氨基甲酰基)-甲基-α-D-吡喃型葡萄糖苷)；
11.结构R-C6H4-O-(-CH2-CH2-)n-OH的烷基苯氧基聚乙氧基乙醇，其中R为介于C6-C18之间的任何烷基链，一般为C8的烷基链。烷基链可以是饱和的、不饱和的和/或分支的(n＞＝3)；
12.结构R，-N+(-R1，-R2，-R3)的季铵化合物，其中R为介于C6-C20之间的任何烷基链，一般为C20的烷基链。烷基链可以是饱和的、不饱和的和/或分支的。R1、R2和R3为介于C1-C4之间的烷基链，一般为C1的烷基链。
13.Sarcosyl：N-月桂基肌氨酸钠盐；
14.CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)或塞他弗伦(Cetavlon)。
最优选为NaDoc和Sarcosyl。在室温下适宜把裂解剂与待裂解的病毒一起温育，例如过夜，以进行裂解。合适的话，可以采用裂解剂的组合。
裂解疫苗制品优选包含至少一种表面活性剂，后者可以具体为非离子型表面活性剂。一种或者更多种非离子型表面活性剂可为来自裂解过程的残留物，和/或加入至裂解后的病毒中。确信裂解抗原材料在非离子型表面活性剂存在下是稳定的，尽管应理解本发明并不一定就取决于这样的情况。合适的稳定的非离子型表面活性剂包括octoxynols(TritonTM系列)、聚氧乙烯醚例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween 80TM)，及通式(I)的聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯：
              (I)HO(CH2CH2O)n-A-R其中n为1-50，A为键或-C(O)-，R为C1-50烷基或苯基C1-50烷基，及它们中的两个或者更多个的组合。
得自Triton系列的优选非离子型表面活性剂包括Triton X-100(叔辛基苯氧基多乙氧基乙醇)、Triton X-165、Triton X-205、Triton X-305或Triton X-405 Triton N-101。Triton X-100为特别优选。
优选的非离子型表面活性剂还包括(但不限于)以上的通式(I)的聚氧乙烯醚，具体为：聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-9-硬脂基醚、聚氧乙烯-8-硬脂基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。聚氧乙烯醚最优选为聚氧乙烯-9-月桂基醚(laureth9)。在CAS登记号中公开了聚氧乙烯月桂基醚的另外的术话或名称。聚氧乙烯-9-月桂基醚的CAS登记号为：9002-92-0。在默克索引(第12版，登记号7717，Merck & Co.Inc.，Whitehouse Station，N.J.USA；ISBN 0911910-12-3)中描述了聚氧乙烯醚例如聚氧乙烯月桂基醚。通过使环氧乙烷与十二烷醇反应可形成laureth 9，且具有平均9个环氧乙烷单位。
存在于最后疫苗制剂中的稳定的表面活性剂的终浓度介于0.001-20％，更优选为0.01-10％，最优选最多可达约2％(w/v)。当一种或者更多种表面活性剂存在时，这些表面活性剂通常以每种最多可达约2％的浓度存在于最后的制剂中，通常每种最多可达约1％的浓度，一般每种最多可达约0.6％的浓度，更通常以最多可达约0.2或0.1％的痕量存在。表面活性剂的任何混合物可以存在于本发明的疫苗制剂中。
通过在血清或者在无血清过程中于合适的细胞底物上复制，可以制备有包膜病毒。组织培养生长病毒可以在例如人细胞，如MRC-5、WI-38、HEp-2或猿猴细胞例如AGMK、Vero、LLc-Mk2、LLc-Mk2、FRhL、FRhL-2或牛细胞例如MDBK、或犬细胞例如MDCK，或原代细胞例如鸡胚成纤维细胞、或任何其它的适合产生用于疫苗目的的病毒的细胞类型，包括衍生自以上提及的细胞系的克隆中产生。
裂解疫苗制品优选与药学上可接受的赋形剂组合。所使用的药学上可接受的赋形剂可以是疫苗制品领域中的那些常规赋形剂。在任何给定的疫苗制剂中所采用的赋形剂应两者相互适配且与组合物的必需成分适配以便不相互作用，如果有任何相互作用的话，它将削弱各成分与活性剂的性能。所有的赋形剂当然必须是无毒的并具有足够的纯度以使它们适于人体使用。赋形剂的合适实例为本领域熟知的。
疫苗制剂也可以优选包括佐剂，后者可以为载体和/或免疫刺激剂。佐剂可以为得自裂解过程的残留物，和/或加入到裂解后的病毒中。用于本发明疫苗的合适的佐剂为本领域熟知的。
因此，本发明另一方面提供疫苗制剂，它包含与佐剂组合的裂解呼吸道合胞病毒或者裂解副流感病毒疫苗制品。所述制剂也合适地包含药学上可接受的赋形剂。
适于使用的佐剂的形式通常依给予疫苗的方法而定。本发明的疫苗制品可以通过借助以下途径给予所述疫苗，以用于保护或者治疗易易疾病或者患有疾病的哺乳动物：
(a)粘膜途径，例如口服/颊/肠道/阴道/直肠或鼻途径；
(b)通过非肠道传递，例如肌内，或皮下给药；或者
(c)通过透皮、经真皮、表皮内或者经皮传递。
本发明扩展至治疗和保护的这样的方法。
本发明的疫苗制品可以任选经所列出的途径的组合给药。经粘膜途径传递
除了避开对引起疼痛的注射的需要和因“打针恐惧”的对患者依从性的负面影响以外，粘膜接种例如通过鼻内方法是吸引人的，因为在动物中已显示，粘膜给予抗原对在粘膜表面诱导保护性应答具有良好的效力，粘膜表面是许多病原体进入的途径。另外，提示粘膜接种，例如鼻内接种，不仅可以在鼻粘膜内而且在远端粘膜部位例如生殖粘膜诱导粘膜免疫性。
本发明的鼻内给药可以以滴剂、喷雾剂，或干燥粉末形式进行。雾化或者气溶胶化疫苗制剂也形成本发明的部分。肠制剂例如口服给药的胃耐受胶囊和颗粒、直肠或阴道给药的栓剂和颊或口服给药的泡罩剂(blister)也形成本发明的部分。
本发明优选的粘膜给药途径是通过鼻内途径的。
可以采用用于鼻内传递的任何合适的佐剂，并且以任何合适的形式存在，例如溶液、非-泡状溶液、悬浮液或粉末。优选的佐剂包括那些在WO99/52549中举例说明的那些物质，其整个内容通过引用结合到本文中。优选的佐剂包括(但不限于)非离子型表面活性剂，例如Tween 80TM、Triton X-100TM和laureth9及它们的组合。
非离子型表面活性剂可以与免疫刺激剂有利地结合，例如脂质A的无毒性衍生物，包括那些在US4,912,094和GB2,220,211中描述的那些，包括一磷脂酰脂质A和二磷脂酰脂质A，例如3-de-O-酰化一磷脂酰脂质A(3D-MPL)和3-de-O-酰化二磷脂酰脂质A的无毒性衍生物。优选的组合为Laureth-9与3D-MPL的组合。如果合适，以上免疫刺激剂也可以用于不含有非离子型表面活性剂的制剂。
