CN102326082A - 凝固蛋白原原料及其制造方法、使用它测定来自生物的生理活性物质的方法和测定装置 - Google Patents
凝固蛋白原原料及其制造方法、使用它测定来自生物的生理活性物质的方法和测定装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102326082A CN102326082A CN2010800085809A CN201080008580A CN102326082A CN 102326082 A CN102326082 A CN 102326082A CN 2010800085809 A CN2010800085809 A CN 2010800085809A CN 201080008580 A CN201080008580 A CN 201080008580A CN 102326082 A CN102326082 A CN 102326082A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- coagulagen
- lal
- raw material
- physiological activator
- regulation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
- G01N21/82—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a precipitate or turbidity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本发明提供获得保持LAL试剂、或者被来自生物的生理活性物质污染的LAL试剂等中的凝固蛋白原的功能,同时使凝固酶活性不可逆地失活,并且可用于试剂的凝固蛋白原原料的技术。通过将LAL试剂在某些规定温度下加热处理规定时间,只使LAL试剂中的酶活性不可逆地失活。此时,凝固蛋白原本来的活性得以保持,即,通过激活的凝固酶水解形成凝固素,引发凝胶化、凝集反应。
Description
技术领域
本发明涉及用于迅速或高灵敏度地进行内毒素、β-D-葡聚糖等来自生物的生理活性物质的检测或浓度测定的试剂、其制造方法、以及使用该试剂的测定方法和测定装置。
背景技术
内毒素是存在于革兰氏阴性菌的细胞壁中的脂多糖,是最有代表性的致热原。如果被该内毒素污染的输液、注射药、血液等进入人体,则可能引起发热、休克等严重的副作用。因此,需要管理上述药物等以使其不被内毒素污染。
在鲎(カブトガニ)的血细胞提取物(以下也称为“LAL:鲎变形细胞溶解物”)中存在被内毒素激活的酶——丝氨酸蛋白酶。并且在LAL与内毒素反应时,根据内毒素量而激活的丝氨酸蛋白酶产生酶级联,由此,存在于LAL中的凝固蛋白原被水解成凝固素,凝固素缔合生成不溶性的凝胶。利用该LAL的特性,可以高灵敏度地检测内毒素。
另外,β-D-葡聚糖是构成真菌中特征性细胞膜的多糖。通过测定β-D-葡聚糖,不仅在如念珠菌(Candida)、スペルギルス(Spergillus)、隐球菌(Cryptococcus)的一般临床中常见的真菌中,而且在也包含稀有真菌的广范围内对于真菌感染病的筛选等是有效的。
在β-D-葡聚糖的测定中,也利用鲎的血细胞提取成分被β-D-葡聚糖凝固(凝胶凝固)的特性,可以高灵敏度地检测β-D-葡聚糖。
对这种内毒素、β-D-葡聚糖等可由鲎的血细胞提取成分检测的来自生物的生理活性物质(以下也称为规定生理活性物质)进行检测或浓度测定的方法是半定量凝胶化法,其中将要进行规定生理活性物质的检测或浓度测定(以下也简称为“规定生理活性物质的测定”)的样品与基于LAL制造的试剂(LAL试剂)混合所得的混合液静置,在一定时间后将容器倒转,通过样品有无垂落来判定是否凝胶化,从而检查样品中是否含有一定浓度以上的内毒素。还有比浊法、比色法等,在比浊法中,LAL试剂与规定生理活性物质的反应导致凝胶的生成,随时间测量伴随凝胶生成的样品浊度进行分析;在比色法中,使用由于酶级联而水解并显色的合成底物。
在通过上述比浊法进行规定生理活性物质的测定的情况下,在经干热灭菌处理的玻璃制测定池内生成测定样品与LAL试剂的混合液。然后,从外部对混合液的凝胶化进行光学测定。但是,在比浊法中,特别是在规定生理活性物质的浓度低的样品中,存在混合液发生凝胶化需要很长时间的情况。为此,需要可进行规定生理活性物质的短时间测定的方法。已提出了激光散射颗粒测量法等,该方法例如用磁性搅拌子来搅拌测定样品与LAL试剂的混合液,由此生成凝胶微粒,根据由凝胶颗粒散射的激光强度或者透过混合液的光强度,可在短时间内测定样品中规定生理活性物质的存在。
LAL试剂是以鲎的血细胞提取物为主要原料制造的。因此,在制造中,内毒素、β-D-葡聚糖可能以一定的概率混入,形成无法作为试剂利用的废弃物。另外,在内毒素或β-D-葡聚糖中任一种的测定方法中,测定试剂的原料都为有限资源的鲎的血细胞提取物,因此必须努力减少试剂的使用量、或者降低试剂制造上的损耗。
作为减少试剂使用量的尝试,当然可以单纯地减少样品容量,另外提高测定灵敏度因而降低测定次数也是有效的。另一方面,为了减少制造上的损耗,如何抑制内毒素、β-D-葡聚糖带来的污染是重要的。进一步地,还必须考虑如何从制造过程中变得无法作为试剂使用的原料中除去内毒素、β-D-葡聚糖,进行再利用,或者作为辅助性的试剂添加物利用等。在作为辅助性的试剂添加物利用的情况下,考虑作为起试剂粘性调节剂的作用、在凝胶化·凝集中起中心作用的凝固蛋白原原料的利用等。
但是,如果只是除去例如被内毒素污染而变得无法使用的原料中的内毒素,仍不可能除去已经被激活的酶组。只使原料中的酶活性失活而仍保持凝固蛋白原的功能,即,被激活的凝固酶水解形成凝固素、发生凝胶化·凝集反应的功能的原料的制造方法尚未见报道。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特许第2667695号公报;
专利文献2:日本特开2004-061314号公报;
专利文献3:日本特开平10-293129号公报。
发明内容
本发明针对上述问题而提出,其目的在于提供获得凝固蛋白原原料的技术,所述原料保持LAL试剂或者被来自生物的生理活性物质污染的LAL试剂等中的凝固蛋白原功能、同时使凝固酶活性不可逆地失活,并且可用于试剂。
为解决上述课题,本发明的最大特征在于:通过在某种温度条件下对允许混入一些规定生理活性物质的LAL试剂进行加热处理,只使LAL试剂中的酶活性不可逆地失活。在本发明中,此时凝固蛋白原原本的活性得以保持,该凝固蛋白原原本的活性是:被激活的凝固酶水解形成凝固素,引发凝胶化·凝集反应。
更具体地说,本发明是凝固蛋白原原料的制造方法,该凝固蛋白原原料在下述情况下使用:使含有规定的酶组和凝固蛋白原的鲎的血细胞提取物LAL与来自生物的规定的生理活性物质反应,通过上述生理活性物质激活上述酶组,发生酶级联,由此,凝固蛋白原被水解为凝固素,利用该性质检测上述生理活性物质或测定上述生理活性物质的浓度;本发明的凝固蛋白原原料的制造方法的特征在于:将LAL以规定温度加热处理规定时间,从而使该LAL中的上述酶组的至少一部分失活,同时保持凝固蛋白原的活性。
由此,可以使LAL中构成酶级联的酶组的至少一部分失活,由此来抑制酶级联的发生,可以获得即使被内毒素、β-D-葡聚糖等污染也难以被水解形成凝固素的凝固蛋白原原料。
另外,由此,可以使由于内毒素、β-D-葡聚糖等的污染而变得不可使用的LAL试剂的凝固蛋白原在保持其功能的情况下获得,因此可以更有效地活用由鲎的血细胞获得的有限的资源。
这里,规定的酶组例如是指LAL中的C因子、B因子、G因子、凝固酶前体等,它们通过内毒素、β-D-葡聚糖等发生酶级联,可生成最终水解凝固蛋白原的凝固酶的酶类。即,不使LAL中的全部的酶失活,而是使至少一部分酶失活,即使存在内毒素或β-D-葡聚糖等,也不会生成最终水解凝固蛋白原的凝固酶,则可实现本发明的目的。
另外,在上述描述中,来自生物的规定的生理活性物质是指具有下述特性的生理活性物质:激活LAL中的规定的酶组,发生酶级联,生成最终水解凝固蛋白原的凝固酶,例如如上所述,可举出内毒素、β-D-葡聚糖。不过,其意图也包含具有同等特性的其它生理活性物质,并不限于上述2种物质。
在上述描述中,在LAL以溶液的形式供给的情况下,可以使规定温度为60℃以上。这里,根据本发明人的深入研究,了解到将溶液形式的LAL试剂在60℃以上加热处理,则可以使丝氨酸蛋白酶等酶组的酶活性大致完全失活。因此,在LAL以溶液的形式供给的情况下,通过使规定温度为60℃以上,可以更确实地获得即使被内毒素、β-D-葡聚糖等污染,也不会被水解生成凝固素的凝固蛋白原原料。
