CN117224670B - 一种脂质体佐剂组合物、疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/70—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in livestock or poultry
Abstract
本发明公开了一种脂质体佐剂组合物、疫苗组合物及其制备方法和应用，涉及兽用生物制品技术领域。每毫升脂质体佐剂组合物包括如下含量的原料：甘油磷脂100~5000μg、胆固醇100~2000μg和免疫增强剂，免疫增强剂包括维生素E、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇和单磷酰脂质A衍生物。本发明提供的脂质体佐剂组合物具有良好的稳定性，且抗原包载能力得到显著的提升，包载抗原后，通过刺激机体持续产生抗体，具有免疫应答水平较高，免疫持续时间长，副作用小，安全性好，缓释时间长的技术优势。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体而言，涉及一种脂质体佐剂组合物、疫苗组合物及其制备方法和应用。
背景技术
免疫佐剂作为非特异性免疫增强剂，通过配合抗原混匀后一起注射注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。其作用机制分为体液免疫和细胞免疫，增强抗原的免疫原性，通过增强巨噬细胞的免疫活性从而刺激B细胞或T细胞的免疫应答反应。
常见的疫苗按照抗原类型，可分为灭活疫苗、亚单位疫苗、DNA重组疫苗、mRNA疫苗等，通常这些抗原的免疫原性较差，有效刺激机体产生抗体的时间较短，需要配合不同类型的佐剂组合物来提升其免疫原性。
在抗原进入机体后，作用于机体产生抗体需要一定的时间进行反应，此时抗体水平较低，佐剂作为刺激免疫增强的助推剂具有良好的促进效果。
脂质体结构是磷脂分散在水中形成的双分子层，其内层为包裹的水相囊泡，结构类似生物膜。脂质体作为佐剂可与抗原有效结合，能够协助抗原诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，特别是细胞免疫，可持续诱导产生较高抗体水平。脂质体可以通过多种免疫途径将各种来源的抗原（如细菌、病毒、肿瘤、寄生虫等 ）靶向传递至抗原递呈细胞。
脂质体主要是由磷脂、胆固醇及衍生物通过人工手段合成，制备获得粒子粒径为纳米级，可穿透生物膜进入细胞内刺激机体产生作用。脂质体拥有优异的生物相容性和代谢属性，在进入机体后对其目标具有靶向性，在药物递送、疾病诊断、保健功能性食品开发等领域有不同程度的应用。 因此脂质体不仅可作为粘膜疫苗，在DNA疫苗中也具有也具有显著优势。
在疫苗的实际生产应用中，需要使用便捷、安全、副作用小、免疫增强效果好的佐剂，然而国内大部分兽用疫苗主要依赖于进口佐剂，宠物疫苗市场中进口疫苗占比更达到80%以上。 因此有必要开发一种免疫效果明显、持续时间长、注射无残留损害的佐剂。
脂质体作为免疫佐剂的优点主要有以下几点：（1）抗原包裹性：脂质体特有的类似生物膜的双分子层的结构，与抗原进行简单的混匀，可吸附包裹抗原，具有良好的免疫原性。（2）靶向性：具有良好的靶向性可将抗原递送至胞内系统，优先被抗原递呈细胞摄取。（3）安全性高：可作为粘膜免疫佐剂刺激机体的粘膜免疫系统，其本身无毒，可在生物体内自行降解，相比传统的注射免疫疫苗，粘膜免疫疫苗更便捷、安全。（4）储库效应：脂质体可将抗原进行包裹，在疫苗进入机体后，持续有效释放抗原，刺激机体不断产生高滴度的抗体。（5）免疫协同性：脂质体可与其他类型的佐剂进行协同作用，从而激发APC对抗原的加工、递呈，同时促进免疫细胞间相互作用。（6）治疗效应：阳离子脂质体在进入细胞后，可直接作用于基因的复制转染，脂质体作为疫苗组合物之一，在疾病治疗方面，对基因的调控有独特作用。