在本发明的另一个实施方案中，佐剂为ADP-核糖基化毒素或其突变体。这样的毒素的实例为得自大肠杆菌的Heat Labile Toxin(热不稳定毒素)(LT)及其突变体例如LTR192G，以及这些毒素的片段例如结合神经节苷脂的成分(LTB)。
本发明疫苗的鼻内给药的优选装置为喷雾装置。合适的鼻喷雾装置可从Becton Dickinson，Pfeiffer GmBH和Valois经市售获得。
鼻内使用的优选喷雾装置不依它们对使用者施加的压力的性能而定。压力阈控制(threshold)装置是特别有用的，因为仅当达到压力阈值时，液体才会自喷嘴释放。这些装置更易于获得具有常规液滴大小的喷雾。适于本发明使用的压力阈控制(threshold)装置是本领域已知的，并且例如在WO91/13281和EP311863B中有描述。这样的装置目前可以从Pfeiffer GmBH得到，并且也在Bommer R.Advancesin Nasal drug delivery Technology，Pharmaceutical Technology Europe1999年9月，第26-33页中有描述。
优选的鼻内装置产生1-500μm范围内的液滴(采用水作为液体测量)。10μm以下的液滴存在吸入的危险，因此。要求10μm以下的液滴不多于约5％。
双剂量传递是用于本发明疫苗的鼻内传递系统的另外的优选特征。双剂量装置含有单一疫苗剂量的两个亚剂量，每个鼻孔给予一个亚剂量。
本发明另一个方面提供一个药用试剂盒，它包含一个如在此描述的鼻内给药装置，该装置含有本发明疫苗制剂，或者它包含一个鼻内给药装置和一个分开的用于该装置的疫苗制剂。本发明也提供鼻内传递装置，它包含本发明的裂解疫苗制剂。
本发明的这个方面不一定限制于液体制剂的喷雾传递。本发明的疫苗可以其它的形式，例如粉末给药。
本发明的疫苗也可以通过口服途径给予。在这样的情况下，药学上可接受的赋形剂也可以包括碱性缓冲剂、肠溶胶囊、微粒和/或泡罩剂的形式。
本发明的疫苗也可以通过阴道途径给予。在这样的情况下，药学上可接受的赋形剂也可以包括乳化剂、聚合物例如CARBOPOL，及阴道霜剂和栓剂的其它已知的稳定剂。本发明的疫苗也可以通过直肠途径给予。在这样的情况下，赋形剂也可以包括蜡和本领域已知的用于形成直肠栓剂的聚合物。非肠道途径
另外，本发明的疫苗可以经非肠道传递，例如肌内，或皮下给药。在这种情况下，为TH-1反应的优先刺激剂的佐剂为优选。
免疫反应可以粗略地分类在两个目录中，即体液(抗体)或者细胞介导的免疫反应(CTLs、T辅助细胞、NK细胞)。在小鼠和人体内，功能性分离的T辅助(Th)细胞底物，通过它们产生的细胞因子的模式，鉴定称为Th1和Th2的细胞亚群。事实上，体液和细胞介导的免疫反应分别与Th2-型反应和Th1-型反应有关。这两种特异性细胞免疫反应的极化形式对解释参与对抗多种病原体的保护作用的不同效应的机理提供了有用的模型。Th1超优势反应对根除包括细胞内病原体在内的感染因子是有效的。Th2反应有助于对抗病原体的细胞外形式的保护作用。
Th1和Th2-型免疫反应的区别并非绝对。事实上，个体应支持免疫反应，后者被描述为主要的Th1或者主要的Th2。当Mosmann与同事提供了Th细胞的抗原刺激作用导致细胞因子产生的限制及定型化模式的发展的证据(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L(1989)TH1and TH2 cells：different patterns of lymphokine secretion lead to differentfunctional properties.Annual Review of Immunology，7，145-173)，首次描述了在小鼠中Th细胞担负的Th1/Th2二歧式的机理。在鼠系中，Th1细胞产生细胞因子例如IFN-γ并促进激活抗体-依赖细胞的细胞毒性和迟缓型超敏反应。Th1细胞也参与IgG2a抗体产生的调节。Th2鼠细胞产生细胞因子例如IL-4和IL-5，并且包括参与体液反应的调节；更具体地说，为IgG1和IgE同种型。
已知某些疫苗佐剂特别适于Th1或者Th2-型反应的刺激。一般地，接种或者感染后免疫反应的Th1∶Th2平衡的最佳指示剂包括通过T淋巴细胞的Th1或Th2细胞因子的产生的测量，和/或抗原特异性抗体同种型，例如小鼠体内IgG2a∶IgG1比率的测量。
因此，Th1-型佐剂为一种刺激疫苗抗原-特异性-T细胞群体以产生高水平的Th1-型细胞因子。它也诱导小鼠体内与Th1-型同种型(例如IgG2a)有关的抗原特异性免疫球蛋白反应。
能够优先刺激TH1细胞反应的佐剂在国际专利申请WO94/00153号和WO95/17209号中有描述。
3De-O-酰化一磷脂酰脂质A(3D-MPL)为一个这样的佐剂。这是从GB2220211(Ribi)中已知的。化学上它是3De-O-酰化一磷脂酰脂质A与4，5或6酰化链的混合物，并且通过Corixa Montana制备。3De-O-酰化一磷脂酰脂质A的优选形式公开于欧洲专利0 689 454B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)中。
优选地，3D-MPL的颗粒小到足以通过0.22微米膜而灭菌过滤(如在欧洲专利号0 689 454中所述)。3D-MPL以每剂量10μg-100μg，优选25-50μg的范围存在，其中抗原将一般以每剂量2-50μg的范围存在。
另一种优选的佐剂包含QS21，一种衍生自Quillaja SaponariaMolina(皂素树)树皮的Hplc纯化部分。这可以与3De-O酰化一磷脂酰脂质A(3D-MPL)及任选与载体一起混合。
在美国专利5057540中公开了生产QS21的方法。
先前(WO96/33739)已描述含QS21的非反应原性佐剂。当与抗原一起配制时，包含QS21和胆固醇的这样的制剂已显示是成功的TH1刺激佐剂。因此，形成本发明一部分的疫苗组合物可以包括QS21和胆固醇的组合。
为TH1细胞反应的优选刺激剂的其它的佐剂包括免疫调节的寡核苷酸，例如在WO96/02555中公开的未甲基化的CpG序列。
不同的TH1刺激佐剂的组合，例如在上文中提及的那些，也被期待来提供佐剂，后者为TH1细胞反应的优先刺激剂。例如，QS21能够与3D-MPL一起配制。QS21∶3D-MPL的比率一般以1∶10至10∶1，优选1∶5至5∶1，经常基本上为1∶1的数量级存在。最佳协同作用的优选范围为2.5∶1至1∶1 3D-MPL∶QS21。
在本发明的一个优选实施方案中，疫苗制剂包括泡状(vesicular)佐剂制剂，后者包括胆固醇、皂草苷和LPS衍生物。在这个方面，优选的佐剂制剂包括含胆固醇的单层脂质体，具有优选包含二油酰基磷脂酰胆碱的脂质双层，其中皂草苷和LPS衍生物与脂质双层有关或者包埋在脂质双层中。更优选地，这些佐剂制剂包括作为皂草苷的QS21、作为LPS衍生物的3D-MPL，其中QS21∶胆固醇的比率为1∶1至1∶100重量/重量，最优选1∶5重量/重量。在EP0822831B中描述这样的佐剂制剂，其公开通过引用结合到本文中。
