TW201918249A

TW201918249A - 修復胰臟受損之醫藥組合物及其治療方法

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Publication number: TW201918249A
Application number: TW106138102A
Authority: TW
Inventors: 劉紹毅; 黃志揚; 劉才睿; 陳冬生; 劉懿德
Original assignee: 綠恩生化科技股份有限公司
Priority date: 2017-11-03
Filing date: 2017-11-03
Publication date: 2019-05-16
Also published as: TWI638656B

Abstract

本發明是關於一種修復胰臟受損之醫藥組合物及其使用方法，尤其關於一種提供含有酯型兒茶素(EGCG)和脂肪幹細胞的醫藥組合物，酯型兒茶素(EGCG)能提升脂肪幹細胞能力，增加脂肪幹細胞修復受損組織的能力，以進行修復胰臟受損之使用方法。

Description

修復胰臟受損之醫藥組合物及其治療方法

本發明提供一種修復胰臟受損之醫藥組合物及其使用方法，其中前述修復受損胰臟之醫藥組合物含有以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)預處理之脂肪幹細胞，所述之經表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)預處理脂肪幹細胞的修復受損組織的能力具有明顯上升。

糖尿病的認定在臨床上是空腹血糖值110mg/dl以上及糖化血色素HbA1c值高於6.5%，而高血糖的成因是血中葡萄糖的代謝機制出問題，胰臟所分泌的胰島素是代謝血中葡萄糖最重要的蛋白質，所以高血糖的成因是體內胰島素的分泌出了問題。

第一型糖尿病是胰島素分泌量不足，少量的胰島素無法代謝大量的血中葡萄糖，造成血中累積高濃度的葡萄糖而形成高血糖。由於第一型糖尿病的主因是胰島素分泌不足，所以造成第一型糖尿病的成因多半是胰臟功能出問題。形成第一型糖尿病的因素很多，如自體免疫疾病造成胰臟細胞死亡、遺傳問題呈現胰臟功能低下或是病毒感染使得胰臟功能受損等諸多因素都會造成胰臟功能出問題而使胰島素分泌量不足，胰臟的β細胞是胰島上負責生產胰島素的機器。先前小鼠研究若能修復受損胰臟β細胞，胰島素的量也會相對增加，且血糖含量回復到正常值。

目前對於第一型糖尿病的管理，除了施打胰島素及胰臟移植之外，同時亦包括生活習慣的控制(如規律的運動、低卡低油飲食、體重控制)及藥物治療。除了前述方法之外，亦有文獻報告提及或可藉由移植幹細胞而達到治療糖尿病的目的。然而，截至目前為止，藉移植幹細胞來治療糖尿病多為基礎醫學研究文獻報告，但臨床上以幹細胞移植來治療糖尿病相關的文獻相對就較少。

另外亦有研究指出，高糖環境之下會傷害幹細胞，使幹細胞的移動能力或是修復能力下降，甚至可能導致幹細胞內部氧化壓力提昇。換言之，如何使幹細胞在不適生長環境如高糖環境中生存，且能對受損器官如胰臟而能有效修復是一重要課題。

有鑑於此，如何發展前述幹細胞能在不利於細胞生長的環境中如高糖、高氧化壓力等微環境下生存；且進一步能有效改善並治療生物體受損器官，解決習知技術之缺失，實為相關技術領域者目前所迫切需要解決之問題。

本發明提供一種用於製備治療胰臟受損之醫藥處組合物之應用，其中該醫藥組合物包含一幹細胞與酯型一兒茶素(Catechin)。

較佳地，該幹細胞為一成體幹細胞。

較佳地，該成體幹細胞為一脂肪幹細胞。

較佳地，該兒茶素係包括一酯型兒茶素、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)。

較佳地，該酯型兒茶素係包括表兒茶素沒食子酸酯(ECG)及表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)。

較佳地，該脂肪幹細胞係以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)預處理2小時。

較佳地，預處理脂肪幹細胞之酯型兒茶素之濃度為低於20μM。

較佳地，預處理脂肪幹細胞之酯型兒茶素之濃度為5-15μg/mL。

較佳地，其中將顆1X10⁵~1X10⁷顆之幹細胞藉由靜脈注射給與一個體。

發明內容旨在提供本發明內容的簡化摘要，以使閱讀者對本發明內容具備基本的理解。此發明內容並非本發明內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

