CN109459428A - 一种乳酸检测干化学试纸及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种乳酸检测干化学试纸及其制备方法，属于体外诊断试纸技术领域。解决了如何提供一种简单、快捷、安全、有效，对阴道炎的诊断具有很高的敏感度和特异性的乳酸检测干化学试纸及其制备方法的问题。本发明的乳酸检测干化学试纸，为分散有底物、酶、螯合剂、保护剂和缓冲物的滤纸；其中，底物为联苯胺类或联苯胺类衍生物；酶为乳酸氧化酶和过氧化物酶。该干化学试纸可一步测定乳酸含量，简单、快捷、安全、有效、敏感度高、特异性好。

Description

一种乳酸检测干化学试纸及其制备方法
技术领域
本发明属于体外诊断试纸技术领域，具体涉及一种乳酸检测干化学试纸及其制备方法。
背景技术
下生殖道感染属于妇科常见病，易导致流产、不孕不育、宫颈糜烂甚至宫颈癌，现已成为发展中国家面临的重要公共卫生问题。
阴道炎以各种原因导致的阴道菌群失调及以阴道微生态平衡破坏为首要影响因素。近年来临床病例显示常见妇女阴道炎多数是由大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、伤寒杆菌和肠球菌引起的。乳酸杆菌是健康妇女阴道中的正常菌种和优势菌群，它是一种微需氧菌群，与阴道菌群之间形成微生态平衡并制约其他菌的生长。乳酸杆菌的代谢产物(乳酸)可以降低阴道pH值，维持阴道的生态平衡，作为妇女阴道的清洗剂，无毒、无副作用，在保持阴道清洁等方面起重要作用。研究表明各种阴道炎患者的乳酸杆菌数量明显下降，乳酸杆菌的替代、排斥和竞争等保护作用减少或消失，寄生在阴道的支原体、真菌、加德纳杆菌、或其他外来病原微生物在阴道中大量繁殖，引起各种阴道炎的发作，阴道中乳酸杆菌数量的减少在各种阴道炎的发病过程中起着非常关键的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、快捷、安全、有效，对阴道炎的诊断具有很高的敏感度和特异性的乳酸检测干化学试纸及其制备方法。
本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下。
乳酸检测干化学试纸，该干化学试纸为分散有底物、酶、螯合剂、缓冲物和保护剂的滤纸；
所述底物为聚苯胺类或聚苯胺类衍生物；
所述酶为乳酸氧化酶和过氧化物酶。
优选的是，所述底物为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺衍生物、N，N-二甲基苯胺盐酸盐、对氨基-N,N-二甲基苯胺盐酸盐或对氨基-N,N-二甲基苯胺盐酸盐衍生物。
优选的是，所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)。
优选的是，所述保护剂为海藻糖、葡萄糖、牛血清白蛋白中的一种或多种。
优选的是，所述缓冲物为乙酸钾缓冲物、磷酸盐缓冲物、柠檬酸缓冲物中的一种或多种。
优选的是，所述滤纸为7218型滤纸、31ET型滤纸、3MM型滤纸或526型滤纸。
上述乳酸检测干化学试纸的制备方法，步骤如下：
步骤一、将酶溶解于含有螯合剂和保护剂的缓冲液中，形成浸液A，用浸液A浸润滤纸，干燥，得到分散有酶的滤纸；
步骤二、将底物溶解于醇溶剂中，形成浸液B，用浸液B浸润步骤一得到的分散有酶的滤纸，干燥，裁切，得到乳酸检测干化学试纸。
优选的是，所述浸液A中，乳酸氧化酶的浓度为19KU/L-30KU/L，过氧化物酶的浓度为50KU/L-150KU/L。
优选的是，所述含有螯合剂和保护剂的缓冲液的pH为3-7；更优选的是，pH为4-5。
优选的是，所述含有螯合剂和保护剂的缓冲液的离子强度为0.2-1M；更优选的是，离子强度为0.5-0.8M。
优选的是，所述缓冲液的浓度为0.1-1M，缓冲液为乙酸钾缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种或多种。