目前的脂质佐剂在制备、存储过程中稳定性有待提升，且抗原包载能力和免疫应答水平不高。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脂质体佐剂组合物、疫苗组合物及其制备方法和应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种脂质体佐剂组合物，每毫升脂质体佐剂组合物包括如下含量的原料：
甘油磷脂100~5000μg、胆固醇100~2000μg和免疫增强剂，所述免疫增强剂包括维生素E、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和单磷酰脂质A衍生物，且每毫升脂质体佐剂组合物包括如下含量的免疫增强剂原料：
维生素E 50~1000μg、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇10~300μg和单磷酰脂质A衍生物10~100μg；甘油磷脂与胆固醇的质量比为（1-5）:1。
发明人经过长期大量的筛选发现：（1）设置上述配比的脂质体佐剂组合物具有良好的稳定性；（2）抗原包载能力得到显著的提升，包载抗原后，通过刺激机体，抗体免疫持续时间长，副作用小；（3）相对于传统水佐剂的缓释时间更长；（4）免疫应答水平较高，在抗原含量较低时也能使动物获得较好的免疫效果，具有抗原用量少的优势。
甘油磷脂和胆固醇组成脂质体佐剂组合物的基本骨架，其中胆固醇起到调节膜流动性的作用，故可称为脂质体佐剂组合物的“流动性缓冲剂”。二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇是兼具亲水、疏水性的磷脂缀合物，具有良好的物理稳定性和生物相容性，该物质可延长抗原在血液中循环的时间，以及加强脂质体与抗原结合的稳定性。将二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇应用于药物运输、疫苗传递系统中，可以增强靶向抗体的递送。
单磷酰脂质A衍生物（MPLA衍生物）作为Toll样受体的（Toll like receptors，TLR）的天然配体或合成的激动剂的一种，在疫苗作为免疫增强剂被广泛使用。MPLA作为TLR4的受体激动剂，是脂多糖脂质A的衍生物，在TLR4受体通路中担任激活免疫活性的角色，并且在刺激机体产生抗体的同时，减少炎症细胞因子的产生。
维生素E、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和单磷酰脂质A衍生物起到增强免疫应答的效果。发明人发现，将三者组合能够取得协同的增强免疫应答的效果。
本发明提供的脂质体佐剂组合物通过特定的膜结构。能够快速包裹大量抗原，在进入机体后，能刺激机体产生快速的体液免疫。脂质体佐剂组合物通过包裹抗原进入细胞中，能辅助抗原的内涵体逃逸，提高了疫苗进入细胞核进行表达的有效剂量，能刺激机体持续性产生抗体。该脂质体佐剂组合物具有良好的稳定性、安全性，可实现大规模生产。
甘油磷脂与胆固醇的质量比会影响脂质体佐剂组合物的平均粒径、分散度（多分散性系数（PI）），进而影响脂质体佐剂组合物的保存稳定性。在上述质量比范围内，脂质体佐剂组合物具有一定的稳定性。
在一种可选的实施方式中，甘油磷脂与胆固醇的质量比为3：1，或3.5:1，或4:1，或4.5:1或5:1。
甘油磷脂与胆固醇的质量比为3：1时，具有比质量比为5:1的脂质体佐剂组合物更小的粒径（平均粒径小于200nm），且多分散系数PI<0.2，更有利于脂质体佐剂组合物以更稳定的状态保存。
脂质体佐剂组合物至少具有双层膜结构。例如双层膜结构、三层膜结构或者多层膜结构。
在本发明应用较佳的实施方式中，免疫增强剂还包括皂苷类免疫增强剂和/或多糖。这样有助于进一步提升免疫应答效果。
在一种可选的实施方式中，多糖包括不限于四君子汤总多糖、黄芪多糖、天门冬多糖、岩藻多糖、茯苓多糖、甘草多糖和淫羊藿多糖中的至少一种。
在本发明应用较佳的实施方式中，皂苷类免疫增强剂包括不限于黄芪皂苷、人参皂苷、田七皂苷和四君子汤总皂苷中的至少一种。