另外,在上述描述中,在LAL以溶液形式供给的情况下,规定温度可以是80℃以下。这里,根据本发明人的深入研究,了解到在将LAL试剂加热处理至比80℃高的温度、使酶活性失活的情况下,由于LAL中蛋白质的变性而使试剂发生白浊。这样,可能不适合通过试剂的透射光、散射光,通过光学方法进行规定生理活性物质的检测或浓度测定的目的。因此,在本发明中,在LAL以溶液形式供给的情况下,通过使规定温度为80℃以下,可以获得也适合光学测定的、利用价值更高的凝固蛋白原原料。
并且,在上述描述中,在LAL以溶液的形式供给的情况下,规定时间可以是10分钟以上且8小时以下。这里,在将溶液形式的LAL试剂在60℃以上加热处理的情况下,可知加热时间10分钟左右可以使丝氨酸蛋白酶等酶组的酶活性大致完全失活。因此,通过使规定时间为10分钟以上,可以在广范围的加热温度下使丝氨酸蛋白酶等酶组的酶活性大致完全失活。另外,在加热时间过长的情况下,即使在低温下LAL中的蛋白质也会变性,产生白浊。因此,在本发明中,通过使规定时间为10分钟以上且8小时以下,可以更确实地获得即使被内毒素、β-D-葡聚糖等污染也不会被水解形成凝固素的适合光学测定的凝固蛋白原原料。
并且,在上述描述中,在LAL以冷冻干燥物的形式供给的情况下,规定温度可以是100℃以上且250℃以下。这里可知,在LAL以冷冻干燥物的形式供给的情况下,与以溶液的形式供给时比较,必须以更高的温度加热处理。在这种情况下,通过使LAL试剂为100℃以上且250℃以下,可以更确实地获得即使被内毒素、β-D-葡聚糖等污染也不会被水解形成凝固素的适合光学测定的、利用价值更高的凝固蛋白原原料。
另外,在这种情况下,可以使规定时间为300分钟以上。这里,在LAL以冷冻干燥物的形式供给的情况下可知,通过将LAL试剂在120℃下加热300分钟,可以使丝氨酸蛋白酶等酶组的酶活性大致完全失活。因此,通过使规定时间为300分钟以上,可以在更广范围的加热温度下更确实地获得即使被内毒素、β-D-葡聚糖等污染也不会被水解形成凝固素的凝固蛋白原原料。
另外,本发明也为凝固蛋白原原料,该凝固蛋白原原料在下述情况下使用:使含有规定的酶组和凝固蛋白原的鲎的血细胞提取物LAL与来自生物的规定的生理活性物质反应,通过上述生理活性物质激活上述酶组,发生酶级联,由此,凝固蛋白原被水解为凝固素,利用该性质检测上述生理活性物质或测定上述生理活性物质的浓度;
所述凝固蛋白原原料的特征在于:将LAL以规定温度加热处理规定时间,从而使该LAL中的上述酶组的至少一部分失活。
在该凝固蛋白原原料中,与规定生理活性物质反应而发生酶级联的酶组失活,因此可以抑制由于少量的规定生理活性物质污染而使凝固蛋白原水解、生成凝固素的情况,可以获得操作性更良好的凝固蛋白原原料。在这种情况下,在LAL以溶液的形式供给的情况下,规定温度可以是60℃以上。还可以是80℃以下。并且规定时间可以是10分钟以上且8小时以下。另一方面,在LAL以冷冻干燥物的形式供给的情况下,规定温度可以是100℃以上且250℃以下。另外,规定时间可以是300分钟以上。
另外,本发明中可以是用于上述生理活性物质的检测或上述生理活性物质浓度测定的LAL试剂,其特征在于:通过将上述得到的凝固蛋白原原料与未经加热处理的LAL混合,提高上述未经加热处理的LAL中的凝固蛋白原浓度。
即,通过将使规定的酶组失活的凝固素原料加入到未经加热处理的LAL中,可以制备凝固蛋白原浓度比通常更高的LAL试剂。由此,可以使凝固蛋白原的量相对增加,该凝固蛋白原被与规定生理活性物质反应而激活的酶组水解、形成凝固素。因此,可以使规定生理活性物质引起的LAL试剂的凝胶化更为显著,可以更高灵敏度地进行规定生理活性物质的测定。
另外,本发明可以是用于测定内毒素的、结合凝固蛋白原的微珠,其特征在于:将上述得到的凝固蛋白原原料中的凝固蛋白原结合或吸附于比该凝固蛋白原直径大的多个微粒的表面来制备。
这里可知,使内毒素等的规定生理活性物质与凝固蛋白原结合或吸附于例如树脂制微粒上的状态的LAL作用时,与使规定生理活性物质与LAL单体作用的情形比较,早期生成更大的凝集块。这是由于微粒上的凝固蛋白原被LAL中的酶级联水解,形成凝固素,它们使微粒之间产生缔合。还明确了,该凝集反应难以受样品的浊度、颜色的影响,并且该凝集反应与由LAL单体所引发的凝集反应相比非常强大。
在本发明中,利用该现象,制备了使LAL中的酶组失活而得到的凝固蛋白原原料结合或吸附于微粒上的试剂(以下也称为“结合凝固蛋白原的微珠”)。通过使含有内毒素的样品与将该结合凝固蛋白原的微珠与LAL混合得到的试剂作用,LAL中原本存在的凝固蛋白原成为凝固素,发生凝集,同时,结合或吸附于微粒上的凝固蛋白原成为凝固素,使微粒之间缔合,早期生成更大的凝集块。由此,可以大幅促进LAL试剂与样品的混合液中凝胶颗粒的生成。结果,可以更迅速且高灵敏度地进行规定生理活性物质的检测或浓度的测定。
LAL中所含的凝固蛋白原结合或吸附于微粒上时,首先,使可结合、吸附蛋白质的官能团存在于微粒的表面。然后,根据以往的方法,在该状态下使LAL作用,使凝固蛋白原与微粒表面化学键合,或者静电性、亲水性、疏水性地吸附。此时的LAL中的反应时间长,因此考虑在以往的方法中,微粒、所使用的试剂类、水等中微量混合存在的规定生理活性物质与蛋白质中的酶组反应,凝固蛋白原被水解为凝固素,在凝固蛋白原与微粒的结合·吸附反应中,就开始发生了微粒的凝集。并且在这种情况下,由于酶的激活,试剂中的凝固蛋白原可能被水解、消耗。
针对上述问题,以往,在将凝固蛋白原结合或吸附于微粒表面时,必须在使LAL试剂与微粒的悬浮液混合的同时,添加抑制LAL中的酶组与规定生理活性物质反应的抑制剂,将凝固蛋白原结合或吸附于微粒表面的操作复杂,在成本方面不利。与此相对,在本发明中,在凝固蛋白原原料的制备过程中使LAL中的酶组失活,因此可以省略添加抑制剂的步骤。由此,可以更简便或以更低廉的成本制备将凝固蛋白原结合或吸附于微粒上的试剂。
另外,本发明可以是来自生物的生理活性物质的测定方法,其特征在于:将上述凝固蛋白原原料与未加热处理的LAL混合,由此提高上述未经加热处理的LAL中的凝固蛋白原浓度,将上述所得的LAL试剂与含有上述规定的生理活性物质的样品混合;用上述规定的生理活性物质激活上述LAL试剂中的酶组,通过发生的酶级联将浓度得到提高的上述凝固蛋白原水解为凝固素,利用上述过程来检测上述规定生理活性物质或测定上述规定生理活性物质的浓度。
根据该来自生物的生理活性物质的测定方法,可以使用更高浓度的凝固蛋白原进行规定生理活性物质的测定。因此,可以使规定生理活性物质与LAL的反应导致的凝胶化更为显著,可以更高灵敏度地测定规定生理活性物质。
另外,本发明可以是来自生物的生理活性物质的测定方法,其特征在于:将上述结合凝固蛋白原的微珠与未经加热处理的LAL和含有上述规定生理活性物质的样品混合,由此,通过上述规定的生理活性物质,上述未经加热处理的LAL中的酶组被激活,发生酶级联,由此,结合或吸附于上述微粒表面的凝固蛋白原被水解为凝固素,上述微粒之间交联,利用该性质来检测上述规定的生理活性物质或测定上述规定的生理活性物质的浓度。
根据该规定的生理活性物质的测定方法,使含有内毒素的样品与如下制备的试剂作用:将使LAL中的酶组失活得到的凝固蛋白原原料结合或吸附于微粒上,将所得到的结合凝固蛋白原的微珠和未经加热处理的LAL混合而成的试剂。由此,原本在LAL中存在的凝固蛋白原成为凝固素,发生凝集,同时,结合或吸附于微粒上的凝固蛋白原成为凝固素,使微粒之间缔合,早期生成更大的凝集块。由此可以大幅促进LAL试剂与样品的混合液中凝胶颗粒的生成。结果,可以更迅速且高灵敏度地进行规定生理活性物质的检测或浓度的测定。
另外,本发明可以是来自生物的生理活性物质的搅拌比浊测定装置,其特征在于,该装置装备有以下设备:
混合液保持设备,其使上述结合凝固蛋白原的微珠、未经加热处理的LAL和含有上述规定的生理活性物质的样品的混合液保持可以入射光,并使上述混合液中的反应进行;
搅拌设备,其搅拌上述混合液保持设备中的上述混合液;
光入射设备,其向上述混合液保持设备中的混合液入射光;
受光设备,其接收上述入射光在上述混合液中的透射光,并将其转换为电信号;
导出设备,其通过从在上述受光设备中变换的电信号获得的上述混合液的透射率而导出上述样品中上述生理活性物质的浓度。
