JP2003232794A - エンドトキシン活性の測定方法 - Google Patents
エンドトキシン活性の測定方法Info
- Publication number
- JP2003232794A JP2003232794A JP2002030691A JP2002030691A JP2003232794A JP 2003232794 A JP2003232794 A JP 2003232794A JP 2002030691 A JP2002030691 A JP 2002030691A JP 2002030691 A JP2002030691 A JP 2002030691A JP 2003232794 A JP2003232794 A JP 2003232794A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- endotoxin
- surfactant
- endotoxin activity
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】リムルステスト試薬を促進又は阻害するような
物質が混在する試料においても、正確にかつ迅速にエン
ドトキシンの活性を測定する方法の提供。 【解決手段】リムルス試薬を用いてエンドトキシン活性
の測定方法において、試料中に界面活性剤を添加し、次
いで超音波処理した後に測定することを特徴とし、界面
活性剤が陰イオン界面活性剤であり、試料中の界面活性
剤濃度が０．０１％未満であることを特徴とするエンド
トキシン活性の測定方法。
物質が混在する試料においても、正確にかつ迅速にエン
ドトキシンの活性を測定する方法の提供。 【解決手段】リムルス試薬を用いてエンドトキシン活性
の測定方法において、試料中に界面活性剤を添加し、次
いで超音波処理した後に測定することを特徴とし、界面
活性剤が陰イオン界面活性剤であり、試料中の界面活性
剤濃度が０．０１％未満であることを特徴とするエンド
トキシン活性の測定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は細菌内毒素であるエ
ンドトキシン活性の測定方法に関するものであり、詳し
くはエンドトキシンをカブトガニ血球抽出液由来成分を
もって定量する方法であるリムルステストに関するもの
である。
ンドトキシン活性の測定方法に関するものであり、詳し
くはエンドトキシンをカブトガニ血球抽出液由来成分を
もって定量する方法であるリムルステストに関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】エンドトキシンとは、グラム陰性菌の細
胞外膜に存在するリポ多糖体であり、発熱、炎症さらに
はショック死などの毒作用を引き起こす性質から、注射
用薬剤などの医薬品類、医療用具や透析液においては、
生菌数とともに重要な管理項目となっている。
胞外膜に存在するリポ多糖体であり、発熱、炎症さらに
はショック死などの毒作用を引き起こす性質から、注射
用薬剤などの医薬品類、医療用具や透析液においては、
生菌数とともに重要な管理項目となっている。
【０００３】エンドトキシンを測定する方法としては、
ウサギ発熱性試験、鶏胚致死試験、ラジオイムノアッセ
イ、エンザイムイムノアッセイ、ガスマススペクトル等
があるが、最も鋭敏、簡便かつ迅速な方法としてカブト
ガニ血球抽出物由来成分（以下ＬＡＬと略す）を利用し
たリムルステストが挙げられる。
ウサギ発熱性試験、鶏胚致死試験、ラジオイムノアッセ
イ、エンザイムイムノアッセイ、ガスマススペクトル等
があるが、最も鋭敏、簡便かつ迅速な方法としてカブト
ガニ血球抽出物由来成分（以下ＬＡＬと略す）を利用し
たリムルステストが挙げられる。
【０００４】リムルステストとはＬＡＬにエンドトキシ
ンを加えると凝固反応が生じる性質を応用した試験法
で、１９８８年には日本薬局方にエンドトキシン試験法
として収載されている。
ンを加えると凝固反応が生じる性質を応用した試験法
で、１９８８年には日本薬局方にエンドトキシン試験法