第二方面，本发明还提供了一种脂质体佐剂组合物的制备方法，将胆固醇、甘油磷脂以及维生素E进行混合获得油相混合物，再将油相混合物与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、单磷酰脂质A衍生物混合，所得的混合物混入缓冲液中，经初乳剪切、均质制得脂质体佐剂组合物。
本发明提供的制备方法简单易行，易于大批量制备。
在本发明应用较佳的实施方式中，缓冲液为PBS缓冲液，PBS缓冲液的pH为6.4-7.0，且PBS缓冲液包括6.85 mmol/L浓度的一水合磷酸二氢钠、5%~10%蔗糖、3.65mmol/L浓度的无水磷酸氢二钠和0.308 mol/L氯化钠；或PBS缓冲液包括6.85 mmol/L浓度的一水合磷酸二氢钠、3.15mmol/L浓度的无水磷酸氢二钠和0.154mol/L氯化钠。
相比于现有的PBS缓冲液，本发明提供的PBS缓冲液可以更好地调节pH。本配方中作为水相缓冲液的PBS，其配制完成pH呈弱酸性，无需再加入酸进行调节，制备成的脂质体能更好的包裹抗原，蔗糖起到提升PBS稳定性的作用。
在本发明应用较佳的实施方式中，在制备油相混合物之前，还包括先将原料进行预溶解，预溶解的步骤包括：将胆固醇溶解于第一有机溶剂中制得第一混合液，甘油磷脂和维生素E混合溶解于第二有机溶剂中制得第二混合液，将第一混合液和第二混合液进行混合制得油相混合物。
预溶解有助于保证物料分散的均匀性，便于后续的混匀。
在一种可选的实施方式中，混合的条件为55-65℃下水浴混匀。例如在55-58℃下水浴，或在58℃-65℃下水浴。在上述水浴温度下具有更佳的混匀效果。
在一种可选的实施方式中，第一有机溶剂选自乙醇和甲醇中的至少一种；第二有机溶剂选自乙醇和甲醇中的至少一种。
在本发明应用较佳的实施方式中，初乳剪切是以剪切机以5000-8000rpm的转速进行初乳剪切5-10分钟；均质是在800-1100bar压力均质3-10次。
在一种可选的实施方式中，先以800 bar压力均质3-5次，再以1100bar压力均质3-5次。
在一种可选的实施方式中，均质后还包括将皂苷类免疫增强剂和/或多糖与除菌后的脂质体佐剂组合物混合。
在一种可选的实施方式中，对均质后的产物先进行除菌而后与皂苷类免疫增强剂和/或多糖混合；或者，先将均质后的产物与皂苷类免疫增强剂和/或多糖混合，然后进行除菌。
在一种可选的实施方式中，采用无菌滤器、射线照射（60钴15～20kGy）或热压（121℃）进行除菌。例如采用0.22μm的滤器进行除菌。
第三方面，本发明还提供了一种疫苗组合物或药物组合物，其包括脂质体佐剂组合物或由上述制备方法制备的脂质体佐剂组合物。
在一种可选的实施方式中，药物还包括药学上可接受的辅料。
在本发明应用较佳的实施方式中，药学上可接受的辅料选自填充剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、粘合剂、助悬剂和香精中的至少一种。
药学上可接受的辅料包括不限于：药学上可接受的载体、辅助物质或溶剂。药学上可接受的辅料包括各种有机或无机载体和/或辅助材料，因为它们通常用于药物目的，特别是用于固体药物制剂。示例包括：赋形剂，例如蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石、磷酸钙、碳酸钙；粘合剂，例如纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉；崩解剂，例如淀粉、水解淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙盐、羟丙基淀粉、乙二醇淀粉钠、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙；润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石、月桂基硫酸钠；香料，例如柠檬酸、薄荷醇、甘氨酸、橙粉；防腐剂，例如苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯)；稳定剂，例如柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸和来自titriplex系列的多羧酸，例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)；悬浮剂，例如甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝；分散剂；稀释剂，例如水、有机溶剂；蜡、脂肪和油，例如蜂蜡、可可脂；聚乙二醇；白凡士林等。