载体也优选存在于本发明的疫苗组合物中。载体可以是水包油乳剂、脂质结构例如脂质体或者胶束或铝盐，例如磷酸铝或氢氧化铝。
优选的水包油乳剂包含可代谢油、例如角鲨烯、α-生育酚和Tween80。另外，水包油乳剂可包含斯盘85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。
在一个特别优选的方面，本发明疫苗组合物中的抗原与3D-MPL和明矾组合。
一般对人给药，QS21和3D-MPL在疫苗中以每剂量1μg-200μg，例如10μg-100μg，优选10μg-50μg的范围存在。水包油一般应包含2-10％角鲨烯，2-10％α-生育酚和0.3-3％Tween80。优选角鲨烯：α-生育酚的比率相等或者小于1，因为这样提供更稳定的乳剂。司盘85也可以1％的水平存在。在某些情况下，本发明的疫苗应另外包含稳定剂可能是有利的。
无毒性水包油乳剂优选在水溶性载体中包含无毒的油，例如角鲨烷或角鲨烯、乳化剂例如Tween80。水溶性载体可以为例如磷酸缓冲盐水。
在WO95/17210中描述在水包油乳剂中包含QS21、3D-MPL和生育酚的特别有效的佐剂制剂。透皮、真皮内、上皮内或经皮途径
当应用于皮肤(透皮、真皮内、上皮内或经皮传递)时，本发明也可以用于诱导对病毒抗原的免疫反应。这包括(但不限于)贴剂(WO97/48440、WO98/28037、WO99/64580)、霜剂、电穿孔的传递和抛射(ballistic)传递，例如通过压缩气体。贴剂可以任选包括用于破裂皮肤完整性的装置。
通过例如真皮内注射“芒图方法(mantoux procedure)”的常规技术，在人体内可以获得真皮内传递。这包括清洁皮肤的步骤，然后用一只手拉紧，将窄的管经针头(26-31号管径)斜面朝上以介于10-15°之间的角度插入针头。一旦针头的斜面插入，把针桶放低并进一步推进，同时提供轻微的压力以在皮肤下把它抬高。然后将液体非常缓慢地注射，因而在皮肤表面形成疱疹或结节性红斑，随后缓慢拔出针头。
任何合适的佐剂可以用于真皮内传递的本发明的疫苗。佐剂优选包括MPL、QS21和胆固醇。真皮内佐剂优选包括囊泡状佐剂制剂，后者包括如在以上非肠道给药方面中描述的胆固醇、皂草苷和LPS衍生物。对透皮传递，通过加入ADP-核糖基化毒素或其突变型，也能够辅助疫苗。
应该意识到，适于以上描述的任何接种途径的以上佐剂中的任何一种也可以适用于通过任何其它的途径，并且这样的组合特别地和各自包括在本发明范围内。
本发明的制剂可以用于预防和治疗两种目的。因此，本发明提供治疗易感或者患有感染性疾病，尤其是PIV或RSV感染或者与这样的感染有关的疾病的哺乳动物的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的根据本发明的疫苗制剂。本发明的另一方面提供在此描述的用于医药的疫苗。
在New Trends and Developments in Vaccines，Voller等编辑，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978中全面描述了疫苗制品。
疫苗可以以任何合适的给药方案传递，例如一次剂量或者两次剂量方案。疫苗可用于首次进行实验的和已接触过抗原的群体。
当采用IN传递时，优选所述制剂包含佐剂和/或给予通过接触于RSV或PIV已接触过抗原的个体。
本发明还涉及生产疫苗制剂的方法，该方法包括以下步骤：
(a)裂解有包膜病毒；
(b)任选使裂解有包膜病毒制品与稳定剂混合；和
(c)任选使裂解有包膜病毒制品与佐剂(载体和/或免疫刺激剂)混合。
病毒优选为RSV或PIV。所述方法合适地包括步骤(a)和(b)、(a)和(c)，或(a)、(b)和(c)。稳定剂适合包括至少一种选自包括聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(TWEEN 80TM)、叔辛基苯氧基多乙氧基乙醇(TRITON X100TM)、聚氧乙烯-9-月桂基醚在内的表面活性剂。
以该方法生产的疫苗可以任选与载体混合。
本发明通过以下(但不限于)实施例和图说明，其中：
图1说明裂解RSVA与抗F抗体的蛋白质印迹；
图2说明裂解RSVA与抗-M2抗体的蛋白质印迹；
图3说明裂解RSVA与抗G抗体的蛋白质印迹；
图4说明裂解RSVA与抗N抗体的蛋白质印迹；
图5说明通过EM观察的RSV/A原料；
图6说明通过用EM观察的NaDOC裂解的RSV/A；
图7说明通过用EM观察的Sarkosyl裂解的RSV/A；
图8说明用裂解RSV经肌内或鼻内途径免疫已接触过抗原的小鼠的抗-FG抗体(ELISA)滴度(Post II)；
图9说明用裂解RSV经肌内或鼻内途径免疫已接触过抗原的小鼠的抗-RSV/A中和抗体滴度(Post II)；
图10说明用裂解RSV经肌内或鼻内途径免疫已接触过抗原的小鼠的抗-FGIgG同种型反应(Post II)；
图11说明用裂解RSV经肌内或鼻内途径免疫已接触过抗原的小鼠的抗-FG抗体(ELISA)滴度(Post I)；
图12说明用裂解RSV经肌内途径免疫已接触过抗原的小鼠的抗-FG抗体(ELISA)滴度；
图13说明用裂解RSV经肌内途径免疫已接触过抗原的小鼠的抗-RSV/A中和抗体滴度；
图14说明用裂解RSV经肌内途径免疫已接触过抗原的小鼠的抗-FGIgG同种型反应；
图15说明用裂解RSV经鼻内途径免疫已接触过抗原的小鼠的抗-FG抗体(ELISA)滴度；
图16说明用裂解RSV经鼻内途径免疫已接触过抗原的小鼠的抗-RSV/A中和抗体滴度；
图17说明通过真皮内或者肌内途径用裂解RSV免疫已接触过抗原的豚鼠的抗-FG抗体(ELISA)滴度；和
图18说明通过真皮内途径用裂解RSV免疫已接触过抗原的豚鼠的抗-RSV/A中和抗体滴度。
实施例1裂解病毒的生成
通过加入裂解剂例如表面活性剂，将来源于各个病毒科的有包膜病毒裂解。通过SDS-PAGE/蛋白质印迹分析目测和裂解病毒在蔗糖梯度或缓冲垫层中的迁移特性以及通过采用电子显微镜评价直接检测裂解病毒产物，可以评价裂解。
在这个实施例中描述的裂解病毒包括多个有包膜病毒科的代表。例如，副粘病毒科(呼吸道合胞病毒A和B、副流感病毒-3、腮腺炎病毒和麻疹病毒)的成员、披盖病毒科(风疹病毒)和疱疹病毒科(爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒或单纯疱疹病毒)的成员被评价。
通过加入裂解剂，例如在对无细胞病毒制品的助溶浓度下的表面活性剂，可以实现破裂病毒颗粒(裂解)的作用。具体地说，胆汁酸和烷基糖苷被用作表面活性剂。单独或者以多种组合加入表面活性剂，并温育使该过程进行至完成。所有病毒被贮存以待通过电子显微镜评价。
