CN114736845B - 胰岛细胞团葡萄糖糖刺激胰岛素分泌试验高糖低糖溶液配制试剂盒 - Google Patents
胰岛细胞团葡萄糖糖刺激胰岛素分泌试验高糖低糖溶液配制试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及胰岛细胞功能评价中的葡萄糖刺激胰岛素分泌试验技术领域，公开了胰岛细胞团葡萄糖糖刺激胰岛素分泌试验中高糖/低糖溶液配制试剂盒，包括无菌稀释液粉末、BSA粉末和葡萄糖粉末，所述稀释液粉末包括如下组分：HEPES，NaCl，NaHCO3，KCl，MgCl2，CaCl2，烟酰胺，L‑谷氨酰胺；还公开了配制高糖/低糖溶液的方法。本发明的试剂盒用于GSIS试验中高/低葡萄糖溶液的配制，可保持胰岛细胞团在葡萄糖刺激试验中的活性和提高提胰岛细胞糖刺激结果的均匀性，配制方式简单。
Description
技术领域
本发明涉及胰岛细胞团葡萄糖糖刺激胰岛素分泌试验技术领域，具体涉及胰岛细胞团葡萄糖糖刺激胰岛素分泌试验高糖/低糖溶液配制试剂盒。
背景技术
糖尿病是一种因胰岛素绝对或相对缺乏引起的以糖代谢紊乱为主要表现的代谢病。虽然糖尿病病因复杂，发病机制亦未完全阐明，但胰岛细胞在血糖稳态调节中的核心作用已勿容置疑。既往的研究已显示胰岛β细胞功能和数量的下降不仅是各种类型糖尿病发生发展的中心环节，亦是糖尿病防治中的重要靶点。尤其是1型糖尿病和长病程型2型糖尿病患者，由于存在自身胰岛细胞相关抗体的原因，或长时间血糖控制不理想，导致体内胰岛细胞团数量逐渐减少甚至耗竭，血糖波动幅度大，不易控制。长期下去，导致患者出现严重的糖尿病并发症，尤其是视网膜毛细血管增生、肾功能衰竭和糖尿病足等并发症。
胰岛移植是目前唯一微创并能实现血糖有效调控的临床治疗方法，并已在临床和实验研究中被证实有效。但该治疗方法需分离和培养供体的胰岛细胞团，并将其移植至受者体内，在有或无免疫抑制剂作用下，发挥胰岛细胞团的血糖调节功能。但分离后的胰岛细胞团需做功能评估，以便在移植前确定所获得的胰岛细胞团有功能。胰岛细胞团葡萄糖糖刺激胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)试验是胰岛功能评估的重要方法，在GSIS试验中需要使用高糖、低糖溶液进行糖刺激实验。
葡萄糖刺激胰岛素分泌试验分为体内试验和体外试验。体内试验通常利用口服葡萄糖或者馒头餐，刺激胰岛β细胞引起胰岛素释放增加，或者在动物试验中也有往动物腹腔注射葡萄糖溶液，导致试验动物的血糖升高，从而可反映β细胞的功能状态，因而对糖尿病的诊断、分型与指导治疗有一定价值。体外试验通常要分离和提取胰岛细胞团，在培养后或未经培养，用适当浓度的高葡萄糖溶液和低葡萄糖溶液进行共培养，刺激胰岛细胞释放胰岛素。体外试验还包括动态糖刺激试验，即葡萄糖刺激液中的葡萄糖浓度变化是连续和逐渐改变的；静态糖刺激试验，即糖糖糖刺激液中的葡萄糖浓度是固定的高葡萄糖溶液和低葡萄糖溶液，实验的过程往往是在一定数量的胰岛细胞团中，交替加入低糖溶液、高糖溶液，必要时可再用低糖溶液与胰岛细胞团在37℃5％CO2培养箱中共培养一定时间，再分别收集上清液，进行胰岛素或C肽浓度的测定。
