JP3825812B2 - 固体表面の処理剤 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は医療用具、医薬品容器等の固体表面からエンドトキシン及び／または（１→３）−β−Ｄ−グルカン（これらを包括して、後に定義するように「リムルス反応性物質」という）を簡便かつ効率良く遊離させるための方法、その方法に用いる処理剤、その処理剤の使用及びカブトガニ・アメボサイト・ライセートを用いたリムルス反応によるリムルス反応性物質の測定において、医療用具、医薬品容器等の固体表面からエンドトキシン及び／または（１→３）−β−Ｄ−グルカンを簡便かつ効率良く遊離させることにより、エンドトキシン及び／または（１→３）−β−Ｄ−グルカンの検出感度を著しく高め、該医療用具、医薬品容器等の適切な安全性評価を可能にする測定法に関する。
背景技術
カブトガニ・アメボサイト・ライセート（以下単にライセートともいう）のＣ因子を利用して、発熱物質であるエンドトキシンを測定する方法が知られており、ウサギの発熱性試験の代替法として公定法にも採用されている。この方法は、微量のエンドトキシンによりライセートが凝固することに基づいているが、その後の生化学的解明により、該反応はいくつかの凝固因子の段階的活性化より成ることが明らかにされている（図１）（中村隆範、日本細菌学雑誌、３８、７８１ー８０３（１９８３））。この反応の引き金となるエンドトキシンは、グラム陰性菌細胞壁の外膜成分で、リポ多糖（ＬＰＳ）ともよばれており、親水性の糖鎖と疎水性のリポドＡ部分が分子内に局在した両親媒性物質である。
エンドトキシンは、生体内では微量でも発熱作用があり、ＴＮＦ、ＩＬ−１等の炎症性サイトカインの遊離やショックの誘発ならびに致死作用等様々な生物活性（毒性）が知られており、人体への混入は極力避けねばならない。ＦＤＡは１９７８年にウサギ発熱性試験の代替法としてのリムルステストによるエンドトキシン試験のガイドラインを作成したが、それ以降、医薬品の安全性試験に本テストが広く適用されるに至っている。
エンドトキシンのサブユニットは、通常の条件では、疎水結合、イオン結合等で巨大な分子集合状態（会合体）を形成し、蛋白や脂質等とも複雑なミセルを形成することが知られており、このミセル構造は、リムルス反応にも大きく影響し、最大活性を示す分子サイズとそのミセル構造が存在する。また、両親媒性であるエンドトキシンはその親水基と疎水基を介して、種々の物質や担体に吸着する。特に、プラスチックには、条件によっては強く吸着する性質を有する。従って、プラスチック器具に吸着したエンドトキシンは、単に蒸留水のみでは全く遊離されず、体液たとえば血液等に接触してはじめて遊離することもあり得るため、従来の蒸留水による遊離液を用いてリムルステストでこれら器具のエンドトキシン汚染を検出する方法ではエンドトキシンが正確に検出できない危険性も指摘されている。そのため、たとえエンドトキシン汚染があっても、従来の試験法では適合するケースがあり、人体とりわけ免疫能が低下した易感染性患者へのこれら医療用具の適用は、医療上大きな問題を提起することになる。
さらに、外科領域や救急医療の場においても、エンドトキシンの日常管理は、感染症、とくに敗血症の病態把握と治療及び予後の判定、術後のモニタリング等にきわめて重要となっており、血液透析患者における透析液の安全管理にも不可欠な項目である。そのため、治療を主たる目的とした医療用具の安全性には特に厳重な注意が必要である。
一方、ライセートのＧ因子を利用して、エンドトキシンとは別に（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定する方法が知られている。この反応の引き金となる（１→３）−β−Ｄ−グルカンは、酵母、キノコ、カビ等の真菌類及び高等植物の細胞壁成分として、自然界に広く分布し、マクロファージからのＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６等のサイトカインの産生誘導、（１→３）−β−Ｄ−グルカンリセプターを介した補体系の活性化、網内系の活性化、抗腫瘍作用等の多彩な生物活性を示す。また、エンドトキシンの作用を高める相乗効果を有する場合もあるため、種々医薬品ならびに医療用具等への（１→３）−β−Ｄ−グルカンの混入も医療上重要な問題になりつつある。
薬事法により定められている医療用具基準におけるリムルス試験に供する試料溶液の調製法として、各種の加熱温度と加熱時間が記載されているが、大部分が苛酷な抽出条件（７０℃など）を採用しており、また対象医療用具ごとにその方法が異なっている。さらに、低濃度のエンドトキシンの場合、特にこれらの処理に伴うエンドトキシンの不活化という問題が指摘されており、該用具に付着または吸着されている活性なエンドトキシン濃度を正確に測定すること、即ち、適切な安全性評価が困難である(ジャーナル・オブ・アンチバクテリアル アンチファンガス エージェンツ（J.Antibact.Antifung.Agents), 19, 561-566(1991)）という問題があった。また、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）やグロブリンを抽出剤として用いるエンドトキシン測定法が知られている（特開平５ー２５５４０５）が、アルブミンやグロブリン溶液自体からエンドトキシンを除去あるいは失活させる操作が煩雑で、かつこれら操作を確実に行うことが困難である点やヒト由来の病原性微生物（ＨＩＶ、マイコプラズマ等）が、抽出剤に混入する危険性もあるという問題があり、実用的方法とは言えないものであった。更に、該抽出剤は、貴重な血液から調製されるため価格も高くかつ貴重な資源の有効な利用とは言えないものである。
本発明は、医療用具、医薬品容器等の固体表面に付着または吸着したリムルス反応性物質を簡便かつ効率良く遊離させ得る衛生上安全で低価格な方法、その方法に用いる処理剤、その処理剤の使用とそれを用いたリムルス反応性物質の測定法を提供するものである。
発明の開示
本発明は、以下の構成からなる。
１）リムルス反応性物質が付着又は吸着した固体表面にクエン酸塩、アミノポリカルボン酸及びその塩からなる群から選択されるキレート剤並びに／又は界面活性剤のみをリムルス反応性物質を遊離させるための有効成分として含有する処理剤を接触させ、リムルス反応性物質を遊離させることを特徴とする固体表面の処理方法。
２）リムルス反応性物質がカブトガニ・アメボサイト・ライセートのＣ因子系を活性化する物質又はＧ因子系を活性化する物質であることを特徴とする前記１」に記載の固体表面の処理方法。
３）Ｃ因子系を活性化する物質がエンドトキシンであり、Ｇ因子系を活性化する物質が（１→３）−β−Ｄ−グルカンであることを特徴とする前記２）に記載の固体表面の処理方法。
４）界面活性剤が非イオン性界面活性剤又は陰イオン性界面活性剤であることを特徴とする前記１）〜３）の何れか１項に記載の固体表面の処理方法。
５）非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン類及びポリエチレングリコールから選択されることを特徴とする前記４）に記載の固体表面上の処理方法。
６）陰イオン性界面活性剤がアルキル硫酸塩であることを特徴とする前記４）に記載の固体表面の処理方法。