本发明中,将使LAL中的酶组失活得到的凝固蛋白原原料结合或吸附于微粒上所得到的结合凝固蛋白原的微珠、未经加热处理的LAL和含有规定生理活性物质的样品混合,加入混合液保持设备中。然后,通过搅拌设备搅拌该混合液,由此促进被规定生理活性物质激活的凝固酶导致的凝固蛋白原的水解、以及由水解得到的凝固素所导致的微粒的缔合。
然后,测定由光入射设备入射的光中透过上述混合液到达受光元件的光强度。在导出设备中,进一步由上述混合液的透射率导出规定生理活性物质的浓度。
这里,结合或吸附于微粒上的凝固蛋白原的水解进展、生成凝固素时,凝固素使微粒之间缔合,早期生成更大的凝集块。这里,结合凝固蛋白原的微珠、未经加热处理的LAL和含有规定生理活性物质的样品的混合液在混合时,大量微珠的微粒分散,因此产生强烈的混浊。然后,由于生成凝固素而使微粒的缔合进展时,微粒的浓度急剧减少,因此混合液的透射率急剧升高。
本发明中的搅拌比浊测定装置与有关通常的比浊法的测定装置不同,其测定伴随着凝固素生成的微粒的缔合导致的透射率急剧升高,因此,与搅拌混合液带来的反应促进效果相联合,可以大幅缩短测定时间,同时可以非常高灵敏度地进行规定生理活性物质的测定。
对于解决上述本发明的课题的设备,其可以尽可能地组合使用。
在本发明中,可以获得保持LAL试剂、或者被来自生物的生理活性物质污染的LAL试剂等中的凝固蛋白原的功能,同时使凝固酶活性不可逆地失活,并且可用于试剂的凝固蛋白原原料。
附图说明
图1是表示本发明的实施例中的LAL试剂水溶液的加热温度与残留凝固酶比活性的关系的图。
图2是表示本发明的实施例中的LAL试剂冷冻干燥物的加热时间与残留凝固酶比活性的关系的图。
图3是表示本发明的实施例中比浊测量装置的概略构成的图。
图4是用于说明活性凝固酶导致凝固蛋白原的凝胶化·凝集过程和结合凝固蛋白原的微珠的凝集过程的图。
图5是对结合凝固蛋白原的微珠法和比浊法中的内毒素用量反应进行比较的图。
图6是用于对通过内毒素或β-D-葡聚糖使LAL凝胶化的过程及其检测方法进行说明的概略图。
具体实施方式
已对LAL与内毒素反应生成凝胶的过程进行了详细研究。即,如图6所示,内毒素与LAL中的丝氨酸蛋白酶C因子结合时,C因子被激活,形成活性C因子,活性C因子水解LAL中的其它丝氨酸蛋白酶B因子,使其激活,形成活性B因子。该活性B因子立即水解LAL中的凝固酶前体,形成凝固酶,并且,该凝固酶水解LAL中的凝固蛋白原,生成凝固素。然后,生成的凝固素互相缔合,进一步生成不溶性的凝胶,认为全部LAL牵涉在其中,形成凝胶化。
另外同样地,β-D-葡聚糖与LAL中的G因子结合时,G因子被激活,形成活性G因子,活性G因子水解LAL中的凝固酶前体,形成凝固酶。结果,与内毒素同LAL的反应同样,生成凝固素,生成的凝固素互相缔合,进一步生成不溶性的凝胶。
该一系列反应与在哺乳动物中见到的克里斯马斯(Christmas)因子、凝血酶等丝氨酸蛋白酶介导的纤维蛋白凝胶生成过程类似。这种酶级联反应是:即使是极少量的激活因子也会引起之后的级联连锁活化,因此具有非常强的扩增作用。因此,根据使用LAL的规定生理活性物质的测定法,可以检测出亚皮克/mL级的极微量的规定生理活性物质。
可以定量规定生理活性物质的测定方法如上所述,可举出比浊法、以及激光散射颗粒测量法。关于这些测定方法,前者是以样品的浊度、后者是以系统内生成的凝胶微粒来检测由该LAL的酶级联反应生成的凝固素的缔合物,可进行高灵敏度的测定。
特别是在激光散射颗粒测量法中,由于直接测定在系统内生成的凝胶的微粒,因此比比浊法灵敏度更高,并且由于通常是强制性搅拌含有LAL和分析物的样品,因此与比浊法比较可在短时间内检测出凝胶的生成。
另外,内毒素的其它测定方法有比色法。如图6所示,其为下述方法:虽然利用LAL的酶级联反应,但并不测定凝固素凝胶导致的样品的浊度,而是利用因凝固酶而受到水解而显色的合成底物,使含有合成底物的LAL与分析物反应,测定其吸光度变化。在该比色法中,测定在系统内生成的显色物质的浓度,因此与测定样品中的凝胶生成的比浊法、激光散射颗粒测量法比较,可以在短时间内测定低浓度的规定生理活性物质。
在制造用于按照上述各测定方法测定内毒素、β-D-葡聚糖的LAL试剂的过程中,如果混入了内毒素或β-D-葡聚糖,则根据混入的物质的量,在试剂制造中存在原料发生了凝胶化而无法作为试剂使用的情况。此时的混入量即使是微量,也如上所述,由于LAL试剂具有酶的级联产生的扩增作用,因此,在试剂的制备需要较长时间的情况下,可能全体试剂发生凝胶化。
关于内毒素,已知存在多粘菌素B、聚赖氨酸等的吸附物质,通过将所述吸附物质应用于LAL试剂可以除去混入的内毒素。但是,已经激活的C因子、B因子、以及凝固酶在酶级联的最下游的水解凝固蛋白原的方向上持续作用,因此,只除去内毒素无法防止LAL试剂的凝胶化。这对于β-D-葡聚糖也是同样的。
以下示出即使极微量混入内毒素或β-D-葡聚糖,也可以抑制在制造中发生凝胶化的LAL试剂、或者以LAL试剂为材料的凝固蛋白原原料的制造方法的例子。但是,本发明的LAL试剂和凝固蛋白原原料的制造方法并不限于以下的例子。
有关本发明的凝固蛋白原原料的材料可以使用鲎的血细胞提取物、使用该提取物制造的LAL试剂、以及在它们之中有极微量的内毒素或β-D-葡聚糖混入因此无法作为试剂使用的废弃物等。但是,本发明的目的在于制造具有功能的凝固蛋白原原料,因此,已经有大多数凝固蛋白原成为凝固素、已经凝胶化的物质除外。对于这些材料,可根据需要添加吸附内毒素的物质、吸附β-D-葡聚糖的物质、使内毒素的作用失活的物质、使β-D-葡聚糖的作用失活的物质的至少一种以上。
吸附内毒素的物质可例举:多粘菌素B、聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚乙烯亚胺等,或者C因子本身或含有C因子结合内毒素的部位的蛋白质、多肽、结合内毒素的抗体等。使内毒素失活的物质可例举:含有铁离子、铝离子、铬离子、镍离子、钴离子、锰离子的水溶液,以及供给它们的金属片等。
同样,与β-D-葡聚糖结合的物质可例举:凝集素、或G因子本身或含有G因子结合β-D-葡聚糖的部位的蛋白质、多肽、结合β-D-葡聚糖的抗体等。另外,为了使β-D-葡聚糖失活,考虑通过降低材料的氢离子浓度而使β-D-葡聚糖的溶解性降低并析出。
接着,对于如此地根据需要混合了最适当的添加物的材料进行加热处理。通过以适当的加热温度、加热时间进行该加热处理,使材料中规定的酶组C因子、活性C因子、B因子、活性B因子、G因子、活性G因子、凝固酶前体、凝固酶的至少一部分不可逆地失活。并且,不会通过与内毒素、β-D-葡聚糖的反应而生成凝固酶。这样,即使被内毒素、β-D-葡聚糖污染,也可以获得不被水解形成凝固素而发生凝胶化的凝固蛋白原原料。
这种情况的加热处理可根据材料的状态适当调节加热温度和加热时间。例如在材料为溶液的情况下,反应的温度优选40℃以上且140℃以下,进一步优选60℃以上且100℃以下。优选的加热时间根据加热温度而有很大不同,优选30秒以上且72小时以下,进一步优选10分钟以上且8小时以下。
过于提高加热温度或过于延长加热时间时,LAL试剂或者LAL中的蛋白质变性,发生白浊,可能难以在测定样品的浊度的方法中使用,并且凝固蛋白原可能变性,丧失功能,因此需要注意这些问题。
另一方面,在材料为已经形成冷冻干燥物的LAL试剂的情况下,与材料为溶液的情况不同,更高的加热温度和更长的加热时间是必须的。加热温度优选80℃以上且300℃以下,进一步优选100℃以上且250℃以下。优选的加热时间与水溶液的情况同样地根据加热温度而不同,优选30秒以上且72小时以下,进一步优选10分钟以上且8小时以下。
对于这样的加热处理的材料,可根据需要,用各种金属盐或铵盐、酸、碱、进一步地缓冲液等调节pH,还可以根据需要添加表面活性剂、糖类等。
这样制造的凝固蛋白原原料即使与内毒素、β-D-葡聚糖直接作用,也不会引发凝胶化或凝集反应。但是,与激活的凝固酶作用或者与未经加热处理的LAL试剂混合后与内毒素、β-D-葡聚糖作用时,其可以迅速地水解为凝固素,引发凝胶化或凝集反应。
另外,通过本发明制造的凝固蛋白原原料可在内毒素、β-D-葡聚糖的测定灵敏度提高、测定时间缩短、测定方便性提高等方面起作用。即,通过将本发明的凝固蛋白原原料与未经加热处理的LAL试剂混合,可以制备凝固蛋白原的浓度比通常高的LAL试剂。通过使内毒素、β-D-葡聚糖与该LAL试剂作用,可以更迅速地进行高灵敏度的测定。
另外,例如通过制备在将根据本发明的凝固蛋白原原料结合或吸附于聚苯乙烯胶乳的微小颗粒表面的状态下的LAL试剂,可实现比以往的利用比浊法的内毒素测定更大幅度地缩短时间的测定方法。