本发明主要应用于体外的胰岛细胞团静态糖刺激时，高糖、低糖溶液配制的试剂盒。常规的GSIS实验常采用自己配制Kreb’s溶液，并加入葡萄糖粉末进行高糖、低糖溶液的配制；也有的团队采用细胞培养液、Hanks液等，加入葡萄糖，配制成高糖、低葡萄糖溶液。高糖、低糖溶液配制所使用的成分不统一，葡萄糖浓度也不统一，比如有的报道采用的是高糖溶液中葡萄糖浓度为16mmol/L，低糖溶液中葡萄糖浓度为1.6mmol/L；有的报道采用的高糖溶液中葡萄糖浓度为25mmol/L，低糖溶液中葡萄糖浓度为2.5mmol/L；有的报道采用的高糖溶液中葡萄糖浓度为28mmol/L，低糖溶液中葡萄糖浓度为2.8mmol/L，不利于方法和结果的标准化。本发明采用成套试剂盒的形式，在美国临床胰岛移植(CIT，clinical islettransplantation，CIT)联盟制定的胰岛糖刺激方案的基础上进行了成分改良，使所用的糖刺激溶液成分对胰岛活性保持和胰岛功能的正常发挥有更好的效果，糖刺激实验结果也更均匀。
美国临床胰岛移植(CIT，clinical islet transplantation，CIT)联盟制定的胰岛糖刺激方案采用的稀释溶液为Kreb’s液，成分为HEPES，NaCl，NaHCO3，KCl，MgCl2，CaCl2，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)和葡萄糖，成分可为水合物或无水物；配制的葡萄糖溶液浓度为：高糖溶液的葡萄糖浓度为28mmol/L，低糖溶液的葡萄糖浓度为2.8mmol/L。
但上述成分中主要为一些缓冲盐成分，BSA具有一定的营养胰岛细胞团的成分，但在维持糖刺激过程中的胰岛细胞团活性和功能上，还缺少一些必要的营养成分。
烟酰胺(Nicotinamide，NAM)又称为尼克酰胺，吡啶-3-甲酰胺，维生素B3，烟碱酰胺，维生素PP，分子式：C6H6N2O，CAS号：98-92-0，分子量：122.12。属于维生素B家族，是维生素B3的酰胺形式。烟酰胺存在于食物中，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)的组分之一。NAM是细胞培养基中的一个重要成分，尤其在胰岛细胞团的培养中。NAM控制细胞代谢，氧化反应，线粒体功能和能量产生，对维持细胞功能和活性有较好的作用。烟酰胺联合胰高血糖素肽-1受体激动剂(Exendin4，艾塞那肽)能明显促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)转分化为胰岛素分泌细胞团，表达胰岛素、C肽和相应基因(尼克酰胺联合Exendin-4促进大鼠骨髓间充质干细胞体外转分化为胰岛素分泌细胞团的研究.中国糖尿病杂志.2006，3：230-232)。NAM有神经保护功能，促进神经元成熟。它能够跨越血脑屏障，在缺血性中风和创伤性脑损伤中提供保护。NAM还可能对于阿尔兹海默症，帕金森症和亨廷顿病有治疗作用。烟酰胺用于肠道干细胞类器官培养，食管鳞状细胞癌(ESCC)，胰腺肿瘤类器官和胰腺祖细胞诱导培养基补充剂。烟酰胺在体外细胞培养中可以抑制NF-kB(Nuclear factor-k-gene binding，k基因结合核因，一种促炎症的转录蛋白细胞因子)来抑制组织因子(Tissue factor，TF)和单核细胞趋化蛋白1，(Monocyte chemoattractantprotein-1，MCP-1)在巨噬细胞和内皮细胞中的表达。有文献报道(王鑫.F-尼克酰胺抑制胰岛移植后IBMIR作用的研究[D].中国医科大学，2008.)，通过提纯后的胰岛细胞与50mM尼克酰胺在37℃培养箱中共同培养48h作为实验组，以未处理的胰岛细胞基础培养基培养为对照。体外葡萄糖刺激下胰岛素释放试验检测不同培养条件下胰岛功能，并利用酶联免疫方法测定混合培养后胰岛细胞中TF与MCP-1的含量，结果发现对照组TF含量为9.90±2.12pg/islet，MCP-1含量为2.22±0.58pg/islet，实验组中TF含量为1.42±0.42pg/islet，MCP-1含量为0.33±0.13pg/islet。