采用蔗糖梯度或缓冲垫层离心，初步进行有效裂解的评价。简言之，将表面活性剂处理和未处理的样品上样至蔗糖梯度/缓冲垫层，并且在SDS-PAGE凝胶上分析各部分。在可溶性部分中所有类型的病毒体蛋白质的迁移指明有效的裂解。通过电子显微镜，进一步分析经蔗糖-SDS-PAGE分析被认为有效裂解的样品。采用标准负染色技术对样品目测。
以下具体裂解实验在RSV和PIV上进行。1.1细胞培养条件
将人野生型RSV/A/Long和PIV-3在VERO细胞中以固定无血清方法复制。感染前，使VERO细胞生长4天至汇合。病毒产生条件适用于每种病毒：在37℃下，MOI0.03，对RSV/A4天和MOI0.01、对PIV-35天。在收获当天，于裂解后收获细胞液体，加入稳定剂并立即在-70℃下贮存。1.2病毒纯化
通过以1000xg离心10分钟澄清后，经PEG6000沉淀上清液，使病毒颗粒沉淀。使沉淀重悬浮于Tris50mM-NaCl50mM-MgSO42mM(pH7.5)缓冲液中，随后通过benzonase处理。在500KDAGT膜上，对5体积的磷酸盐缓冲盐水超滤该溶液，然后对5体积的磷酸盐缓冲液(pH7.5)渗滤。
如由EM证实的那样，产生完整的病毒颗粒并且如在此描述的那样在蔗糖缓冲垫层上离心。测定蛋白浓度。1.3病毒裂解
通过向无细胞病毒制品中加入裂解剂，可裂解病毒颗粒。
为有效，必须在其临界胶束浓度cmc以上采用去污剂。它们的cmc值以以上的终浓度使用所有的去污剂。研究D/P比率(去污剂/蛋白比率)。D/P比率≥25时成功获得裂解，此为优选的。
在2％浓度下，采用以下去污剂以裂解病毒颗粒；脱氧胆酸钠、Sarkosyl、Plantacare和Laureth9。
裂解后，对制剂缓冲液(PO4 10mM/NaCl 150mM pH7.5)透析溶液以除去过量的去污剂。
裂解过程概述如下：RSV-A：病毒纯化流程图收获澄清液
在3500RPM(1000xg)+4℃下，于Beckman JA10转子上离心10分钟。
                       →澄清上清液
                            ↓
                      10％PEG6000沉淀
                于4℃下，缓慢搅拌1小时30分钟
               以3500RPM 离心(1000xg)约20分钟
 沉淀重悬浮于Tris50mM-NaCl 50mM-MgSO4 2mM(pH7.5)缓冲液中。
                            ↓
                       Benzonase处理
                       在125单位/ml下
                    搅拌下温育最少4小时
                            ↓
               超滤：AGT-VAGE4A-500Kd-420cm25体积对PO4(Na)10mM-NaCl 150mM(pH7.5)随后5体积的PO4(Na)20mM
                         (pH7.5)
                            ↓
                          裂解
  缓慢搅拌下，于室温下加入去污剂≤2％最终-温育O/N
                           ↓
                         澄清在Sartopure300(GF2-深度滤膜1.2μm)上死端式过滤(Dead-end filtration)
                           ↓
                 超滤：清除去污剂-浓缩
                5体积PO4(Na)20mM(pH7.5)
         然后5体积PO4(Na)10mM/NaCl 150mM(pH7.5)
                           ↓
                        裂解体积1.4裂解病毒特性
通过30％蔗糖缓冲垫层(在TL100 Beckman转子上，在50,000rpm下1小时)上超速离心，测定起始病毒的完整性和裂解质量。通过特异性蛋白质印迹测定分析各部分；对这些部分中的一些部分进行电子显微镜和感染性效价分析。1.4.1超速离心
用30％蔗糖溶液(450μl)填充离心管一半后，将待分析的样品(450μl)温和且小心填充到该蔗糖缓冲垫层上，然后在Beckman TL100转子中，以50,000rpm于+4℃离心1小时。离心后，试管排出3个部分。上相(300μl)称为“上清液”。中间相(300μl)为样品与蔗糖缓冲垫层之间的界面相；在此称之为“中间层(middle)”。当在完整病毒上离心时，下相(300μl)为具有重悬浮沉淀物的底部溶液，称之为“沉淀物”。
进一步分析这3个部分。1.4.2蛋白质印迹分析：
这个分析可检测待检查的病毒(沉淀部分阳性)的完整性和待测定的裂解物(合适地，上清液部分对所有或大多数的结构蛋白例如包膜蛋白阳性)的功效。
特异性抗体用于特异性病毒蛋白的特征鉴定。
分析对RSV-A非-裂解和裂解部分的抗F蛋白(表面蛋白)、抗G蛋白(表面蛋白)、抗N蛋白(核衣壳)和抗M蛋白(基质)的含量。
对PIV-3病毒，分析非-裂解和裂解部分的HN蛋白含量(用单克隆抗体)和F、M、HN蛋白含量(用多克隆抗体)。1.4.3裂解的标准
针对沉淀部分中的所有四种待测蛋白的阳性蛋白质印迹(WB)信号的存在和裂解前在两个其它部分中的信号的不存在提示在病毒制剂中存在全完整病毒。
当包膜破裂时，裂解被认为是有效的，并且在上清液和/或中间部分中检测出包膜蛋白。当F或G例如在S或M部分中被检测到时，对RSV，裂解是有效的。优选F和G基本上位于S层和/或M层，并且在沉淀中不存在。1.5结果的概述
对RSVA的结果示于图1-4中。
在所有的蛋白质印迹结果中，“Split-O”指裂解前的病毒。“S”、“M”和“P”分别指在蔗糖缓冲垫层上超速离心后采集的“上清液”、“中间层”和“沉淀物”样品。电泳泳道的编号从左至右。体积指沉积在SDS-PAGE凝胶上的样品的量。
图1说明用mAb B4(抗-F)探测的裂解RSVA的蛋白质印迹；上图：                                                下图：
  1   STD   10μl
  2   Split-O   10μl
  3   Split O-S   10μl
  4   Split O-M   10μl
  5   Split O-P   10μl
  6   Split DOC-S   10μl
  7   Split DOC-M   10μl
  8   Split DOC-P   10μl
