WO2005062056A1

WO2005062056A1 - リポアラビノマンナンの測定方法とその応用

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Publication number: WO2005062056A1
Application number: PCT/JP2004/019206
Authority: WO
Inventors: Shigenori Tanaka; Shoji Takahashi
Original assignee: Seikagaku Corporation
Priority date: 2003-12-22
Filing date: 2004-12-22
Publication date: 2005-07-07
Also published as: US7851179B2; DE602004028048D1; US8703412B2; EP1710584B1; US20110033939A1; EP1710584A4; JPWO2005062056A1; EP1710584A1; JP4637750B2; US20070154979A1

Abstract

　リムルス試薬とＬＡＭ含有試料との接触工程を少なくとも含むＬＡＭの測定法と抗酸菌の検知法、ＬＡＭ含有試料に所定の物質を共存させる工程を少なくとも含むＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性除去法、リムルス試薬を用いるＥｔの測定法においてＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を前記の除去法で除去する工程を少なくとも含むＬＡＭ含有試料中のＥｔの測定法とＥｔ関連疾患の検知法、リムルス試薬を用いるＢＧの測定法においてＬＡＭのリムルス試薬に対する反応性を前記の除去法で除去する工程を少なくとも含むＬＡＭ含有試料中のＢＧの測定法と真菌症の検知法等。

Description

明細書

リポアラビノマンナンの測定方法とその応用

技術分野

[0001] 本発明は、リポアラビノマンナンの測定方法、これに用いるキット、リポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反応性の除去方法、これを応用したエンドトキシン及び (

1→3)— 18—グルカンの測定方法、これらに用いるキット及びリポアラビノマンナンに対する結合剤等に関する。

背景技術

[0002] リムルス試薬 (ライセート試薬とも呼ばれて、る。）は、カブトガ二のァメボサイト ·ライセートを主成分とする試薬であって、エンドトキシン (以下、 Etと略記する。）や（1→3 )— j8 -グルカン（以下、 BGと略記する。）の検知 ·測定に用いられている。 Etや BGはリムルス試薬に対する反応性を有しており、リムルス試薬とこれらの物質が接触すると、リムルス試薬中の種々の因子が関与するカスケード反応（以下、リムルス反応という。）が惹起され、この反応を検知することでこれらの物質を検知 ·測定することができる

[0003] 一方、リポアラビノマンナン (以下、 LAMと略記する。 )は、抗酸菌（例えば、結核菌等）に特有の細胞壁成分であることが知られている。

特許文献 1には、 Etや BGとは物質的に異なるリムルス反応活性ィ匕物質、その不活化方法、その測定方法等が開示されている。しかしこの物質は後述の通り LAMとは全く異なるものであり、 LAMがリムルス試薬に対して反応性を有することについての開示や示唆はない。

特許文献 1：特開平 10- 185924号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 本発明は、 LAMの測定方法、これに用いるキット、 LAMのリムルス試薬に対する反応性の除去方法、これを応用した Et及び BGの測定方法、これらに用いるキット、 L AMに対する結合剤等を提供することを目的とする。課題を解決するための手段

[0005] 本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、 LAMがリムルス試薬に対する反応性を有することを初めて見出し、この知見に基づいて、 LAMの測定方法、これに用いるキット、 LAMのリムルス試薬に対する反応性の除去方法、これを応用した Et及び BGの測定方法並びにこれらに用いるキット等を提供するに至った

[0006] すなわち本発明は、リムルス試薬と「LAMを含有する試料」とを接触させる工程を少なくとも含む、当該試料中の LAMの測定方法 (以下、本発明 LAM測定方法という。）を提供する。この方法は、リムルス試薬との接触前に、「LAMを含有する試料」を加熱する工程をさらに含むことが好ましい。また、リムルス試薬は Et特異的リムルス試薬であることが好ましい。

[0007] また本発明は、本発明 LAM測定方法を用いることを特徴とする、抗酸菌の検知方法 (以下、本発明抗酸菌検知方法という。）を提供する。検知対象とする抗酸菌は、結核菌が好ましい。

[0008] また本発明は、リムルス試薬を構成成分として含む、 LAMの測定キット（以下、本発明 LAM測定キットという。）を提供する。リムルス試薬は、 Et特異的リムルス試薬であることが好ましい。

[0009] また本発明は、本発明 LAM測定キットからなる、抗酸菌の検知キット（以下、本発明抗酸菌検知キットという）を提供する。検知対象とする抗酸菌は、結核菌が好ましいまた本発明は、「LAMを含有する試料」に、下記の群カゝら選ばれる 1又は 2以上の物質を共存させる工程を少なくとも含む、当該試料中の LAMのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法 (以下、本発明反応性除去方法という。）を提供する。

[0010] 界面活性剤、抗結核抗体、抗 LAM抗体、 BG、カルボキシメチル化された BG、 G 因子活性化阻害剤、強アルカリ性物質、ポリミキシン B、コリスチン、コンカナパリン A 、ヒスチジン、ヒスタミン。

[0011] また本発明は、リムルス試薬を用いる Etの測定方法において、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を本発明反応性除去方法で除去する工程を少なくとも含む、「LA Mを含有する試料」中の Etの測定方法 (以下、本発明 Et測定方法という。）を提供する。リムルス試薬は、 Et特異的リムルス試薬であることが好ましい。

[0012] また本発明は、本発明 Et測定方法を用いることを特徴とする、 Et関連疾患の検知方法 (以下、本発明 Et関連疾患検知方法という。）を提供する。

また本発明は、リムルス試薬と下記の群カゝら選ばれる 1又は 2以上の物質を構成成分として含む、 Etの測定キット（以下、本発明 Et測定キットという。）を提供する。

[0013] 界面活性剤、抗結核抗体、抗 LAM抗体、 BG、カルボキシメチル化された BG、 G 因子活性化阻害剤、強アルカリ性物質。

リムルス試薬は、 Et特異的リムルス試薬であることが好まし、。

[0014] また本発明は、本発明 Et測定キットからなる、 Et関連疾患の検知キット（以下、本発明 Et関連疾患検知キットという。）を提供する。

また本発明は、リムルス試薬を用いる BGの測定方法において、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を本発明反応性除去方法で除去する工程を少なくとも含む、「LA Mを含有する試料」中の BGの測定方法 (以下、本発明 BG測定方法という。）を提供する。リムルス試薬は、 BG特異的リムルス試薬であることが好ましい。

[0015] また本発明は、本発明 BG測定方法を用いることを特徴とする、真菌症の検知方法

(以下、本発明真菌症検知方法という。）を提供する。

また本発明は、リムルス試薬と下記の群カゝら選ばれる 1又は 2以上の物質を構成成分として含む、 BGの測定キット（以下、本発明 BG測定キットという。）を提供する。

[0016] 界面活性剤、抗結核抗体、抗 LAM抗体、強アルカリ性物質、ポリミキシン B、コリスチン、コンカナバリン八、ヒスチジン、ヒスタミン。

また本発明は、本発明 BG測定キットからなる、真菌症の検知キット（以下、本発明真菌症検知キットという。）を提供する。

[0017] さらに本発明は、下記の群力選ばれる 1又は 2以上の物質を有効成分とする、 LA Mに対する結合剤 (以下、本発明結合剤という。）を提供する。

抗結核抗体、抗 LAM抗体、（1→3)— j8—グルカン、カルボキシメチル化された（1 →3)— j8—グルカン、 G因子活性化阻害剤、ポリミキシン B、コリスチン、コンカナバリン k ヒスチジン、ヒスタミン。発明の効果