胰岛形态学检查(TCT)发现，对照组中的胰岛数量较少，周围可见大量红细胞形成的微血栓。实验组中胰岛数量较多，周围无大量红细胞包裹，也未见明显微血栓形成。因此烟酰胺处理能够减少胰岛表达TF和MCP-1，从而抑制IBMIR。L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的培养液添加剂。L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺脱掉氨基后，可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。
胰腺供体患者在长期ICU治疗期间，会经常输注葡萄糖、糖皮质激素、升压药物等，对胰岛细胞团造成一定的损伤。同时，患者也可能会输注一些胰岛素，来稳定和降低血糖。加上胰岛分离过程中的损伤，均可能导致获得的胰岛处于活性和功能损伤状态，因此，会影响胰岛在葡萄糖刺激胰岛素释放试验中的功能发挥。本发明的目的是为了使胰岛在体外GSIS实验中维持稳定的细胞活性和功能状态，得到更真实的胰岛体外功能。
发明内容
基于以上问题，本发明提供胰岛细胞团葡萄糖糖刺激胰岛素分泌试验(GSIS)高糖低糖溶液配制试剂盒，本发明主要是为了使胰岛细胞团在体外的糖刺激胰岛素释放试验中维持更稳定的细胞活性和功能状态，为GSIS试验提供了一种高糖、低糖溶液的配方。
为解决以上技术问题，本发明提供了胰岛细胞团葡萄糖糖刺激胰岛素分泌试验高糖低糖溶液配制试剂盒，包括无菌稀释液粉末、BSA粉末和葡萄糖粉末。
进一步的，所述稀释液粉末包括如下组分：HEPES，NaCl，NaHCO3，KCl，MgCl2.6H2O，CaCl2.H2O，烟酰胺，L-谷氨酰胺。
进一步的，所述稀释液粉末包括如下质量的组分：HEPE1.5-0.2g，NaCl 1.6-0.1g，NaHCO3 0.2-0.01g，KCl 0.2-0.01g，MgCl2.6H2O 0.2-0.01g，CaCl2.2H2O 0.5-0.01g，烟酰胺1.0-0.001g，L-谷氨酰胺0.1-0.001g；所述BSA粉末的质量为1.0-0.01g，所述无菌葡萄糖粉末的质量为0.2774g。
进一步的，包含各成分的水化物和无水化物，所用稀释液成分和BSA的量为配制体积为100ml稀释液的用量，所述无菌葡萄糖粉末的量为配制体积为5ml 280mM高糖溶液储备液的用量。
进一步的，HEPES的分子量为238.3，NaCl的分子量为58.44，NaHCO3的分子量为84.01，KCl的分子量为74.55，MgCl2.6H2O的分子量为203.3，CaCl2.2H2O的分子量为147，烟酰胺的分子量为122.12，L-谷氨酰胺的分子量为146.15。
进一步的，所述无菌葡萄糖粉末中一水合葡萄糖的分子量为198.17。
为解决以上技术问题，本发明还提供了试剂盒配制高糖/低糖溶液的方法，具体如下：
1)取稀释液粉末，加纯化水80ml，搅拌溶解；
2)往步骤1)制备的溶液中加入BSA粉末，搅拌溶解后加纯化水定容至100ml；
3)用0.22μm微孔滤膜过滤步骤2)中制备的溶液；
4)取经步骤3)处理之后的溶液4ml，加入无菌葡萄糖粉末，搅拌溶解后，用经步骤3)处理之后的溶液定容至5ml，即得280mM高糖溶液储备液；
5)取步骤4)中制备的280mM高糖溶液储备液，加入经步骤3)处理之后的溶液进行十倍稀释，上下颠倒5次混匀后即得28mM高糖溶液；