  9   Split sarco-S   10μl
  10   Split sarco-M   10μl
  11   Split sarco-P   10μl
  1   STD   10μl
  2   样品缓冲液   10μl
  3   Split O-S   10μl
  4   Split O-M   10μl
  5   Split O-P   10μl
  6   Split planta-S   10μl
  7   Split planta-M   10μl
  8   Split planta-P   10μl
  9   Split laureth9-S   10μl
  10   Split laureth9-M   10μl
  11   Split laureth9-P   10μl
  12   STD
图2说明用抗-M单克隆探测的裂解RSVA的蛋白质印迹；上图：                                                 下图：
  1   STD   10μl
  2   Split-O   20μl
  3   Split O-S   20μl
  4   Split O-M   20μl
  5   Split O-P   20μl
  6   Split DOC-S   20μl
  7   Split DOC-M   20μl
  8   Split DOC-P   20μl
  9   Split sarco-S   20μl
  10   Split sarco-M   20μl
  11   Split sarco-P   20μl
  1   STD   10μl
  2   样品缓冲液   20μl
  3   Split O-S   20μl
  4   Split O-M   20μl
  5   Split O-P   20μl
  6   Split planta-S   20μl
  7   Split planta-M   20μl
  8   Split planta-P   20μl
  9   Split laureth9-S   20μl
  10   Split laureth9-M   20μl
  11   Split laureth9-P   20μl
图3说明用抗-G单克隆探测的裂解RSVA的蛋白质印迹；上图：                                                 下图：
  1   STD   10μl
  2   Split-O   20μl
  3   Split O-S   20μl
  4   Split O-M   20μl
  5   Split O-P   20μl
  6   Split DOC-S   20μl
  7   Split DOC-M   20μl
  8   Split DOC-P   20μl
  9   Split sarco-S   20μl
  10   Split sarco-M   20μl
  11   Split sarco-P   20μl
  1   STD   10μl
  2   样品缓冲液   20μl
  3   Split O-S   20μl
  4   Split O-M   20μl
  5   Split O-P   20μl
  6   Split planta-S   20μl
  7   Split planta-M   20μl
  8   Split planta-P   20μl
  9   Split laureth9-S   20μl
  10   Split laureth9-M   20μl
  11   Split laureth9-P   20μl
图4说明用抗-N单克隆探测的裂解RSVA的蛋白质印迹；上图：                                                 下图：
  1   STD   10μl
  2   Split-O   20μl
  3   Split O-S   20μl
  4   Split O-M   20μl
  5   Split O-P   20μl
  6   Split DOC-S   20μl
  7   Split DOC-M   20μl
  8   Split DOC-P   20μl
  9   Split sarco-S   20μl
  10   Split sarco-M   20μl
  11   Split sarco-P   20μl
  1   STD   10μl
  2   样品缓冲液   20μl
  3   Split O-S   20μl
  4   Split O-M   20μl
  5   Split O-P   20μl
  6   Split planta-S   20μl
  7   Split planta-M   20μl
  8   Split planta-P   20μl
  9   Split laureth9-S   20μl
  10   Split laureth9-M   20μl
  11   裂解laureth9-P   20μl
裂解F和G蛋白后，在培养基和上清液部分存在信号而在沉淀部分几乎没有任何条带，这显示病毒包膜完全破裂。所有部分中的N和M蛋白的信号存在显示这些蛋白存在于Split制品中。这些结果提示受试的所有四种去污剂导致RSVA裂解病毒。
在所有的部分中对全部四种蛋白的信号的分析，并且特别是对在培养基和上清液部分裂解后的N和M蛋白的比较的信号提示，在试验条件下，NaDOC和Sarkosyl不仅导致裂解病毒，而且也能够使所有的病毒结构破坏，并且溶解结构和非-结构蛋白。
用裂解PIV得到类似的结果。
NaDoc和Sarkosyl为所有病毒的优选裂解剂。1.6体外病毒滴定
裂解后完整性的丧失可使病毒成为非感染性的。RSVA和PIV3病毒成功的破裂的分析显示裂解后的病毒滴度丧失106log或以上。1.7电子显微镜分析
采用标准两步负染色方法，使用磷钨酸钠作为造影剂，进行电子显微镜分析(Hayat和Miller，1990，Negative Staining，McGraw，ed.Hill)。检测栅格以评价原料的裂解模式。
非-裂解和NaDOC或Sarkosyl裂解的RSVA和PIV3病毒制品的电子显微镜分析支持经蛋白质印迹分析得到的观察结果。为说明结果，显示RSV数据。图5说明裂解前的RSVA病毒。图6和7显示分别用NaDOC或Sarkosyl裂解的RSVA病毒。
非裂解病毒(全完整病毒)含有相对保存完好的或者轻微损伤的病毒颗粒和某些无定形物。NaDoc或Sarkosyl裂解病毒显示出现不匀分布的无定形物，这些物质以不同的程度聚集，伴有极少量来自病毒包膜或者核蛋白源的可鉴别的结构。用PIV得到类似的数据。实施例2.裂解疫苗在小鼠体内的免疫原性