７）アミノポリカルボン酸が、エチレンジアミン４酢酸、ジアミノプロパン４酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン３酢酸、グリコールエーテルジアミン４酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ−２酢酸、ニトリロ３酢酸、ジエチレントリアミン５酢酸及びそれらの塩から選択されることを特徴とする前記１）〜３）の何れか１項に記載の固体表面の処理方法。
８）有効成分がエチレンジアミン４酢酸、その塩及びポリエチレングリコールからなることを特徴とする前記１）に記載の固体表面の処理方法。
９）有効成分がポリオキシエチレンソルビタン類、ポリエチレングリコール及びエチレンジアミン４酢酸又はその塩からなることを特徴とする前記１）に記載の固体表面の処理方法。
１０）有効成分がポリオキシエチレンソルビタン類及びポリエチレングリコールからなることを特徴とする前記１）に記載の固体表面の処理方法。
１１）固体表面が合成樹脂、天然樹脂、合成繊維、天然繊維、金属及びガラスから選択される表面であることを特徴とする前記１）〜１０）の何れか１項に記載の固体表面の処理方法。
１２）リムルス反応性物質が付着又は吸着した固体表面からリムルス反応性物質を遊離させるために用いられ、クエン酸塩、アミノポリカルボン酸及びその塩からなる群から選択されるキレート剤並びに／又は界面活性剤のみをリムルス反応性物質を遊離させるための有効成分として含有することを特徴とする固体表面の処理剤。
１３）有効成分がエチレンジアミン４酢酸、その塩及びポリエチレングリコールからなることを特徴とする前記１２）に記載の固体表面の処理剤。
１４）有効成分がポリオキシエチレンソルビタン類、ポリエチレングリコール及びエチレンジアミン４酢酸又はその塩からなることを特徴とする前記１２）に記載の固体表面の処理剤。
１５）有効成分がポリオキシエチレンソルビタン類及びポリエチレングリコールからなることを特徴とする前記１２）に記載の固体表面の処理剤。
１６）ポリオキシエチレンソルビタン類がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート及びポリオキシエチレンエーテルモノステアレートから選択されることを特徴とする前記１４）又は１５）に記載の固体表面の処理剤。
１７）リムルス反応性物質が付着又は吸着した固体表面から、リムルス反応性物質を遊離させる処理へのクエン酸塩、アミノポリカルボン酸及びその塩からなる群から選択されるキレート剤並びに／又は界面活性剤のみをリムルス反応性物質を遊離させるための有効成分とする処理剤の使用。
１８）リムルス反応性物質が付着又は吸着した固体表面をクエン酸塩、アミノポリカルボン酸及びその塩からなる群から選択されるキレート剤並びに／又は界面活性剤のみをリムルス反応性物質を遊離させるための有効成分として含有する処理剤で処理して得られた処理液にリムルス試薬を作用させることを特徴とするリムルス反応性物質の測定法。
本発明において、キレート剤及び／又は界面活性剤を有効成分とする処理剤により種々材質の医療用具、医薬品容器等の表面を処理し、器材の表面に付着又は吸着したリムルス反応性物質、即ち、エンドトキシン及び／又は（１→３）−β−Ｄ−グルカンを簡便かつ効率良く遊離させることができる（以下、前記処理剤を「本発明の処理剤」ともいう）。
また、本発明は、本発明の処理剤により固体表面を処理した処理液にリムルス試薬を作用させてリムルス反応性物質を精度良く測定することができる。なお、本発明の処理剤は、水溶液の状態で、長期間安定したリムルス反応性物質の遊離効果を示す。
本発明において「リムルス反応性物質」とは、ライセート成分に作用し、リムルス反応を惹起させる物質を意味し、Ｃ因子系（成分として少なくともＣ因子、Ｂ因子及び／又は凝固酸素前駆体を含む）を活性化するエンドトキシン及びＧ因子系（成分として少なくともＧ因子及び／又は凝固酵素前駆体を含む）を活性化する（１→３）−β−Ｄ−グルカンなどを意味する。
ライセートは、カブトガニのアメボサイト（血球細胞）をホモゲナイザー等適当な方法により抽出することにより調製される。
また、本発明のリムルス反応性物質の測定法に使用されるリムルス試薬としては、ライセートを原料として得られた試薬であれば、いずれも使用できる。このようなリムルス試薬としては具体的には、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・トリデンタツス、タキプレウス・ギガス、タキプレウス（カルシノスコルピウス）・ロツンディカウダ等のカブトガニの血リンパ液から、公知の方法（例えば、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J.Biochem.),80,1011-1021(1976)）で調製した通常のライセート、Ｇ因子の反応を排除したエンドトキシン特異的ライセート、及びこれらのライセートにさらに合成基質を加えて調製した合成基質法用エンドトキシン特異的試薬（特公平2-18080、オウバヤシ ティー等(Obayashi T.et al.), クリニカ キミカ アクタ(Clin.Chim.Acta), 149, 55-65(1985)）ならびにＣ因子の反応を排除した（１→３）−β−Ｄ−グルカン特異的ライセート（特開平4-285859）、及びさらにこれのライセートに合成基質を加えて調製した合成基質法用（１→３）−β−Ｄ−グルカン特異的試薬（特開平4-285859）などから選ばれたリムルス試薬などが挙げられる。また、本発明の測定法を合成基質法リムルス試薬を用いて行うと精度が高く、コアギュローゲンを使う必要がないという利点があるが、これに限定されず、ゲル化法リムルス試薬やゲル化反応を応用した比濁法リムルス試薬を用いて行うこともできる。
従って、本発明の測定法においては、エンドトキシンに特異的又は（１→３）−β−Ｄ−グルカンに特異的なリムルス試薬を選定することにより固体表面に存在するリムルス反応性物質がエンドトキシンであるのか、（１→３）−β−Ｄ−グルカンであるのかを特定することができる。
本発明の処理剤は、キレート剤及び界面活性剤の両者又は一方を少なくとも有効成分として含有するものである。
本発明に用いることが出来るキレート剤としては、金属イオンへの配位により環状構造（キレート環）を形成する化合物であれば、特に限定されないが、分子内に酸素、窒素ないしはイオウを複数個有し、配位により５〜６員環構造を形成し得る有機化合物がより望ましい。具体的には、クエン酸塩、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ジアミノプロパン４酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン３酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、グリコールエーテルジアミン４酢酸（ＧＥＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎー２酢酸（ＨＢＥＤ）、ニトリロ３酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）等のアミノポリカルボン酸、又はこれら化合物の塩（ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等）等が使用でき、これらは単独又は組み合わせて用いることができる。好ましいキレート剤としては、クエン酸塩、エチレンジアミン４酢酸又はその塩が挙げられる。