即,使被内毒素、β-D-葡聚糖激活的凝固酶与将凝固蛋白原原料结合或吸附于聚苯乙烯胶乳的微粒(以下也称为珠)的表面所得的LAL试剂作用时,凝固蛋白原由于酶级联而水解,成为凝固素,它们使微粒之间缔合。因此,通过将由本发明获得的凝固蛋白原原料中的凝固蛋白原结合或吸附于微粒,可以更高效率地使微粒之间缔合,可以更早期地生成凝集块。
在将本发明的凝固蛋白原原料中的凝固蛋白原与珠结合时考虑以下方法:通过珠所带有的电荷进行吸附的方法;利用珠的离子性质的方法;在珠表面形成可与凝固蛋白原原料中的蛋白质反应的官能团,利用该官能基团和蛋白质中的氨基或羧基进行化学结合的方法等,并且可以采用任何方法。
以往,在改变LAL的材料、这样进行结合或吸附于珠上的操作时,制造所需的时间需要数小时以上的较长时间,因此,微量混入其它材料中的内毒素、β-D-葡聚糖产生影响,或者这些生理活性物质在操作中微量混入,导致原料凝胶化,在这种情况下存在无法获得目标物质的情况。
为此,以往考虑了对原料添加各种酶抑制剂的对策。该酶抑制剂可例举氟磷酸二异丙酯、苄脒、苯基甲磺酰氟、4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟、6-脒基-2-萘基-4-胍基苯甲酸酯二甲磺酸盐、对脒基苯基甲磺酰氟、抑酶肽、抗蛋白酶、亮抑蛋白酶肽、大肠杆菌素、PPACK (苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-氯甲酮)、α2-巨球蛋白、胰蛋白酶抑制剂等。
但是,在使用本发明的凝固蛋白原原料的情况下,只有LAL中的酶功能不可逆地失活,同时保持凝固蛋白原活性。因此,无需添加上述酶抑制剂,即可防止在结合或吸附于珠的操作中混入材料中的内毒素、β-D-葡聚糖导致的原料的凝胶化。
以下对于本发明的凝固蛋白原原料的制造方法进行详细说明。制造例给出制造方法的一个例子,有关本发明的制造方法并不限于以下制造例的条件。
[制造例1]
在LAL试剂的冷冻干燥物(リムルスES-IIシングルテストワコー,和光纯药制造,以下简称为ES-II)中加入规定量(0.15 mL)的注射用蒸馏水(大塚制药制造),用旋涡混合器混合。然后设置于预先加热至规定温度(后述)的铝块加热器(HDB-1N,アズワン制造,以下如无特别说明,使用这种机器作为铝块加热器)中,进行规定时间(后述)的加热。加热后立即在冰中冷却,得到凝固蛋白原原料的水溶液。
[制造例2]
将LAL试剂(ES-II)的冷冻干燥物直接设置于预先加热至120度的铝块加热器中,进行规定时间(后述)的加热。加热后立即在冰中冷却,得到凝固蛋白原原料的冷冻干燥物。
[制造例3]
使用可进行内毒素定量的激光散射颗粒测量法,对于制造例1以及制造例2中所得的凝固蛋白原原料的酶活性不可逆失活和凝固蛋白原功能的保持进行评价。在激光散射颗粒测量法中,使用内部存在用于搅拌样品的不锈钢制搅拌子(φ1 mm,长度5 mm)的φ7 mm、长度50 mm的专用玻璃容器。为了使该容器中不含内毒素,用铝箔覆盖容器的开口部,进一步将各20个用铝箔分包的容器装入铁制干燥热处理罐中,在250℃下加热处理3小时,使内毒素热分解。这样,通过干热处理制造不含内毒素的测定容器并用于试验。
[制造例4]
为了研究根据本发明的凝固蛋白原原料的凝固蛋白原功能、即,研究凝固蛋白原是否被激活的凝固酶水解并凝胶化,或者是否显示凝集反应,如下得到凝固酶的激活物。即,使200 μL 1.0 EU/mL浓度的内毒素水溶液与未经加热处理的LAL试剂(ES-II)作用,将LAL试剂和内毒素水溶液的混合物转移至根据制造例3制造的测定容器中,在37℃下一边保温一边用在容器底面方向配置了容器内部的不锈钢搅拌子的搅拌器使其旋转,进行反应。
在激光散射颗粒测量法中,已知通过内毒素凝胶化的LAL试剂由于搅拌而作为微小的凝集块出现,该凝集块的出现时间与样品中内毒素的浓度在双对数图上形成直线。在该条件下,在约6分钟检测出凝集,检测出凝集后继续搅拌,自测定开始20分钟的时间点,从装置中取出容器,将容器内部的凝胶凝集物全部回收,转移至无内毒素的一次性离心管中,以15000
rpm (转子半径7 cm)离心2分钟,使凝固素聚合物为主成分的凝胶成分沉淀。通过其它方法确认了离心上清中不含有凝固蛋白原。通过该制造方法,可制备通过内毒素激活的凝固酶。
[制造例5]
向LAL试剂(ES-II)中加入0.2 mL规定浓度(后述)的内毒素水溶液,用旋涡混合器混合,然后设置于预先加热至100℃的铝块加热器上,进行20分钟的加热。加热后立即在冰中冷却,得到混入了内毒素的凝固蛋白原原料的水溶液。
[制造例6]
将0.5mL表面被羧基化的聚苯乙烯胶乳微粒(Polybeads羧基化微球,0.45 μm,固形成分2.63%,Polysciences Inc.制造,以下简称为羧基珠)的悬浮液用无内毒素的带旋盖的离心管(容量0.2 mL)、以15000 rpm离心5分钟,除去上清,接着加入注射用蒸馏水,制成2.0 mL,使其悬浮后再次离心,除去上清。再次通过该离心操作除去上清,然后再悬浮于1 mL注射用蒸馏水中,其后再转移至无内毒素的带旋盖离心管(容量15 mL)。进一步加入4 mL的注射用蒸馏水,然后实施高压灭菌(121℃,20分钟),使混入珠中的内毒素失活以及除去。
将高压灭菌后的羧基珠转移至2 mL容量的带旋盖离心管中,按照上述方法将组合了离心和除去上清、进一步在注射用蒸馏水中再悬浮的洗涤操作共进行2次。接着用注射用蒸馏水溶解,在10 mL制备为20 mg/mL浓度的水溶性碳二亚胺(WSC,同仁化学制造)水溶液中混合2 mL 0.1 M乙酸缓冲液(pH 4.98),将其通过孔径φ0.2 μm的灭菌用滤器(ミリポア制造),使上述羧基珠的沉淀物再悬浮于其中的0.5 mL中。
另外,向LAL试剂(ES-II)的冷冻干燥物中加入0.5 mL注射用蒸馏水(大塚制药制造)进行溶解,在60℃下进行10分钟的加热。将0.5 mL由该加热处理得到的本发明的凝固蛋白原原料和0.5 mL按照上述方法制备的羧基珠悬浮液、以及10 μL制备为1.0%的非离子表面活性剂TritonX-100水溶液(用注射用蒸馏水制备后,用孔径φ0.2 μm的灭菌用滤器过滤)混合,在室温下反应2小时。
通过该反应,羧基珠的羧基被碳二亚胺激活,然后与凝固蛋白原的氨基发生酰胺键合,在珠表面化学键合凝固蛋白原。反应后,如上所述离心、除去上清、用注射用蒸馏水再悬浮2次来洗涤反应物。接着加入100 μL 0.25 M的氨基乙醇水溶液(用注射用蒸馏水制备后,用孔径φ0.2 μm的灭菌用滤器过滤),在室温下搅拌20分钟,使羧基珠上的被激活的羧基中未反应的部分失活。然后,同样用注射用蒸馏水共洗涤3次,再悬浮于5 mL的注射用蒸馏水中,将上述1.0%的TritonX-100水溶液与2%的叠氮化钠水溶液(用注射用蒸馏水制备,然后用孔径φ0.2 μm的灭菌用滤器过滤)各加入50 μL,得到结合凝固蛋白原的微珠。
以下对本发明的实施例进行说明。
[实施例1]
在制造例1中,将铝块加热器的指示温度设为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、100℃以及120℃的任一条件,使加热时间为10分钟,由所制造的凝固蛋白原原料中取出100 μL,加入到制造例3中制造的测定容器中。向其中加入100 μL 2.0 EU/mL浓度的内毒素水溶液使其作用,用激光散射颗粒测量装置(PA-200,兴和制造,以下简称为PA-200)进行测定。由未经加热处理时的测定浓度(C=1.0
EU/mL)和加热的LAL试剂中的测定浓度(S),按照下式定义和导出加热后残留的酶活性、即残留凝固酶比活性(A)。
A=S/C×100(%)
(1)
图1表示所得残留凝固酶比活性(A)与LAL试剂水溶液的加热温度的关系。如图1所示可知,在加热时间为10分钟的情况下,加热温度达到60℃以上,则酶活性完全消失。另外,虽然未图示,但可观察到加热温度越高则制造后凝固蛋白原原料的水溶液发生白浊现象。例如,在120℃下加热制造凝固蛋白原原料水溶液的情况下,有很大一部分由于热变性而变为可见的白浊和不溶物,判定其不适合实际应用。
[实施例2]
在制造例1中,将铝块加热器的指示温度设为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、100℃和120℃中的任一条件,使加热时间为10分钟,在所制造的凝固蛋白原原料(150 μL)中加入50 μL制造例4中得到的激活的凝固酶水溶液并使其作用,用旋涡混合器混合5秒钟。将该样品转移至制造例3中制造的测定容器中,用激光散射颗粒测量装置(PA-200)进行凝集开始时间的测定。