として収載されている。
【０００５】リムルステストには、ゲル化法（ゲル化転
倒法）、比濁法（比濁時間分析法）、合成基質法（比色
法）の３方式が現在広く実施されている。
倒法）、比濁法（比濁時間分析法）、合成基質法（比色
法）の３方式が現在広く実施されている。
【０００６】ゲル化法はＬＡＬと試料を混合し、３７℃
で６０分反応させた後１８０°転倒させ、ゲル化を判定
する半定量法である。比濁法はＬＡＬと試料を混合し、
３７℃で反応中の透過光量変化を観測して割り出される
ゲル化時間からエンドトキシンを定量する方法である。
合成基質法はＬＡＬとエンドトキシンの反応によって活
性化される酵素により分解して色素を遊離する合成基質
を用い、遊離色素量からエンドトキシンを定量する方法
である。
で６０分反応させた後１８０°転倒させ、ゲル化を判定
する半定量法である。比濁法はＬＡＬと試料を混合し、
３７℃で反応中の透過光量変化を観測して割り出される
ゲル化時間からエンドトキシンを定量する方法である。
合成基質法はＬＡＬとエンドトキシンの反応によって活
性化される酵素により分解して色素を遊離する合成基質
を用い、遊離色素量からエンドトキシンを定量する方法
である。
【０００７】上記のそれぞれの手法に対し、各種試薬
（例えば生化学工業製「エンドスペシー」や和光純薬製
「リムルス−ＥＳ−Ｔｅｓｔ−Ｗａｋｏ」等）が既に市
販され、広く一般に使用されている。
（例えば生化学工業製「エンドスペシー」や和光純薬製
「リムルス−ＥＳ−Ｔｅｓｔ−Ｗａｋｏ」等）が既に市
販され、広く一般に使用されている。
【０００８】しかしながら、エンドトキシンの物性やリ
ムルステスト試薬の活性は試料中に混在する金属塩溶液
など種々の化学物質により、促進又は阻害される場合が
あり、試料によってはそのままリムルステストに適用す
ることが出来ない場合がある。
ムルステスト試薬の活性は試料中に混在する金属塩溶液
など種々の化学物質により、促進又は阻害される場合が
あり、試料によってはそのままリムルステストに適用す
ることが出来ない場合がある。
【０００９】例えば、最近では医療用具等の滅菌方法と
して放射線照射を用いることが多く、この放射線滅菌に
より医薬品や医療用具の容器や構成基材の分解物が試料
中に溶出することがあり、その分解溶出物がエンドトキ
シンやリムルス試薬の活性を促進又は阻害することがあ
る。
して放射線照射を用いることが多く、この放射線滅菌に
より医薬品や医療用具の容器や構成基材の分解物が試料
中に溶出することがあり、その分解溶出物がエンドトキ
シンやリムルス試薬の活性を促進又は阻害することがあ
る。
【００１０】その解決方法の一つとしては、特開平２−
１４３１６４号公報に記載されているようにリムルステ
ストを妨害する物質が混入している試料を妨害作用が失
われる濃度にまで必要に応じて加熱しながら希釈して測
定する方法が知られているが、試料中のエンドトキシン
も希釈されるため、試料中のエンドトキシン量が少ない
とリムルステストの感度以下になって検出不能になるこ
と、希釈を繰り返すと希釈に使用した容器にエンドトキ
シンが吸着して正確な値が得られなくなる危険性があ
る。
１４３１６４号公報に記載されているようにリムルステ
ストを妨害する物質が混入している試料を妨害作用が失
われる濃度にまで必要に応じて加熱しながら希釈して測
定する方法が知られているが、試料中のエンドトキシン
も希釈されるため、試料中のエンドトキシン量が少ない
とリムルステストの感度以下になって検出不能になるこ
と、希釈を繰り返すと希釈に使用した容器にエンドトキ
シンが吸着して正確な値が得られなくなる危険性があ
る。
【００１１】他の解決方法として、既に市販のエンドト
キシン吸着体を用いエンドトキシンを吸着させ洗浄した
のちに脱離させる方法があるが、試料を吸着時には酸性
・低イオン強度の条件下に、脱離時にはアルカリ条件下
に調整する必要があり、コンタミネーションの問題や作
業効率が良くないという問題があった。
キシン吸着体を用いエンドトキシンを吸着させ洗浄した