优选的是，所述浸液A中，螯合剂的浓度为0.1％-0.5％。
优选的是，所述浸液A中，每种保护剂的浓度为1％-5％。
优选的是，所述浸液B中，底物的浓度为1-5mg/mL。
优选的是，所述浸液B中，醇溶剂为无水乙醇。
优选的是，浸液A的干燥温度为40-70℃，浸液B的干燥温度为40℃-70℃；浸液A和浸液B的干燥方式为烘箱干燥或浸渍干燥机自动化干燥；浸液A和浸液B烘箱干燥的干燥时间分别为20-25min和10-25min；浸渍干燥机自动化干燥的温度设置为：浸液A和浸液B均是开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度≥60℃左右时开始浸液；浸渍干燥机走速设定：浸液A为8.0-11.0Hz，浸液B为22.0-25.0Hz。
本发明的原理：乳酸是乳酸杆菌分泌的，可以降低阴道pH值，维持阴道的生态平衡；乳酸在乳酸氧化酶作用下生成丙酮酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶作用下，释放出新生态氧，使联苯胺底物产生绿色或是蓝色，呈色深度与过氧化氢浓度呈正比；显绿色或是蓝色，标记为显阴性，表示存在大量乳酸杆菌，阴道菌群正常；不显色，标记为显阳性，阴道菌群失调，阴道环境病态或处于亚健康状态。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的乳酸检测干化学试纸可一步测定乳酸含量，检测时将样品与试纸接触，37℃温浴8-10min，试纸由无色或浅黄色变成绿色或是蓝色，即判定为乳酸存在，该试纸简单、快捷、安全、有效、敏感度高、特异性好。
本发明的乳酸检测干化学试纸的制备方法，工艺简单，便于操作。
附图说明
图1为本发明的乳酸检测干化学试纸制备过程中的干燥工艺的示意图；
图2为本发明的乳酸检测干化学试纸检测样品时的示意图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
本发明提供一种乳酸检测干化学试纸，为分散有底物、酶、螯合剂、保护剂和缓冲物的滤纸；其中，底物为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺衍生物、N，N-二甲基苯胺盐酸盐、对氨基-N,N-二甲基苯胺盐酸盐或对氨基-N,N-二甲基苯胺盐酸盐衍生物；酶为乳酸氧化酶和过氧化物酶；螯合剂优选为乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)；保护剂为糖类化合物或蛋白类试剂，如海藻糖、葡萄糖、牛血清白蛋白中的一种或多种；缓冲物优选为乙酸钾缓冲物、磷酸盐缓冲物、柠檬酸缓冲物中的一种或多种，为对应的缓冲液干燥后的物质，如乙酸钾缓冲物为乙酸钾缓冲液干燥后的物质；滤纸为本领域技术人员常用物，可以采用7218型滤纸、31ET型滤纸、3MM型滤纸、526型滤纸等。
本发明还提供上述乳酸检测干化学试纸的制备方法，步骤如下：
步骤一、将酶溶解于含有螯合剂和保护剂的缓冲液中，形成浸液A，用浸液A浸润滤纸，干燥，得到分散有酶的滤纸；
步骤二、将底物溶解于醇溶剂中，形成浸液B，用浸液B浸润步骤一得到的分散有酶的滤纸，干燥，裁切，得到乳酸检测干化学试纸。
上述技术方案中，浸液A中，乳酸氧化酶的浓度为19KU/L-30KU/L，过氧化物酶的浓度为50KU/L-150KU/L。
上述技术方案中，含有螯合剂和保护剂的缓冲液的pH优选为3-7，更优选为4-5，离子强度优选为0.2-1M，更优选为0.5-0.8M，缓冲液的浓度为0.1-1M，缓冲液为乙酸钾缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种或多种。
上述技术方案中，浸液A中，螯合剂的浓度为0.1％-0.5％。
上述技术方案中，浸液A中，每种保护剂的浓度为1％-5％；如仅含有海藻糖，则海藻糖的浓度为1-5％；如含有海藻糖和牛血清白蛋白，则海藻糖的浓度为1-5％，牛血清白蛋白的浓度也为1-5％。