在本发明应用较佳的实施方式中，药物的剂型为片剂、丸剂、粉剂、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、纳米颗粒、胶囊、栓剂、注射剂或喷雾剂。
在一种可选的实施方式中，上述药物为液体药物制剂（如作为注射剂的一种），例如溶液、悬浮液和凝胶通常含有液体载体，例如水和/或药学上可接受的有机溶剂。此外，此类液体制剂还可包含pH调节剂、乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐剂、润湿剂、胶凝剂(例如甲基纤维素)、染料和/或调味剂，例如如上所定义的。药物可以是等渗的，即，它们可具有与血液相同的渗透压。药物的等渗性可通过使用氯化钠和其他药学上可接受的试剂来调节，这些试剂例如葡萄糖、麦芽糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇和其他无机或有机可溶性物质。液体组合物的粘度可通过药学上可接受的增稠剂例如甲基纤维素来调节。其他合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度取决于所选择的试剂。
在本发明应用较佳的实施方式中，药物被配制用于经口施用或注射施用。注射施用包括不限于皮下注射，肌内注射，静脉注射，皮内注射。
在一种可选的实施方式中，疫苗组合物还包括疫苗。
在一种可选的实施方式中，疫苗组合物中脂质体佐剂组合物的含量为20%~50%W/V。本发明提供的脂质体佐剂组合物具有载疫苗量大的优势。
在一种可选的实施方式中，疫苗由病原微生物和/或其代谢产物经过减毒、灭活或基因工程方法制得。基因工程方法包括不限于通过遗传改造（如基因突变等方式）的方式、或对纯疫苗分子进行改造、或将疫苗基因导入微生物载体，或对DNA进行改造等方式制得疫苗。
在一种可选的实施方式中，疫苗选自减毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗或核酸疫苗。
在一种可选的实施方式中，疫苗来自感染猪、羊、牛、鸡、鸭、鱼、鹅、猫、狗、猴或人的病原微生物。
在一种可选的实施方式中，疫苗选自猪腹泻病毒抗原、猪传染性胃肠炎病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪圆环病毒抗原和猪肺炎支原体抗原的至少一种。
第四方面，本发明还提供了疫苗组合物在制备预防和/或治疗禽畜疾病的药物中应用。
在其他实施方式中，本发明还提供了疫苗组合物在制备预防和/或治疗宠物疾病的药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
（1）设置特定配比的脂质体佐剂组合物具有良好的稳定性，包括低温、常温和高温的稳定性，可以明显延长保存期；
（2）提供的脂质体佐剂组合物，其抗原包载能力得到显著的提升，包载抗原后，通过刺激机体持续产生抗体，具有免疫持续时间长，副作用小的技术优势；
（3）相对于传统水佐剂的缓释时间更长；
（4）免疫应答水平较高，在抗原含量较低时也能使动物获得较好的免疫效果，具有抗原用量少的优势；
（5）安全性好，无明显发热或副作用。
（6）本发明提供的制备方法简单易行，易于大批量制备，可以制备预防和/或治疗禽畜或宠物疾病的药物或疫苗组合物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为不同处理组的猪圆环病毒抗体水平统计图；
图2为不同处理组的猪肺炎支原体抗体水平统计图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种含有人参皂苷的脂质体（即脂质体佐剂组合物）的制备方法。