第1A圖為以幹細胞表面標記而分析幹細胞特性；第1B圖為以幹細胞分化能力而分析幹細胞特性；第2圖為幹細胞於高糖環境下(a)細胞存活率分析；(b)存活蛋白表現量分析；第3圖為實驗動物幹細胞治療前後血糖值分析；第4圖為實驗動物胰臟組織存活相關蛋白質表現量分析，西方墨點分析；第5圖為實驗動物胰臟組織存活相關蛋白質表現量分析，定量圖；第6圖為實驗動物胰臟組織Sirt1路徑相關蛋白質表現量分析，西方墨點分析；第7圖為實驗動物胰臟組織Sirt1路徑相關蛋白質表現量分析，定量圖；第8圖為實驗動物胰臟組織凋亡路徑相關蛋白質表現量分析，西方墨點分析；第9圖為實驗動物胰臟組織凋亡路徑相關蛋白質表現量分析，西方墨點分析；第10圖為實驗動物胰臟組織凋亡路徑相關蛋白質表現量分析，定量圖；第11圖為實驗動物胰臟組織凋亡路徑相關蛋白質表現量分析，定量圖；第12圖為實驗動物胰臟組織切片分析，HE染色分析胰島組織大小；第13圖為實驗動物胰臟組織切片分析，胰島組織大小分析定量圖；第14圖為實驗動物胰臟組織切片分析，Masson’s Trichrome染色分析胰臟組織纖維化程度；第15圖為實驗動物胰臟組織切片分析，西方墨點法分析胰臟組織纖維化相關蛋白質表現量。

為了使本發明內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

本發明提供一種治療胰臟受損之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含一以綠茶多酚預處理之幹細胞，可具有提升幹細胞分化能力的功效。

以下實施例為示例性之說明，並非用於限制本發明之範疇。

實施例1：動物實驗設計

1. 8月齡Wistar品系公鼠(購自樂思科公司)分成四組，分別是正常組(Sham)、以STZ(55mg/kg)誘發成糖尿病組(DM)、糖尿病加上自體脂肪幹細胞治療組(DM+ADSC)及糖尿病加上綠茶EGCG前處理之自體脂肪幹細胞治療組(DM+E-ADSC)等，如下表1所示。大鼠是在日間12小時、夜間12小時的循環下飼養於動物房，飼養期間飲食及飲水自由取食，以二隻大鼠共養一在個動物籠，飼養期間每二天換動物塾料。當糖尿病組老鼠血糖上升至200mg/dl時，即認定有糖尿病的病症，認定糖尿病組一個月後即以自體幹細胞移植做治療。自體幹細胞的回輸是每隻大鼠以尾靜脈方式回輸1X10⁵~1X10⁷顆幹細胞。

2.血糖分析

大鼠血糖測試採空腹尾靜脈血以羅氏血糖儀(Accu-Chek Active)檢測之。

實施例2：大鼠脂肪幹細胞萃取和實驗

1.脂肪幹細胞萃取

以手術方式將8月齡Wistar品系公鼠腹腔內脂肪取出，將脂肪切成適當大小後，用含抗生素之生理食鹽水洗淨脂肪，將洗淨之脂肪組織置入含有第二型膠原蛋白酶(0.01%)的生理食鹽水中，以37℃水浴加熱攪拌約1小時，於室溫下以3000rpm離心約10分鐘，將下層沈澱物取出後在細胞培養皿中，做細胞培養。

2.幹細胞特性分析

在動物自體移植幹細胞治療之前，需確定移植的細胞是否為幹細胞，確定幹細胞的分析方式有二類，第一種是以流式細胞儀分析幹細胞膜上的正向標記(positive marker)與負向標記(negative marker)，幹細胞特性是正向標記表現量愈高、負向標記表現量愈少。另一種方式為分化實驗，觀察幹細胞是否具有能力分化成其他不同種類的細胞。由圖1(A)可知，細胞群所分析的正向標記CD90表現量為96.6%，而負向標記CD45表現量為1%；另外圖1(B)顯示此細胞群具分化成脂肪細胞的能力，綜合上述可知，此細胞群具備幹細胞的特性。