本発明の処理剤に用いられる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤又は陰イオン性界面活性剤が好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン類、ポリエチレングリコール等が好ましく、これらは単独又は組み合わせて用いられる。また、これら非イオン性界面活性剤は、キレート剤、例えば、エチレンジアミン４酢酸又はその塩等と併用すると特に有効である。
本発明に用いることが出来るポリオキシエチレンエーテル類としては、Ｔｒｉｔｏｎ系としてポリオキシエチレン−ｐ−ターシャリーオクチル（又はイソオクチル）フェニルエーテル（重合度８〜４０）、ポリオキシエチレン−４−ターシャリーオクチル（又はイソオクチル）フェニルエーテル（重合度８〜４０）、ポリオキシエチレン−ｐ−ノニルフェニルエーテル（重合度１０〜２０）、Ｂｒｉｊ系としてポリオキシエチレンドデシルエーテル（重合度１０〜２９）などが挙げられ、これらは単独又は組み合わせて用いられる。ポリオキシエチレンソルビタン類としてはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンエーテルモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ系）などを挙げることが出来、これらは単独又は組み合わせて用いられる。さらに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）としては、エチレングリコールの重合体で平均分子量が２００〜２，０００，０００、好ましくは２，０００〜２００，０００、さらに好ましくは４，０００〜２０，０００のものを挙げることができ、これらは単独又は組み合わせて用いられる。
また、本発明に用いることが出来る陰イオン性界面活性剤としては、アルキル硫酸塩、コール酸塩、デオキシコール酸塩（好ましくはナトリウム等のアルカリ金属塩）等が挙げられ、好ましくはアルキル硫酸ナトリウムで、具体的にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を挙げることが出来る。
本発明がより処理される固体表面は、リムルス反応性物質の存否の確認又は定量が必要とされる任意のものを包含し、真空採血管、注射筒、輸液用連結管、ホローファイバー型人工透析用モジュール膜、血漿交換用モジュール膜、血液回路等の医療用具等の表面が挙げられるが、これに限定されるものではなく、例えば、飲食品容器等の表面も含まれる。従って、該固体表面の素材としては、本発明の処理剤で溶解、変形等により使用し得なくなることがなければいかなる素材も含まれる。尚、本発明によりリムルス反応性物質を遊離させた処理液は、リムルス反応に供することによりその存否又は量が確認されるが、該処理液をリムルス反応に供することなく廃棄乃至一般的な水処理施設に回して良いことは言を待たない。即ち、本発明は単に固体表面から人体等に有害な作用を及ぼすリムルス反応性物質を除去する洗浄剤としての機能のみを有していてもよい。
固体表面の素材としては、具体的に、合成樹脂、天然樹脂、合成繊維、天然繊維、金属、ガラス等が挙げられ、これらは単独でも組み合わされたものでもよい。例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、フェノール樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、ジエン系ゴム、オレフィン系ゴム、ウレタンゴム、シリコーンゴム、フッ素ゴム、多硫化ゴム等からなる合成樹脂、合成繊維；アラビアゴム、カシューゴム、アンモニアゴム、天然ゴム等の天然樹脂；綿、カポック、亜麻、ラミー、マニラ麻、羊毛、モヘア、絹、アスベスト等の天然繊維；ステンレス銅、銀、金、白金、鉄、ニッケル、クロム等の金属；軟鉄ガラス、カリガラス、硬質二級、硬質一級、タングステン、ガラス、石英ガラス等が挙げられる。
本発明の処理剤は、少なくともキレート剤及び／又は界面活性剤を有効成分として含むものであれば、基本的にその態様は制限されないが、少なくとも使用時は通常、溶液乃至懸濁液状態であり、水溶液であることが好ましい。有効成分の溶媒としては、通常、水を用いるが、リムルス反応に影響を及ぼさない程度の有機溶媒も水と組み合わせて、又は単独で使用することができる。ここで、本発明により固体表面からリムルス反応性物質を遊離させた処理液をリムルス反応に供する場合は、前記溶媒としてはリムルス反応性物質を含まないものでなければならないが、その必要がない場合は特に制限はないので目的に応じて溶媒の質を選定すればよい。
本発明の処理剤において、キレート剤の濃度はその種類により異なるが、好ましくは０．０１ｍＭ〜２０ｍＭの範囲、より好ましくは０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲である。また、界面活性剤の濃度は、キレート剤同様その種類によっても異なるが、好ましくは０．０００１％〜０．５％（重量／容量）の範囲、より好ましくは０．００１〜０．０５％（重量／容量）の範囲である。
本発明の処理剤は、また、次亜塩素酸ソーダのような殺菌剤と組み合わせて使用することもできる。すなわち、本発明の処理剤に殺菌剤を添加して、あるいは本発明の処理剤と殺菌剤を相前後して用い、固体表面を処理することができる。固体表面を処理した後に、処理済みの溶液のリムルス反応性物質を測定する場合、殺菌剤がリムルス反応に影響を与える物質である場合、影響がなくなるまで処理液を希釈することが好ましい。
本発明の処理剤を固体表面に接触させる際の接触温度は４〜５０℃、特に好ましくは１０〜３０℃、接触時間は５分間〜２時間、特に３０分間〜１時間の範囲が好ましい。ここで、接触処理の方法は、特に制限はないが、例えば、振盪処理、攪拌処理、静置等が挙げられ、処理方法により適宜、処理時間が選定される。
本発明は、このように処理した後、固体表面に付着又は吸着しているリムルス反応性物質をその活性を損なうことなく簡便に効率よく定量的に遊離させ、該物質を含む処理液を得ることができ、これと前記リムルス試薬を混合し、常法によりリムルス反応性物質を精度よく測定することができる。本発明は、それにより、より適切な医療用具や医薬品容器等の安全性評価試験を実施することができ、医療等の進歩に大きく貢献するものである。
また、本発明の処理剤を用いて医療用具や医薬品容器等の任意の固体表面を処理することにより、リムルス反応性物質のない、もしくは極めて少ない安全な固体表面を提供することができる。ここで、本発明の処理剤による固体表面の処理の後、所望により残留した本発明の処理剤を水等で除去することにより本発明の処理剤及びリムルス反応性物質を含まない固体表面を提供することができる。更に、このような本発明の処理剤による処理は、目的によりその処理回数を適宜選定することもできる。
【図面の簡単な説明】
図１は、リムルス反応を説明するための図である。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