所使用的试剂组成：
PBS溶液：6.85 mmol/L浓度的一水合磷酸二氢钠，5%蔗糖，3.15mmol/L浓度的无水磷酸氢二钠，0.154 mol/L氯化钠，pH为6.5。
准确称取胆固醇1.25g，定容于15ml的无水乙醇（即第一有机溶剂）中，获得混合液1；准确称取甘油磷脂2.50g，定容于15ml无水乙醇（即第二有机溶剂）中，加入0.25g的维生素E，获得混合液2，将混合液1和2混匀，即获得混合液3，在混合液3中加入二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇为0.25g，单磷酰脂质A衍生物为70mg(上海安奕康生物科技有限公司提供)。
开启连续流剪切机将混合液3用注射器缓慢加入到970ml含有5%蔗糖的PBS溶液中，获得初乳，将初乳通过高压均质机，采用800bar均质3~5次，中间取样检测粒径，采用1100bar压力均质3~5次，取样检测粒径。
配制浓度为20mg/ml的人参皂苷溶液备用。
将均质过的样品通过超滤膜包（Sartorius，型号VIVAFLOW 50R(0.11㎡)）清洗，将获得的滤液与人参皂苷溶液按照人参皂苷终浓度2mg/ml进行混匀，通过磁力搅拌器进行搅拌混匀。
通过过滤除菌的方式，采用0.22μm的滤器将溶液进行过滤，最终成品保存于2~8℃药品阴凉柜中。
实施例2
实施例提供了一种含有人参皂苷的脂质体的制备方法。与实施例1相比，胆固醇与甘油磷脂的配比不同。
准确称取胆固醇0.833g，溶解于10ml的无水乙醇中，获得混合液1；准确称取甘油磷脂4.165g、0.833g维生素E，溶解于25ml无水乙醇中，获得混合液2，将混合液1和2混匀，即获得混合液3，在混合液3中加入二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇为0.25g，单磷酰脂质A衍生物为70mg。
开启连续流剪切机将混合液3用注射器缓慢加入到965ml含有5%蔗糖的PBS溶液（配方同实施例1）中，获得初乳，将初乳通过高压均质机，采用800bar均质3~5次，中间取样检测粒径，采用1100bar压力均质3~5次，取样检测粒径。
配制浓度为20mg/ml的人参皂苷溶液备用。
将均质过的样品通过超滤膜包清洗，将获得的滤液与人参皂苷溶液按照人参皂苷终浓度2mg/ml进行混匀，通过磁力搅拌器进行搅拌混匀。
通过过滤除菌的方式，采用0.22μm的滤器将溶液进行过滤，最终成品保存于2~8℃药品阴凉柜中。
实施例3
实施例提供了一种含有人参皂苷的脂质体的制备方法。与实施例1相比，胆固醇与甘油磷脂的配比不同。
准确称取胆固醇1.25g，溶解于15ml的无水乙醇中，获得混合液1；准确称取甘油磷脂3.75g，0.625g维生素E作为1份溶质，溶解于22.5ml无水乙醇中，获得混合液2，将混合液1和2混匀，即获得混合液3，在混合液3中加入二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇为0.25g，单磷酰脂质A衍生物为70mg。
开启连续流剪切机将混合液3用注射器缓慢加入到962.5ml 含有5%蔗糖的PBS溶液中，获得初乳，将初乳通过高压均质机，采用800bar均质3~5次，中间取样检测粒径，采用1100bar压力均质3~5次，取样检测粒径。
配制浓度为20mg/ml的人参皂苷溶液备用。
将均质过的样品通过超滤膜包清洗，将获得的滤液与人参皂苷溶液按照人参皂苷终浓度2mg/ml进行混匀，通过磁力搅拌器进行搅拌混匀。
通过过滤除菌的方式，采用0.22μm的滤器将溶液进行过滤，最终成品保存于2~8℃药品阴凉柜中。
对比例1
与实施例3相比，区别在于：本实施例中脂质体佐剂组合物中的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇替换为失水山梨醇月桂酸酯。其余原料配比不变，制备方法参考实施例3，下表主要展示主要成分，缓冲液PBS和有机溶剂不作描述。
对比例2