實施例3：細胞存活分析

細胞培養於24-well dish中，細胞加藥處理後，除去培養液並以PBS buffer進行沖洗(3次)，換含有0.5mg/ml MTT的培養液，培養約3~4小時後除去培養液並以PBS buffer進行沖洗，並加入1ml isopropanol將紫色formazan結晶溶解，5分鐘後進行O.D.570nm吸光值測定。

幹細胞處於高糖環境刺激下的細胞存活率為圖2(a)，與控制組(ADSC)相比，處於高糖環境下的幹細胞(HG+ADSC)其存活率為56±4%(p<0.001)。若將幹細胞經EGCG預處理後再以高糖刺激(HG+E-ADSC)，其存活率為68±5%，明顯高於HG+ADSC組(HG+E-ADSC>HG+ADSC,p<0.05)。

實施例4：蛋白濃度測定

蛋白質的定量採用Bradford protein assay方法，其原理為蛋白質可與Coomassie billiant blue G-250形成藍色複合物，當藍色越深表示蛋白含量越高。測試方法首先以一系列已知濃度BSA加入五分之一體積的Bradford protein dye，以波長595nm可見光之析光度做一標準曲線，再以同樣的方法測得樣品之O.D.值，即可根據標準曲線求得樣品蛋白之濃度。

實施例5：血糖分析

各組實驗動物於幹細胞治療前後血糖值改變

圖3為實驗動物於幹細胞治療前後血糖值之分析，由圖可知，正常組(Sham)、糖尿病組(DM)、糖尿病經幹細胞治療組(DM+ADSC)、糖尿病經EGCG預處理過幹細胞治療組(DM+E-ADSC)的血糖值分別為103±10、540±50、504±23、412±28mg/dl，其中DM組血糖值明顯高於Sham組(DM>Sham,p<0.001)，而DM+E-ADSC組則明顯低於DM組及DM+ADSC組(DM>DM+E-ADSC，p<0.01；DM+ADSC>DM+E-ADSC,p<0.01)。

實施例6：西方墨點法

取樣品蛋白40ug加入PBS solution與5X loading dye混合均勻再煮沸10分鐘，然後再進行SDS-聚丙烯胺板膠電泳分析。SDS-聚丙烯胺板膠電泳之上層膠體為3.75% Stacking gel，下層膠體為5%和12% Separating gel。將做好之板膠固定到電泳裝置上，並將電泳緩衝液(Electrode buffer)注滿電泳槽，然後將處理過的蛋白樣品溶液加入板膠上所形成的U型槽中，以75伏特進行電泳。電泳結束後進行蛋白轉移，將膠體取出，將膠體平鋪在一張浸濕的Whatman 3M濾紙上。此時將預先用甲醇浸濕的PVDF membrane蓋在膠體上面，依次在覆蓋一張浸濕的3M濾紙，並以玻棒輕趕其間的氣泡後裝入Transfer Holder，然後置於Electrotransfer Tank(內含Transfer buffer)於4℃下，進行100伏特電壓轉移，電轉移1小時之後，取出PVDF membrane浸入含5%(w/v)脫脂牛奶(Blocking buffer)(PBS-non-fat milk powder)於室溫下搖動一個小時。將PVDF membrane置於4度冰箱中與一級抗體反應overnight，之後以Washing buffer清洗兩次，每一次10分鐘，最後再清洗一次倒掉即可。再以Horseradish peroxidase conjugated secondary antibody反應2小時，以相同的方式清洗PVDF membrane。最後將PVDF membrane浸入4ml的受質溶液(substrate buffer)進行呈色反應。

圖2(b)為幹細胞處於高糖環境時，其存活相關蛋白質p-Akt表現量，與ADSC相較高糖環境明顯調降幹細胞存活蛋白p-Akt表現量(HG+ADSC<ADSC)；相對的，經EGCG預處理後的幹細胞在高糖環境下(HG+E-ADSC)，其存活蛋白p-Akt表現量明顯比HG+ADSC組高。