のちに脱離させる方法があるが、試料を吸着時には酸性
・低イオン強度の条件下に、脱離時にはアルカリ条件下
に調整する必要があり、コンタミネーションの問題や作
業効率が良くないという問題があった。
【００１２】また、特開平４−１６７６５号公報や特開
平６−１１８０８６号公報については主に血液由来成分
を試料とし、硝酸と界面活性剤にて前処理する方法や界
面活性剤を加えて血液成分による阻害作用を除去する測
定方法が開示されているが、血液以外の試料には言及し
ておらず、種々の化学物質が混入したより阻害作用の強
い試料を測定する場合については回収率が上がらない場
合がある。
平６−１１８０８６号公報については主に血液由来成分
を試料とし、硝酸と界面活性剤にて前処理する方法や界
面活性剤を加えて血液成分による阻害作用を除去する測
定方法が開示されているが、血液以外の試料には言及し
ておらず、種々の化学物質が混入したより阻害作用の強
い試料を測定する場合については回収率が上がらない場
合がある。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、前述した従
来技術の問題点を直視し、リムルステスト試薬を促進又
は阻害するような物質が混在する試料においても、正確
にかつ迅速にエンドトキシンの活性を測定する方法を提
供するものである。
来技術の問題点を直視し、リムルステスト試薬を促進又
は阻害するような物質が混在する試料においても、正確
にかつ迅速にエンドトキシンの活性を測定する方法を提
供するものである。
【００１４】
【課題を解決する手段】本発明は、以下に記す簡単な前
処理を施すことで正確に且つ迅速にエンドトキシンの活
性を測定できるところに特徴を有する。 （１）リムルステストによるエンドトキシン活性の測定
方法において、検査対象試料中に界面活性剤を添加して
なる混合液を超音波処理した後にリムルステストにて測
定することを特徴とするエンドトキシン活性の測定方
法。 （２）該混合液の界面活性剤濃度が０．０１％未満であ
ることを特徴とする、上記（１）記載のエンドトキシン
活性の測定方法。 （３）界面活性剤が陰イオン界面活性剤であることを特
徴とする上記（１）又は（２）記載のエンドトキシン活
性の測定方法。 （４）界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウムである
ことを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載
のエンドトキシン活性の測定方法。 （５）比濁法によってエンドトキシン活性を測定するこ
とを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の
エンドトキシン活性の測定方法。
処理を施すことで正確に且つ迅速にエンドトキシンの活
性を測定できるところに特徴を有する。 （１）リムルステストによるエンドトキシン活性の測定
方法において、検査対象試料中に界面活性剤を添加して
なる混合液を超音波処理した後にリムルステストにて測
定することを特徴とするエンドトキシン活性の測定方
法。 （２）該混合液の界面活性剤濃度が０．０１％未満であ
ることを特徴とする、上記（１）記載のエンドトキシン
活性の測定方法。 （３）界面活性剤が陰イオン界面活性剤であることを特
徴とする上記（１）又は（２）記載のエンドトキシン活
性の測定方法。 （４）界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウムである
ことを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載
のエンドトキシン活性の測定方法。 （５）比濁法によってエンドトキシン活性を測定するこ
とを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の
エンドトキシン活性の測定方法。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。
