CN106645721A

CN106645721A - 一种凝固酶检测试剂、反应垫、其制备方法及试剂盒

Info

Publication number: CN106645721A
Application number: CN201610881479.3A
Authority: CN
Inventors: 眭红燕; 朱华琳; 范静彦; 李必松
Original assignee: GUANGZHOU HONGQI OPTICAL INSTRUMENT TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU HONGQI OPTICAL INSTRUMENT TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2016-09-30
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2017-05-10
Anticipated expiration: 2036-09-30
Also published as: CN106645721B

Abstract

本发明公开一种凝固酶检测试剂、反应垫、其制备方法及试剂盒；所述凝固酶检测试剂，包括反应剂和显色剂；反应剂包括：吗啉乙磺酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和甘氨酰‑精氨酰四甲氧基‑β‑萘胺；所述反应垫，包括载体和所述的反应剂的成分；所述反应剂的成分包被在载体上；所述反应垫的制备方法包括：1)将蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和甘氨酰‑精氨酰四甲氧基‑β‑萘胺溶于吗啉乙磺酸中，得到浸泡液；2)将载体置于浸泡液中充分浸泡后取出，然后进行干燥，得到反应垫；通过该制备方法获得的反应垫结合检测试剂的成分应用于制备一种灵敏度高、精确度高的试剂盒。

Description

一种凝固酶检测试剂、反应垫、其制备方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及需氧菌性阴道炎检测试剂领域，具体涉及一种凝固酶检测试剂、反应垫、其制备方法及试剂盒。

背景技术

阴道炎是阴道黏膜及黏膜下结缔组织的炎症，是妇科门诊常见的疾病。正常健康妇女，由于解剖学及生物化学特点，阴道对病原体的侵入有自然防御功能，当阴道的自然防御功能遭到破坏，则病原体易于侵入，导致阴道炎症。常见的阴道炎有细菌性阴道炎(BV/AV)、霉菌性阴道炎(VVC)及滴虫性阴道炎(TV)三大类。其中，女性细菌性阴道感染可分为两种，一种由厌氧菌和兼性厌氧菌引起，临床上称细菌性阴道病(BV)，另一种由需氧菌引起，临床上称需氧菌性阴道炎(AV)。两种细菌性阴道炎的病原体不同，临床症状、治疗方案和结局也不相同，区别这两种细菌性阴道感染，在阴道感染的诊疗中具有重要意义。BV是指一类在生殖学上正常菌群(产H₂O₂乳酸杆菌)减少，代之以加德纳菌、厌氧菌，弯曲弧菌大量繁殖，阴道内生态平衡系统改变引起的一类疾病。AV是由阴道乳酸杆菌减少，需氧菌感染引起的阴道炎症。常见病原体为链球菌、葡萄球菌以及大肠埃希菌。正常阴道是以乳酸杆菌为优势菌的正常微生物群，阴道pH＜4.5。而当患需氧菌性阴道炎时，阴道乳酸杆菌减少，而需氧菌繁殖导致阴道壁黏膜充血、水肿和产生脓性分泌物。临床表现以阴道异常分泌物、性交痛为主。细菌预成酶是细菌在生长繁殖过程中合成的一系列与生长代谢有关的酶类，这些酶类能分解多种生化反应的底物，并且在有氧环境中能较长时间地保留其活性。不同种属的细菌，其预成酶的种类不同。AV的主要致病菌黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌可产生凝固酶。通过检测凝固酶来诊断阴道中需氧菌菌群结构是一个有效、可行的方法。但目前用于检测凝固酶的检测试剂其精确度有所欠缺。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种凝固酶检测试剂，该试剂可使用生理盐水作为样品稀释液，使用条件简单方便，精确性高。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种凝固酶检测试剂，包括反应剂和显色剂；所述反应剂包括：吗啉乙磺酸缓冲液、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和甘氨酰-精氨酰四甲氧基-β-萘胺。

作为优选，所述反应剂的成分按重量份计包括：

蔗糖 0.2～10份；

聚乙烯吡咯烷酮 0.2～2份；

甘氨酰-精氨酰四甲氧基-β-萘胺 0.2～2份；

吗啉乙磺酸缓冲液的摩尔浓度为：0.05～1.5mol/L。

再优选地，所述反应剂的成分按重量份计包括：

蔗糖 0.2份；

聚乙烯吡咯烷酮 2份；

甘氨酰-精氨酰四甲氧基-β-萘胺 2份；

吗啉乙磺酸缓冲液的摩尔浓度为：0.2mol/L。

作为优选，所述显色剂按重量份计包括：

盐酸 3.5～14份；

肉桂醛 0.2～1份。

再优选地，所述显色剂按重量份计包括：

盐酸 7份；

肉桂醛 0.5份。

作为优选，所述聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮-K90。

作为优选，使用所述凝固酶检测试剂进行检测的样品的稀释液为生理盐水。

本发明的第二个目的是为了提供一种反应垫，该反应垫使用方便快捷，精确性高。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种反应垫，包括载体和如上所述的反应剂的成分；所述反应剂的成分包被在载体上；所述反应垫用于检测凝固酶。