日局方エンドトキシン（Ｅ．ｃｏｌｉ ＵＫＴ−Ｂ、ｃｏｎｔｒｏｌ ８９１７）１０，０００ＥＵ／ｍＬを蒸留水で１．０ＥＵ／ｍＬまで希釈し、この２ｍＬをファルコンチューブ ２０９６（ポリプロピレン製、ベクトン・ディッキンソン社）及びアシストチューブ Ｎｏ．５５．４６７（ポリスチレン製、アシスト社）にそれぞれ分注し、ミクロミキサーＭＴ（タイテック社）にて室温、３時間振盪し、蒸留水で充分洗浄することにより、エンドトキシン吸着チューブを調製した。該チューブに、蒸留水（対照）、０．１％ヒト血清アルブミン（比較例）ならびに種々の本発明の処理剤（キレート剤又は／ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）＃６０００を含有）を２ｍＬずつ加え、ミクロミキサーＭＴで１時間振盪処理した。その処理液５０μＬにエンドトキシン特異的リムルス試薬であるエンドスペシー（生化学工業（株））を５０μＬ加え、ウェルリーダーＳＫ６０１（生化学工業（株））にてカイネティックアッセイ（３７℃、３０分間）を行い、エンドトキシン濃度を自動算出した。吸着エンドトキシンの理論値（添加量−洗浄水中の検出量）を１００％として、各処理液におけるエンドトキシンの遊離効果指数（％）を求めた（表１）。尚、表１中、キレート剤とＰＥＧとの併用の本発明の処理剤の濃度は、混合液の各成分の濃度を示す。
表１に示したように、金属イオンとの環状構造を形成するキレート剤は、すべて、固体表面からの有意のエンドトキシン遊離効果を有し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加により効果が高まることが見いだされた。さらに、比較例としての特開平５ー２５５４０５（エンドトキシンの抽出方法）記載の方法（人血清アルブミン（ＨＳＡ）使用）と比べてもその効果は著しく大きく、またこれら本発明のキレート作用を有する化合物やＰＥＧは、すべてＨＳＡのようなヒト由来成分ではなく、かつ病原菌混入の恐れもないため、安全性、操作性の面で優れ、また安価でもある点、実用性のきわめて高い方法であることは明らかである。
実施例２
実施例１において使用したエンドトキシン吸着チューブに、蒸留水（対照）、０．１％γ−グロブリン（比較例）ならびに本発明の処理剤（界面活性剤又は／及びＥＤＴＡ−４Ｎａを含有）を２ｍＬずつ加え、ミクロミキサーＭＴにて室温、１時間振盪処理した。その処理液５０μＬにエンドスペシーを５０μＬ加え、実施例１と同様に測定し、エンドトキシン濃度を算出した。吸着エンドトキシンの理論値（添加量ー洗浄水中の検出量）を１００％として、各処理液におけるエンドトキシンの遊離効果指数（％）を求めた（表２）。尚、表２中、ＰＥＧとの混合液の各成分の濃度は、混合後の濃度を示す。
表２に示したように、ポリオキシエチレンエーテル類又はポリエチレンソルビタン類から成る界面活性剤はすべて、有意のエンドトキシン遊離効果を有し、これらの界面活性剤とさらにＰＥＧを添加した際に、キレート剤と同様にＰＥＧの促進効果が認められた。さらに、ＰＥＧとキレート剤を共存させた場合はその効果は一層高まることが確認された。これら界面活性作用を有する化合物はすべてＨＳＡやγ−グロブリンの場合のような病原菌混入の恐れがないため、キレート剤と同様に、安全性、操作性の面で優れ、また安価でもある点、実用性の高い方法であることは明らかである。
実施例３
実施例１において使用したエンドトキシン吸着チューブに、ＥＤＴＡ-４ＮａとＰＥＧ＃６０００の混合液（それぞれ０．５ｍＭ、０．００４％）を２ｍＬずつ加え、ミクロミキサーＭＴにて４℃、１０℃、２５℃、３０℃、３７℃、５０℃で１時間振盪処理した。その処理液５０μＬにエンドスペシーを５０μＬ加え、実施例１と同様に測定し、エンドトキシン濃度を算出した。吸着エンドトキシンの理論値（添加量ー洗浄水中の検出量）を１００％として、各処理液におけるエンドトキシンの遊離効果指数（％）を求めた（表３）。
表３に示したように、固体表面をキレート剤及び界面活性剤を有効成分として含有する本発明による処理剤で処理することにより、４℃の条件下でも、対照（蒸留水で処理した場合）に比べ著しく高いエンドトキシンの遊離効果が認められたが、接触温度を１０℃以上に上げることによりさらにその効果が高まることが明らかとなった。
実施例４
各種滅菌ディスポーザブル器具類及び医療用具のそれぞれに、Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＥＧ＃６０００及びＥＤＴＡ-４Ｎａの混合液（それぞれ０．０１％、０．００４％、０．５ｍＭ）を２ｍＬ加え、ミクロミキサーＭＴにて室温、１時間振盪処理した。手術用ゴム手袋又は輸液セットの場合は、２００ｍＬの上記処理液に浸し、室温で３時間振盪処理後、その処理液５０μＬにエンドスペシーを５０μＬ加え、蒸留水処理を対照として、実施例１と同様に測定し、エンドトキシン濃度を算出した（表４）。
表４から明らかなように、今回検討した滅菌済みプラスチック器具類及び医療用具中には、通常の蒸留水処理ではまったく検出されない（定量試薬の検出限界以下）が、本発明による処理剤を用いるとはじめて検出される場合があることが判明した。
実施例５
実施例４で用いた製品と同一ロットの器具類及び医療用具を使用して同様に処理を行い、その処理液５０μＬに（１→３）−β−Ｄ−グルカン特異的リムルス試薬であるグルスペシー（生化学工業（株））を５０μＬ加え、ウェルリーダー ＳＫ６０１にてカイネティックアッセイ（３７℃、３０分間）を行い、（１→３）−β−Ｄ−グルカン濃度を自動算出し、蒸留水処理した対照と比較した（表５）。
表５から明らかなように、今回検討した滅菌済みプラスチック器具類及び医療用具中には、通常の蒸留水処理では全く検出されない微量の（１→３）−β−Ｄ−グルカン汚染があり、本発明による処理剤を用いるとはじめて検出される場合があることが判明した。
通常、医療用具の発熱性試験のための検体調製としては、エンドトキシンを対象とした場合は温和な抽出条件で行い、化学的発熱物質を対象とした場合は比較的苛酷な条件を用いて抽出効率を高める方法が知られている。ＦＤＡガイドラインによる医療用具のリムルス試験のための溶出／抽出条件として、最小抽出時間は、３７℃で１５分間、室温（１８℃以上）で１時間あるいは、他の実証された同等の条件とすると定められている。
しかしながら、実施例３に示したように、上記条件下で当該プラスチック器具類を抽出しても、何らその抽出効果が見られないことは明白である。また、ＨＳＡやγ−グロブリンを用いた例でもその効果は甚だしく不充分であり、しかも病原性微生物混入の危険性があり、安全性の面でも問題が大きく使用に耐えうるものではない。
産業上の利用可能性
上述した状況を踏まえ、本発明はリムルス反応性物質が付着又は吸着された固体表面からリムルス反応性物質を遊離させるための処理剤を提供する。本発明により、滅菌器具類、医療用具中のリムルス反応性物質の汚染、とりわけ通常の抽出法では検出されない素材に強く結合した潜在的エンドトキシン及び／又は（１→３）−β−Ｄ−グルカンの汚染をより適切に把握することができ、該用具の安全かつ簡便な安全性評価試験を行うことが可能である。これにより、より安全な医療行為が達成でき、医療の質的向上につながる。
本発明は医療用具、医薬品容器等の固体表面からエンドトキシン及び／または（１→３）−β−Ｄ−グルカン（これらを包括して、後に定義するように「リムルス反応性物質」という）を簡便かつ効率良く遊離させるための方法、その方法に用いる処理剤、その処理剤の使用及びカブトガニ・アメボサイト・ライセートを用いたリムルス反応によるリムルス反応性物質の測定において、医療用具、医薬品容器等の固体表面からエンドトキシン及び／または（１→３）−β−Ｄ−グルカンを簡便かつ効率良く遊離させることにより、エンドトキシン及び／または（１→３）−β−Ｄ−グルカンの検出感度を著しく高め、該医療用具、医薬品容器等の適切な安全性評価を可能にする測定法に関する。
背景技術