上述技术方案中，浸液B中，底物的浓度为1-5mg/mL。
上述技术方案中，浸液B中，醇溶剂为无水乙醇，无水乙醇沸点低，缩短干燥时间，且无水乙醇生物安全性高。
上述技术方案中，浸液A的干燥温度为40-70℃，浸液B的干燥温度为40-70℃；浸液A和浸液B的干燥方式为烘箱干燥或浸渍干燥机自动化干燥：
1、烘箱干燥方法：取滤纸，先用浸液A浸湿均匀，在40-70℃高温干燥烘箱中干燥20-25min，烘干后将滤纸再用浸液B浸湿均匀，在40-70℃高温干燥烘箱中干燥10-25min，烘干，室温密封保存。
2、浸渍干燥机自动化干燥方法：
2.1、浸渍干燥机温度设定：
浸液A：开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度≥60℃左右时开始浸液；
浸液B：开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度≥60℃左右时开始浸液；
对主加热和副加热同时设定，可控制设备出现温度过高或过低带来的不利影响，当干燥室温度低于设定值，主加热和副加热同时加热可快速达到设定温度；当干燥室温度高于设定温度，主加热和副加热同时降温可快速达到设定温度。
2.2、浸渍干燥机走速设定：
浸液A：8.0-11.0Hz 浸液B：22.0-25.0Hz
走速调节随干燥室的温度来设定，来保证试纸干燥程度的一致性，当试纸干燥过快，将走速调快，当试纸干燥过慢，将走速调慢。
本发明的乳酸干化学试纸条的使用方法，将待检测的样品与试纸接触，于37℃温浴8-10min，观察试纸的颜色变化，试纸由黄色变成绿色或是蓝色，即判定为乳酸大量存在；
通常待检测的样品与试纸接触的方式为：将待检测的样品用1.2mL细胞保存液稀释，滴加一滴在试纸块上。
以下结合实施例进一步说明本发明，实施例中所采用的化学试剂为分析纯，可通过商购获得。
实施例1
乳酸检测干化学试纸的制备：取7218型滤纸，先用浸液A浸湿均匀，在50℃高温干燥烘箱中干燥25min，烘干后将滤纸再用浸液B浸湿均匀，在50℃高温干燥烘箱中干燥25min，烘干，密封保存在2-8℃；
浸液A：0.2M的柠檬酸缓冲液，19KU/L的乳酸氧化酶，50KU/L的过氧化物酶，0.1％EDTA-2Na，1％海藻糖，5％牛血清白蛋白，pH为5。
浸液B：含有1mg/mL3,3,5,5-四甲基联苯胺的无水乙醇溶液。
实施例2
乳酸检测干化学试纸的制备：取31ET型滤纸，先用浸液A浸湿均匀，在50℃高温干燥烘箱中干燥25min，烘干后将滤纸再用浸液B浸湿均匀，在50℃高温干燥烘箱中干燥20min，烘干，密封保存在2-8℃；
浸液A：1M的柠檬酸缓冲液，23KU/L的乳酸氧化酶，100KU/L的过氧化物酶，0.5％EDTA-2Na，5％葡萄糖，1％牛血清白蛋白，pH为5。
浸液B：含有3mg/mL3,3,5,5-四甲基联苯胺的无水乙醇溶液。
实施例3
乳酸检测干化学试纸的制备：取3MM滤纸，先用浸液A浸湿均匀，在60℃高温干燥烘箱中干燥20min，烘干后将滤纸再用浸液B浸湿均匀，在60℃高温干燥烘箱中干燥15min，烘干，密封保存在2-8℃；
浸液A：0.2M的磷酸缓冲液，27KU/L的乳酸氧化酶，120KU/L的过氧化物酶，0.1％EDTA-2Na，3％海藻糖，2％牛血清白蛋白，pH为4。
浸液B：含有4mg/mL N，N-二甲基苯胺盐酸盐的无水乙醇溶液。
实施例4
乳酸检测干化学试纸的制备：取526型滤纸，先用浸液A浸湿均匀，在70℃高温干燥烘箱中干燥20min，烘干后将滤纸再用浸液B浸湿均匀，在70℃高温干燥烘箱中干燥10min，烘干，密封保存在2-8℃；
浸液A：1M的柠檬酸缓冲液，30KU/L的乳酸氧化酶，150KU/L的过氧化物酶，0.5％EDTA-2Na，1％葡萄糖，4％牛血清白蛋白，pH为3。
浸液B：含有5mg/mL3,3,5,5-四甲基联苯胺的无水乙醇溶液。
实施例5