[0018] 本発明 LAM測定方法、本発明抗酸菌検知方法、本発明 LAM測定キット及び本発明抗酸菌検知キットは、 LAMや抗酸菌を簡便、迅速かつ安価に測定'検知することができ、極めて有用である。

[0019] また、本発明反応性除去方法は、リムルス反応における LAMの影響を簡便、迅速かつ安価に除去することができ、極めて有用である。

本発明 Et測定方法、本発明 Et関連疾患検知方法、本発明 Et測定キット及び本発明 Et関連疾患検知キットは、 Etや Et関連疾患を特異的、かつ簡便、迅速、安価に測定 '検知することができ、極めて有用である。

[0020] 本発明 BG測定方法、本発明真菌症検知方法、本発明 BG測定キット及び本発明真菌症検知キットは、 BGや真菌症を特異的、かつ簡便、迅速、安価に測定 '検知することができ、極めて有用である。

[0021] 本発明結合剤は、 LAMの検知 ·測定や LAMの除去に用いることができ、極めて有用である。

発明を実施するための最良の形態

[0022] < 1 >本発明 LAM測定方法

本発明 LAM測定方法は、リムルス試薬と「LAMを含有する試料」とを接触させる工程を少なくとも含む、当該試料中の LAMの測定方法である。

[0023] 「リムルス試薬」は、カブトガ二のァメボサイト ·ライセートを主成分とする試薬である限りにおいて特に限定されない。このカブトガ二の種類も限定されず、リムルス'ポリフェムス（北アメリカ産力ブトガ-)、タキプレウス'トリデンタツス、タキプレウス.ギガス、タキプレウス ·口タンディ力ウダ（以上はアジア産の力ブトガ-)の、ずれのァメボサイト · ライセートをも用いることができる。ァメボサイト'ライセートは、公知の方法で製造することができる。また、市販されているリムルス試薬を用いてもよい。

[0024] このリムルス試薬は、 BGに反応しないように調製されたリムルス試薬 (本明細書中において、「Et特異的リムルス試薬」という。）であっても、 Etにも BGにも反応するリムルス試薬であっても良いが、「Et特異的リムルス試薬」であることが好ましい。この Et 特異的リムルス試薬は公知の方法で製造することもでき、市販されてヽるものを利用することちでさる。

[0025] 「LAMを含有する試料」は、 LAMを含有し又は LAMを含有して!/、ることが疑われる試料である限りにお、て特に限定されな、。 LAMは抗酸菌特有の細胞壁成分であることから、例えば抗酸菌 (例えば結核菌等)の生菌ゃ死菌自体、その細胞壁、細胞壁成分を含有し又は含有してヽることが疑われる試料等が例示される。このような試料としては、結核ワクチン等が例示される。

[0026] また「LAMを含有する試料」として「生体由来の試料」を用いることもできる。「生体由来の試料」も特に限定されないが、体液であることが好ましい。体液は、 LAMが含有されて!/、る又はその可能性がある体液である限りにお、て特に限定されな、。例えば、血液 (本明細書では、血清や血漿をも含む概念として用いる。）、尿、汗、唾液、涙液、関節液、喀痰、乳汁、髄液等を例示することができる。なかでも血液が好ましい。

[0027] なお、「生体由来の試料」として血液用いる場合は、血液中のリムルス反応妨害因子（セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター等）を公知の方法 (例えば、特開昭 58— 85162号公報等に記載の方法)で予め除去又は不活ィ匕しておくことが好ましい。

[0028] また、リムルス試薬と試料との「接触」の方法も、リムルス試薬中の因子と試料中の L AM分子とが接触する限りにお、て限定されず、リムルス試薬に試料を添加してもよぐ試料にリムルス試薬を添加してもよぐ両者を同時に添加してもよい。

[0029] 本発明 LAM測定方法は、リムルス試薬と「LAMを含有する試料」とを接触させる工程を含む限りにおいて、他の工程を含んでいてもよい。例えば、リムルス試薬との接触前に、「LAMを含有する試料」を加熱する工程をさらに含むことが好ましい。本明細書において「加熱」とは、室温の状態のものに熱をカ卩えることを意味する。加熱後の温度は特に限定されないが、 37— 121°C、好ましくは 60— 100°C、なかでも 95 °Cまで加熱することが好まヽ。加熱した状態を維持する時間も特に限定されなヽが、 5— 60分、好ましくは 10— 30分、なかでも 20分程度加熱状態を維持することが好ましい。

[0030] リムルス試薬と試料とが接触することにより、試料中の LAMがリムルス試薬中の。因子 (Etによって活性ィ匕される因子として知られている。）を活性ィ匕し、これによつてリムルス反応が惹起されることとなる。

[0031] このリムルス反応を検知し測定することによって、試料中の LAMを測定することができる。リムルス反応の検知 ·測定は、公知の方法で行うことができる。例えば、比色法 (エンドポイントアツセィゃ力イネティックアツセィ）、ゲルイ匕法、比濁法 (エンドポイントアツセィゃ力イネティックアツセィ)等の公知の方法で、それぞれの方法に応じた検知 ·測定方法を採用することができる。

[0032] なお本明細書にぉ、て「測定」とは、定量的な測定のみならず、定性的な測定 (LA Mの存否の測定等）をも含む概念である。

LAMの定量的な測定は、目的に応じて種々の方法を採用することができる。例えば、 LAM濃度が既知の試料を用いて LAM濃度とリムルス反応の強度との関係について検量線や関係式を作成しておき、これを用いることによって厳密な定量を行うことができる。また、厳密な定量が必要ない場合には、 2つ以上の試料についてその試料間の LAM量の多少を比較してもよ!/、。 LAMはリムルス反応を惹起させることから、リムルス反応の強度が高ければ、試料中の LAM量も多いこととなる。

[0033] LAMの定性的な測定は、リムルス反応の有無を検知することによって行うことができる。 LAMはリムルス反応を惹起させることから、リムルス反応が検知されれば、試料中に LAMが存在することとなる。

< 2>本発明抗酸菌検知方法

本発明抗酸菌検知方法は、本発明 LAM測定方法を用いることを特徴とする、抗酸菌の検知方法である。

[0034] 本発明抗酸菌検知方法は、本発明 LAM測定方法を、そのまま抗酸菌の検知に応用したものである。 LAMは抗酸菌特有の細胞壁成分であることから、 LAMを測定することによって、抗酸菌の検知を行うことができる。

[0035] 本発明 LAM測定方法については上記 < 1 >を参照されたい。本発明抗酸菌検知方法では、本発明 LAM測定方法における「LAMを含有する試料」として、抗酸菌を含有し又は抗酸菌を含有してヽることが疑われる試料を用いることとなる。

[0036] 検知対象とする菌は、抗酸菌として分類される菌である限りにおいて特に限定されない。 ί列えば、 Mycobacterium属、 Nocardia属、 Rhodococcus属、 Gordonia属、 Corynebacterium属に属する細菌等が例示される。なかでも結核菌 (Mycobacterium 属に属する）が好ましい。

[0037] また、検知対象とする抗酸菌は、生菌であっても死菌であってもよ!/、。

このような試料について、本発明 LAM測定方法を用いることによって、抗酸菌の検知をすることができる。

[0038] なお本明細書にぉ、て、抗酸菌の「検知」とは、定性的な検知 (抗酸菌の存否の検知）のみならず、定量的な検知 (抗酸菌の量の検知や、抗酸菌感染の悪性度の検知等)をも含む概念である。