与实施例3相比，区别在于：本实施例中脂质体佐剂组合物中的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇替换为聚氧乙烯蓖麻油。其余原料配比不变，制备方法参考实施例3，表1展示了主要成分，缓冲液PBS和有机溶剂不作描述。
表1 替换二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇对比成分表（1000ml）
对比例3
与实施例3相比，区别在于：本实施例中脂质体佐剂组合物中的单磷酰脂质A衍生物替换为聚胞苷酸。其余原料配比不变，制备方法相同，下表2展示主要成分，缓冲液PBS和有机溶剂不作描述。
对比例4
与实施例3相比，区别在于：本实施例中脂质体佐剂组合物中的单磷酰脂质A衍生物替换为黄芪多糖。其余原料配比不变，制备方法相同，下表2主要展示主要成分，缓冲液PBS和有机溶剂不作描述。
表2 替换单磷酰脂质A衍生物对比成分表（1000ml佐剂）
实验例1
将对比例1-4和实施例3分别配制成佐剂与猪圆环病毒2型（PCV2）抗原制备为疫苗组合物。抗原由浙江洪晟生物科技股份有限公司提供，抗原溶液100ml（灭活前病毒含量为107.2TCID50），采用生理盐水进行定容，获得疫苗组合物。其中佐剂与抗原按照1:3的比例进行稀释。分别检测上述5种疫苗组合物的免疫效果。
选取30日龄猪圆环病毒抗体阴性健康仔猪30头，随机分成5组，每组6头，按照表3分别免疫对应疫苗。2ml/头，免疫后14天、28天和90天采血，分离血清检测抗体。抗体检测使用猪圆环病毒2-dCap型ELISA抗体检测试剂盒(购自北京金诺百泰生物技术有限公司)。抗体效价大于1：180则表示为阳性。
表3为替换二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或者单磷酰脂质A衍生物后脂质体复合佐剂配合猪圆环病毒抗原免疫结果
仔猪免疫试验结果（表3）表明替换本发明佐剂复合物中任一免疫增强剂，如二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇或者单磷酰脂质A衍生物，替换后会不同程度的降低原有配方配合抗原后的免疫效价。硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇在佐剂中免疫效果优于失水山梨醇月桂酸酯组和聚氧乙烯蓖麻油组；单磷酰脂质A衍生物在佐剂中的免疫效果优于多糖类物质黄芪多糖组和聚胞苷酸组。
实验例2
下面通过实验对脂质体佐剂组合物的各方面性能进行测试。
（1）外观性状
将实施例1-3制备的不同胆固醇含量的佐剂使用PBS为溶剂配置成浓度为2.0mg/ml溶液封存于西林瓶，观察脂质体佐剂溶液的外观性状。
在无色透明容器内，在非阳光直射下，目测其外观应为均匀混悬液，具有淡蓝色乳光的溶液，经长时间放置无固体样品析出。
表4平均粒径与分布
由脂质体的平均粒径和分散度（表4）可以发现，随着甘油磷脂的含量增加，胆固醇含量减少，平均粒径呈现略增大趋势，但分散度从明显的大于0.2朝着变小的趋势发展。整体平均粒径在200nm以内。多分散系数PI<0.2则后期有利于样品稳定性的保存。结果表明胆固醇：甘油磷脂比例为1:3时，为优选配方。
（2）加速稳定性实验。
将不同浓度（胆固醇和甘油磷脂）的脂质体溶液分布置于37℃、2~8℃、常温条件下进行稳定性实验。
表5 不同样品在2~8℃条件下的稳定性数据
表6 不同样品在常温条件下的稳定性数据
表7 不同样品在37℃条件下的稳定性数据
表5-表7结果可知，胆固醇：甘油磷脂比例为1:3时，无论是低温、常温还是37 ℃条件，脂质体佐剂组合物的物理稳定性更优，表现为粒径变化很小，且外观颜色基本维持不变，表明胆固醇：甘油磷脂比例为1:3时的脂质体佐剂组合物稳定性都明显优于实施例2胆固醇：甘油磷脂1:5比例的脂质体佐剂组合物的稳定性。
（3）安全性评估
实验动物：20-25gBALB/c小鼠60只，购自成都达硕实验技术有限公司。小鼠经过运输后，经过隔离饲养24h，状态稳定后随机称重分组，开展实验，实验前禁食12h，不禁水。
实验分组按照表8进行实施：