表1中示出了各加热温度下的凝集开始时间,其示出在任一加热温度下在从添加激活的凝固酶水溶液起3分钟左右开始聚集,凝固蛋白原的功能几乎未受加热的影响。另外,在120℃的高温下处理时,LAL试剂中的大部分蛋白质发生热变性而凝固,但残留在其中的凝固蛋白原本身保持功能,自添加激活的凝固酶水溶液起4分钟左右开始凝集。由此显示凝固蛋白原对于加热的耐性非常强。另外,由表1可知,在80℃以下对LAL试剂进行加热处理使酶活性失活时,LAL试剂中几乎未见到白浊。因此可知,通过在80℃以下对LAL试剂进行加热处理使酶活性失活,可以获得适合光学测定的、利用价值更高的凝固蛋白原原料。
[表1]。
加热温度(℃) | 凝集开始时间(分钟) | 水溶液的状态 |
未经热处理 | 2.33 | 透明 |
60 | 3.00 | 透明 |
80 | 2.33 | 稍白浊 |
100 | 2.17 | 白浊 |
120 | 4.00 | 凝固物多 |
[实施例3]
在制造例2中,使加热时间为10分钟、30分钟、60分钟、120分钟以及300分钟中的任一时间,在将LAL试剂(リムルスES-IIシングルテストワコー,和光纯药制造)未开封而直接进行加热处理的凝固蛋白原原料的冷冻干燥物中添加1.0 EU/mL内毒素水溶液(200 μL)。然后用漩涡混合器混合5秒,然后转移至通过制造例3制造的测定容器中,通过激光散射颗粒测量装置(PA-200)研究加热处理后残留的酶活性。然后计算上式(1)中定义的残留凝固酶比活性(%)。
图2中示出本实施例得到的残留凝固酶比活性与LAL试剂冷冻干燥物的加热处理时间的关系。如图2所示可知,与实施例1的情形相比,即使在高温下进行长时间加热处理,酶活性也不会完全消失。但是,通过在120℃下加热处理300分钟,残留凝固酶比活性减少至0.2%左右。在如此制造的凝固蛋白原原料中,将原料溶解于水时的水溶液颜色倾向于稍稍变黄,但是没有白浊、凝固不溶物质的发生,原料迅速溶解于水中。
[实施例4]
在实施例4中,研究在预先混入了内毒素的状态下对LAL试剂进行加热处理时,混入的内毒素浓度与加热处理导致的酶失活的程度的关系。在制造例5中,使预先混入的内毒素水溶液的内毒素浓度为10、1、0.1 EU/mL,得到混入了各浓度的内毒素的凝固蛋白原原料。
接着,在本实施例中,为了与上述的混入了内毒素的凝固蛋白原原料进行比较,如下制造对照凝固蛋白原原料:将用0.2 mL不含有内毒素的注射用蒸馏水(大塚制药制造)溶解所得的LAL试剂按照制造例5所示的顺序加热制备。进一步制作内毒素水溶液的稀释系列,将其各200 μL加入到未经加热处理的LAL试剂(ES-II)中,用旋涡混合器搅拌5秒,然后由各样品中取出100 μL,与100 μL上述的对照凝固蛋白原原料混合,通过激光散射颗粒测量装置(PA-200)得到内毒素浓度的校准曲线。
接着,将未经加热处理的LAL试剂(ES-II)用200 μL注射用蒸馏水(大塚制药制造)溶解,将其中的100 μL与100 μL上述预先混入了内毒素的各凝固蛋白原原料用旋涡混合器混合5秒钟。然后通过激光散射颗粒测量装置(PA-200),对照上述得到的校准曲线计算内毒素浓度。所得结果在表2中示出。如表2所示,在任一样品中,测定的内毒素浓度都比实际混入的内毒素浓度低。然后,如表中的加热后的活性残留率所示,混入的内毒素浓度越低,则从所得内毒素浓度的实际值降低的程度越大。如此地,显示出预先混入的内毒素浓度越低,则加热处理带来的酶失活的效果越大。
[表2]。
混入浓度(EU/mL) | 加热后的测定浓度(EU/mL) | 加热后的活性残留率(%) |
10.00 | 3.11 | 31.1 |
1.00 | 0.18 | 17.6 |
0.100 | 0.004 | 4.4 |
[实施例5]
使用由制造例6制造的结合凝固蛋白原的微珠,采用搅拌比浊法测定内毒素水溶液的稀释系列中的内毒素浓度(以下,将该测定法作为结合凝固蛋白原的微珠法)。搅拌比浊法与以往的比浊法不同,其搅拌样品,同时由样品的透射率的变化程度测定内毒素的浓度。
图3示出作为本实施例的搅拌比浊测定装置的比浊测量装置1的概略构成。在本实施例的搅拌比浊法中,将样品转移至作为混合液保持设备的专用的玻璃制容器2中。设置保温器5以便包围玻璃制容器2。该保温器5的内部装备未图示的电热线,通过对该电热线通电,可将玻璃制容器2保温至约37℃。该玻璃制容器2中装备不锈钢制的搅拌子3。该搅拌子3通过设置于玻璃制容器2的下部的搅拌器4的作用,在玻璃制容器2中旋转。即,搅拌器4含有马达4a和设于马达4a的输出轴上的永久磁铁4b。然后,通过对马达4a通电使永久磁铁4b旋转。来自该永久磁铁4b的磁场旋转,因此不锈钢制的搅拌子3由于旋转磁场的作用而旋转。该搅拌子3与搅拌器4相当于搅拌设备。
比浊测量装置1中设置作为光入射设备的光源6和作为受光设备的受光元件9。由光源6射出的光通过光圈7后,通过设置于保温器5的入射孔5a,入射到玻璃制容器2中的样品上。透过玻璃制容器2中的样品的光由设置于保温器5的射出孔5b射出,通过光圈8照射到受光元件9。在受光元件9中,根据受光的光强度,输出光电信号。根据该光电信号的输出,在作为导出设备的计算装置10中计算样品的透射率。
将2个未经热处理的LAL试剂(ES-II)溶解于200 μL注射用蒸馏水中,在其中加入50 μL在制造例6中制造的结合凝固蛋白原的微珠,用旋涡混合器搅拌5秒钟,得到结合凝固蛋白原的微珠-LAL试剂混合物。将内毒素水溶液的稀释系列,即2、0.2、0.02、0.002 EU/mL的任一50 μL与50 μL上述结合凝固蛋白原的微珠-LAL试剂混合物加入到按照上述制造例3制造的玻璃制容器2中,用比浊测量装置1进行测定。
在结合凝固蛋白原的微珠法中,在通过作用的内毒素激活LAL试剂中的凝固酶时,同样地,LAL试剂中所含的凝固蛋白原成为凝固素,同时,结合凝固蛋白原的微珠上的凝固蛋白原也被水解,成为凝固素,珠由于这些凝固素而发生交联,形成大的凝集块。在样品中,起初是含有大量的单体珠且高度混浊,但由于凝集,单体的珠浓度急剧减少,因此样品的光透射率升高。在结合凝固蛋白原的微珠法中,根据该光的透射率急剧升高来确定凝集块产生的开始时间。
图4示出以往的活性凝固酶导致的凝固蛋白原的凝胶化・凝集过程、以及结合凝固蛋白原的微珠法中凝固蛋白原的凝胶化・凝集过程。图4(A)示出的是以往的活性凝固酶导致的凝固蛋白原的凝胶化・凝集过程。如图所示,粒径为数nm左右的凝固蛋白原100被活性凝固酶水解,形成凝固素101。这些凝固素101凝集,形成多聚体,并在搅拌比浊法中形成凝胶颗粒。然后,随着时间的推移,凝固素101的凝集进一步发展,凝胶颗粒的粒径逐渐变大。然后,在经过了较长的时滞(lag time)的时间点,形成可测定的数μm-数十μm粒径的凝胶颗粒102。
与此相对,在结合凝固蛋白原的微珠法中,如图4(B)所示,活性凝固酶与结合在珠103上的凝固蛋白原100作用时,珠103上的凝固蛋白原100通过酶级联被水解,形成凝固素101,在凝固素101凝集的过程中,凝固素101使珠103之间缔合。由此,以凝固素101和珠103为主成分的粒子直径迅速增大,在短时间的时滞下得到可测定的粒径。也明确,该凝集反应与由LAL单体引发的凝集反应相比非常强大。
另外,在本实施例中,为了与使用结合凝固蛋白原的微珠法的情形进行比较,也通过比浊法进行内毒素浓度测定。在比浊法中,在未经热处理的LAL试剂中加入100 μL注射用水、100 μL内毒素水溶液稀释系列中的任何浓度的样品,用比浊法装置(トキシノメータET-2000、和光纯药制造)进行测定。结合凝固蛋白原的微珠法与比浊法的比较结果在图5中示出,在这两种测定法中均是横轴为内毒素浓度、纵轴为检测时间时,两轴对数图近似直线。近似曲线是:结合凝固蛋白原的微珠法为Y=
-0.190X+0.738,比浊法为Y=
-0.349X+0.869,由此显示,结合凝固蛋白原的微珠法与比浊法相比,可大幅缩短测定时间,作用的内毒素浓度越低,则测定所需的时间差越增大。测定所需的实际时间等总结于表3中。
[表3]
在本实施例中,对珠103的材料没有特别限定,除聚苯乙烯胶乳树脂之外,还可例举二氧化硅、有机硅树脂、纤维素树脂、聚乙烯醇树脂、羟基磷灰石等,聚苯乙烯胶乳树脂、二氧化硅、纤维素树脂是期望的。
另外,根据通过凝集可早期地光学检测的条件、和制备时的操作容易程度、在系统内分散的容易性等,使用0.05 μm至50 μm范围大小的珠103。为了使珠103的表面结合凝固蛋白原,考虑静电性、亲水性、或疏水性地吸附凝固蛋白原的方法,以及化学键合的方法。