[0039] 抗酸菌の定性的な測定は、リムルス反応の有無を検知することによって行うことができる。抗酸菌特有の細胞壁成分である LAMはリムルス反応を惹起させることから、リムルス反応が検知されれば、試料中に抗酸菌が存在することとなる。

[0040] 抗酸菌の定量的な測定は、目的に応じて種々の方法を採用することができる。例えば、抗酸菌量が既知の試料を用いて抗酸菌量とリムルス反応の強度との関係について検量線や関係式を作成しておき、これを用いることによって厳密な定量を行うことができる。また、厳密な定量が必要ない場合には、 2つ以上の試料についてその試料間の抗酸菌量の多少を比較してもよ、。抗酸菌特有の細胞壁成分である LAMはリムルス反応を惹起させることから、リムルス反応の強度が高ければ、試料中の抗酸菌量ち多ヽこととなる。

< 3 >本発明 LAM測定キット

本発明 LAM測定キットは、リムルス試薬を構成成分として含む、 LAMの測定キットである。「リムルス試薬」の説明については、前記のく 1 >と同様である。すなわち、このリムルス試薬も Et特異的リムルス試薬であることが好ましい。

[0041] 本発明 LAM測定キットは、少なくとも「リムルス試薬」を構成成分として含んで、る限りにおいて、他の構成成分をさらに含んでいてもよい。このような構成成分としては、例えばブランクテスト用蒸留水，反応試薬溶解液、反応用緩衝液等を挙げることができる。さらに本発明 LAM測定キットには、測定バッチ同士の実施レベルを一定水準に保っための陽性コントロール (QCコントロール)等を含有させることもできる。 [0042] これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容し保存しておくことができる。本発明 LAM測定キットを用いた LAMの測定は、前記 < 1 >の本発明 LAM測定方法に従って行うことができる。

<4>本発明抗酸菌検知キット

本発明抗酸菌検知キットは、本発明 LAM測定キットからなる、抗酸菌の検知キットである。本発明 LAM測定キットの説明は、前記く 3 >を参照されたい。

[0043] 本発明抗酸菌検知キットの検知対象とする抗酸菌の説明につ!/、ては、前記 < 2 > の本発明抗酸菌検知方法と同様である。すなわち、検知対象とする抗酸菌は、結核菌であることが好ましい。

[0044] 本発明抗酸菌検知キットを用いた抗酸菌の検知は、前記 < 2>の本発明抗酸菌検知方法に従って行うことができる。

< 5 >本発明反応性除去方法

本発明反応性除去方法は、「LAMを含有する試料」に、下記の群から選ばれる 1 又は 2以上の物質を共存させる工程を少なくとも含む、当該試料中の LAMのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法である。

[0045] 界面活性剤、抗結核抗体、抗 LAM抗体、 BG、カルボキシメチル化された BG、 G 因子活性化阻害剤、強アルカリ性物質、ポリミキシン B、コリスチン、コンカナパリン A

、ヒスチジン、ヒスタミン。

[0046] 「LAMを含有する試料」や「リムルス試薬」についての説明は、前記く 1 >の本発明 LAM測定方法と同様である。

ここで用いることができる「界面活性剤」は、 Etや BGのリムルス試薬に対する反応性を損なわせるものではなぐかつ、リムルス試薬中に存在するリムルス反応に関与する種々の因子に対して阻害作用がな、ものである限りにお、て特に限定されな!、

。例えば、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非ィオン性界面活性剤または天然由来の界面活性剤などの、ずれであってもよ!/ヽ。

[0047] なかでも、 Etに対する直接作用の少ない非イオン性界面活性剤を選択することが好ましい。なお、これらの界面活性剤を適宜組み合わせて用いてもよい。

非イオン性界面活性剤の中でも、親水性部分にポリオキシエチレンを有する構造をもつ界面活性剤（以下、「ポリオキシエチレン類」とも、う）が好まし!/、。ポリオキシェチレン類としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（一般式、 C H (OCH CH )

n 2n+l 2 2 x

OHと表され、通常省略して C Eと表記する）、アルキル鎖とポリオキシエチレン鎖の間にフエ-ル基が入ったポリオキシエチレンアルキルフエ-ルエーテル（C ΦΕ )及びァシルポリオキシエチレンソルビタン（Cソルビタン E )などが挙げられ、これらは、それぞれ Brij(C E )、 TergitoKC E )、 Triton

X (C ΦΕ )、 Tween (Cソルビタン E )という一般的名称（商品名）で呼ばれ、膜タンパク質の可溶ィ匕など多くの目的で汎用されている。

[0048] ここで用いることができるポリオキシエチレン類のポリオキシエチレン鎖（上記一般式中の「(0CH CH ) 0H」部分、「Ex」とも略記する）は、特に限定されないが、 x= 2— 2

2 2

5の整数、好ましくは x=4— 23の整数、さらに好ましくは x= 7— 13の整数である化合物が好ま、。また本発明で用いられるポリオキシエチレン類のアルキル基（上記式中の「C H 」部分、「Cn」とも略記する）の炭素数としては、特に限定されないが、

n 2n+l

n = 8— 18の整数である化合物が好ましい。

[0049] このようなポリオキシエチレン類としては、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンへキサデシルエーテル（ポリオキシエチレンセチルエーテルとも、う )、ポリオキシエチレンイソォクチルフエニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフエ -ルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルならびにポリオキシエチレンソルビトールエステルなどが挙げられる。これらの中でも、ポリオキシエチレンへキサデシルエーテルが極めて好ましい。またこれらの界面活性剤は水溶液として用い、一定のミセルサイズを有するものが望まし、。

[0050] なお、これらの界面活性剤の水溶液の溶媒は、緩衝液であってもよヽ。緩衝液としては、 pH7— 9程度に調整された緩衝液であることが好ましぐ例えばグッド緩衝液〔例えば、 HEPES (N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン N，— 2—エタンスルホン酸緩衝液） ,コラミンクロリド緩衝液， BES緩衝液， MOPS緩衝液， TES緩衝液， HEPPS緩衝液（N— 2—ヒドロキシェチルピペラジン N，— 3 プロパンスルホン酸）， Tricine緩衝液，グリシンアミド緩衝液， Bicine緩衝液， TAPS緩衝液等〕 ,トリス—塩酸緩衝液等を挙げることができる。 [0051] 「LAMを含有する試料」に共存させる界面活性剤の量は、界面活性剤の種類等に応じて適宜変更可能であり、特に限定されない。具体的な界面活性剤の濃度としては、「LAMを含有する試料」に接触した際の終濃度として、通常 0. 001%— 0. 8% ( W/V)、好ましくは 0. 003%— 0. 5% (W/V)、さらに好ましくは 0. 005%— 0. 3

% (wZv)等が例示される。

[0052] また、ここで用いることができる「抗結核抗体」は、結核菌の細胞壁に存在する LA Mに対して結合する抗体である限りにおいて特に限定されず、結核菌やその細胞壁成分等を抗原として公知の方法で製造したものであってもよぐ市販のものであってもよい。なかでも、結核菌の細胞壁に存在する LAMに特異的に結合する抗体が好ましい。

[0053] また、ここで用いることができる「抗 LAM抗体」は、 LAMに対して結合する抗体である限りにお、て特に限定されず、 LAMを抗原として公知の方法で製造したものであってもよぐ市販のものであってもよい。なかでも、 LAMに特異的に結合する抗体が好ましい。

[0054] これらの抗体は、免疫グロブリンの分子構造を完全に保持しているものは勿論、抗原結合部位 (Fab)を分解しないプロテアーゼ (例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で処理して Fabを含むフラグメントとしたものであっても良!、。抗体の Fabを含むフラグメントとしては、 Fab以外に、 Fabc、 (Fab')等が例示される。