する。
【００１６】本発明で言う検査試料とは、エンドトキシ
ン活性測定を行うことが有効であって、その対象となる
ものであれば何でも良く、例えば中空糸型人工腎臓の充
填液、特に放射線滅菌された中空糸型人工腎臓の充填液
等が好適であるが、特にこれに限定されるものではな
い。
ン活性測定を行うことが有効であって、その対象となる
ものであれば何でも良く、例えば中空糸型人工腎臓の充
填液、特に放射線滅菌された中空糸型人工腎臓の充填液
等が好適であるが、特にこれに限定されるものではな
い。
【００１７】検査試料は無菌的且つパイロジェンフリー
（エンドトキシンフリー）下で採取する。ポリプロピレ
ン製容器や軟質ガラス製容器はエンドトキシンを吸着す
るといわれており、試料と長期にわたって接触させるこ
とは避けた方がよく、２５０℃以上で乾熱処理したＰＹ
ＲＥＸ（登録商標）等の硬質ガラスを用いることが好ま
しい。また、パイロジェンフリーのポリスチレン容器も
好適に使用できる。
（エンドトキシンフリー）下で採取する。ポリプロピレ
ン製容器や軟質ガラス製容器はエンドトキシンを吸着す
るといわれており、試料と長期にわたって接触させるこ
とは避けた方がよく、２５０℃以上で乾熱処理したＰＹ
ＲＥＸ（登録商標）等の硬質ガラスを用いることが好ま
しい。また、パイロジェンフリーのポリスチレン容器も
好適に使用できる。
【００１８】採取した試料をリムルステスト試薬に所定
量分注するが、試料をリムルステスト試薬に添加する前
に、本発明記載の前処理を実施することで、エンドトキ
シン活性測定を正確に実施することが出来る。
量分注するが、試料をリムルステスト試薬に添加する前
に、本発明記載の前処理を実施することで、エンドトキ
シン活性測定を正確に実施することが出来る。
【００１９】先ず、パイロジェンフリーであることが確
認された注射用水に界面活性剤を溶解した界面活性剤溶
液を作製し、測定対象の試料中にクリーンベンチ下で添
加する。本発明において用いられる界面活性剤は、分子
内に親水性部分と疎水性部分を合わせ持ち、表面活性す
なわち液体に溶解したときにその溶液の表面張力を減少
させる活性を有する物質であれば良いが、陰イオン界面
活性剤を使用することが好ましく、陰イオン界面活性剤
としては例えばドデシル硫酸ナトリウムの様なアルキル
硫酸塩やラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の芳
香族系硫酸塩、コール酸塩やデオキシコール酸塩の様な
胆汁酸塩、などがあるが、更に好ましくはコール酸ナト
リウム、デオキシコール酸ナトリウムを使用することが
できる。
認された注射用水に界面活性剤を溶解した界面活性剤溶
液を作製し、測定対象の試料中にクリーンベンチ下で添
加する。本発明において用いられる界面活性剤は、分子
内に親水性部分と疎水性部分を合わせ持ち、表面活性す
なわち液体に溶解したときにその溶液の表面張力を減少
させる活性を有する物質であれば良いが、陰イオン界面
活性剤を使用することが好ましく、陰イオン界面活性剤
としては例えばドデシル硫酸ナトリウムの様なアルキル
硫酸塩やラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の芳
香族系硫酸塩、コール酸塩やデオキシコール酸塩の様な
胆汁酸塩、などがあるが、更に好ましくはコール酸ナト
リウム、デオキシコール酸ナトリウムを使用することが
できる。
【００２０】ここで、添加する界面活性剤の量は、検査
試料に界面活性剤を添加してなる混合液中の界面活性剤
濃度が０．０１％未満となるように、更に好ましくは
０．００５％以下にすることが重要な要件であり、該混
合液中の界面活性剤が多すぎると、逆に阻害的に作用
し、すなわち試料中のエンドトキシンのミセル構造が分
解して活性が損なわれる可能性がある。また、測定に比
濁法を用いている場合には塩析効果でリムルステスト試
薬の白濁を引き起こし正確な測定が不可能になる場合が
あり、該混合液中の界面活性剤濃度を０．０１％未満と
する事が好ましい。