裂解RSV和/或PIV制品用作接种小鼠以评价这些制剂的免疫原性的免疫原。简言之，用裂解疫苗制品免疫8周龄雌性小鼠。研究免疫接种的非肠道、粘膜和ID途径。依给药途径而定，佐剂可以变化。在所有的情况下，包括未加佐剂的对照。以数周的间隔给予两个剂量。
最后一次给药两周后，处死动物并收集血液、脾细胞和/或鼻腔洗液。通过在病毒-特异性ELISA测定中试验小鼠血清，评价血清中的病毒特异性体液免疫应答。另外，采用同种型特异性测定，测定抗体反应的同种型分布。采用特异性病毒中和试验，评价中和抗体在血清中的存在。通过测定鼻腔洗液中的中和抗体或者测定鼻腔洗液中的病毒-特异性IgA，可以评价有关的局部免疫反应的诱导作用。
通过体外刺激收获的脾细胞和测定细胞增殖(氚代胸苷摄取)和/或通过受刺激细胞的IL-5和IFNγ的分泌，可以评价病毒特异性细胞免疫反应的诱导作用。
将特别注意力放在由裂解制品诱导的反应的性质和大小上，能够评价在实验中的变量的影响。
借助实施例测试RSV。2.1裂解RSV制剂
当通过肌内(IM)、鼻内(IN)，或真皮内(ID)途径给药时，以下系列实验示例性说明裂解RSV诱导有效的免疫反应。为更准确地反映幼年(pediatric)(首次进行试验)或老年(已接触过抗原的)群体的免疫状态，在已接触过抗原的或者未接触过抗原的动物中评价免疫原性，并且在两种群体中证实免疫原性。
在第一套实验中，8周龄雌性Balb/c小鼠被用于测试经IM或IN途径给予裂解RSV制品的免疫原性。通过以60μl(2×30μl)体积鼻内给予3×105噬斑形成单位(pfu)的活RSV病毒，实现已接触过抗原的目的。接触抗原后三周，用RSV裂解抗原接种动物。RSV裂解产物的定量基于RSVF蛋白特异性ELISA，后者可将裂解产物中的F蛋白与重组FG蛋白标准物比较来定量。以21天的间隔，通过肌内途径给予2个剂量RSV裂解抗原(在100μl中含4.2μgF蛋白)使A组小鼠免疫。以21天的间隔，通过肌内途径给予2次剂量为100μl中含辅以50μgAl(OH)3的4.2μgF蛋白的RSV裂解抗原使B组小鼠免疫。通过鼻内途径给予60μl含2.7μgF蛋白的第一个剂量和21天后用在60μl中含4μgF蛋白的第二个剂量的RSV裂解抗原，使C组小鼠免疫。最后一次给药后两周，处死所有的动物并评价免疫反应。
在图8-18中概述实验结果。用于评价免疫反应的读出的第一次免疫为ELISA测定，该测定测量存在于已接种动物血清中的总RSVFG-特异性免疫球蛋白(Ig)或者FG-特异性IgG同种型(IgG1和IgG2A)。在这些测定中，用重组RSV FG抗原包被96孔皿，并且系列稀释动物血清并加样至包被的孔中。通过加入生物素化的抗-小鼠Ig、IgG1或IgG2A，随后用过氧化物酶-缀合的链霉抗生物素蛋白扩增，可以检测已结合的抗体。加入OPDA底物，随后用2N H2SO4处理，在490nm下测量光密度(OD)，显示已结合的抗体。采用SoftMax Pro软件(采用四参数方程式)自对照品计算抗体滴度并以EU/ml表示。
除ELISA测定以外，也包括中和试验对由免疫接种诱导的免疫反应的性质作进一步的特征鉴定。对中和试验，将动物血清的两倍稀释液与RSV/A病毒(3000pfu)和豚鼠补体在96孔组织培养皿中于37℃温育1小时。将Hep-2细胞(104细胞/孔)直接加入到每孔中，并于37℃把培养板温育4天。吸出上清液，并向每孔中加入可市售获得的WST-1溶液。于37℃将该板温育另外18-24小时。在450nm下监测OD并通过线性回归分析进行滴定分析。所报道的滴度与血清稀释度相反，后者导致对未感染细胞所观察到的最大OD减少50％。
图8显示采用读出总IgELISA所得到的结果。在已接触过抗原的小鼠体内，通过IM(A组、B组)或IN(C组)给予裂解RSV抗原接种2次，诱导有效的抗-FG抗体反应。对IM接种，存在朝着提高辅以Al(OH)3的免疫反应数值(magnitude)的趋势。
具体地说，图8显示在已与活RSV接触过并经肌内(IM)或鼻内(IN)途径用裂解RSV免疫的小鼠体内的抗-FG抗体(ELISA)滴度(第二次接种后)。A组接受2个剂量，每个剂量4.2μg裂解RSVIM。B组接受2个剂量，每个剂量4.2μg辅以明矾的裂解RSVIM。C组接受2个剂量，分别为2.7和4.0μg裂解RSVIN。
图9显示图8样品的中和试验结果。在这些已接触过抗原的动物中，通过IM或者IN接种2个剂量的裂解RSV产物诱导有效的病毒中和抗体反应，并且如用ELISA读出所指示的那样，在辅以明矾的组中有诱导激发反应的相似的趋势。
具体地说，图9显示在已接触活RSV并通过肌内(IM)或鼻内(IN)途径用裂解RSV免疫的小鼠中的抗-RSV/A中和抗体滴度(第二次接种后)。A组接受2个剂量，每个剂量4.2μg裂解RSVIM。B组接受2个剂量，每个剂量4.2μg辅以明矾的裂解RSVIM。C组接受2个剂量分别为2.7和4.0μg的裂解RSVIN。
图10显示图8和图9样品的同种型分析的结果。在鼻内已接触过抗原的动物中，与在未接触过抗原的小鼠中得到的随后的数据(图14)相比较，IgG2A∶IgG1的比率增加，提示当小鼠已与活病毒接触过时，往往有助于更多的Th1-样反应(即老年群体的自然情况)发展。
具体地说，图10显示在已接触过活RSV并经肌内(IM)或鼻内(IN)途径用裂解RSV免疫的小鼠中抗-FGIgG同种型(ELISA)反应(第二次接种后)。A组接受2个剂量，每个剂量4.2μg裂解RSVIM。B组接受2个剂量，每个剂量4.2μg辅以明矾的裂解RSVIM。C组接受2个剂量，分别为2.7和4.0μg的裂解RSVIN。
图11证实即使在单次给予抗原后，也可在已接触过抗原的群体中对用裂解RSV经IM或者IN接种的应答产生强免疫反应。因此，在已接触过抗原的群体中，裂解RSV为IM或IN接种后诱导高滴度抗体反应的有效免疫原。
具体地说，图11显示在已接触过活RSV并经肌内(IM)或鼻内(IN)途径用裂解RSV免疫的小鼠体内的抗-FG抗体(ELISA)滴度(首次接种后)。A组接受2个剂量，每个剂量4.2μg裂解RSVIM。B组接受2个剂量，每个剂量4.2μg辅以明矾的裂解RSVIM。C组接受2个剂量，分别为2.7和4.0μg的裂解RSVIN。D组仅接触过抗原且不接受接种-对该组报道的抗体滴度在已接触过抗原后第21天测定。
在第二个系列的实验中，未接触过抗原的小鼠被用于证明抗原剂量的作用和对裂解RSV产物的免疫原性的辅助作用。用经IM途径给予的100μl含4.2(高剂量)或0.42μg(低剂量)F蛋白的裂解RSV抗原免疫小鼠。不加入佐剂或通过加入50μg Al(OH)3，或者如在EP0822831中描述的含胆固醇、3dPL和QS21的囊泡状佐剂制剂(在此称作DQ 3DMPL)辅助，在两种抗原剂量下给予IM裂解RSV制剂。接受含3.4μg F蛋白的全纯化RSV病毒的对照组也经IM途径给予100μl。30天后IM给予每种制剂的第二个剂量(除全纯化病毒组接受含4.2μg F蛋白的制品以外，全部与第一次注射相同)。最后一次剂量给予两周后，处死所有的动物并评价免疫反应。