カブトガニ・アメボサイト・ライセート（以下単にライセートともいう）のＣ因子を利用して、発熱物質であるエンドトキシンを測定する方法が知られており、ウサギの発熱性試験の代替法として公定法にも採用されている。この方法は、微量のエンドトキシンによりライセートが凝固することに基づいているが、その後の生化学的解明により、該反応はいくつかの凝固因子の段階的活性化より成ることが明らかにされている（図１）（中村隆範、日本細菌学雑誌、３８、７８１ー８０３（１９８３））。この反応の引き金となるエンドトキシンは、グラム陰性菌細胞壁の外膜成分で、リポ多糖（ＬＰＳ）ともよばれており、親水性の糖鎖と疎水性のリポドＡ部分が分子内に局在した両親媒性物質である。
エンドトキシンは、生体内では微量でも発熱作用があり、ＴＮＦ、ＩＬ−１等の炎症性サイトカインの遊離やショックの誘発ならびに致死作用等様々な生物活性（毒性）が知られており、人体への混入は極力避けねばならない。ＦＤＡは１９７８年にウサギ発熱性試験の代替法としてのリムルステストによるエンドトキシン試験のガイドラインを作成したが、それ以降、医薬品の安全性試験に本テストが広く適用されるに至っている。
エンドトキシンのサブユニットは、通常の条件では、疎水結合、イオン結合等で巨大な分子集合状態（会合体）を形成し、蛋白や脂質等とも複雑なミセルを形成することが知られており、このミセル構造は、リムルス反応にも大きく影響し、最大活性を示す分子サイズとそのミセル構造が存在する。また、両親媒性であるエンドトキシンはその親水基と疎水基を介して、種々の物質や担体に吸着する。特に、プラスチックには、条件によっては強く吸着する性質を有する。従って、プラスチック器具に吸着したエンドトキシンは、単に蒸留水のみでは全く遊離されず、体液たとえば血液等に接触してはじめて遊離することもあり得るため、従来の蒸留水による遊離液を用いてリムルステストでこれら器具のエンドトキシン汚染を検出する方法ではエンドトキシンが正確に検出できない危険性も指摘されている。そのため、たとえエンドトキシン汚染があっても、従来の試験法では適合するケースがあり、人体とりわけ免疫能が低下した易感染性患者へのこれら医療用具の適用は、医療上大きな問題を提起することになる。
さらに、外科領域や救急医療の場においても、エンドトキシンの日常管理は、感染症、とくに敗血症の病態把握と治療及び予後の判定、術後のモニタリング等にきわめて重要となっており、血液透析患者における透析液の安全管理にも不可欠な項目である。そのため、治療を主たる目的とした医療用具の安全性には特に厳重な注意が必要である。
一方、ライセートのＧ因子を利用して、エンドトキシンとは別に（１→３）−β−Ｄ−グルカンを測定する方法が知られている。この反応の引き金となる（１→３）−β−Ｄ−グルカンは、酵母、キノコ、カビ等の真菌類及び高等植物の細胞壁成分として、自然界に広く分布し、マクロファージからのＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６等のサイトカインの産生誘導、（１→３）−β−Ｄ−グルカンリセプターを介した補体系の活性化、網内系の活性化、抗腫瘍作用等の多彩な生物活性を示す。また、エンドトキシンの作用を高める相乗効果を有する場合もあるため、種々医薬品ならびに医療用具等への（１→３）−β−Ｄ−グルカンの混入も医療上重要な問題になりつつある。
薬事法により定められている医療用具基準におけるリムルス試験に供する試料溶液の調製法として、各種の加熱温度と加熱時間が記載されているが、大部分が苛酷な抽出条件（７０℃など）を採用しており、また対象医療用具ごとにその方法が異なっている。さらに、低濃度のエンドトキシンの場合、特にこれらの処理に伴うエンドトキシンの不活化という問題が指摘されており、該用具に付着または吸着されている活性なエンドトキシン濃度を正確に測定すること、即ち、適切な安全性評価が困難である(ジャーナル・オブ・アンチバクテリアル アンチファンガス エージェンツ（J.Antibact.Antifung.Agents), 19, 561-566(1991)）という問題があった。また、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）やグロブリンを抽出剤として用いるエンドトキシン測定法が知られている（特開平５ー２５５４０５）が、アルブミンやグロブリン溶液自体からエンドトキシンを除去あるいは失活させる操作が煩雑で、かつこれら操作を確実に行うことが困難である点やヒト由来の病原性微生物（ＨＩＶ、マイコプラズマ等）が、抽出剤に混入する危険性もあるという問題があり、実用的方法とは言えないものであった。更に、該抽出剤は、貴重な血液から調製されるため価格も高くかつ貴重な資源の有効な利用とは言えないものである。
本発明は、医療用具、医薬品容器等の固体表面に付着または吸着したリムルス反応性物質を簡便かつ効率良く遊離させ得る衛生上安全で低価格な方法、その方法に用いる処理剤、その処理剤の使用とそれを用いたリムルス反応性物質の測定法を提供するものである。
発明の開示
本発明は、以下の構成からなる。
１）リムルス反応性物質が付着又は吸着した固体表面にクエン酸塩、アミノポリカルボン酸及びその塩からなる群から選択されるキレート剤並びに／又は界面活性剤のみをリムルス反応性物質を遊離させるための有効成分として含有する処理剤を接触させ、リムルス反応性物質を遊離させることを特徴とする固体表面の処理方法。
２）リムルス反応性物質がカブトガニ・アメボサイト・ライセートのＣ因子系を活性化する物質又はＧ因子系を活性化する物質であることを特徴とする前記１」に記載の固体表面の処理方法。
３）Ｃ因子系を活性化する物質がエンドトキシンであり、Ｇ因子系を活性化する物質が（１→３）−β−Ｄ−グルカンであることを特徴とする前記２）に記載の固体表面の処理方法。
４）界面活性剤が非イオン性界面活性剤又は陰イオン性界面活性剤であることを特徴とする前記１）〜３）の何れか１項に記載の固体表面の処理方法。
５）非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン類及びポリエチレングリコールから選択されることを特徴とする前記４）に記載の固体表面上の処理方法。
６）陰イオン性界面活性剤がアルキル硫酸塩であることを特徴とする前記４）に記載の固体表面の処理方法。
７）アミノポリカルボン酸が、エチレンジアミン４酢酸、ジアミノプロパン４酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン３酢酸、グリコールエーテルジアミン４酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ−２酢酸、ニトリロ３酢酸、ジエチレントリアミン５酢酸及びそれらの塩から選択されることを特徴とする前記１）〜３）の何れか１項に記載の固体表面の処理方法。
８）有効成分がエチレンジアミン４酢酸、その塩及びポリエチレングリコールからなることを特徴とする前記１）に記載の固体表面の処理方法。
９）有効成分がポリオキシエチレンソルビタン類、ポリエチレングリコール及びエチレンジアミン４酢酸又はその塩からなることを特徴とする前記１）に記載の固体表面の処理方法。
１０）有効成分がポリオキシエチレンソルビタン類及びポリエチレングリコールからなることを特徴とする前記１）に記載の固体表面の処理方法。
１１）固体表面が合成樹脂、天然樹脂、合成繊維、天然繊維、金属及びガラスから選択される表面であることを特徴とする前記１）〜１０）の何れか１項に記載の固体表面の処理方法。
１２）リムルス反応性物質が付着又は吸着した固体表面からリムルス反応性物質を遊離させるために用いられ、クエン酸塩、アミノポリカルボン酸及びその塩からなる群から選択されるキレート剤並びに／又は界面活性剤のみをリムルス反応性物質を遊離させるための有効成分として含有することを特徴とする固体表面の処理剤。