符号说明
1・・・比浊测量装置
2・・・玻璃制容器
3・・・搅拌子
4・・・搅拌器
4a・・・马达
4b・・・磁铁
5・・・保温器
5a・・・入射孔
5b・・・射出孔
6・・・光源
7・・・光圈
8・・・光圈
9・・・受光元件
10・・・计算装置
100・・・凝固蛋白原
101・・・凝固素
102・・・凝集颗粒
103・・・珠
Claims (17)
1.凝固蛋白原原料的制造方法,所述凝固蛋白原原料在下述情况下使用:使含有规定的酶组和凝固蛋白原的鲎的血细胞提取物LAL与来自生物的规定的生理活性物质反应,通过所述生理活性物质激活所述酶组,发生酶级联,通过所述酶级联将凝固蛋白原水解为凝固素,利用这一过程检测所述生理活性物质或测定所述生理活性物质的浓度;所述凝固蛋白原原料的制造方法的特征在于:将LAL以规定温度加热处理规定时间,从而使所述LAL中的所述酶组的至少一部分失活,同时保持凝固蛋白原的活性。
2.权利要求1的凝固蛋白原原料的制造方法,其特征在于:所述LAL是以溶液的形式供给的,所述规定温度为60℃以上。
3.权利要求1或2的凝固蛋白原原料的制造方法,其特征在于:所述LAL是以溶液的形式供给的,所述规定温度为80℃以下。
4.权利要求1-3中任一项的凝固蛋白原原料的制造方法,其特征在于:所述LAL是以溶液的形式供给的,所述规定时间为10分钟以上且8小时以下。
5.权利要求1的凝固蛋白原原料的制造方法,其特征在于:所述LAL是以冷冻干燥物的形式供给的,所述规定温度为100℃以上且250℃以下。
6.权利要求1或5的凝固蛋白原原料的制造方法,其特征在于:所述LAL是以冷冻干燥物的形式供给的,所述规定时间为300分钟以上。
7.凝固蛋白原原料,所述凝固蛋白原原料在下述情况下使用:使含有规定的酶组和凝固蛋白原的鲎的血细胞提取物LAL与来自生物的规定的生理活性物质反应,通过所述生理活性物质激活所述酶组,发生酶级联,通过所述酶级联将凝固蛋白原水解为凝固素,利用这一过程检测所述生理活性物质或测定所述生理活性物质的浓度;所述凝固蛋白原原料的特征在于:将LAL以规定温度加热处理规定时间,从而使所述LAL中的所述酶组的至少一部分失活。
8.权利要求7的凝固蛋白原原料,其特征在于:所述LAL是以溶液的形式供给的,所述规定温度为60℃以上。
9.权利要求7或8的凝固蛋白原原料,其特征在于:所述LAL是以溶液的形式供给的,所述规定温度为80℃以下。
10.权利要求7-9中任一项的凝固蛋白原原料,其特征在于:所述LAL是以溶液的形式供给的,所述规定时间为10分钟以上且8小时以下。
11.权利要求7的凝固蛋白原原料,其特征在于:所述LAL是以冷冻干燥物的形式供给的,所述规定温度为100℃以上且250℃以下。
12.权利要求7或11的凝固蛋白原原料,其特征在于:所述LAL是以冷冻干燥物的形式供给的,所述规定时间为300分钟以上。
13.LAL试剂,所述试剂用于生理活性物质的检测或者生理活性物质的浓度测定,其特征在于:通过将权利要求7-12中任一项的凝固蛋白原原料与未经加热处理的LAL混合,使所述未经加热处理的LAL中的凝固蛋白原浓度提高。
14.用于测定内毒素的结合凝固蛋白原的微珠,其特征在于:使权利要求7-12中任一项的凝固蛋白原原料中的凝固蛋白原与比所述凝固蛋白原直径大的多个微粒表面结合或吸附来制备。
15.来自生物的生理活性物质的测定方法,其特征在于:将权利要求13的LAL试剂和含有所述规定生理活性物质的样品混合,由此通过所述规定的生理活性物质将所述LAL试剂中的酶组激活,发生酶级联,通过所述酶级联将浓度得到提高的所述凝固蛋白原水解为凝固素,利用这一过程检测所述规定的生理活性物质或者测定所述规定的生理活性物质的浓度。
16.来自生物的生理活性物质的测定方法,其特征在于:将权利要求14的结合凝固蛋白原的微珠、未经加热处理的LAL和含有规定生理活性物质的样品混合,由此,通过所述规定的生理活性物质将所述未经加热处理的LAL中的酶组激活,发生酶级联,通过所述酶级联将结合或吸附于所述微粒表面的凝固蛋白原水解为凝固素,所述微粒之间交联,利用这一过程检测所述规定的生理活性物质或测定所述规定的生理活性物质的浓度。
17.搅拌比浊测定装置,其特征在于,所述装置装备有以下设备:
混合液保持设备,其使权利要求14的结合凝固蛋白原的微珠、未经加热处理的LAL和含有规定的生理活性物质的样品的混合液保持可以入射光,并使所述混合液中的反应进行;
搅拌设备,其搅拌所述混合液保持设备中的所述混合液;
光入射设备,其向所述混合液保持设备中的混合液入射光;
受光设备,其接收所述入射光在所述混合液中的透射光,并将其转换为电信号;
导出设备,其通过从在所述受光设备中变换的电信号获得的所述混合液的透射率而导出所述样品中所述生理活性物质的浓度。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009037150A JP5437660B2 (ja) | 2009-02-19 | 2009-02-19 | コアギュロゲン原料及びその製造方法、それを用いた生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 |
JP2009-037150 | 2009-02-19 | ||
PCT/JP2010/052551 WO2010095718A1 (ja) | 2009-02-19 | 2010-02-19 | コアギュロゲン原料及びその製造方法、それを用いた生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102326082A true CN102326082A (zh) | 2012-01-18 |
Family
ID=42633995
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2010800085809A Pending CN102326082A (zh) | 2009-02-19 | 2010-02-19 | 凝固蛋白原原料及其制造方法、使用它测定来自生物的生理活性物质的方法和测定装置 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8790885B2 (zh) |
EP (1) | EP2400302A4 (zh) |
JP (1) | JP5437660B2 (zh) |
KR (1) | KR20110132334A (zh) |
CN (1) | CN102326082A (zh) |
CA (1) | CA2753062A1 (zh) |
WO (1) | WO2010095718A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106645721A (zh) * | 2016-09-30 | 2017-05-10 | 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 | 一种凝固酶检测试剂、反应垫、其制备方法及试剂盒 |
CN108956543A (zh) * | 2017-05-18 | 2018-12-07 | 微采视像科技股份有限公司 | 凝血酶原时间的测定方法 |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102348984B (zh) * | 2009-03-13 | 2014-04-02 | 兴和株式会社 | 来自生物的生理活性物质的测定方法以及测定装置 |
JP5981338B2 (ja) | 2009-06-26 | 2016-08-31 | チャールズ リバー ラボラトリーズ, インコーポレイテッド | 加熱処理したリムルスアメーバ様細胞溶解物 |
EP2631655B1 (en) * | 2010-10-18 | 2020-07-01 | Toru Obata | Gel particle measurement reagent and measurement method using same |
WO2013062013A1 (ja) * | 2011-10-26 | 2013-05-02 | 興和株式会社 | 生物由来の生理活性物質の測定方法及び、それに用いられる微粒子及び抽出液 |