表8 复合脂质体佐剂小鼠安全性评估分组
实验过程：将小鼠称重后标记，并记录体重，每组随机选择10只小鼠，同时设置生理盐水组和空白对照组，共6组，每组腹腔注射0.5ml/只，空白组除外。配制的佐剂与生理盐水按照不同比例的稀释。注射后连续两周内每天观察小鼠的状态，并记录死亡情况。
表8结果表明，各组均未出现死亡，所有小鼠健康状况良好，佐剂安全性良好。
实验例3
本实验例进行脂质体复合佐剂疫苗对仔猪的安全性评价。
选取12头20~30日龄健康仔猪，猪圆环病毒2型病原和抗体均为阴性，随机分成2组，每组6头。注射前一周，监测仔猪的体温，每日两次，记录并统计体温数据。
将脂质体复合佐剂与猪圆环病毒抗原按照1：3进行配比，制成的疫苗与生理盐水分别注射6头仔猪，每头份2ml。注射后每隔6小时测温，连续监测2天；观察仔猪的精神状态与存活状况，连续观察7天。疫苗组和生理盐水组在注射后均有略微体温上升，疫苗组较生理盐水对照组体温高出0.3℃。在免疫后的24小时体温均恢复至免疫前水平；免疫后的7天并未出现其他不良反应以及死亡情况。
实验例4
本实验例进行圆环病毒2型（PCV2）脂质体复合水佐剂疫苗的免疫效果试验。
选取20~30日龄仔猪24头，猪圆环病毒2型病原和抗体均为阴性，随机分为3组，每组8头。
猪圆环病毒2型（PCV2）抗原由浙江洪晟生物科技股份有限公司提供，将实施例3制备的脂质体佐剂组合物与圆环病毒2型（PCV2）抗原按照混合比（1：3）混合制得脂质体复合佐剂疫苗。
将SEPPIC公司的GEL01佐剂作为同类型佐剂对照品，并将GEL01佐剂与圆环病毒2型（PCV2）抗原按照佐剂推荐使用比例，混合制得同类佐剂对照疫苗。另外设置一组生理盐水作为空白对照。分别颈部肌肉注射脂质体复合佐剂疫苗，同类型佐剂对照疫苗，以及生理盐水各2ml。免疫后分别在第2周、第4周、第6周、第8周、第10周、第12周、第14周、第16周采血，分离血清检测抗体。（猪圆环病毒2-dCap-ELISA检测试剂盒购自北京金诺百泰生物技术有限公司），对获得抗体滴度结果，来判定各组疫苗抗体水平趋势。
图1为猪圆环抗体水平结果，从第2周脂质体复合水佐剂疫苗与市场对照佐剂组都呈现明显上升趋势，第4周抗体滴度出现略微下降拐点，虽然从第4周到第16周，脂质体复合佐剂（图1中的M103）较同类佐剂对照疫苗下降更缓慢，整体抗体水平均较高。
实验例5
本实验例针对猪肺炎灭活支原体复合脂质体疫苗进行免疫效果试验。
猪肺炎灭活支原体复合脂质体疫苗的制备：
猪肺炎支原体（菌株为MH03株）由浙江洪晟生物科技股份有限公司提供。
将实施例3制备的脂质体佐剂组合物与猪肺炎支原体按照混合比（1:3）混合制得脂质体复合佐剂疫苗。
将SEPPIC公司的GEL01佐剂作为同类型佐剂对照品，GEL01佐剂与猪肺炎支原体按照佐剂推荐使用比例，混合制得同类佐剂对照疫苗。
选取5~10日龄猪肺炎支原体血清抗体阴性健康仔猪21头。随机分为3组，每组7头。另外设置一组生理盐水作为空白对照。分别颈部肌肉注射脂质体复合佐剂疫苗，同类型佐剂对照疫苗，以及生理盐水各2ml。免疫后分别在第2周、第4周、第6周、第8周、第10周、第12周、第14周、第16周采血，分离血清检测抗体。(猪肺炎支原体竞争ELISA抗体检测试剂盒购自IDVET，货号：MHYOPC-5P)。
结果参照图2所示，从免疫后第2周，本发明提供的脂质体复合佐剂疫苗出现明显上升拐点，直到免疫后第4周抗体滴度达到最高，第4周后出现略微下降，在第6~16周抗体滴度均较高于市场同类型复合佐剂疫苗，本发明的脂质体复合佐剂疫苗处理组的抗体缓慢下降至第4个月；而市场同类型复合佐剂疫苗出现明显下降趋势，并且抗体滴度在第8周明显转阴。显示出本发明提供的脂质体复合佐剂疫苗具有更优的免疫效果，抗体免疫持续时间长，副作用小，并且相对于传统水佐剂的缓释时间更长。