１３）有効成分がエチレンジアミン４酢酸、その塩及びポリエチレングリコールからなることを特徴とする前記１２）に記載の固体表面の処理剤。
１４）有効成分がポリオキシエチレンソルビタン類、ポリエチレングリコール及びエチレンジアミン４酢酸又はその塩からなることを特徴とする前記１２）に記載の固体表面の処理剤。
１５）有効成分がポリオキシエチレンソルビタン類及びポリエチレングリコールからなることを特徴とする前記１２）に記載の固体表面の処理剤。
１６）ポリオキシエチレンソルビタン類がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート及びポリオキシエチレンエーテルモノステアレートから選択されることを特徴とする前記１４）又は１５）に記載の固体表面の処理剤。
１７）リムルス反応性物質が付着又は吸着した固体表面から、リムルス反応性物質を遊離させる処理へのクエン酸塩、アミノポリカルボン酸及びその塩からなる群から選択されるキレート剤並びに／又は界面活性剤のみをリムルス反応性物質を遊離させるための有効成分とする処理剤の使用。
１８）リムルス反応性物質が付着又は吸着した固体表面をクエン酸塩、アミノポリカルボン酸及びその塩からなる群から選択されるキレート剤並びに／又は界面活性剤のみをリムルス反応性物質を遊離させるための有効成分として含有する処理剤で処理して得られた処理液にリムルス試薬を作用させることを特徴とするリムルス反応性物質の測定法。
本発明において、キレート剤及び／又は界面活性剤を有効成分とする処理剤により種々材質の医療用具、医薬品容器等の表面を処理し、器材の表面に付着又は吸着したリムルス反応性物質、即ち、エンドトキシン及び／又は（１→３）−β−Ｄ−グルカンを簡便かつ効率良く遊離させることができる（以下、前記処理剤を「本発明の処理剤」ともいう）。
また、本発明は、本発明の処理剤により固体表面を処理した処理液にリムルス試薬を作用させてリムルス反応性物質を精度良く測定することができる。なお、本発明の処理剤は、水溶液の状態で、長期間安定したリムルス反応性物質の遊離効果を示す。
本発明において「リムルス反応性物質」とは、ライセート成分に作用し、リムルス反応を惹起させる物質を意味し、Ｃ因子系（成分として少なくともＣ因子、Ｂ因子及び／又は凝固酸素前駆体を含む）を活性化するエンドトキシン及びＧ因子系（成分として少なくともＧ因子及び／又は凝固酵素前駆体を含む）を活性化する（１→３）−β−Ｄ−グルカンなどを意味する。
ライセートは、カブトガニのアメボサイト（血球細胞）をホモゲナイザー等適当な方法により抽出することにより調製される。
また、本発明のリムルス反応性物質の測定法に使用されるリムルス試薬としては、ライセートを原料として得られた試薬であれば、いずれも使用できる。このようなリムルス試薬としては具体的には、リムルス・ポリフェムス、タキプレウス・トリデンタツス、タキプレウス・ギガス、タキプレウス（カルシノスコルピウス）・ロツンディカウダ等のカブトガニの血リンパ液から、公知の方法（例えば、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J.Biochem.),80,1011-1021(1976)）で調製した通常のライセート、Ｇ因子の反応を排除したエンドトキシン特異的ライセート、及びこれらのライセートにさらに合成基質を加えて調製した合成基質法用エンドトキシン特異的試薬（特公平2-18080、オウバヤシ ティー等(Obayashi T.et al.), クリニカ キミカ アクタ(Clin.Chim.Acta), 149, 55-65(1985)）ならびにＣ因子の反応を排除した（１→３）−β−Ｄ−グルカン特異的ライセート（特開平4-285859）、及びさらにこれのライセートに合成基質を加えて調製した合成基質法用（１→３）−β−Ｄ−グルカン特異的試薬（特開平4-285859）などから選ばれたリムルス試薬などが挙げられる。また、本発明の測定法を合成基質法リムルス試薬を用いて行うと精度が高く、コアギュローゲンを使う必要がないという利点があるが、これに限定されず、ゲル化法リムルス試薬やゲル化反応を応用した比濁法リムルス試薬を用いて行うこともできる。
従って、本発明の測定法においては、エンドトキシンに特異的又は（１→３）−β−Ｄ−グルカンに特異的なリムルス試薬を選定することにより固体表面に存在するリムルス反応性物質がエンドトキシンであるのか、（１→３）−β−Ｄ−グルカンであるのかを特定することができる。
本発明の処理剤は、キレート剤及び界面活性剤の両者又は一方を少なくとも有効成分として含有するものである。
本発明に用いることが出来るキレート剤としては、金属イオンへの配位により環状構造（キレート環）を形成する化合物であれば、特に限定されないが、分子内に酸素、窒素ないしはイオウを複数個有し、配位により５〜６員環構造を形成し得る有機化合物がより望ましい。具体的には、クエン酸塩、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ジアミノプロパン４酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン３酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、グリコールエーテルジアミン４酢酸（ＧＥＤＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎー２酢酸（ＨＢＥＤ）、ニトリロ３酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）等のアミノポリカルボン酸、又はこれら化合物の塩（ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等）等が使用でき、これらは単独又は組み合わせて用いることができる。好ましいキレート剤としては、クエン酸塩、エチレンジアミン４酢酸又はその塩が挙げられる。
本発明の処理剤に用いられる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤又は陰イオン性界面活性剤が好ましい。
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン類、ポリエチレングリコール等が好ましく、これらは単独又は組み合わせて用いられる。また、これら非イオン性界面活性剤は、キレート剤、例えば、エチレンジアミン４酢酸又はその塩等と併用すると特に有効である。
本発明に用いることが出来るポリオキシエチレンエーテル類としては、Ｔｒｉｔｏｎ系としてポリオキシエチレン−ｐ−ターシャリーオクチル（又はイソオクチル）フェニルエーテル（重合度８〜４０）、ポリオキシエチレン−４−ターシャリーオクチル（又はイソオクチル）フェニルエーテル（重合度８〜４０）、ポリオキシエチレン−ｐ−ノニルフェニルエーテル（重合度１０〜２０）、Ｂｒｉｊ系としてポリオキシエチレンドデシルエーテル（重合度１０〜２９）などが挙げられ、これらは単独又は組み合わせて用いられる。ポリオキシエチレンソルビタン類としてはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンエーテルモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ系）などを挙げることが出来、これらは単独又は組み合わせて用いられる。さらに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）としては、エチレングリコールの重合体で平均分子量が２００〜２，０００，０００、好ましくは２，０００〜２００，０００、さらに好ましくは４，０００〜２０，０００のものを挙げることができ、これらは単独又は組み合わせて用いられる。