2

[0055] また、抗体をコードする遺伝子の塩基配列や抗体のアミノ酸配列が決定されれば、遺伝子工学的にこれらの抗体の Fabを含むフラグメントやキメラ抗体を作製することもできる。以上のような、抗体の Fabを含むフラグメントやキメラ抗体も、本明細書における「抗体」の概念に包含される。

[0056] 「LAMを含有する試料」に共存させるこれらの抗体の量は、抗体の種類等に応じて適宜変更可能であり、特に限定されない。

また、ここで用いることができる「BG」も特に限定されないが、パキマン、カードラン、 CSBG (Candida albicans菌体由来の BG)等が例示される。なかでもパキマンが好ましい。また BGは、 β— 1, 3結合のみを含むものだけでなぐ β— 1, 6結合等で枝分かれしたものであってもょ、。 [0057] また、 BGは官能基等が修飾された誘導体であってもよい。このような誘導体としては、例えばカルボキシメチルイ匕された BGを例示することができる。なかでもカルボキシメチルカ一ドランが好まし、。

[0058] 「LAMを含有する試料」に共存させる BGやその誘導体の量は、これらの種類、分子サイズ等に応じて適宜変更可能であり、特に限定されない。

また、ここで用いることができる「G因子活性ィ匕阻害剤」も、リムルス試薬中に存在する G因子の活性ィ匕を阻害する作用を有する物質である限りにおいて特に限定されないが、例えば国際公開 WO90Z02951号パンフレットに記載されているポリダルコシド等が例示される。「LAMを含有する試料」に共存させる「G因子活性ィ匕阻害剤」の量は、「G因子活性ィ匕阻害剤」の種類等に応じて適宜変更可能であり、特に限定されない。

[0059] また、ここで用いることができる「強アルカリ性物質」も特に限定されないが、アルカリ金属水酸ィ匕物であることが好ましい。アルカリ金属水酸ィ匕物としては、水酸化ナトリウムゃ水酸化カリウム等が例示される。

[0060] また、ここで用いることができる「ポリミキシン B」、「コリスチン」、「コンカナパリン A」、「ヒスチジン」、「ヒスタミンは」、巿販のものを用いることもできる。

「LAMを含有する試料」にこれらの物質を共存させる際の順序や方法等は、これらの物質が修飾や破壊されることなく「LAMを含有する試料」中に存在することとなる限りにおいて、特に限定されない。

[0061] 「LAMを含有する試料」にこれらの物質を共存させる方法は、通常、「LAMを含有する試料」とこれらの物質とを十分混合することにより達成される。また、「LAMを含有する試料」とこれらの物質とを共存させる順序にっ、ては、リムルス試薬中にこれらの物質をカ卩えておヽて「LAMを含有する試料」との混合及び反応を同時に行ってもよ!ヽが、リムルス試薬と「LAMを含有する試料」とを接触させる前に予め「LAMを含有する試料」と混合されてヽる方が効果の点でより望まヽ。

[0062] 本発明反応性除去方法により、「LAMを含有する試料」中の LAMのリムルス試薬に対する反応性を特異的に除去することができる。

く 6 >本発明 Et測定方法本発明 Et測定方法は、リムルス試薬を用いる Etの測定方法において、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を本発明反応性除去方法で除去する工程を少なくとも含む、「LAMを含有する試料」中の Etの測定方法である。

[0063] 「リムルス試薬」や「LAMを含有する試料」についての説明は、前記 < 1 >の本発明 LAM測定方法と同様である。すなわち、このリムルス試薬も、 Et特異的リムルス試薬であることが好ましい。

[0064] また、本発明反応性除去方法については、前記く 5 >を参照されたい。ただし、ここではポリミキシン B、コリスチン、コンカナバリン八、ヒスチジン、ヒスタミン以外の物質を用いる必要がある。

[0065] 本発明 Et測定方法は、リムルス試薬を用いる Etの測定方法にぉ、て、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を本発明反応性除去方法で除去する工程を含む限りにおいて、他の工程を含んでいてもよい。

[0066] また、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を本発明反応性除去方法で除去するタイミングも特に限定されな、が、リムルス試薬と「LAMを含有する試料」とを接触させる前に、当該試料中の LAMのリムルス試薬に対する反応性を本発明反応性除去方法で除去する工程を置くことが好ましい。ここにいう「接触」についての説明は、前記

< 1 >の本発明 LAM測定方法と同様である。

[0067] 本発明 Et測定方法によれば、「LAMを含有する試料」中の LAMのリムルス試薬に対する反応性が除去されることから、当該試料中の Etを、 LAMの影響を受けることなく測定することができる。

[0068] Etによって引き起こされるリムルス反応の検知 ·測定は、公知の方法で行うことができる。例えば、比色法 (エンドポイントアツセィゃ力イネティックアツセィ）、ゲルイ匕法、比濁法 (エンドポイントアツセィゃ力イネティックアツセィ)等の公知の方法で、それぞれの方法に応じた検知 ·測定方法を採用することができる。

[0069] 前記の通り、本明細書において「測定」とは、定量的な測定のみならず、定性的な測定 (Etの存否の測定等)をも含む概念である。

Etの定量的な測定は、目的に応じて種々の方法を採用することができる。例えば、

Et濃度が既知の試料を用、て Et濃度とリムルス反応の強度との関係につ、て検量線や関係式を作成しておき、これを用いることによって厳密な定量を行うことができる

。また、厳密な定量が必要ない場合には、 2つ以上の試料についてその試料間の Et 量の多少を比較してもよい。 Etはリムルス反応を惹起させることから、リムルス反応の強度が高ければ、試料中の Et量も多いこととなる。

[0070] Etの定性的な測定は、リムルス反応の有無を検知することによって行うことができる

。 Etはリムルス反応を惹起させることから、リムルス反応が検知されれば、試料中に E tが存在することとなる。

< 7>本発明 Et関連疾患検知方法

本発明 Et関連疾患検知方法は、本発明 Et測定方法を用いることを特徴とする、 Et 関連疾患の検知方法である。

[0071] 本発明 Et関連疾患検知方法は、本発明 Et測定方法を、そのまま Et関連疾患の検知に応用したものである。

本発明 Et測定方法にっ、ては上記 < 6 >を参照された、。本発明 Et関連疾患検知方法では、本発明 Et測定方法における「LAMを含有する試料」として、 Etを含有し又は Etを含有していることが疑われる生体由来の試料を用いることとなる。

[0072] 検知対象とする Et関連疾患は、 Etに基づいて引き起こされる疾患である限りにおいて特に限定されない。例えば、 Et血症やグラム陰性菌感染症が例示される。

また「生体由来の試料」も特に限定されないが、体液であることが好ましい。体液は

、 Etが含有されて、る又はその可能性がある体液である限りにお、て特に限定されない。例えば、血液 (本明細書では、血清や血漿をも含む概念として用いる。）、尿、汗、唾液、涙液、関節液、喀痰、乳汁、髄液等を例示することができる。なかでも血液が好ましい。

[0073] なお、「生体由来の試料」として血液用いる場合は、血液中のリムルス反応妨害因子（セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター等）を公知の方法 (例えば、特開昭 58— 85162号公報等に記載の方法)で予め除去又は不活ィ匕しておくことが好ましい。