综上所述，本发明提供的脂质体佐剂组合物的免疫效果明显优于市面的复合型水佐剂。具有如下技术优势：（1）刺激机体持续产生抗体，免疫持续时间长，副作用小，并且相对于传统水佐剂的缓释时间更长。（2）安全性：相比传统猪用疫苗需要多次注射，副作用较明显，本发明的脂质体佐剂组合物注射次数少，无明显发热或副作用。（3）抗原用量少，在抗原含量较低时也能使动物获得较好的免疫效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种脂质体佐剂组合物，其特征在于，每毫升所述脂质体佐剂组合物包括如下含量的原料：甘油磷脂100~5000μg、胆固醇100~2000μg和免疫增强剂，所述免疫增强剂包括维生素E、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和单磷酰脂质A衍生物，且每毫升所述脂质体佐剂组合物包括如下含量的免疫增强剂原料：
维生素E 50~1000μg、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇10~300μg和单磷酰脂质A衍生物10~100μg；所述甘油磷脂与胆固醇的质量比为（1-5）:1。
2.根据权利要求1所述的脂质体佐剂组合物，其特征在于，所述脂质体佐剂组合物至少具有双层膜结构。
3.根据权利要求1所述的脂质体佐剂组合物，其特征在于，所述免疫增强剂还包括皂苷类免疫增强剂和/或多糖；
所述多糖选自四君子汤总多糖、黄芪多糖、天门冬多糖、岩藻多糖、茯苓多糖、甘草多糖和淫羊藿多糖中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的脂质体佐剂组合物，其特征在于，所述皂苷类免疫增强剂选自黄芪皂苷、人参皂苷、田七皂苷和四君子汤总皂苷中的至少一种。
5.如权利要求1-4任一项所述的脂质体佐剂组合物的制备方法，其特征在于，将胆固醇、甘油磷脂以及维生素E进行混合获得油相混合物，再将油相混合物与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、单磷酰脂质A衍生物混合，所得的混合物混入缓冲液中，经初乳剪切、均质制得脂质体佐剂组合物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的pH为6.4-7.0，且所述PBS缓冲液包括6.85 mmol/L浓度的一水合磷酸二氢钠、5%~10%蔗糖、3.65mmol/L浓度的无水磷酸氢二钠和0.308 mol/L氯化钠；或所述PBS缓冲液包括6.85 mmol/L浓度的一水合磷酸二氢钠、3.15mmol/L浓度的无水磷酸氢二钠和0.154mol/L氯化钠。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在制备所述油相混合物之前，还包括先将原料进行预溶解，所述预溶解的步骤包括：将胆固醇溶解于第一有机溶剂中制得第一混合液，甘油磷脂和维生素E混合溶解于第二有机溶剂中制得第二混合液，将第一混合液和第二混合液进行混合制得所述油相混合物；
所述混合的条件为55-65℃下水浴混匀；
所述第一有机溶剂选自乙醇和甲醇中的至少一种；所述第二有机溶剂选自乙醇和甲醇中的至少一种。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述初乳剪切是以剪切机以5000-8000rpm的转速进行初乳剪切5-10分钟；所述均质是在800-1100bar压力均质3-10次；
所述均质后还包括将皂苷类免疫增强剂和/或多糖与除菌后的脂质体佐剂组合物混合。
9.一种疫苗组合物或药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的脂质体佐剂组合物或权利要求5-8任一项所述的制备方法制备的脂质体佐剂组合物；其中，所述疫苗组合物还包括疫苗；所述疫苗组合物中所述脂质体佐剂组合物的含量为20%~50%W/V；所述疫苗由病原微生物和/或其代谢产物经过减毒、灭活或基因工程方法制得，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
10.如权利要求9所述的组合物在制备预防和/或治疗禽畜或宠物疾病的药物中应用。
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