DE102012110288A1 (de) * | 2012-10-26 | 2014-04-30 | Leibniz-Institut Für Neue Materialien Gemeinnützige Gmbh | Verfahren zur Detektion von Endotoxinen und/oder 1,3-beta-D-Glucanen in einer Probe |
EP3007662B1 (en) | 2013-06-12 | 2020-05-06 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Absorbent article containing a nonwoven web formed from porous polyolefin fibers |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0476459A (ja) * | 1990-07-19 | 1992-03-11 | Taiyo Fishery Co Ltd | β―グルカン類に対する特異性の高いアメボサイト・ライセート及びその製造方法 |
CN1087724A (zh) * | 1992-05-08 | 1994-06-08 | 生化学工业株式会社 | 前处理剂、前处理方法、使用经前处理的试样的测定法、测定用药盒以及感染症的诊断方法 |
EP0613004A1 (en) * | 1993-02-26 | 1994-08-31 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Reagent for endotoxin assay and method for endotoxin assay using the same |
CN1469124A (zh) * | 2003-06-04 | 2004-01-21 | 湛江安度斯生物有限公司 | 一种血液的细菌内毒素定量检测方法—同系统模型法 |
CN1621841A (zh) * | 2003-11-29 | 2005-06-01 | 丁友玲 | 抗干扰鲎试剂的制备工艺 |
CN1632579A (zh) * | 2005-01-13 | 2005-06-29 | 丁友玲 | 鲎试剂检测用的血液前处理法 |
WO2008038329A1 (fr) * | 2006-09-25 | 2008-04-03 | Kowa Kabushiki Kaisha | Appareil de mesure de la gélification et cuve à échantillon |
WO2008139544A1 (ja) * | 2007-05-01 | 2008-11-20 | Kowa Company, Ltd. | ゲル化測定装置および試料セル |
CN101368967A (zh) * | 2008-08-28 | 2009-02-18 | 湛江安度斯生物有限公司 | 一种微量终点显色鲎试验方法 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1159754A (en) * | 1980-06-27 | 1984-01-03 | Roxane N. Dikeman | Process for preparing limulus lysate |
US4322217A (en) | 1980-06-27 | 1982-03-30 | Mallinckrodt, Inc. | Process for preparing Limulus lysate |
DK255887D0 (da) | 1987-05-20 | 1987-05-20 | Claus Koch | Immunoassay |
JP2737514B2 (ja) | 1992-01-24 | 1998-04-08 | 和光純薬工業株式会社 | エンドトキシン測定用試料の前処理方法 |
JP3793573B2 (ja) * | 1994-09-01 | 2006-07-05 | 生化学工業株式会社 | (1→3)−β−D−グルカン結合性タンパク質、それを認識する抗体及びその利用 |
JPH10293129A (ja) | 1997-04-18 | 1998-11-04 | Nof Corp | リン脂質中のエンドトキシン測定法 |
JP3913132B2 (ja) | 2002-07-29 | 2007-05-09 | 東亜ディーケーケー株式会社 | エンドトキシン測定方法及び装置、並びにエンドトキシン計測システム |
EP1836492B1 (en) * | 2005-01-13 | 2008-12-31 | Charles River Laboratories, Inc. | Method for classifying a microorganism in a biological sample |
US20100119530A1 (en) | 2006-07-06 | 2010-05-13 | Wenchao Song | Regulation of TLR Signaling by Complement |
JP4940085B2 (ja) * | 2007-10-02 | 2012-05-30 | 興和株式会社 | エンドトキシン測定用の容器 |
-
2009
- 2009-02-19 JP JP2009037150A patent/JP5437660B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-02-19 CN CN2010800085809A patent/CN102326082A/zh active Pending
- 2010-02-19 KR KR1020117019609A patent/KR20110132334A/ko not_active Application Discontinuation
- 2010-02-19 WO PCT/JP2010/052551 patent/WO2010095718A1/ja active Application Filing
- 2010-02-19 EP EP10743843A patent/EP2400302A4/en not_active Withdrawn
- 2010-02-19 CA CA2753062A patent/CA2753062A1/en not_active Abandoned
- 2010-02-19 US US13/202,285 patent/US8790885B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0476459A (ja) * | 1990-07-19 | 1992-03-11 | Taiyo Fishery Co Ltd | β―グルカン類に対する特異性の高いアメボサイト・ライセート及びその製造方法 |
CN1087724A (zh) * | 1992-05-08 | 1994-06-08 | 生化学工业株式会社 | 前处理剂、前处理方法、使用经前处理的试样的测定法、测定用药盒以及感染症的诊断方法 |
EP0613004A1 (en) * | 1993-02-26 | 1994-08-31 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha (Seikagaku Corporation) | Reagent for endotoxin assay and method for endotoxin assay using the same |
CN1469124A (zh) * | 2003-06-04 | 2004-01-21 | 湛江安度斯生物有限公司 | 一种血液的细菌内毒素定量检测方法—同系统模型法 |
CN1621841A (zh) * | 2003-11-29 | 2005-06-01 | 丁友玲 | 抗干扰鲎试剂的制备工艺 |
CN1632579A (zh) * | 2005-01-13 | 2005-06-29 | 丁友玲 | 鲎试剂检测用的血液前处理法 |
WO2008038329A1 (fr) * | 2006-09-25 | 2008-04-03 | Kowa Kabushiki Kaisha | Appareil de mesure de la gélification et cuve à échantillon |