6)取步骤5)中制备的28mM高糖溶液，加入经步骤3)处理之后的溶液进行十倍稀释，上下颠倒5次混匀后即得2.8mM低糖溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的试剂盒用于GSIS试验中高/低葡萄糖溶液的配制，可更好的维持胰岛细胞团在体外的糖刺激胰岛素释放试验中的细胞活性和维持稳定的功能状态，使GSIS刺激试验结果能更均匀和更真实反映胰岛的功能，配制方式简单。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
本实施例提供一种胰岛细胞团葡萄糖糖刺激胰岛素分泌试验(GSIS)高糖低糖溶液配制试剂盒，主要由以下三个部分组成：A粉末：稀释液粉末(可配制100ml)，B粉末：BSA粉末，C粉末：无菌葡萄糖粉末。本试剂盒粉末应置于2-8℃低温保存，有效期为24个月，由无色透明带盖小螺口玻璃瓶包装，罐装后灭菌。
其中A粉末的成分表如下：
B粉末的成分表如下：
C粉末的成分表如下：
如果成分的分子量与上表中不一致，则需要根据最终的浓度重新计算所需要的剂量。
利用上述成分配制高糖/低糖溶液的步骤如下：
(1)24孔板的静态糖刺激试验
1)取A粉末，加纯化水80ml，搅拌溶解；
2)往上述1)溶液中加入B粉末，搅拌溶解后加纯化水定容至100ml；
3)用0.22μm微孔滤膜过滤上述2)溶液；
4)取上述溶液3)4ml，加入粉末C，搅拌溶解后，用溶液3)定容至5ml，用0.22μm微孔滤膜过滤上述溶液，得到280mM高糖溶液储备液；
5)取上述溶液4)0.6ml至15ml离心管中，加入溶液3)5.4ml定容至6ml，上下颠倒5次混匀后得到6ml 28mM高糖溶液；
6)取上述溶液5)1.2ml至15ml离心管中，加入溶液3)10.8ml定容至12ml，上下颠倒5次混匀后得到12ml 28mM高糖溶液；
注1：上述溶液3)、4)配制后，可在4℃冰箱保存，两周内使用。
本试剂盒可进行4次胰岛细胞团葡萄糖刺激胰岛素分泌试验。
24孔板的静态糖刺激试验
1)加入糖刺激溶液：取一个24孔板，左边四排的A、B、C三孔加液为：A1-A3，B1-B3，C1-C3均加入2.8mM低糖液(标记为L)，D1-D3加入28mM高糖溶液(标记为H)；其中A，B每孔加入1ml溶液，C，D每孔加1.3ml(溶液的添加见下表1)；往A4，A5，A6三孔中各放入一个细胞培养小室，放置于37℃培养箱中平衡1h。
表1高糖/低糖溶液加液试验表
2)在平衡的1h中，取约400IEQ高纯度胰岛，至1.5ml无菌EP管中，溶液体积为400μl；
3)用宽口的移液枪取三份人的胰岛(每份100μl约100IEQ)，添加到A4，A5，A6三孔的细胞培养小室中，用酒精棉擦过的镊子提起筛网，用无菌纱布轻轻吸干筛网下的液体，将筛网连同刚才装的胰岛分别放至A1，A2，A3孔中，用低浓度葡萄糖溶液清洗一遍胰岛；取出筛网及胰岛，用无菌纱布吸干溶液，再分别装到B1，B2，B3三孔中，放置于37℃5％CO2培养1h，作为复温和过渡；
4)1h后用酒精棉擦过的镊子取出筛网，底部用无菌纱布轻轻吸干培养液，用将含胰岛的筛网放至C1，C2，C3开始进行低糖刺激，迅速移取C1，C2，C3中的溶液0.3ml至1.5ml无菌EP管中，作为0时间低糖刺激的样本；同时，可以把B1，B2，B3的溶液要分别装到1.5ml无菌EP管中作为基线对照；
5)将上述24孔板放至37℃5％CO2培养箱中孵育1h，用酒精棉擦过的镊子取出小室和胰岛，将小室的底轻轻触碰孔板中对应的培养孔，使小室中的胰岛素溶液尽量流到培养孔中；小室底部用无菌纱布轻轻吸干培养液后，分别放至D1，D2，D3高糖溶液中继续培养，迅速移取D1，D2，D3中的溶液各0.3ml至1.5ml无菌EP管中，作为0时间高糖刺激的样本。把低糖刺激后的溶液全部取出，至1.5ml无菌EP管中，标记为LC1，LC2，LC3；