[0074] このような試料について、本発明 Et測定方法を用いることによって、 Et関連疾患の検知をすることができる。前記の通り、本明細書において「検知」とは、定性的な検知 (Et関連疾患の存否の検知)のみならず、定量的な検知 (Et関連疾患の悪性度の検知等)をも含む概念である。

[0075] Et関連疾患の定性的な測定は、リムルス反応の有無を検出することによって行うことができる。 Etはリムルス反応を惹起させることから、リムルス反応が検知されれば、 E t関連疾患であるか又はその疑いがあることになる。

[0076] Et関連疾患の定量的な測定は、目的に応じて種々の方法を採用することができる。例えば、 Et量が既知の試料を用いて Et量とリムルス反応の強度との関係について検量線や関係式を作成しておき、これを用いることによって厳密な定量を行うことができる。また、厳密な定量が必要ない場合には、 2つ以上の試料についてその試料間の Et量の多少を比較してもよい。 Etはリムルス反応を惹起させることから、リムルス反応の強度が高ければ試料中の Et量も多いこととなり、これに対応して Et関連疾患の悪性度が高、又はその疑、があると関連づけることができる。

く 8 >本発明 Et測定キット

本発明 Et測定キットは、リムルス試薬と下記の群力選ばれる 1又は 2以上の物質を構成成分として含む、 Etの測定キットである。

[0077] 界面活性剤、抗結核抗体、抗 LAM抗体、 BG、カルボキシメチル化された BG、 G 因子活性化阻害剤、強アルカリ性物質。

「リムルス試薬」、上記の各物質の説明については、前記の < 1 >及び < 5 >と同様である。すなわち、ここで用いるリムルス試薬も Et特異的リムルス試薬であることが好ましい。

[0078] 本発明 Et測定キットは、少なくとも「リムルス試薬」を構成成分として含んでいる限りにおいて、他の構成成分をさらに含んでいてもよい。このような構成成分としては、例えばブランクテスト用蒸留水，反応試薬溶解液、反応用緩衝液等を挙げることができる。さらに本発明 Et測定キットには、測定バッチ同士の実施レベルを一定水準に保つための陽性コントロール (QCコントロール)等を含有させることもできる。

[0079] これらの構成成分は、それぞれ別体の容器に収容し保存しておくことができる。

本発明 Et測定キットを用いた Etの測定は、前記く 6 >の本発明 Et測定方法に従つて行うことができる。

< 9 >本発明 Et関連疾患検知キット

本発明 Et関連疾患検知キットは、本発明 Et測定キットからなる、 Et関連疾患の検知キットである。本発明 Et測定キットの説明は、前記く 8 >を参照されたい。

[0080] 本発明 Et関連疾患検知キットの検知対象とする Et関連疾患の説明、及び、用いる「生体由来の試料」等の説明については、前記 < 7>の本発明 Et関連疾患検知方法と同様である。すなわち、検知対象とする Et関連疾患としては Et血症やグラム陰性菌感染症が例示され、用いる「生体由来の試料」は血液であることが好ましい。また、「生体由来の試料」として血液を用いる場合に、血液中のリムルス反応妨害因子（セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター等）を予め除去又は不活化しておくことが好ま、点についても、前記く 7 >と同様である。

[0081] 本発明 Et関連疾患検知キットを用いた Et関連疾患の検知は、前記 < 7>の本発明 Et関連疾患検知方法に従って行うことができる。

< 10 >本発明 BG測定方法

本発明 BG測定方法は、リムルス試薬を用いる BGの測定方法において、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を本発明反応性除去方法で除去する工程を少なくとも含む、「LAMを含有する試料」中の BGの測定方法である。

[0082] 「リムルス試薬」や「LAMを含有する試料」についての説明は、前記 < 1 >の本発明 LAM測定方法と同様である。

また、本発明反応性除去方法については、前記く 5 >を参照されたい。ただし、ここでは、 BG、カルボキシメチルイ匕された BG、 G因子活性ィ匕阻害剤以外の物質を用いる必要がある。

[0083] 本発明 BG測定方法は、リムルス試薬を用いる BGの測定方法において、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を本発明反応性除去方法で除去する工程を含む限り〖こおいて、他の工程を含んでいてもよい。

[0084] また、本発明反応性除去方法を適用するタイミング、「接触」についての説明等にっ、ても、前記く 6 >の本発明 Et測定方法と同様である。

本発明 BG測定方法によれば、「LAMを含有する試料」中の LAMのリムルス試薬に対する反応性が除去されることから、当該試料中の BGを、 LAMの影響を受けることなく測定することができる。

[0085] BGによって引き起こされるリムルス反応の検知 ·測定に関する説明、「測定」についての説明等も、前記く 6 >の本発明 Et測定方法と同様である。

< 11 >本発明真菌症検知方法

本発明真菌症検知方法は、本発明 BG測定方法を用いることを特徴とする、真菌症の検知方法である。

[0086] 本発明真菌症検知方法は、本発明 BG測定方法を、そのまま真菌症の検知に応用したものである。

本発明 BG測定方法については上記 < 10 >を参照されたい。本発明真菌症検知方法では、本発明 BG測定方法における「LAMを含有する試料」として、 BGを含有し又は BGを含有していることが疑われる生体由来の試料を用いることとなる。

[0087] 検知対象とする真菌症は、真菌症のカテゴリーに分類される疾患である限りにおいて特に限定されない。例えば、深在性真菌感染症等が例示される。

「生体由来の試料」の説明については、前記 < 7>の本発明 Et関連疾患検知方法と同様である。「生体由来の試料」として血液用いる場合は、血液中のリムルス反応妨害因子（セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼインヒビター等）を公知の方法 (例えば、特開昭 58— 85162号公報等に記載の方法)で予め除去又は不活ィ匕しておくことが好まし!/、点についても、前記 < 7 >と同様である。

[0088] このような試料について、本発明 BG測定方法を用いることによって、真菌症の検知をすることができる。

「検知」の説明等についても、前記 < 7 >と同様である。

< 12 >本発明 BG測定キット

本発明 BG測定キットは、リムルス試薬と下記の群力選ばれる 1又は 2以上の物質を構成成分として含む、 BGの測定キットである。

[0089] 界面活性剤、抗結核抗体、抗 LAM抗体、強アルカリ性物質、ポリミキシン B、コリスチン、コンカナバリン八、ヒスチジン、ヒスタミン。

「リムルス試薬」、上記の各物質の説明については、前記の < 1 >及び < 5 >と同様である。ただし、ここで用いるリムルス試薬は、 BG特異的リムルス試薬であることが好ましい。

[0090] 本発明 BG測定キットは、少なくとも「リムルス試薬」を構成成分として含んでいる限りにおいて、他の構成成分をさらに含んでいてもよい。このような構成成分の説明等は

、上記く 8 >の本発明 Et測定キットと同様である。

[0091] 本発明 BG測定キットを用いた BGの測定は、前記 < 10>の本発明 BG測定方法に従って行うことができる。

く 13 >本発明真菌症検知キット

本発明真菌症検知キットは、本発明 BG測定キットからなる、真菌症の検知キットである。本発明 BG測定キットの説明は、前記く 12>を参照されたい。

[0092] 本発明真菌症検知キットの検知対象とする真菌症の説明、及び、用いる「生体由来の試料」等の説明につ、ては、前記 < 11 >の本発明真菌症検知方法と同様である

。すなわち、検知対象とする真菌症としては深在性真菌感染症が例示され、用いる「生体由来の試料」は血液であることが好ましい。また、「生体由来の試料」として血液を用いる場合に、血液中のリムルス反応妨害因子 (セリンプロテアーゼ、セリンプロテァーゼインヒビター等）を予め除去又は不活ィ匕しておくことが好ましい点についても、前記く 11 >と同様である。