图12概述了在这些动物体内的FG-特异性Ig反应。当辅以DQ/3DMPL且经IM途径给予时，在用高或低剂量F蛋白免疫的动物体内可诱导有效的免疫反应。通过经IM途径给予辅以或者不辅以明矾的制剂，可以诱导低水平的抗体。在所有的情况下，当低抗原剂量诱导比高抗原剂量低水平的抗体时，显然存在剂量反应。高剂量的全病毒诱导的抗体水平与通过低剂量的辅以DQ/3DMPL裂解的RSV类似。
具体地说，图12显示在未接触过抗原的经肌内(IM)途径用裂解RSV免疫的小鼠体内的抗-FG抗体(ELISA)滴度(第二次接种后)。A组接受2个剂量，每个剂量0.42μg裂解RSV。B组接受2个剂量，每个剂量0.42μg辅以明矾的裂解RSV。C组接受2个剂量，每个剂量0.42μg辅以DQ/3DMPL的裂解RSV。D组接受2个剂量，每个剂量4.2μg裂解RSV。E组接受2个剂量，每个剂量4.2μg辅以明矾的裂解RSV。组F接受2个剂量，每个剂量4.2μg辅以DQ/3DMPL的裂解RSV。G组接受2个剂量分别为3.4和4.2μg全纯化RSV病毒。
当病毒中和作用读数被用于图12(图13)的样品时，可得到类似的结果。图13显示在未接触过抗原的经肌内(IM)途径用裂解RSV免疫的小鼠体内的抗-RSV/A中和抗体滴度(第二次接种后)。A组接受2个剂量，每个剂量0.42μg裂解RSV。B组接受2个剂量，每个剂量0.42μg辅以明矾的裂解RSV。C组接受2个剂量，每个剂量0.42μg辅以DQ/3DMPL的裂解RSV。组D接受2个剂量，每个剂量4.2μg裂解RSV。组E接受2个剂量，每个剂量4.2μg辅以明矾的裂解RSV。组F接受2个剂量，每个剂量4.2μg辅以DQ/3DMPL的裂解RSV。组G接受2个剂量，分别为3.4和4.2μg全纯化RSV病毒。
通过这些制剂(图14)诱导的IgG同种型的分析揭示，当在未辅以和辅与明矾佐剂制剂诱导未接触过抗原的小鼠的典型Th2样反应时，向该制剂中加入DQ/3DMPL导致向更多的Th1样反应转移的趋势，伴随IgG2A∶IgG1比率增加。这与在用未辅以或者辅与明矾佐剂制剂接种的已接触过抗原的动物体内观察到的分布相类似(图10)。因此，在用裂解RSVIM接种的未接触过抗原的小鼠体内，诱导强烈的抗体反应，这种反应通过加入佐剂而增强。
具体地说，图14显示在未接触过抗原的经肌内(IM)途径用裂解RSV免疫的小鼠体内的抗-FGIgG同种型(ELISA)反应(第二次接种后)。A组接受2个剂量，每个剂量0.42μg裂解RSV。B组接受2个剂量，每个剂量0.42μg辅以明矾的裂解RSV。C组接受2个剂量，每个剂量0.42μg辅以DQ/3DMPL的裂解RSV。D组接受2个剂量，每个剂量4.2μg裂解RSV。E组接受2个剂量，每个剂量4.2μg辅以明矾的裂解RSV。F组接受2个剂量，每个剂量4.2μg辅以DQ/3DMPL的裂解RSV。G组接受2个剂量，每个剂量分别为3.4和4.2μg全纯化RSV病毒。
在未接触过抗原的小鼠中通过IN途径进行类似的免疫接种。在这种情况下，小鼠接受第一次剂量的含2.4μg的F蛋白(以60.μl传递-2×30μl)的裂解RSV抗原。30天后，小鼠接受第二次剂量传递的含3.5μg的F蛋白的裂解RSV抗原。或者在没有佐剂或者经加入5μgX大肠杆菌不稳定毒素(LT)或者用聚氧乙烯-9-月桂基醚0.5％(在此为“Laureth9”)辅助的情况下，可以给予IN裂解RSV。用在第一次剂量中含2.0μg的F蛋白和在第二次剂量中含3.5μgF蛋白的全纯化RSV病毒经鼻内免疫对照组。最后一次接种两周后，处死动物并评价免疫反应。
如图15和16所示，在未接触过抗原的小鼠中通过IN制剂诱导抗体反应。当ELISA读数(图15)提示对IN接种的反应稍弱于那些通过IM诱导的反应时，中和读数(图16)提示辅以LT的裂解RSVIN制剂在诱导中和抗体中至少与IM同样好并且其它的制剂也可以与IM相当。因此，在未接触过抗原的小鼠中，通过IN途径给予的裂解RSV也是具有免疫原性的。
具体地说，图15显示在未接触过抗原的经鼻内(IN)或肌内(IM)途径用裂解RSV免疫的小鼠体内的抗-FG抗体(ELISA)滴度(第二次接种后)。A组接受2个剂量，各为2.4和3.5μg的裂解RSVIN。B组接受2个剂量，各为2.4和3.5μg辅以Laureth9的裂解RSVIN。C组接受2个剂量，各为2.4和3.5μg辅以LT的裂解RSVIN。D组接受2个剂量，各为2.0和3.5μg的纯化全病毒IN。E组接受2个剂量，各为4.2μg裂解的RSVIM。
图16显示在未接触过抗原的经鼻内(IN)或肌内(IM)途径用裂解RSV免疫的小鼠体内的抗-RSV/A中和抗体滴度(第二次接种后)。A组接受2个剂量，各为2.4和3.5μg的裂解RSVIN。B组接受2个剂量，各为2.4和3.5μg辅以Laureth9的裂解RSVIN。C组接受2个剂量，各为24和3.5μg辅以LT的裂解RSVIN。D组接受2个剂量，各为2.0和3.5μg的纯化全病毒IN。E组接受2个剂量，各为4.2μg的裂解RSVIM。
当经ID途径给予时，在豚鼠中评价RSV裂解抗原的免疫原性。通过注射印度墨水(Indiaink)到真皮中并对组织进行组织学检查，已证实在该物种中准确的ID注射的可行性(数据未显示)。再者，在刺激免疫状态的努力中，发现用活RSV病毒(5×105pfu以100μl-50μl/鼻孔IN给予；A组-E)或者用纯化全RSV病毒(含6μgF蛋白以100μlIM给予；组F-J)可以使老年群体(即对RSV已接触过抗原)、Hartley豚鼠(每组5只)接触抗原。在已接触抗原后第21天和第42天给予两个等剂量的疫苗。A组和F组接受经ID途径给予的含4.2μgF蛋白的裂解RSV制品。B组和G组接受经ID途径给予的含0.84μg的F蛋白的裂解RSV制品。C组和H组组接受经ID途径给予的含辅以DQ/3DMPL的4.2μgF蛋白的裂解RSV制品。组D和I组接受经ID途径给予的含辅以DQ/3DMPL的0.84μgF蛋白的裂解RSV制品。组E和J组接受经IM途径给予的含4.2μgF蛋白的裂解RSV制剂。首次给予疫苗后第3周和第二次给予疫苗后第2周，将动物放血并评价免疫反应。