6)相同方法，将上述24孔板放至37℃5％CO2培养箱中进行高糖刺激孵育1h，用酒精棉擦过的镊子取出小室和胰岛，将小室的底轻轻触碰孔板中对应的培养孔，使小室中的胰岛素溶液尽量流到培养孔中；弃去小室，将高糖刺激后的溶液全部取出至1.5ml无菌EP管中，标记HD1，HD2，HD3；
注：胰岛素样本一周内测定时可放在4℃冰箱中保存，一个月内测定的样本可放到-20℃保存。
7)用Elisa法或放射免疫方法测定胰岛素浓度，计算刺激因子；
8)每个样品需平行测定三次取平均值，刺激指数计算公式为：SI1＝HD1/LC1，SI2＝HD2/LC2，SI3＝HD3/LC3，胰岛细胞团糖刺激胰岛素分泌(GSIS)指数SI＝(SI1+SI2+SI3)/3，标准差为SD，请将结果填入相应的胰岛质量评价表中。
胰岛细胞团活性的测定：
1)二乙酸荧光素(Fluorescein diacetate，FDA)溶液的配制：称取上表量的FDA，用丙酮(acetone)溶解，浓度：2mg/200ml＝10μg/mL，用100ml棕色瓶或锡箔纸包裹避光，日常使用-4℃保存；长期保存建议-20℃；
2)碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液的配制：称取上表量的PI，用DPBS溶液溶解，浓度：12.5mg/25ml，用铝箔纸包裹避光-20℃长期保存；
3)胰岛细胞团活性测定：取含胰岛组织0.5ml，加入10μl FDA，再加入10μl PI，稍混匀后避光室温下静置染色30s左右，在荧光显微镜下观察细胞染色情况，绿色激发光使死亡的胰岛发出红色光，蓝色的激发光使胰岛发出绿色的光；在绿色激发光下估算红色细胞占整个细胞团中的比例；一般数50个胰岛细胞团的活性，取其平均值即为胰岛活性。
以不含烟酰胺和L-谷氨酰胺成分的传统Kreb’s液配方制备的高糖、低糖溶液进行的胰岛细胞团GSIS试验为对照组。
统计学处理：
采用SPSS 11.0统计学软件，所有数据采用均数表示，并采用成对样品t检验进行统计学分析。
结果：
含烟酰胺和L-谷氨酰胺成分的试剂盒GSIS得到的结果：
胰岛细胞团糖刺激胰岛素分泌(GSIS)指数SI＝3.51
标准差SD：0.21。
在糖刺激前，胰岛细胞团的活性为：89.3±4.5；糖刺激后，胰岛细胞团的活性为：87.9±3.9。糖刺激前后胰岛活性无显著性差异(p>0.05)。
对照组GSIS试验得到的结果：
胰岛细胞团糖刺激胰岛素分泌(GSIS)指数SI＝2.32
标准差SD：0.68。
在糖刺激前，胰岛细胞团的活性为：90.2±3.7；糖刺激后，胰岛细胞团的活性为：83.6±5.8。糖刺激前后胰岛活性有显著性差异(p<0.05)。
上述两组试验在胰岛细胞团糖刺激胰岛素分泌(GSIS)指数SI上有显著性差异(p<0.05)，含烟酰胺和L-谷氨酰胺成分的试剂盒GSIS得到的SI结果明显更高，标准差更小；糖刺激后胰岛细胞团的活性也显著性差异(p<0.05)，含烟酰胺和L-谷氨酰胺成分的试剂盒GSIS得到的胰岛活性结果明显更好。
实施例2：
本实施例所使用的A粉末、B粉末和C粉末的组成与实施例1中的一样。
本实施例的12孔板的静态糖刺激试验的高糖/低糖溶液配制步骤如下：
12孔板的静态糖刺激试验
1)取A粉末，加纯化水80ml，搅拌溶解；
2)往上述1)溶液中加入B粉末，搅拌溶解后加纯化水定容至100ml；
3)用0.22μm微孔滤膜过滤上述2)溶液；
4)取上述溶液3)4ml，加入粉末C，搅拌溶解后，用溶液3)定容至5ml，用0.22μm微孔滤膜过滤上述溶液，得到280mM高糖溶液储备液；