[0093] 本発明真菌症検知キットを用いた真菌症の検知は、前記 < 11 >の本発明真菌症検知方法に従って行うことができる。

く 14 >本発明結合剤

さらに本発明は、下記の群力選ばれる 1又は 2以上の物質を有効成分とする、 LA

Mに対する結合剤 (以下、本発明結合剤という。）を提供する。

[0094] 抗結核抗体、抗 LAM抗体、 (1→3) βーグルカン、カルボキシメチル化された ( 1

→3) j8—グルカン、 G因子活性化阻害剤、ポリミキシン B、コリスチン、コンカナバリン k ヒスチジン、ヒスタミン。

[0095] 上記の各物質の説明については、前記の < 5 >と同様である。

また本発明結合剤は、前記の物質群の少なくとも 1つを有効成分として含んでいる限りにおいて、他の物質を含んでいてもよい。ここにいう「他の物質」は、本発明結合剤の有効成分である物質の LAMに対する結合作用を、実質的に害しないものである限りにおいて特に限定されない。このような「他の物質」としては、例えば通常の医薬又は試薬の調製に用いられる賦形剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等のうち、本発明結合剤中の有効成分物質の LAMに対する結合作用を実質的に害しな!/、ものが挙げられる。

[0096] なお、本明細書において「LAMに対する結合剤」という用語は、当該剤中の有効成分物質を LAMに結合させるために用いられる剤を意味するものとして用いる。そして本発明結合剤は、その有効成分物質が LAMに結合することから、例えば L AMの検知 ·測定や LAMの除去等に用いることができる。

[0097] すなわち、本発明結合剤を LAMに接触 (本発明結合剤中の有効成分物質の分子と、 LAM分子とを接触）させ、その後、 LAMに結合した有効成分物質を直接又は溶出させて力も検出することにより、 LAMの検知 '測定を行うことができる。この場合、本発明結合剤中の有効成分物質は、何らかの特殊なシグナルとして検出しうる物質 ( 例えば、酵素、放射性同位元素、蛍光色素、化学発光物質、ハプテン、金属粒子、特異的結合対など)で標識されて、てもよ!、。標識する方法やその検知 ·測定方法も特に限定されず、公知の手法を用いることができる。

[0098] また、本発明結合剤を不溶性の担体に固着 (本発明結合剤中の有効成分物質の分子を不溶性の担体に固相ィ匕）させ、これを LAMを含有する溶液に接触させることで固相化された有効成分物質分子に LAMを結合させ、その後有効成分物質が固着された担体を溶液と分離することによって、溶液中の LAMを除去することができる。本発明結合剤中の有効成分物質を固着させる担体及び固着方法は特に限定されず、公知の手法を用いることができる。

[0099] したがって、本発明は、下記の群力も選ばれる 1又は 2以上の物質を用いることを特徴とする LAMの検知 ·測定方法、下記の群力選ばれる 1又は 2以上の物質を構成成分として含む LAMの測定キット、下記の群力選ばれる 1又は 2以上の物質が固着された担体を用いることを特徴とする LAMの除去方法、及び、下記の群から選ばれる 1又は 2以上の物質が固着された担体を含む LAMの除去剤（吸着除去剤)等の概念をも包含する。抗結核抗体、抗 LAM抗体、 (1→3) βーグルカン、カルボキシメチル化された ( 1 →3) j8—グルカン、 G因子活性化阻害剤、ポリミキシン B、コリスチン、コンカナバリン k ヒスチジン、ヒスタミン。

< 15 >本発明の具体的な実施態様の例

例えば、以下に示す具体的な実施態様は、いずれも本発明に包含されるものである。なお、以下の態様はあくまで例示であって、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるものではない。

(1) LAMを含有する試料中の Et活性 (濃度）を、共存している LAMの影響を受けることなく測定する方法であって、当該試料を予め界面活性剤、パキマン、抗結核死菌体抗体及び抗 LAM抗体カゝら選ばれる少なくとも 1つの物質と接触させてから、 Et特異的リムルス試薬で測定する方法。

(2) LAMを含有する試料中の LAM活性 (濃度）を、共存してヽる Etの影響を受けることなく測定する方法であって、当該試料を予め加熱してから、 Et特異的リムルス試薬で測定する方法。

(3)上記（1)の方法で血中の Et濃度を測定し、 Et血症又はグラム陰性菌感染症を検知する方法。

(4)上記（2)の方法で血中の LAM濃度を測定し、結核感染を検知する方法。

(5) LAMを含有する試料中の Et活性 (濃度）を、共存してヽる LAM及び BGの影響を受けることなく測定する方法であって、当該試料を予め界面活性剤及び G因子活性ィ匕阻害剤と接触させてから、 Etと BGの両方に反応するリムルス試薬で測定する方法。

(6) LAMを含有する試料中の Et活性 (濃度）を、共存してヽる LAM及び BGの影響を受けることなく測定する方法であって、当該試料を予めパキマン及び G因子活性ィ匕阻害剤と接触させてから、 Etと BGの両方に反応するリムルス試薬で測定する方法。

(7) LAMを含有する試料中の Et活性 (濃度）を、共存してヽる LAM及び BGの影響を受けることなく測定する方法であって、当該試料を予め抗結核死菌体抗体及び G 因子活性ィ匕阻害剤と接触させてから、 Etと BGの両方に反応するリムルス試薬で測定する方法。 (8) LAMを含有する試料中の Et活性 (濃度）を、共存してヽる LAM及び BGの影響を受けることなく測定する方法であって、当該試料を予め抗 LAM抗体及び G因子活性ィ匕阻害剤と接触させてから、 Etと BGの両方に反応するリムルス試薬で測定する方法。

(9) LAMを含有する試料中の Et活性 (濃度）を、共存してヽる LAM及び BGの影響を受けることなく測定する方法であって、当該試料を予め界面活性剤及びカードラン (及び/又はカルボキシメチルカードラン）と接触させてから、 Etと BGの両方に反応するリムルス試薬で測定する方法。

(10) LAMを含有する試料中の Et活性 (濃度）を、共存してヽる LAM及び BGの影響を受けることなく測定する方法であって、当該試料を予めパキマン及びカードラン（及び Z又はカルボキシメチルカードラン）と接触させてから、 Etと BGの両方に反応するリムルス試薬で測定する方法。

(11) LAMを含有する試料中の Et活性 (濃度）を、共存して!/ヽる LAM及び BGの影響を受けることなく測定する方法であって、当該試料を予め抗結核死菌体抗体及びカードラン (及び/又はカルボキシメチルカードラン）と接触させてから、 Etと BGの両方に反応するリムルス試薬で測定する方法。

(12) LAMを含有する試料中の Et活性 (濃度）を、共存して!/ヽる LAM及び BGの影響を受けることなく測定する方法であって、当該試料を予め抗 LAM抗体及びカードラン (及び/又はカルボキシメチルカードラン）と接触させてから、 Etと BGの両方に反応するリムルス試薬で測定する方法。

(13) LAMを含有する試料中の LAM活性 (濃度）を、共存している Et及び BGの影響を受けることなく測定する方法であって、当該試料を予め G因子活性ィ匕阻害剤の存在下で加熱してから、 Etと BGの両方に反応するリムルス試薬で測定する方法。

(14) LAMを含有する試料中の LAM活性 (濃度）を、共存してヽる Et及び BGの影響を受けることなく測定する方法であって、当該試料を予めカードラン及び Z又は力ルボキシメチルカ一ドランの存在下で加熱してから、 Etと BGの両方に反応するリムルス試薬で測定する方法。