圖4-5為實驗動物胰臟組織存活相關蛋白質表現量分析，由圖可知，與正常組(Sham)相較，糖尿病組(DM)會調降動物胰臟組織存活相關蛋白質表現量，包含p-IGF1R、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad及Bcl-xL，相對的，以幹細胞移殖治療後(DM+ADSC及DM+E-ADSC)則存活蛋白相關表現量有回升的趨勢。其中以EGCG預處理過之幹細胞治療組(DM+E-ADSC)調升存活蛋白表現量最為顯著。

由圖6-7可知，與正常組(Sham)相較，糖尿病組(DM)會調降動物胰臟組織Sirt1路徑相關蛋白質表現量，包含p-AMPK及Sirt1，相對的，以幹細胞移植治療後(DM+ADSC及DM+E-ADSC)則Sirt1路徑相關蛋白質表現量有回升的趨勢，其中以EGCG預處理過之幹細胞治療組(DM+E-ADSC)調升存活蛋白表現量最為顯著。

由圖8-11可知，與正常組(Sham)相較，糖尿病組(DM)會調升動物胰臟組織細胞凋亡路徑相關蛋白質表現量。相對的，以幹細胞移植治療後(DM+ADSC及DM+E-ADSC)則細胞凋亡路徑相關蛋白質表現量有下降的趨勢，其中以EGCG預處理過之幹細胞治療組(DM+E-ADSC)調升存活蛋白表現量最為顯著。

實施例7：切片染色

1.大鼠犧牲後取下胰臟組織，浸泡福馬林固定組織，之後以乙醇脫水，並將胰臟組織以石蠟包埋後切成0.2μm大小之組織切片。在HE染色部分，將組織切片以乙醇及福馬林脫蠟並固定後，以hematoxylin及eosin染色觀察即可。在Masson’s Trichrome染色部份，將組織切片以乙醇及福馬林脫蠟並固定後，依序將組織以下列染劑染色即可：Bouin’s染劑15分鐘、Weiger染劑10分鐘、Beibrich染劑5分鐘、PPA染劑10分鐘及Aniline blue染劑5分鐘。

2.實驗動物胰臟組織切片分析

圖12-13為動物胰臟組織HE染色，觀察胰島組織直徑大小，以及其直徑之量化圖。由圖可知，正常組(Sham)、糖尿病組(DM)、糖尿病經幹細胞治療組(DM+ADSC)、糖尿病經EGCG預處理過幹細胞治療組(DM+E-ADSC)的胰島組織直徑大小分別為18±0.2、14.1±0.2、15.1±0.5、16.2±0.4μm，其中DM組胰島組織直徑大小明顯比Sham小(DM<Sham, p<0.001)，經幹細胞治療後胰島組織直徑大小明顯回升(DM+ADSC>DM,p<0.05；DM+E-ACSC>DM,p<0.01)，經EGCG預處理過之幹細胞其治療效果又比單純幹細胞治療來得好(DM+ADSC<DM+E-ADSC,p<0.05)。

3.實驗動物胰臟組織切片纖維化分析

圖14為動物胰臟組織Masson’s Trichrome染色，觀察胰島組織纖維化程度，由圖可知，與正常組(Sham組)相較，糖尿病組(DM組)藍色膠原蛋白染色處較多，代表纖維化程度嚴重。相對的，幹細胞治療組如DM+ADSC及DM+E-ADSC藍色膠原蛋白染色處較少，尤其是DM+E-ADSC組改善較明顯。圖15為動物胰臟組織纖維化相關蛋白質表現量分析，與Sham組相比，DM組的TGF β蛋白質表現量明顯增加；相對的，幹細胞治療組如DM+ADSC及DM+E-ADSC的TGF β蛋白質表現量明顯變少，尤其是DM+E-ADSC組改善較明顯。

4.統計分析

每個檢體/樣品的分析結果都是以三次或三次以上的實驗數據進行分析，採用ANOVA分析方式進行統計。p<0.05表示有顯著差異。

由實驗結果可知，糖尿病大鼠可透過幹細胞治療達到降血糖的目的，其機轉是透過調升胰臟組織存活相關蛋白質、調升Sirt1路徑相關蛋白質、調降凋亡路徑相關蛋白質的表現量而使胰臟中的胰島組織大小回復，進而使得胰臟功能回復正常，並使得血糖值調降。同時，透過幹細胞治療亦可使胰臟組織中纖維化相關蛋白質表現量調降，使得胰臟組織纖維化程度降低，間接恢復胰臟功能。