5)取上述溶液4)0.9ml，加入溶液3)8.1ml定容至9ml，上下颠倒5次混匀后得到28mM高糖溶液；
6)取上述溶液5)2.0ml，加入溶液3)18.0ml定容至20ml，得到2.8mM低糖溶液；
注1：上述溶液3)、4)配制后，可在4℃冰箱保存，两周内使用。
本试剂盒可进行3次胰岛细胞团葡萄糖刺激胰岛素分泌试验。
12孔板的静态糖刺激试验
1)加入糖刺激溶液：取一个12孔板，左边四排的A、B、C、D孔加液为：A1-C1，A2-C2，A3-C3均加入2.8mM低糖液(标记为L)，A4-C4加入28mM高糖溶液(标记为H)；其中A1-C1，A2-C2每孔加入2.0ml溶液，A3-C3、A4-C4每孔加2.3ml(溶液的添加见下表2)；放置于37℃培养箱中平衡1h。
表2高糖/低糖溶液加液试验表
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| A | L2.0ml | L2.0ml | L2.3ml | H2.3ml |
| B | L2.0ml | L2.0ml | L2.3ml | H2.3ml |
| C | L2.0ml | L2.0ml | L2.3ml | H2.3ml |
2)在平衡的1h中，取约400IEQ高纯度胰岛，至1.5ml无菌EP管中，溶液体积为400μl；
3)用宽口的移液枪取三份人的胰岛(每份100μl约100IEQ)，添加到三个细胞培养小室(insert)中，用酒精棉擦过的镊子提起筛网，用无菌纱布轻轻吸干筛网下的液体，将筛网连同刚才装的胰岛分别放至A1，B1，C1孔中，用低浓度葡萄糖溶液清洗一遍胰岛；取出筛网及胰岛，用无菌纱布吸干溶液，再分别装到A2，B2，C2三孔中，放置于37℃5％CO2培养1h，作为复温和过渡；
4)1h后用酒精棉擦过的镊子取出筛网，底部用无菌纱布轻轻吸干培养液，用将含胰岛的筛网放至A3、B3、C3开始进行低糖刺激，迅速移取A3、B3、C3中的溶液0.3ml至1.5ml无菌EP管中，作为0时间低糖刺激的样本标记为LA30，LB30，LC30；同时，可以把A2、B2、C2的溶液要分别装到1.5ml无菌EP管中作为基线对照；
5)将上述12孔板放至37℃5％CO2培养箱中孵育1h，用酒精棉擦过的镊子取出小室和胰岛，将小室的底轻轻触碰孔板中对应的培养孔，使小室中的胰岛素溶液尽量流到培养孔中；小室底部用无菌纱布轻轻吸干培养液后，分别放至A4，B4，C4高糖溶液中继续培养，迅速移取A4，B4，C4中的溶液各0.3ml至1.5ml无菌EP管中，作为0时间高糖刺激的样本，标记HA40，HB40，HC40。把低糖刺激后的溶液取出1ml，至1.5ml无菌EP管中，标记为LA31，LB31，LC31；
6)相同方法，将上述12孔板放至37℃5％CO2培养箱中进行高糖刺激孵育1h，用酒精棉擦过的镊子取出小室和胰岛，将小室的底轻轻触碰孔板中对应的培养孔，使小室中的胰岛素溶液尽量流到培养孔中；弃去小室，将高糖刺激后的溶液取出1ml至1.5ml无菌EP管中，标记HA41，HB41，HC41；
注：胰岛素样本一周内测定时可放在4℃冰箱中保存，一个月内测定的样本可放到-20℃保存。
7)用Elisa法或放射免疫方法测定胰岛素浓度，计算刺激因子；
8)每个样品需平行测定三次取平均值，刺激指数计算公式为：SI1＝HA41/LA31，SI2＝HB41/LB31，SI3＝HC41/LC31，胰岛细胞团糖刺激胰岛素分泌(GSIS)指数SI＝(SI1+SI2+SI3)/3，标准差为SD，请将结果填入相应的胰岛质量评价表中。
胰岛细胞团活性评价、统计学处理方法同方案1。
以不含烟酰胺和L-谷氨酰胺成分的传统Kreb’s液配方制备的高糖、低糖溶液进行的胰岛细胞团GSIS试验为对照组。
