JPH0476459A - β―グルカン類に対する特異性の高いアメボサイト・ライセート及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、カブトガニから得られるアメボサイト・ライ
セートに係わり、特にβ−グルカン類に対する特異性の
高いアメボサイト・ライセート及びその製造方法に関す
るものである。

〔従来の技術〕

されるアメボサイト・ライセートのダラム陰性菌表層物
質［エンドトキシン」　（リポポリサッカライド）によ
る凝固現象は、［リムルステスト」の一般名てエンドト
キシン特異的検出法として医学、薬学の領域で広く利用
されている。アメボサイト・ライセートの凝固を起こす
物質としてエンドトキシン以外にトリプシン様プロテア
ーゼ（トリプシン、トロンビン等）及びβ−グルカン類
（β−結合を有するグルコースポリマー及びその誘導体
）が知られている。

アメボサイト・ライセートのエンドトキシンによる凝固
現象はエンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化因子によ
る凝固酵素前駆体の活性化と、活性型凝固酵素の働きに
よるコアギュローゲンの繊維状コアギュリンへの転換に
より起こることが明らかにされている。一方アメボサイ
ト・ライセートのβ−グルカンによる凝固現象が、β−
グルカン性凝固酵素前駆体活性化因子による凝固酵素前
駆体の活性化と、活性型凝固酵素の働きによるコアギュ
ローゲンの繊維状コアギュリンへの転換により起こり、
アメボサイト・ライセートに含まれるエンドトキシン性
凝固酵素前駆体活性化因子と、β−グルカン性凝固酵素
前駆体活性化因子が異なるものであることが、Ｍｏｒｉ
ｔａらにより報告され（ＦＩｌｉＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ
、　１２９．２．３１８−３２１）、硫酸化多糖類を担
体とする液体クロマトグラフィーを用いたβ−グルカン
性凝固酵素前駆体活性化因子の除去を特徴とする、エン
ドトキシンに対する特異性の高いアメボサイト・ライセ
ートの調製法が岩永らにより開示されている。（特開昭
５９−２７８２９）また本発明者らにより、スルホプロ
ピル基を吸着担体とする液体クロマトグラフィーにアメ
ボサイト・ライセートを付し、エンドトキシン性凝固酵
素前駆体活性化因子を特異的に吸着せしめる、β−グル
カン類に対する特異性の高いアメボサイト・ライセート
の製造方法か開示されている。（特願昭６３−２９２４
９４号） 〔発明が解決しようとする課題〕 従来、β−グルカン類に対する特異性の高いアメボサイ
ト・ライセートを得るには、岩永らの方法に従いアメボ
サイト・ライセートを硫酸化多糖類を吸着担体とする液
体クロマトグラフィーに付して分画し、β−グルカン性
凝固酵素前駆体活性化因子と凝固酵素前駆体を組み合わ
せる方法、あるいは、北川らの方法にしたかい、アメボ
サイト・ライセートをスルホプロピル基を吸着担体とす
る液体クロマトグラフィーに付し、エンドトキシン性凝
固酵素前駆体活性化因子を除去する方法が用いられてき
た。しかしながら、岩永らの方法では高価で調製の面倒
な硫酸化多糖類を吸着担体とする液体クロマトグラフィ
ー用充填剤を使用しなければならないという問題点があ
り、北川らの方法ではβ−グルカン類を測定する際に高
価なペプチド性合成基質を使用しなければならないとい
う問題点があった。

本発明は、上述した従来技術の問題点を解消するために
提案されたもので、その目的はカブトガニの血リンパ液
より取得されるアメボサイトの抽出液（アメボサイト・
ライセート）より、エンドトキシン性凝固酵素前駆体活
性化因子を除去し、さらに内因性の凝固物質であるコア
ギュローゲンを添加することにより、β−グルカン類に
対する特異性の高いアメボサイト・ライセートの簡便な
調製法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、スルホプロピル基を吸着担体とするイオ
ン交換クロマトグラフィーにアメボサイト・ライセート
を付することにより得た、凝固物質であるコアギュロー
ゲンを含まないβ−グルカン類に対して特異性の高いア
メボサイト・ライセートに、コアギュローゲンを添加す
ることにより、β−グルカン類に対して特異性の高いア
メボサイト・ライセートが、簡便に製造できるというこ
とを見出し本発明を完成した。

即ち、本発明は、カブトガニから得られるアメボサイト
・ライセートを、スルホプロピル基を吸着担体とするイ
オン交換液体クロマトグラフィーに付し、エンドトキシ
ン性凝固酵素前駆体活性化因子を含まないβ−グルカン
類に対して特異性の高い画分を採取し、本画分にコアギ
ュローゲンを添加することにより、β−グルカン類に対
する特異性の高いアメボサイト・ライセートを製造する
方法にある。