(15)上記（13)及び（14)における「LAMを含有する試料」として血漿または血清を用いることにより血中の LAM活性 (濃度）を測定し、結核感染を検知する方法。

(16)血漿又は血清を、予め界面活性剤、「パキマン、抗結核死菌体抗体及び抗 LA M抗体力も選ばれる少なくとも 1つの物質」及び「G因子活性ィ匕阻害剤、カードラン及びカルボキシメチルカードランカゝら選ばれる少なくとも 1つの物質」を含む水溶液で希釈し、加熱してから、 Etと BGの両方に反応するリムルス試薬で測定することによって、共存して、る LAM及び BGの影響を受けることなく血中の Et活性 (濃度）を測定し

、 Et血症又はグラム陰性菌感染症を検知する方法。

(17)血漿又は血清を、予め界面活性剤及び「パキマン、抗結核死菌体抗体及び抗 LAM抗体カゝら選ばれる少なくとも 1つの物質」を含む水溶液で希釈し、加熱してから、 Et特異的リムルス試薬で測定することによって、共存している LAM及び BGの影響を受けることなく血中の Et活性 (濃度）を測定し、 Et血症又はグラム陰性菌感染症を検知する方法。

(18)血漿又は血清を、予めポリミキシン Bの存在下で加熱してから、 Etと BGの両方に反応するリムルス試薬で測定することによって、共存してヽる LAM及び Etの影響を受けることなく血中の BG活性 (濃度)を測定し、深在性真菌感染症を検知する方法。

(19)本発明結合剤の有効成分物質 (標識したもの)の分子と、 LAM分子とを接触させ、その後、 LAMに結合した当該物質（当該標識)を直接又は溶出させて力検出することにより、 LAMの検知'測定を行う方法。

(20)本発明結合剤の有効成分物質の分子を不溶性の担体に固相化し、これを LA Mを含有する溶液に接触させ、その後当該担体を溶液と分離して除去することによる、溶液中の LAMを除去する方法。

以下に、本発明の実施例を具体的に説明する。し力しながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるものではな、。

なお、本実施例で使用した LAMは、ヒト型結核菌（青山 B株; Mycobacterium tuberculosis Aoyama-B)株の死菌体から有機溶媒抽出とカラムクロマトグラフィーで高純度に単離精製した LAMけ力ライテスタ株式会社販売)である。

実施例 1 [0102] この LAMを、 200ngZmLとなるように蒸留水（Et及び BGフリー）に溶解して、 LA Mを含有する試料を作成した。この試料に以下の各種の処理を施した後、その 25 Lを Et及び BGフリーのマイクロタイタープレート（トキシペットプレート 96F、生化学ェ業株式会社販売）中で Et特異的リムルス試薬 (商品名エンドスペック ESテスト MK 、生化学工業株式会社販売） 100 Lと混合し、マイクロプレートリーダー（ゥエルリ一ダー SK603、生化学工業株式会社販売）内で 37°Cで 30分間測定した。

[0103] その後、 1分間当たりの吸光度 [A405nm- 492 (対照波長）]変化率 (mAbs/min) 力リムルス反応の程度を算出し、無処理の試料 (コントロール）と比較した。

なお、ここで用いたリムルス試薬は、 G因子の反応性を喪失させることにより C因子のみが活性ィ匕されうるように処理してある（Etにのみ反応するように処理してある）。従つて、ここでリムルス反応が検知されたとすれば、 C因子が活性ィ匕されたこと（添加した試料には、 C因子活性ィ匕能があること)を意味することとなる。

(処理）

'ポリミキシン B処理 (LAM含有試料に、終濃度が lmg/mLとなるようにポリミキシン B硫酸塩 (Sigma社)を等量添加して混合した。 )

•酸加熱処理 (LAM含有試料に、終濃度が 0. 2Mとなるように HC1水溶液を等量添カロして混合し、 37°Cで 60分間インキュベートした。 )

'アルカリ加熱処理 (LAM含有試料に、終濃度が 0. 2Mとなるように KOH水溶液を等量添加して混合し、 37°Cで 60分間インキュベートした。 )

•煮沸処理 (LAM含有試料を 60分間煮沸した。 )

•界面活性剤処理 (LAM含有試料に、終濃度が 0. 005— 0. 5%となるように各種の非イオン性界面活性剤（Brij 56 Triton- N- 101 Triton

X-405 Triton X-114又は Tergitol NP-9)を等量添カ卩して混合した。 )

• BG処理 (LAM含有試料に、終濃度が 50pg/mLとなるようにパキマンを等量添加して混合した。 )

'コンカナパリン A処理（湿重量 0. 25gのコンカナパリン A(Con A)セファロース 4B (ァマシャム 'バイオサイエンス社販売）に LAM水溶液 lmLを添カ卩し、混合した後、 3, 0 OOrpmで 10分間遠心分離して得られる上清を用いた。 ) '抗結核抗体に対する反応性 (LAMの抗結核抗体 (抗ヒト型結核死菌体モノクロ一ナル抗体)に対する反応性を検討した。 )

'抗じ因子抗体処理 (LAM含有試料に、「Et特異的リムルス試薬 (商品名：エンドスペック ESテスト MK、生化学工業株式会社販売） 1バイアルに、マウス抗 C因子モノクローナル抗体（2C12 ;腹水）の 20倍希釈液 140 /z 1を添加した溶液」を添加して、リムノレス反応を行ったもの。 )

結果を表 1に示す。なお、表 1中の「 +」は反応が検知されたことを示し、表 1中で具体的な数値を示してあるものは、無処理の試料 (コントロール）における反応性を 100 %としたときの相対値を意味する。

[0104] [表 1] 表 1

無処理の試料（コントロール） +

ポリミキシン B処理 7.5% 酸加熱処理 72.0% アルカリ加熱処理 0¾

煮沸処理 44.4% 界面活性剤処理 0%

B G処理 1.6% コンカナバリン A処理 5.7¾ 抗結核抗体に対する反応性 +

抗 C因子抗体処理 0%

[0105] この結果から、 LAMがリムルス試薬に対して反応性を有する（C因子活性ィ匕能を有する）ことが明らかになった。したがって、リムルス試薬を用いて LAMの測定や、 LA Mを細胞壁成分として保持する抗酸菌の検知が可能であることが示された。

[0106] また、 LAMが有するリムルス試薬反応性は、ポリミキシン B、強アルカリ性物質、各種の非イオン性界面活性剤、 BG、コンカナノリン A等によって消失又は低減させることができることが明ら力となった。

[0107] また、 LAMが抗結核抗体に反応することが確認されたことから、 LAM含有試料を抗結核抗体と反応させておくことによつても、 LAMのリムルス試薬に対する反応性を消失又は低減させることができることが示唆された。

[0108] さらに、 LAMが抗結核抗体やコンカナノリン A等と結合することが示されたことから、これらを用いて LAMの除去等もできることが示された。

したがって、 LAM含有試料をこのような物質で処理することによって、 LAMの影響を受けずに Etや BGの測定ができることが示された。さらに、これによつて LAMの影響を受けずに Et関連疾患や真菌症の検知もできることが示された。さらに、抗結核抗体ゃコンカナパリン A等を LAMの結合剤として用いたり、 LAMの除去等に用いることがでさることち示された。