在图17和18中概述这个实验的结果。图17显示实验期间在豚鼠血清中检测的FG特异性免疫反应。用于豚鼠试验的FG特异性ELISA与小鼠ELISA类似之处在于：用重组FG包被孔和动物血清被稀释且被应用于已包被的孔中。然而，在这个试验中，通过抗-豚鼠Ig缀合的马辣根过氧化物酶可检测结合的抗体，随后加入底物并如先前述展现。对所有的组，观察到已接触过抗原的弱的反应，最初清晰地观察到对经ID或IM途径接种后的加强反应，对初次接种所观察到的加强反应是明显的，并且在除滴度呈平稳状态的H组以外，所有的组第二次接种后另外的加强反应是明显的。辅助作用下可观察到反应的幅度清晰的增加(C组、D、H、I)。在这个实验中可观察到抗原剂量的不清晰的作用，并且甚至在没有辅助作用的情况下，经ID途径给予的1/5剂量似乎与经IM途径给予的充分的剂量所起的作用相同。概述中和作用数据的图18显示类似的趋势。因此，在已接触过抗原的群体(用活的病毒感染或者给予纯化全病毒使其接触抗原)中，经ID途径给予单次剂量的裂解RSV是强烈免疫原性的，并且这一反应能够进一步由第二次给予的疫苗所加强。
具体地说，图17显示在已接触过抗原的经皮内(ID)或肌内(IM)途径用裂解RSV免疫的豚鼠体内的抗-FG抗体(ELISA)滴度。用活RSV病毒使组A-E接触抗原。用纯化全病毒使组F-J接触抗原。对接种，A组和F组接受2个剂量，各为0.84μg的裂解RSVID。B组和G组接受2个剂量，各为4.2μg的裂解RSV ID。C组和H组接受2个剂量，各为0.84μg的辅以DQ/3DMPL的裂解RSVID。D组和I组接受2个剂量，各为4.2μg的辅以DQ/3DMPL的裂解RSVID。E组和J组接受2个剂量，各为4.2μg的裂解RSVIM。
图18显示在已接触过抗原的经皮内(ID)或肌内(IM)途径用裂解RSV免疫的豚鼠体内的抗-RSV/A中和抗体滴度。用活RSV病毒使A组-E接触抗原。用纯化全病毒使组F-J接触抗原。对接种，A组和F组接受2个剂量，各为0.84μg的裂解RSVID。B组和G组接受2个剂量，各为4.2μg的裂解RSVID。C组和H组接受2个剂量，各为0.84μg的辅以DQ/3DMPL的裂解RSVID。D组和I组接受2个剂量，各为4.2μg的辅以DQ/3DMPL的裂解RSVID。E组和J组接受2个剂量，各为4.2μg的裂解RSVIM。
总之，这些实验已证实裂解RSV抗原在首次用于和已接触过抗原的群体中是强免疫原性的。另外，这些实验已显示通过包括肌内、鼻内和真皮内在内的多种途径可以给予裂解RSV，并且在所有的情况下均是有免疫原性的。加入佐剂在某些情况下能够加强抗体反应和/或诱导自Th1样向Th2样反应的反应分布的转移。

Claims (30)

1.一种包含裂解有包膜病毒制品的疫苗制剂，其中所述病毒为RSV或PIV。
2.一种如权利要求1要求的疫苗制剂，其中裂解有包膜病毒制品包含病毒膜碎片，病毒膜包膜蛋白、病毒基质和核蛋白。
3.一种如权利要求1或权利要求2要求的疫苗制剂，其中疫苗制剂还包含另一种选自以下的裂解病毒：流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、肺炎后病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、登革热病毒、黄热病病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒、风疹病毒、东方型、西方型和委内瑞拉型马脑炎病毒及人免疫缺陷病毒。
4.一种如权利要求1-3中任一项要求的疫苗制剂，它还包含一种或者更多种残留的裂解剂。
5.一种如权利要求4要求的疫苗制剂，其中所述残留的裂解剂选自：laureth9、NaDOC、Sarcosyl基团、Tween80TM和Triton X100TM。
6.一种根据权利要求5的疫苗制剂，其中所述残留的裂解剂为NaDOC或Sarkosyl。
7.一种如权利要求1-6中任一项要求的疫苗制剂，它还包含稳定剂。
8.一种如权利要求7要求的疫苗制剂，其中所述稳定剂为表面活性剂。
9.一种如权利要求8要求的疫苗制剂，其中所述表面活性剂或者为单一的聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(TWEEN 80TM)、叔辛基苯氧基多乙氧基乙醇(TRITON X100TM)和聚氧乙烯-9-月桂基醚或者为它们的混合物。
10.一种如前述权利要求中任一项要求的疫苗制剂，其中所述疫苗被配制以便经鼻内传递。
11.一种如权利要求1-9中任一项要求的疫苗制剂，其中所述疫苗被配制以便经肌内或皮下传递。
12.一种如权利要求1-8中任一项要求的疫苗制剂，其中所述疫苗被配制以便通过透皮、真皮内、表皮内或经皮途径传递。
13.一种根据权利要求12的疫苗制剂，其中所述疫苗被配制为用于经真皮内传递。
14.一种如前述权利要求中任一项要求的疫苗制剂，它还包含佐剂。
15.一种根据权利要求14的疫苗制剂，其中所述佐剂为聚氧乙烯-9-月桂基醚。
16.一种根据权利要求14的疫苗制剂，其中所述佐剂为TH1细胞反应的优先刺激剂。
17.一种如权利要求16要求的疫苗制剂，其中TH1细胞反应的优先刺激剂选自以下佐剂，包括：3D-MPL、QS21、QS21和胆固醇的混合物、CpG寡核苷酸及它们的组合。
18.一种根据权利要求17的疫苗制剂，其中所述佐剂为包含胆固醇、皂草苷和LPS衍生物的囊泡状佐剂。
19.一种如任何前述权利要求中要求的疫苗制剂，它还包含载体。
20.一种产生如前述权利要求中任一项要求的疫苗制剂的方法，该方法包括以下步骤：
(a)裂解PIV或者RSV有包膜病毒；
(b)使裂解有包膜病毒制品与稳定剂任选混合；和
(c)使裂解有包膜病毒制品与佐剂任选混合。
21.一种生产如权利要求20要求的疫苗制剂的方法，其中裂解病毒制品与稳定剂混合，稳定剂包含至少一种选自以下的表面活性剂，包括：聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(TWEEN 80TM)、叔辛基苯氧基多乙氧基乙醇(TRITON X100TM)、聚氧乙烯-9-月桂基醚。
22.裂解RSV或PIV疫苗制品在制备疫苗中的用途。
23.裂解RSV或PIV疫苗制品在制备用于预防或者治疗疾病的疫苗制剂中的用途。
24.一种用于如权利要求1-19中任一项要求的鼻内疫苗制剂的传递的试剂盒，它包含：
(a)裂解RSV或PIV有包膜病毒制品；和
(b)鼻内传递装置。
25.一种鼻内传递装置，它包含根据权利要求1-19中任一项的裂解疫苗制剂。
26.一种保护或者治疗易感，或者患有由PIV或者RSV的引起的疾病的哺乳动物的方法，该方法包括给予有效量的根据权利要求1-19中任一项的疫苗。
27.一种根据权利要求26的方法，其中所述疫苗经真皮内或鼻内途径给予。
28.裂解RSV或PIV疫苗制品在制备用于真皮内或鼻内传递的疫苗制剂中的用途。
29.一种根据任一项前述权利要求的制剂、方法、用途、试剂盒或装置，其中所述疫苗制剂为免疫原性的。
30.一种根据权利要求30的制剂、方法、用途、试剂盒或装置，其中所述疫苗制剂在血清反应阳性和血清反应阴性的个体中都有免疫原性。
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