作为优选，使用所述反应垫进行检测的样品的稀释液为生理盐水。

本发明的第三个目的是为了提供一种反应垫的制备方法，通过该制备方法结合检测试剂的成分获得一种灵敏度高、精确度高的反应垫。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种如上所述的反应垫的制备方法，包括以下步骤：

1)制备浸泡液：将蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和甘氨酰-精氨酰四甲氧基-β-萘胺溶于吗啉乙磺酸缓冲液中，得到浸泡液；

2)浸泡液处理：将载体置于浸泡液中充分浸泡后取出，然后进行干燥，得到反应垫。

作为优选，步骤2)中，所述载体置于浸泡液中充分浸泡10～20s。

作为优选，步骤2)中，所述干燥的温度为20～70℃，时间为30～40min。

作为优选，步骤2)中，所述载体为滤纸。

本发明的第四个目的是为了提供一种试剂盒，试剂盒用于检测凝固酶，使用方便灵活。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：

一种试剂盒，包括如上所述的反应垫，以及显色剂；所述试剂盒用于检测凝固酶。

本发明的设计原理如下：

当阴道分泌物中的凝固酶活性异常时，凝固酶水解甘氨酰-精氨酰四甲氧基-β-萘胺，在显色剂的作用下显浅红色、玫红色或红紫色，呈色深度与凝固酶活性成正比。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明的反应垫可使用生理盐水作为检测样品稀释液，使用条件简单方便，并可结合使用条件相同的其他菌种预成酶的检测反应垫同时对样品进行检测，效率更高；

2、本发明的反应垫制备方法最大限度地将检测试剂的成分包被在反应垫中，获得的反应垫灵敏度高，精确性好。

具体实施方式

下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：

一种凝固酶检测试剂，包括：反应剂和显色剂；反应剂按重量份计包括以下成分：

蔗糖 0.2～10份；

聚乙烯吡咯烷酮-K90 0.2～2份；

甘氨酰-精氨酰四甲氧基-β-萘胺 0.2～2份。

吗啉乙磺酸缓冲液的摩尔浓度为：0.05～1.5mol/L；

显色剂按重量份计包括：

盐酸 3.5～14份；

肉桂醛 0.2～1份。

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-K90，在25℃下，体积百分数为5％的水溶液(aq)，其粘度为39.5～45.8mPas。

其中反应剂通过以下制备方法制得：

用吗啉乙磺酸制备吗啉乙磺酸缓冲液，然后将蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和甘氨酰-精氨酰四甲氧基-β-萘胺依次溶于吗啉乙磺酸缓冲液中，得到反应剂；

其中显色剂通过以下制备方法制得：

将盐酸制备盐酸溶液，然后将肉桂醛溶于盐酸溶液中，得到显色剂，显色剂配合反应剂，得到凝固酶检测试剂。

一种反应垫，包括载体和如上所述的反应剂的成分；所述反应剂的成分包被在载体上；所述反应垫用于检测凝固酶；使用该反应垫进行样品检测时，样品的稀释液为生理盐水。

该反应垫的制备方法包括以下步骤：

1)备料：按以上重量份准备吗啉乙磺酸、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和甘氨酰-精氨酰四甲氧基-β-萘胺；

2)配置吗啉乙磺酸缓冲液(MES)：将吗啉乙磺酸溶于水溶剂中，得到吗啉乙磺酸缓冲液，待用；

3)制备浸泡液：将蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和甘氨酰-精氨酰四甲氧基-β-萘胺溶于吗啉乙磺酸缓冲液中，得到浸泡液；

4)浸泡液处理：将滤纸置于浸泡液中充分浸泡10～20s后取出，然后在温度为20～70℃，时间为30～40min的条件下进行干燥，得到反应垫。

更具体地，所述滤纸可以是Whatman玻璃纤维滤纸、GF/A Whatman的纤维滤纸Grade3或普通定量滤纸。

应用反应垫制备试剂盒：试剂盒包括反应垫和显色剂；试剂盒通过以下步骤得到：

1)放置反应垫：将反应垫置于反应孔中，然后将反应孔密封；

2)制备显色剂：将肉桂醛溶于盐酸溶液中，得到显色剂；

所述显色剂配合反应垫，得到试剂盒；试剂盒置于2～8℃中保存。

实施例1～3

实施例1～3公开了凝固酶检测试剂，按表1分别准备三组原料成分，按表2准备浓度不同的吗啉乙磺酸缓冲液；按表3准备显色剂原料；A组用于实施例1，B组用于实施例2，C组用于实施例3。

将蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和甘氨酰-精氨酰四甲氧基-β-萘胺依次溶于100mL吗啉乙磺酸缓冲液中，得到反应剂。

将肉桂醛溶于10mL盐酸溶液中，得到显色剂，显色剂配合反应剂，得到凝固酶检测试剂。

表1反应剂的成分及含量

表2吗啉乙磺酸缓冲液的配制参数

表3显色剂的成分及含量

对实施例1～3中得到的检测试剂进行检测：分别制备酶活性浓度不同的凝固酶标准品溶液，凝固酶标准品溶液以生理盐水作为溶剂，检测实施例1～3的灵敏度。

分别取实施例1～3的凝固酶检测试剂各1mL，然后分别滴加标准品溶液35uL，在温度为37±2℃的条件下水浴8～10min，然后滴入显色剂，观察溶液中的颜色变化，溶液显色为浅红色、玫红色或红紫色表示阳性，无显色表示阴性；结果如表4所示：

表4实施例1～3的检测结果

+表示阳性，-表示阴性。

实施例1～3均可检测凝固酶，且当凝固酶活性较低时仍然能够检测到凝固酶；其中在酶活性浓度为3.75U/mL时，实施例1仍可检测得到少量的凝固酶，实施例1的检测试剂灵敏度最高。

实施例4～6

实施例4～6公开了一种试剂盒：

1)按表1、表2和表3进行备料和配制吗啉乙磺酸缓冲液；A组用于实施例4，B组用于实施例5，C组用于实施例6；

2)制备浸泡液：将蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和甘氨酰-精氨酰四甲氧基-β-萘胺溶于吗啉乙磺酸缓冲液中，得到浸泡液；

3)浸泡液处理：将滤纸置于浸泡液中充分浸泡10～20s后取出，然后在温度为40℃，时间为30～40min的条件下进行干燥，得到反应垫；

4)放置反应垫：将反应垫置于反应孔中，然后将反应孔密封；

5)制备显色剂：将肉桂醛溶于盐酸溶液中，得到显色剂；所述显色剂配合反应垫，得到试剂盒。

对实施例4～6中得到的试剂盒进行检测：分别制备酶活性浓度不同的凝固酶标准品溶液，凝固酶标准品溶液以生理盐水作为溶剂，检测实施例4～6的灵敏度；在实施例4～6的试剂盒反应孔中分别滴加标准品溶液35uL，在温度为37±2℃的条件下水浴8～10min，然后滴入显色剂，观察试剂盒中的颜色变化，显色为浅红色、玫红色或红紫色表示阳性，无显色表示阴性；结果如表5所示：

表5实施例4～6的检测结果

+表示阳性，-表示阴性。

实施例4～6的试剂盒均可检测凝固酶，且当凝固酶活性较低时仍然能够检测到凝固酶；其中在酶活性浓度为3.75U/mL时，实施例4仍可检测得到少量的凝固酶，实施例4的反应垫灵敏度最高。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种凝固酶检测试剂，其特征在于：包括反应剂和显色剂；所述反应剂包括：吗啉乙磺酸缓冲液、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮和甘氨酰-精氨酰四甲氧基-β-萘胺。

2.如权利要求1所述的凝固酶检测试剂，其特征在于：所述反应剂的成分按重量份计包括：

3.如权利要求1所述的凝固酶检测试剂，其特征在于：所述显色剂按重量份计包括：

盐酸 3.5～14份；

肉桂醛 0.2～1份。

4.如权利要求1所述的凝固酶检测试剂，其特征在于：所述聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮-K90。

5.如权利要求1所述的凝固酶检测试剂，其特征在于：使用所述凝固酶检测试剂进行检测的样品的稀释液为生理盐水。

6.一种反应垫，其特征在于：包括载体和如权利要求1-5任一所述的反应剂的成分；所述反应剂的成分包被在载体上；所述反应垫用于检测凝固酶。

7.如权利要求6所述的反应垫，其特征在于：使用所述反应垫进行检测的样品的稀释液为生理盐水。

8.一种如权利要求6所述的反应垫的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

9.如权利要求8所述的反应垫的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述载体置于浸泡液中充分浸泡10～20s。

10.如权利要求8所述的反应垫的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述干燥的温度为20～70℃，时间为30～40min。

11.一种试剂盒，其特征在于：包括如权利要求6所述的反应垫，以及显色剂；所述试剂盒用于检测凝固酶。