実施例 2

[0109] (1)本発明 LAM測定キット (本発明抗酸菌検知キット）の製造例

以下の構成試薬カゝらなるキットを作製した。

A. Et特異的比色法リムルス試薬

カブトガ- (タキプレウス ·トリデンタツス）の血球 (ァメボサイト）力も国際公開 WO90 Z02951号パンフレットの参考例 3に記載の方法に従って調製した G因子の反応性を喪失させたライセートと、発色合成基質 (Boc-Leu-Gly-Arg-pNA)等を含む凍結乾燥品。

B.蒸留水（Etフリー）

ブランクテスト、陽性コントロールの溶解と希釈、及び検体の希釈等に用いる。

C.緩衝液

0. 2モル/ Lトリス-塩酸緩衝液 (pH 8. 0)。リムルス試薬の溶解及び反応に用いる。

D.陽性コントロール

LAMを含有する凍結乾燥品。

[0110] 検体を予め前記「く 1 >本発明 LAM測定方法」に記載の方法で加熱してから、本キットを用いてリムルス反応を行わせることによって、検体中の LAM (抗酸菌）を Etの影響を受けることなく測定'検知できる。

(2)本発明 Et測定キット (本発明 Et関連疾患検知キット）の製造例以下の構成試薬カゝらなるキットを作製した。

A. Et特異的比色法リムルス試薬

エンドスペック ESテスト MK (商品名；生化学工業株式会社販売）を用いる。

B.蒸留水（Etフリー）

C.緩衝液

D.陽性コントロール

大腸菌 0111： B4株由来の Etを含有する凍結乾燥品。

E.血液前処理液

第 1液： 0. 2モル ZL KOH、 0. 2%ポリプレン

第 2液： 0. 2% Triton X- 100、 0. 14%エチレンィミンポリマー、 0. 02モル/ L Ca C1、 0. 06モノレ ZLビシン

2

この前処理液は、検体として血漿又は血清を用いる際に、その中のリムルス反応妨害因子を不活ィ匕するために用いる。使用直前に、第 1液と第 2液とを混合する。

F.界面活性剤

Tergitol NP-9を 0. 01%含有する水溶液。

[0111] 界面活性剤は、 LAMのリムルス試薬反応性の除去のために用いる。すなわち、検体 (血液検体の場合は、血液前処理液で処理したもの）を予めこの界面活性剤で処理し、その後にリムルス反応を行わせることによって、 Et (Et関連疾患）を、 LAMの影響を受けることなく測定'検知できる。

[0112] 本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。

[0113] 本出願は、 2003年 12月 22日出願の日本特許出願（特願 2003-425472)に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。産業上の利用可能性

[0114] 本発明 LAM測定方法、本発明抗酸菌検知方法、本発明 LAM測定キット及び本発明抗酸菌検知キットは、 LAMや抗酸菌の測定'検知に利用することができる。また、本発明反応性除去方法は、リムルス反応における LAMの影響の除去に利用することができる。

[0115] また、本発明 Et測定方法、本発明 Et関連疾患検知方法、本発明 Et測定キット及び本発明 Et関連疾患検知キットは、 Etや Et関連疾患の測定'検知に利用することができる。

[0116] また、本発明 BG測定方法、本発明真菌症検知方法、本発明 BG測定キット及び本発明真菌症検知キットは、 BGや真菌症の測定'検知に利用することができる。

また、本発明結合剤は、 LAMの検知'測定、これに用いるキット、 LAMの除去方法及び LAMの除去剤（吸着除去剤)等に利用することができる。

Claims

請求の範囲

[I] リムルス試薬と「リポアラビノマンナンを含有する試料」とを接触させる工程を少なくとも含む、当該試料中のリポアラビノマンナンの測定方法。

[2] リムルス試薬との接触前に、「リポアラビノマンナンを含有する試料」を加熱する工程をさらに含む、請求項 1に記載の測定方法。

[3] リムルス試薬力エンドトキシン特異的リムルス試薬である、請求項 2に記載の測定方法。

[4] 請求項 1一 3のいずれか 1項に記載の測定方法を用いることを特徴とする、抗酸菌の検知方法。

[5] 抗酸菌が、結核菌である、請求項 4に記載の検知方法。

[6] リムルス試薬を構成成分として含む、リポアラビノマンナンの測定キット。

[7] リムルス試薬力エンドトキシン特異的リムルス試薬である、請求項 6に記載のキット

[8] 請求項 6又は 7に記載のキットからなる、抗酸菌の検知キット。

[9] 抗酸菌が、結核菌である、請求項 8に記載の検知キット。

[10] 「リポアラビノマンナンを含有する試料」に、下記の群力選ばれる 1又は 2以上の物質を共存させる工程を少なくとも含む、当該試料中のリポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反応性を除去する方法；

界面活性剤、抗結核抗体、抗リポアラビノマンナン抗体、（1→3)— 18—グルカン、力ルボキシメチルイ匕された（1→3)— 18 -グルカン、 G因子活性ィ匕阻害剤、強アルカリ性物質、ポリミキシン B、コリスチン、コンカナバリン八、ヒスチジン、ヒスタミン。

[II] リムルス試薬を用いるエンドトキシンの測定方法において、リポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反応性を請求項 10に記載の方法で除去する工程を少なくとも含む、「リポアラビノマンナンを含有する試料」中のエンドトキシンの測定方法。

[12] リムルス試薬力エンドトキシン特異的リムルス試薬である、請求項 11に記載の測定方法。

[13] 請求項 11又は 12に記載の測定方法を用いることを特徴とする、エンドトキシン関連疾患の検知方法。

[14] リムルス試薬と下記の群から選ばれる 1又は 2以上の物質を構成成分として含む、エンドトキシンの測定キット；

界面活性剤、抗結核抗体、抗リポアラビノマンナン抗体、（1→3)— 18—グルカン、力ルボキシメチルイ匕された（1→3)— 18 -グルカン、 G因子活性ィ匕阻害剤、強アルカリ性物質。

[15] リムルス試薬力エンドトキシン特異的リムルス試薬である、請求項 14に記載のキッ

[16] 請求項 14又は 15に記載のキットからなる、エンドトキシン関連疾患の検知キット。

[17] リムルス試薬を用いる（1→3)— |8—グルカンの測定方法において、リポアラビノマンナンのリムルス試薬に対する反応性を請求項 10に記載の方法で除去する工程を少なくとも含む、「リポアラビノマンナンを含有する試料」中の（1→3)— ーグルカンの測定方法。

[18] リムルス試薬力（1→3)— 18 -グルカン特異的リムルス試薬である、請求項 17に記載の測定方法。

[19] 請求項 17又は 18に記載の測定方法を用いることを特徴とする、真菌症の検知方法。

[20] リムルス試薬と下記の群から選ばれる 1又は 2以上の物質を構成成分として含む、 (

1→3)— j8—グルカンの測定キット；

界面活性剤、抗結核抗体、抗リポアラビノマンナン抗体、強アルカリ性物質、ポリミキシン B、コリスチン、コンカナノリン A、ヒスチジン、ヒスタミン。

[21] リムルス試薬力（1→3)— |8—グルカン特異的リムルス試薬である、請求項 20に記載のキット。

[22] 請求項 20又は 21に記載のキットからなる、真菌症の検知キット。

[23] 下記の群力も選ばれる 1又は 2以上の物質を有効成分とする、リポアラビノマンナンに対する結合剤；

抗結核抗体、抗リポアラビノマンナン抗体、（1→3)— 18 -グルカン、カルボキシメチルイ匕された（1→3)— 18—グルカン、 G因子活性ィ匕阻害剤、ポリミキシン B、コリスチン、コンカナバリン八、ヒスチジン、ヒスタミン。