さらに本発明は、上記の製造方法により得られる、β−
グルカン類に対する特異性の高いアメボサイト・ライセ
ートにある。

この方法により得られるアメボサイト・ライセートは、
β−グルカンの検出におけるゲル化法及び比濁時間法に
おいて使用できるものであって、非常に有用なものであ
る。

エンドトキシン試験法としてのゲル化法、及び比濁時間
法は、日本薬局方に記載されている方法であるが具体的
には次の通りである。

ゲル化法はアメボサイト・ライセートと検体を容器に入
れアルミキャブを施しミキサーで１〜２秒間泡立てない
ように混合し３７°Ｃ１１時間放置する。次いで容器を
ゆっくりと１８０°Ｃ転倒させて内容物のゲルが落下す
るか否かを調べてβ−グルカンの検出を行う。このゲル
化法は分光光度計等の特別な機器を必要とせずかつ操作
手順か簡単な、完全な方法である。比濁時間法は検体と
アメボサイト・ライセートとのゲル化反応に伴う濁度変
化を波長６６０ｎｍにおける透過光量の変化として促え
るものである。透過光量の時間変化は反応開始後しばら
くラグがあり、ゲル化が始まると、その進行に伴って透
過光量は減少し、ゲル化完了と共に減少変化も止まる。

透過光量の反応初期の透過光量に対する割合をＲｔとし
、この透過光量比の変化に対してしきい値Ｒｔｈを設定
し、反応開始からＲｔがＲｔｈになるまでの時間をゲル
化時間Ｔｇとして読みとるものです。この比濁時間法は
専用の測定機を必要とするが操作は簡単でしかも定量性
のある方法である。

本発明でいうアメボサイト・ライセートとは、イオン強
度０．０５以下のｐｌが中性付近である溶液、好ましく
はトリス−塩酸緩衝液でカブトガニのアメボサイトを抽
出して得られるものである。

また、本発明で用いられるイオン交換クロマトグラフィ
ーは、北用らの特許に述べられているものと同様のもの
であり、イオン強度０．０５以下のｐＨが中性付近であ
る溶液、好ましくはトリス−塩酸緩衝液で平衡化したス
ルホプロピル基を吸着担体とするものである。この様な
イオン交換クロマトグラフィーに前記アメボサイト・ラ
イセートを付すことによりコアギュローゲンを含まない
β−グルカン類に特異的なアメボサイト・ライセートが
採取できる。

また、本発明で用いられるエンドトキシン性凝固酵素前
駆体活性化因子を含まないコアギュローゲンとは、アメ
ホサイト・ライセードをイオン交換クロマトグラフィー
あるいは、ゲル濾過クロマトグラフィー等の方法で粗分
画して得たコアギュローゲン画分を更に精製する、ある
いは酸処理もしくは熱処理を施す等の方法でエンドトキ
シン性凝固酵素前駆体活性化因子を除去あるいは失活せ
しめたものである。この様にして得たコアギュローゲン
を、前記イオン交換クロマトグラフィーで得たβ−グル
カン類に対して特異性の高いアメボサイト・ライセート
に添加することによりβ−グルカン類に対して特異性の
高いゲル化法用あるいは比濁時間法用のアメボサイト・
ライセートを得ることができる。

上記コアギュローゲン添加量は最終製品のアメボサイト
・ライセート１ｍｌに対し蛋白質量として０、１■〜２
０■である。

次に本発明を実施例により説明する。但し本発明はこの
実施例により限定されるものではない。

〔実施例〕

日本産カブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ　ｔｒｉｄｅ
ｎｔａｔｕｓ）血リンパ液よりアメボサイト２０ｇを無
菌的に採取し、このアメボサイトをｐＨ８，０の１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液で抽出して得られたアメボサイト
・ライセート３００−を、ｐＨ８，０の２０ｍＭ　トリ
ス−塩酸緩衝液で平衡化した５Ｐ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
　６５０Ｃ（東ソー株式会社製）カラムに加える。次い
で吸着されずに溶出され画分を回収し、エンドトキシン
に対しては反応せずβ−グルカンに対して濃度依存的に
反応する、コアギュローゲンを含まない画分を得る。

更に本カラムを、５０ｍＭのＮａＣ１を含む２０ｍＭ　
トリス塩酸緩衝液で洗浄した後、１２５ｍＭのＮａＣ１
を含む２０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液で溶出し、この溶
出液をを回収することにより、高純度のコアキュローゲ
ン画分２００ｍ１’を得る。このコアギュローゲン画分
を、６５℃で２０分間加温することにより、コアギュロ
ーゲンの凝固能を損なうことなく、コアギュローゲン画
分に微■混入しているエンドトキシン性凝固酸素前駆体
活性化因子を失活させる。このコアギュローゲン画分を
、前述の５Ｐ−Ｔｏｙｐｅａｒｌ　６５０Ｃ非吸着画分
と混合し濃縮して、β−グルカン類に対して特異的に反
応するゲル化法及び比濁時間法用のアメボサイト・ライ
セー）　１００ｍＡ’を得る。