乳酸检测干化学试纸的制备：取3MM型滤纸，先用浸液A浸湿均匀，浸渍干燥机主温度设置80℃，副温度设置60℃，走速8.5Hz，烘干后将滤纸再用浸液B浸湿均匀，浸渍干燥机主温度设置80℃，副温度设置60℃，走速25Hz，烘干后烘干，密封保存在2-8℃；
浸液A：1M的柠檬酸缓冲液，30KU/L的乳酸氧化酶，150KU/L的过氧化物酶，0.5％EDTA-2Na，2％葡萄糖，3％牛血清白蛋白，pH为3。
浸液B：含有5mg/mLN，N-二甲基苯胺盐酸盐的无水乙醇溶液。
采用实施例1-5的乳酸检测干化学试纸检测待测样品。检测方法：将试纸从2℃-8℃取出，平衡至室温(18℃-25℃)；用无菌植绒拭子采集阴道炎患者阴道分泌物，放入软试管中，每个样本加1.2mL细胞保存液，反复涮洗拭子，使拭子样本充分洗脱；将样本分别滴加在试纸上；试纸在37±1℃温育8分钟后，在1分钟内与色标对比判读结果检测结果：实施例1-5对样本检测结果为阴道菌群失调的准确率均达到97％以上。说明该试纸、安全、有效、敏感度高、特异性好。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.乳酸检测干化学试纸，其特征在于，该干化学试纸为分散有底物、酶、螯合剂、保护剂和缓冲物的滤纸；
所述底物为联苯胺类或联苯胺类衍生物；
所述酶为乳酸氧化酶和过氧化物酶。
2.根据权利要求1所述的乳酸检测干化学试纸，其特征在于，
所述底物为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、3,3’,5,5’-四甲基联苯胺衍生物、N，N-二甲基苯胺盐酸盐、对氨基-N,N-二甲基苯胺盐酸盐或对氨基-N,N-二甲基苯胺盐酸盐衍生物；
所述螯合剂为乙二胺四乙酸二钠；
所述保护剂为海藻糖、葡萄糖、牛血清白蛋白中的一种或多种；
所述缓冲物为乙酸钾缓冲物、磷酸盐缓冲物、柠檬酸缓冲物中的一种或多种；
所述滤纸为7218型滤纸、31ET型滤纸、3MM型滤纸或526型滤纸。
3.权利要求1或2所述的乳酸检测干化学试纸的制备方法，其特征在于，步骤如下：
步骤一、将酶溶解于含有螯合剂和保护剂的缓冲液中，形成浸液A，用浸液A浸润滤纸，干燥，得到分散有酶的滤纸；
步骤二、将底物溶解于醇溶剂中，形成浸液B，用浸液B浸润步骤一得到的分散有酶的滤纸，干燥，裁切，得到乳酸检测干化学试纸。
4.根据权利要求3所述的乳酸检测干化学试纸的制备方法，其特征在于，所述浸液A中，乳酸氧化酶的浓度为19KU/L-30KU/L，过氧化物酶的浓度为50KU/L-150KU/L。
5.根据权利要求3所述的乳酸检测干化学试纸的制备方法，其特征在于，所述含有螯合剂和保护剂的缓冲液的pH为3-7，离子强度为0.2-1M；缓冲液的浓度为0.1-1M，缓冲液为乙酸钾缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的乳酸检测干化学试纸的制备方法，其特征在于，所述浸液A中，螯合剂的浓度为0.1％-0.5％。
7.根据权利要求3所述的乳酸检测干化学试纸的制备方法，其特征在于，所述浸液A中，每种保护剂的浓度为1％-5％。
8.根据权利要求3所述的乳酸检测干化学试纸的制备方法，其特征在于，所述浸液B中，底物的浓度为1-5mg/mL。
9.根据权利要求3所述的乳酸检测干化学试纸的制备方法，其特征在于，所述浸液B中，醇溶剂为无水乙醇。
10.根据权利要求3所述的乳酸检测干化学试纸的制备方法，其特征在于，浸液A的干燥温度为40-70℃，浸液B的干燥温度为40℃-70℃；浸液A和浸液B的干燥方式为烘箱干燥或浸渍干燥机自动化干燥；浸液A和浸液B烘箱干燥的干燥时间分别为20-25min和10-25min；浸渍干燥机自动化干燥的温度设置为：浸液A和浸液B均是开机后将设备温度主加热设定80℃，副加热设定60℃，待主机加热温度达到80℃，各干燥室温度≥60℃左右时开始浸液；浸渍干燥机走速设定：浸液A为8.0-11.0Hz，浸液B为22.0-25.0Hz。
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