且經綠茶EGCG預處理過之幹細胞(DM+E-ADSC)其保護胰臟組織的功能比未經處理之幹細胞(DM+ADSC)之結果較好。探就其原因，在細胞實驗中發現幹細胞在高糖的環境下，其存活相關蛋白質p-Akt會調降，導致幹細胞在高糖環境的存活率下降；相對的，經綠茶EGCG預處理之後，幹細胞的p-Akt調升，造成幹細胞在高糖環境下細胞存活率上升。由此實驗結果可引申為幹細胞在移殖到糖尿病動物中，由於糖尿病所造成的高糖環境會使幹細胞存活蛋白p-Akt調降，使得幹細胞在糖尿病動物體內存活率降低，相對的治療較果會打折扣；若在移殖進入糖尿病動物治療前，幹細胞經EGCG預處理後，其p-Akt存活蛋白質調升，使得幹細胞對抗糖尿病所引起的高糖環境能力上升(EGCG預處理後之幹細胞不容易因高糖環境而造成細胞凋亡)，則會有較多的幹細胞存活於糖尿病的動物體內，當然其保護(修復)胰臟組織的功能會較佳。

實驗的結論可歸納出下列幾點重點：(1)EGCG預處理會調升幹細胞對抗高糖環境的能力；(2)經EGCG處理過的幹細胞修復受損胰臟組織的能力及降血糖的能力比未經任何處理的幹細胞來得好；(3)經EGCG處理過的幹細胞修復胰臟受損組織的能力是經由調升胰臟組織內存活相關蛋白質、調升Sirt1路徑相關蛋白質、調降凋亡相關蛋白質及調降纖維化相關蛋白質。

Claims

一種用於製備治療胰臟受損之醫藥組合物之用途，其中該醫藥組合物包含一預處理之脂肪幹細胞與一酯型兒茶素，其中預處理之脂肪幹細胞係以酯型兒茶素與脂肪幹細胞共同培養。
如請求項1所述之用途，其中該胰臟受損造成糖尿病或高血糖。
如請求項1所述之用途，其中該胰臟受損部位為胰臟 β細胞。
如請求項1所述之用途，其中該預處理之脂肪幹細胞係以該酯型兒茶素預處理2小時。
如請求項1所述之用途，其中預處理該脂肪幹細胞之酯型兒茶素之濃度為5-25μM。
如請求項1所述之用途，其中預處理該脂肪幹細胞之該酯型兒茶素之濃度為低於20μM。
如請求項1所述之用途，其中該預處理之脂肪幹細胞在高糖環境中，相較於未經過預處理之脂肪幹細胞有較高的存活率，其中高糖環境係指葡萄糖濃度為22mM~44mM，以33mM為主，其中較高存活率係為80%~100%。
如請求項1所述之用途，其中該預處理之脂肪幹細胞，相較於未經過預處理之脂肪幹細胞，可提升胰臟受損部位之存活相關蛋白質之表現量，其中存活相關蛋白質包含p-IGF1R、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad及Bcl-xL，其中提升的百分比為50%~100%。
如請求項1所述之用途，其中該預處理之脂肪幹細胞，相較於未經過預處理之脂肪幹細胞，可提升胰臟受損部位之Sirt1路徑相關蛋白質之表現量，其中Sirt1路徑相關蛋白質包含p-AMPK及Sirt1，其中提升的百分比為50%~100%。
如請求項1所述之用途，其中該預處理之脂肪幹細胞，相較於未經過預處理之脂肪幹細胞，可降低胰臟受損部位之細胞凋亡路徑相關蛋白質之表現量，其中細胞凋亡路徑相關蛋白質包含FADD、Caspase 8、Bax、Cytochrome C及Caspase 3，其中降低的百分比為40%~80%。
如請求項1所述之用途，其中該預處理之脂肪幹細胞，相較於未經過預處理之脂肪幹細胞，可降低胰臟受損部位之纖維化相關蛋白質，其中纖維化相關蛋白質為TGFβ，其中降低的百分比為40%~80%。