本調製物を用いてのβ−グルカンの定量法は以下のとお
りである。試料０．１ｍｊ、本調製物０．１　ｍｌを直
径１０ｍｍの試験管中で混合した後、トキシンメーター
ＥＴ２０８Ｍ　（和光純薬工業株式会社製）を用いて３
７°Ｃて試料の透過光量が５％減少するまでの時間（以
下Ｔｇと略称する）を測定した。反応開始後１時間経過
したならば試験管を静かに１８０度転倒させ、ゲルの形
成の存無を、　１８０度転倒させても崩れないゲルを形
成したものを士、１８０度転倒させると崩れるものを−
として判定した。結果を第１表に示す。試料中のβ−グ
ルカン濃度を求めるには、試料の代わりに既知濃度のβ
−グルカンを用いて、同様の操作でＴｇを求めることに
より作成した検量線にあてはめることでβ−グルカン濃
度を求めることができる。

なお標準物質としてカードランを用いて作成した検量線
を第１図に、ゲル化判定の結果を第２図に示す。また本
調製物がエンドトキシンに対しては反応しないことを示
すために、試料の代わりに既知濃度のエンドトキシンを
用いた場合の結果を第２図及び第２表に示す。

本発明品のカードランに対するゲル化判定の結果第２表 本発明品のエンドトキシンに対する ゲル化判定の結果 比較例として５Ｐ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｃに付
す前のアメボサイト・ライセートについて、上述の方法
で作成したカードランに対する検量線を第３図に、また
５Ｐ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｃに付す前のアメボ
サイト・ライセートがエンドトキシンに対して感受性を
有することを示すために、エンドトキシンに対して上述
の方法で測定した結果を第４図に示す。第２図と第４図
を比較すると明らかなように、アメボサイト・ライセー
トより得られる本調製物は従来のアメボサイト・ライセ
ートと異なり、β−グルカンに対して濃度依存的に反応
しエンドトキシンに対しては反応性を示さないものであ
る。

〔発明の効果〕

本方法により、エンドトキシンに対しては反応せず、β
−グルカン類に対する特異性の高いゲル化法あるいは比
濁時間法用のアメボサイト・ライセートを容易に得るこ
とができる。

本方法により取得されるアメボサイト・ライセートを用
いてのβ−グルカン類の定量は、高価な合成基質を用い
る必要が無く、操作の煩雑な比色操作を行う必要もない
非常に簡便な方法である。

本方法によるアメボサイト・ライセートの調製物は、エ
ンドトキシンに対しては反応せず、β−グルカンに対し
ては濃度依存的に高感度に反応するため、β−グルカン
類に対する特異性の高い高感度な定量用試薬として利用
可能である。さらに、β−グルカンは真菌類の菌体成分
であるので、β−グルカンの定量による真菌症の診断薬
としても利用可能である。本調製物はβ−グルカン性の
抗癌剤（クレスチン、レンチナンなと）とも反応するた
め、これらの抗癌剤の血中濃度の測定にも利用可能であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は標準物質としてカードランを用いて作成した検
量線、第２図は実施例において得られたβ−グルカン類
に対して特異性の高いアメボサイト・ライセートがエン
ドトキシンに対して反応しないことを示す図、第３図は
５Ｐ−ＴｏｙｏＪ）ｅａｒｌ　６５０Ｃに付す前のアメ
ボサイト・ライセートについてカードランを標準物質と
して作成した検量線、第４図は５Ｐ−Ｔｏｙｏｐｅａｒ
ｌ　６５０Ｃに付す前のアメボサイト・ライセートがエ
ンドトキシンに対して感受性を有することを示す図であ
る。 （ｆｌ　　　　ば） 第２図 エンドトキシン濃度（ｇ／Ｊ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カブトガニのアメボサイト・ライセートをスルホプ
   ロピル基を吸着担体とするイオン交換液体クロマトグラ
   フィーに付し、エンドトキシン性凝固酵素前駆体活性化
   因子を含む画分を除去したものに、カブトガニコアギュ
   ローゲンを添加することを特徴とする、β−グルカン類
   に対する特異性の高いアメボサイト・ライセートの調製
   方法。 ２、請求項１記載の製造方法で得られるβ−グルカン類
   に対する特異性の高いアメボサイト・ライセート。