WO2008139544A1 (ja) * | 2007-05-01 | 2008-11-20 | Kowa Company, Ltd. | ゲル化測定装置および試料セル |
CN101368967A (zh) * | 2008-08-28 | 2009-02-18 | 湛江安度斯生物有限公司 | 一种微量终点显色鲎试验方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
SHIN NAKAMURA等: "A Clottable Protein (Coagulogen) from Amoebocyte Lysate of Japanese Horseshoe Crab (Tachypleus tridentatus). Its Isolation and Biochemical Properties", 《THE JOURNAL OF BIOCHEMISTRY》 * |
王志光,杜良成: "中国鲎试剂中凝固蛋白原的快速纯化", 《昆明医学院学报》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106645721A (zh) * | 2016-09-30 | 2017-05-10 | 广州鸿琪光学仪器科技有限公司 | 一种凝固酶检测试剂、反应垫、其制备方法及试剂盒 |
CN108956543A (zh) * | 2017-05-18 | 2018-12-07 | 微采视像科技股份有限公司 | 凝血酶原时间的测定方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2400302A4 (en) | 2012-07-04 |
WO2010095718A1 (ja) | 2010-08-26 |
JP2010190801A (ja) | 2010-09-02 |
US8790885B2 (en) | 2014-07-29 |
US20120040385A1 (en) | 2012-02-16 |
KR20110132334A (ko) | 2011-12-07 |
JP5437660B2 (ja) | 2014-03-12 |
CA2753062A1 (en) | 2010-08-26 |
EP2400302A1 (en) | 2011-12-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102326082A (zh) | 凝固蛋白原原料及其制造方法、使用它测定来自生物的生理活性物质的方法和测定装置 | |
CN101903776B (zh) | 内毒素的测定方法和内毒素的测定用试剂盒 | |
Vandenberg et al. | Factors affecting protein release from alginate–chitosan coacervate microcapsules during production and gastric/intestinal simulation | |
Sadat Ebrahimi et al. | Rapid detection of Escherichia coli via enzymatically triggered reactions in self-reporting chitosan hydrogels | |
Jafary et al. | Stability improvement of immobilized alkaline phosphatase using chitosan nanoparticles | |
Tallian et al. | Lysozyme-responsive spray-dried chitosan particles for early detection of wound infection | |
Deng et al. | Preparation and characterization of chitosan nanoparticles containing lysozyme | |
Avivi (Lev et al. | An easy sonochemical route for the encapsulation of tetracycline in bovine serum albumin microspheres | |
CN101802213A (zh) | 大体积颗粒样品中的病原体检测 | |
CN104337795A (zh) | 一种蜡质玉米淀粉纳米颗粒-胰岛素缓释胶囊的制备方法 | |
Lin et al. | Stimulus-responsive hydrogels: A potent tool for biosensing in food safety | |
JPS59192099A (ja) | 微生物菌数の測定法 | |
Brückl et al. | A systematic evaluation of mechanisms, material effects, and protein-dependent differences on friction-related protein particle formation in formulation and filling steps | |
WO2009148132A1 (ja) | 生物由来の生理活性物質の測定方法、生物由来の生理活性物質の測定用キット及び、生物由来の生理活性物質の測定装置 | |
CN105770903A (zh) | 一种温控药物释放聚合物微球材料的制备方法 | |
Dubnika et al. | Development of vancomycin delivery systems based on autologous 3D platelet-rich fibrin matrices for bone tissue engineering | |
CN109265758A (zh) | 一种温度/pH双响应型几丁质纳米纤维水凝胶及其制备方法 | |
JPWO2011104871A1 (ja) | 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定用試薬キット | |
Zhao et al. | Mechanical characterization of biocompatible microspheres and microcapsules by direct compression | |
CN103168243B (zh) | 凝胶粒子测定试剂及使用其的测定方法 | |
WO2012102353A1 (ja) | 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 | |
EP1584243A1 (en) | Granular composition and process for producing the same | |
Sato et al. | Temperature-Responsive Polysaccharide Microparticles Containing Nanoparticles: Release of Multiple Cationic/Anionic Compounds | |
Tan et al. | Effect of linoleic-acid modified carboxymethyl chitosan on bromelain immobilization onto self-assembled nanoparticles | |
CN103054814A (zh) | 一种基于药物交联的多聚糖微球的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1163805 Country of ref document: HK |
|
AD01 | Patent right deemed abandoned |
Effective date of abandoning: 20120118 |
|
C20 | Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: WD Ref document number: 1163805 Country of ref document: HK |