结果：
含烟酰胺和L-谷氨酰胺成分的试剂盒GSIS得到的结果：
胰岛细胞团糖刺激胰岛素分泌(GSIS)指数SI＝4.32
标准差SD：0.36。
在糖刺激前，胰岛细胞团的活性为：91.6±3.6；糖刺激后，胰岛细胞团的活性为：90.5±4.1。糖刺激前后胰岛活性无显著性差异(p>0.05)。
对照组GSIS试验得到的结果：
胰岛细胞团糖刺激胰岛素分泌(GSIS)指数SI＝3.32
标准差SD：0.71。
在糖刺激前，胰岛细胞团的活性为：91.7±3.2；糖刺激后，胰岛细胞团的活性为：83.5±7.6。糖刺激前后胰岛活性有显著性差异(p<0.05)。
上述两组试验在胰岛细胞团糖刺激胰岛素分泌(GSIS)指数SI上有显著性差异(p<0.05)，含烟酰胺和L-谷氨酰胺成分的试剂盒GSIS得到的SI结果明显更高，标准差更小；糖刺激后胰岛细胞团的活性也显著性差异(p<0.05)，含烟酰胺和L-谷氨酰胺成分的试剂盒GSIS得到的胰岛活性结果明显更好。
以上结果表明，添加烟酰胺和L-谷氨酰胺成分后，比较传统Kreb’s液配方制备的高糖、低糖溶液进行的胰岛细胞团GSIS试验，糖刺激前后的胰岛活性保持的更好，糖刺激的胰岛素释放指数更均匀，刺激指数值更高。
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.胰岛细胞团葡萄糖糖刺激胰岛素分泌试验高糖低糖溶液配制试剂盒，其特征在于，包括无菌稀释液粉末、BSA粉末和葡萄糖粉末；
其中，所述稀释液粉末包括如下质量的组分：HEPE1.5-0.2 g，NaCl 1.6-0.1 g，NaHCO3 0.2-0.01 g，KCl 0.2-0.01 g，MgCl2.6H2O 0.2-0.01 g，CaCl2.2H2O 0.5-0.01 g，烟酰胺1.0-0.001 g，L-谷氨酰胺0.1-0.001 g；所述BSA粉末的质量为1.0-0.01g，所述无菌葡萄糖粉末的质量为0.2774 g；
HEPES的分子量为238.3，NaCl的分子量为58.44，NaHCO3的分子量为84.01，KCl的分子量为74.55，MgCl2.6H2O的分子量为203.3，CaCl2.2H2O的分子量为147，烟酰胺的分子量为122.12，L-谷氨酰胺的分子量为146.15；
所述无菌葡萄糖粉末中一水合葡萄糖的分子量为198.17。
2.根据权利要求1所述的胰岛细胞团葡萄糖糖刺激胰岛素分泌试验高糖低糖溶液配制试剂盒，其特征在于，包含各成分的水化物和无水化物，所用稀释液成分和BSA的量为配制体积为100 ml稀释液的用量，所述无菌葡萄糖粉末的量为配制体积为5 ml 280 mM高糖溶液储备液的用量。
3.权利要求1-2中任意一项所述的试剂盒配制高糖/低糖溶液的方法，其特征在于，具体如下：
1）取稀释液粉末，加纯化水80 ml，搅拌溶解；
2）往步骤1）制备的溶液中加入BSA粉末，搅拌溶解后加纯化水定容至100 ml；
3）用0.22 μm微孔滤膜过滤步骤2）中制备的溶液；
4）取经步骤3）处理之后的溶液4 ml，加入无菌葡萄糖粉末，搅拌溶解后，用经步骤3）处理之后的溶液定容至5 ml，即得280 mM高糖溶液储备液；
5）取步骤4）中制备的280 mM高糖溶液储备液，加入经步骤3）处理之后的溶液进行十倍稀释，上下颠倒5次混匀后即得28 mM高糖溶液；
6）取步骤5）中制备的28 mM高糖溶液，加入经步骤3）处理之后的溶液进行十倍稀释，上下颠倒5次混匀后即得2.8 mM低糖溶液。
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