また、本発明に用いることが出来る陰イオン性界面活性剤としては、アルキル硫酸塩、コール酸塩、デオキシコール酸塩（好ましくはナトリウム等のアルカリ金属塩）等が挙げられ、好ましくはアルキル硫酸ナトリウムで、具体的にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を挙げることが出来る。
本発明がより処理される固体表面は、リムルス反応性物質の存否の確認又は定量が必要とされる任意のものを包含し、真空採血管、注射筒、輸液用連結管、ホローファイバー型人工透析用モジュール膜、血漿交換用モジュール膜、血液回路等の医療用具等の表面が挙げられるが、これに限定されるものではなく、例えば、飲食品容器等の表面も含まれる。従って、該固体表面の素材としては、本発明の処理剤で溶解、変形等により使用し得なくなることがなければいかなる素材も含まれる。尚、本発明によりリムルス反応性物質を遊離させた処理液は、リムルス反応に供することによりその存否又は量が確認されるが、該処理液をリムルス反応に供することなく廃棄乃至一般的な水処理施設に回して良いことは言を待たない。即ち、本発明は単に固体表面から人体等に有害な作用を及ぼすリムルス反応性物質を除去する洗浄剤としての機能のみを有していてもよい。
固体表面の素材としては、具体的に、合成樹脂、天然樹脂、合成繊維、天然繊維、金属、ガラス等が挙げられ、これらは単独でも組み合わされたものでもよい。例えば、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、フェノール樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、ジエン系ゴム、オレフィン系ゴム、ウレタンゴム、シリコーンゴム、フッ素ゴム、多硫化ゴム等からなる合成樹脂、合成繊維；アラビアゴム、カシューゴム、アンモニアゴム、天然ゴム等の天然樹脂；綿、カポック、亜麻、ラミー、マニラ麻、羊毛、モヘア、絹、アスベスト等の天然繊維；ステンレス銅、銀、金、白金、鉄、ニッケル、クロム等の金属；軟鉄ガラス、カリガラス、硬質二級、硬質一級、タングステン、ガラス、石英ガラス等が挙げられる。
本発明の処理剤は、少なくともキレート剤及び／又は界面活性剤を有効成分として含むものであれば、基本的にその態様は制限されないが、少なくとも使用時は通常、溶液乃至懸濁液状態であり、水溶液であることが好ましい。有効成分の溶媒としては、通常、水を用いるが、リムルス反応に影響を及ぼさない程度の有機溶媒も水と組み合わせて、又は単独で使用することができる。ここで、本発明により固体表面からリムルス反応性物質を遊離させた処理液をリムルス反応に供する場合は、前記溶媒としてはリムルス反応性物質を含まないものでなければならないが、その必要がない場合は特に制限はないので目的に応じて溶媒の質を選定すればよい。
本発明の処理剤において、キレート剤の濃度はその種類により異なるが、好ましくは０．０１ｍＭ〜２０ｍＭの範囲、より好ましくは０．１ｍＭ〜５ｍＭの範囲である。また、界面活性剤の濃度は、キレート剤同様その種類によっても異なるが、好ましくは０．０００１％〜０．５％（重量／容量）の範囲、より好ましくは０．００１〜０．０５％（重量／容量）の範囲である。
本発明の処理剤は、また、次亜塩素酸ソーダのような殺菌剤と組み合わせて使用することもできる。すなわち、本発明の処理剤に殺菌剤を添加して、あるいは本発明の処理剤と殺菌剤を相前後して用い、固体表面を処理することができる。固体表面を処理した後に、処理済みの溶液のリムルス反応性物質を測定する場合、殺菌剤がリムルス反応に影響を与える物質である場合、影響がなくなるまで処理液を希釈することが好ましい。
本発明の処理剤を固体表面に接触させる際の接触温度は４〜５０℃、特に好ましくは１０〜３０℃、接触時間は５分間〜２時間、特に３０分間〜１時間の範囲が好ましい。ここで、接触処理の方法は、特に制限はないが、例えば、振盪処理、攪拌処理、静置等が挙げられ、処理方法により適宜、処理時間が選定される。
本発明は、このように処理した後、固体表面に付着又は吸着しているリムルス反応性物質をその活性を損なうことなく簡便に効率よく定量的に遊離させ、該物質を含む処理液を得ることができ、これと前記リムルス試薬を混合し、常法によりリムルス反応性物質を精度よく測定することができる。本発明は、それにより、より適切な医療用具や医薬品容器等の安全性評価試験を実施することができ、医療等の進歩に大きく貢献するものである。
また、本発明の処理剤を用いて医療用具や医薬品容器等の任意の固体表面を処理することにより、リムルス反応性物質のない、もしくは極めて少ない安全な固体表面を提供することができる。ここで、本発明の処理剤による固体表面の処理の後、所望により残留した本発明の処理剤を水等で除去することにより本発明の処理剤及びリムルス反応性物質を含まない固体表面を提供することができる。更に、このような本発明の処理剤による処理は、目的によりその処理回数を適宜選定することもできる。
【図面の簡単な説明】
図１は、リムルス反応を説明するための図である。
発明を実施するための最良の形態
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
日局方エンドトキシン（Ｅ．ｃｏｌｉ ＵＫＴ−Ｂ、ｃｏｎｔｒｏｌ ８９１７）１０，０００ＥＵ／ｍＬを蒸留水で１．０ＥＵ／ｍＬまで希釈し、この２ｍＬをファルコンチューブ ２０９６（ポリプロピレン製、ベクトン・ディッキンソン社）及びアシストチューブ Ｎｏ．５５．４６７（ポリスチレン製、アシスト社）にそれぞれ分注し、ミクロミキサーＭＴ（タイテック社）にて室温、３時間振盪し、蒸留水で充分洗浄することにより、エンドトキシン吸着チューブを調製した。該チューブに、蒸留水（対照）、０．１％ヒト血清アルブミン（比較例）ならびに種々の本発明の処理剤（キレート剤又は／ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）＃６０００を含有）を２ｍＬずつ加え、ミクロミキサーＭＴで１時間振盪処理した。その処理液５０μＬにエンドトキシン特異的リムルス試薬であるエンドスペシー（生化学工業（株））を５０μＬ加え、ウェルリーダーＳＫ６０１（生化学工業（株））にてカイネティックアッセイ（３７℃、３０分間）を行い、エンドトキシン濃度を自動算出した。吸着エンドトキシンの理論値（添加量−洗浄水中の検出量）を１００％として、各処理液におけるエンドトキシンの遊離効果指数（％）を求めた（表１）。尚、表１中、キレート剤とＰＥＧとの併用の本発明の処理剤の濃度は、混合液の各成分の濃度を示す。
実施例２
実施例１において使用したエンドトキシン吸着チューブに、蒸留水（対照）、０．１％γ−グロブリン（比較例）ならびに本発明の処理剤（界面活性剤又は／及びＥＤＴＡ−４Ｎａを含有）を２ｍＬずつ加え、ミクロミキサーＭＴにて室温、１時間振盪処理した。その処理液５０μＬにエンドスペシーを５０μＬ加え、実施例１と同様に測定し、エンドトキシン濃度を算出した。吸着エンドトキシンの理論値（添加量ー洗浄水中の検出量）を１００％として、各処理液におけるエンドトキシンの遊離効果指数（％）を求めた（表２）。尚、表２中、ＰＥＧとの混合液の各成分の濃度は、混合後の濃度を示す。
実施例３
実施例１において使用したエンドトキシン吸着チューブに、ＥＤＴＡ-４ＮａとＰＥＧ＃６０００の混合液（それぞれ０．５ｍＭ、０．００４％）を２ｍＬずつ加え、ミクロミキサーＭＴにて４℃、１０℃、２５℃、３０℃、３７℃、５０℃で１時間振盪処理した。その処理液５０μＬにエンドスペシーを５０μＬ加え、実施例１と同様に測定し、エンドトキシン濃度を算出した。吸着エンドトキシンの理論値（添加量ー洗浄水中の検出量）を１００％として、各処理液におけるエンドトキシンの遊離効果指数（％）を求めた（表３）。
実施例４
各種滅菌ディスポーザブル器具類及び医療用具のそれぞれに、Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＥＧ＃６０００及びＥＤＴＡ-４Ｎａの混合液（それぞれ０．０１％、０．００４％、０．５ｍＭ）を２ｍＬ加え、ミクロミキサーＭＴにて室温、１時間振盪処理した。手術用ゴム手袋又は輸液セットの場合は、２００ｍＬの上記処理液に浸し、室温で３時間振盪処理後、その処理液５０μＬにエンドスペシーを５０μＬ加え、蒸留水処理を対照として、実施例１と同様に測定し、エンドトキシン濃度を算出した（表４）。
実施例５
実施例４で用いた製品と同一ロットの器具類及び医療用具を使用して同様に処理を行い、その処理液５０μＬに（１→３）−β−Ｄ−グルカン特異的リムルス試薬であるグルスペシー（生化学工業（株））を５０μＬ加え、ウェルリーダー ＳＫ６０１にてカイネティックアッセイ（３７℃、３０分間）を行い、（１→３）−β−Ｄ−グルカン濃度を自動算出し、蒸留水処理した対照と比較した（表５）。
通常、医療用具の発熱性試験のための検体調製としては、エンドトキシンを対象とした場合は温和な抽出条件で行い、化学的発熱物質を対象とした場合は比較的苛酷な条件を用いて抽出効率を高める方法が知られている。ＦＤＡガイドラインによる医療用具のリムルス試験のための溶出／抽出条件として、最小抽出時間は、３７℃で１５分間、室温（１８℃以上）で１時間あるいは、他の実証された同等の条件とすると定められている。
しかしながら、実施例３に示したように、上記条件下で当該プラスチック器具類を抽出しても、何らその抽出効果が見られないことは明白である。また、ＨＳＡやγ−グロブリンを用いた例でもその効果は甚だしく不充分であり、しかも病原性微生物混入の危険性があり、安全性の面でも問題が大きく使用に耐えうるものではない。
産業上の利用可能性
上述した状況を踏まえ、本発明はリムルス反応性物質が付着又は吸着された固体表面からリムルス反応性物質を遊離させるための処理剤を提供する。本発明により、滅菌器具類、医療用具中のリムルス反応性物質の汚染、とりわけ通常の抽出法では検出されない素材に強く結合した潜在的エンドトキシン及び／又は（１→３）−β−Ｄ−グルカンの汚染をより適切に把握することができ、該用具の安全かつ簡便な安全性評価試験を行うことが可能である。これにより、より安全な医療行為が達成でき、医療の質的向上につながる。
Claims (18)
- リムルス反応性物質が付着又は吸着した固体表面にクエン酸塩、アミノポリカルボン酸及びその塩からなる群から選択されるキレート剤並びに／又は界面活性剤のみをリムルス反応性物質を遊離させるための有効成分として含有する処理剤を接触させ、リムルス反応性物質を遊離させることを特徴とする固体表面の処理方法。
- リムルス反応性物質がカブトガニ・アメボサイト・ライセートのＣ因子系を活性化する物質又はＧ因子系を活性化する物質であることを特徴とする請求項１に記載の固体表面の処理方法。
- Ｃ因子系を活性化する物質がエンドトキシンであり、Ｇ因子系を活性化する物質が（１→３）−β−Ｄ−グルカンであることを特徴とする請求項２に記載の固体表面の処理方法。
- 界面活性剤が非イオン性界面活性剤又は陰イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の固体表面の処理方法。
- 非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチレンソルビタン類及びポリエチレングリコールから選択されることを特徴とする請求項４に記載の固体表面の処理方法。
- 陰イオン性界面活性剤がアルキル硫酸塩であることを特徴とする請求項４に記載の固体表面の処理方法。
- アミノポリカルボン酸が、エチレンジアミン４酢酸、ジアミノプロパン４酢酸、ヒドロキシエチルエチレンジアミン３酢酸、グリコールエーテルジアミン４酢酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ−２酢酸、ニトリロ３酢酸、ジエチレントリアミン５酢酸及びそれらの塩から選択されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の固体表面の処理方法。
- 有効成分がエチレンジアミン４酢酸、その塩及びポリエチレングリコールからなることを特徴とする請求項１に記載の固体表面の処理方法。
- 有効成分がポリオキシエチレンソルビタン類、ポリエチレングリコール及びエチレンジアミン４酢酸又はその塩からなることを特徴とする請求項１に記載の固体表面の処理方法。
- 有効成分がポリオキシエチレンソルビタン類及びポリエチレングリコールからなることを特徴とする請求項１に記載の固体表面の処理方法。
- 固体表面が合成樹脂、天然樹脂、合成繊維、天然繊維、金属及びガラスから選択される表面であることを特徴とする請求項１〜１０の何れか１項に記載の固体表面の処理方法。
- リムルス反応性物質が付着又は吸着した固体表面からリムルス反応性物質を遊離させるために用いられ、クエン酸塩、アミノポリカルボン酸及びその塩からなる群から選択されるキレート剤並びに／又は界面活性剤のみをリムルス反応性物質を遊離させるための有効成分として含有することを特徴とする固体表面の処理剤。
- 有効成分がエチレンジアミン４酢酸、その塩及びポリエチレングリコールからなることを特徴とする請求項１２に記載の固体表面の処理剤。
- 有効成分がポリオキシエチレンソルビタン類、ポリエチレングリコール及びエチレンジアミン４酢酸又はその塩からなることを特徴とする請求項１２に記載の固体表面の処理剤。
- 有効成分がポリオキシエチレンソルビタン類及びポリエチレングリコールからなることを特徴とする請求項１２に記載の固体表面の処理剤。
- ポリオキシエチレンソルビタン類がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート及びポリオキシエチレンエーテルモノステアレートから選択されることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の固体表面の処理剤。
- リムルス反応性物質が付着又は吸着した固体表面から、リムルス反応性物質を遊離させる処理へのクエン酸塩、アミノポリカルボン酸及びその塩からなる群から選択されるキレート剤並びに／又は界面活性剤のみをリムルス反応性物質を遊離させるための有効成分とする処理剤の使用。
- リムルス反応性物質が付着又は吸着した固体表面をクエン酸塩、アミノポリカルボン酸及びその塩からなる群から選択されるキレート剤並びに／又は界面活性剤のみをリムルス反応性物質を遊離させるための有効成分として含有する処理剤で処理して得られた処理液にリムルス試薬を作用させることを特徴とするリムルス反応性物質の測定法。
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