試料に界面活性剤を添加してなる混合液中の界面活性剤
濃度が０．０１％未満となるように、更に好ましくは
０．００５％以下にすることが重要な要件であり、該混
合液中の界面活性剤が多すぎると、逆に阻害的に作用
し、すなわち試料中のエンドトキシンのミセル構造が分
解して活性が損なわれる可能性がある。また、測定に比
濁法を用いている場合には塩析効果でリムルステスト試
薬の白濁を引き起こし正確な測定が不可能になる場合が
あり、該混合液中の界面活性剤濃度を０．０１％未満と
する事が好ましい。
【００２１】界面活性剤の添加方法については特に制限
はないが、添加により試料のエンドトキシンが希釈され
過ぎないようにする事が望ましく、例えば試料容積１０
に対し界面活性剤の添加溶液量を１の比率で加えること
が望ましい。
はないが、添加により試料のエンドトキシンが希釈され
過ぎないようにする事が望ましく、例えば試料容積１０
に対し界面活性剤の添加溶液量を１の比率で加えること
が望ましい。
【００２２】試料に界面活性剤を添加した後には、その
効果を十分に発揮させるため、振とう、攪拌装置を用い
均一に混合することが好ましい。
効果を十分に発揮させるため、振とう、攪拌装置を用い
均一に混合することが好ましい。
【００２３】次に、界面活性剤を添加してなる混合液を
超音波処理することが、本発明の特徴であるが、この超
音波処理により、エンドトキシンのミセル構造形成を促
進することができ、正確にエンドトキシン活性を測定す
ることができる。
超音波処理することが、本発明の特徴であるが、この超
音波処理により、エンドトキシンのミセル構造形成を促
進することができ、正確にエンドトキシン活性を測定す
ることができる。
【００２４】ここで言う超音波とは、一般的に"可聴周
波以上の周波数音波"、すなわち"１６ｋＨｚ以上の音
波"と定義されている。
波以上の周波数音波"、すなわち"１６ｋＨｚ以上の音
波"と定義されている。
【００２５】本発明でいう超音波処理は、特に制限され
るものではないが、水槽内に超音波発信器を備えた市販
の超音波処理器を使用することが出来、処理方法の一例
を記すと、試料の入った容器を水槽中にいれ、超音波処
理を行ったのち、室温で放置する。
るものではないが、水槽内に超音波発信器を備えた市販
の超音波処理器を使用することが出来、処理方法の一例
を記すと、試料の入った容器を水槽中にいれ、超音波処
理を行ったのち、室温で放置する。
【００２６】超音波処理時間は、短すぎると試料の分散
が不十分となり超音波処理の効果が発現できず、長すぎ
ると試料の温度が上昇しエンドトキシンの活性が低下す
る可能性がある。好適な処理時間は超音波発生装置の出
力により変動するが、例えば一般実験向けの卓上超音波
発生装置であれば１５分から２時間程度が好ましく、３
０分程度が特に好ましい。
が不十分となり超音波処理の効果が発現できず、長すぎ
ると試料の温度が上昇しエンドトキシンの活性が低下す
る可能性がある。好適な処理時間は超音波発生装置の出
力により変動するが、例えば一般実験向けの卓上超音波
発生装置であれば１５分から２時間程度が好ましく、３
０分程度が特に好ましい。
【００２７】超音波処理後の放置は試料液温を室温に戻
すことを目的に行い、長すぎるとエンドトキシンの活性
が変化する可能性があるので、１５分から２時間程度が
好ましく、１時間程度の放置がより好ましい。
すことを目的に行い、長すぎるとエンドトキシンの活性
が変化する可能性があるので、１５分から２時間程度が
好ましく、１時間程度の放置がより好ましい。
【００２８】また、試料を入れる容器については、この
超音波処理の振動を試料に与えるために極端に厚みのあ
る容器ではなく１〜３ｍｍ厚さの容器を使うことができ
る。容器の材質は前述したとおりポリプロピレン製では
エンドトキシンの吸着があるため適当ではなく、硬質ガ
ラスかポリスチレン製の容器が好適に使用できる。
超音波処理の振動を試料に与えるために極端に厚みのあ
る容器ではなく１〜３ｍｍ厚さの容器を使うことができ
る。容器の材質は前述したとおりポリプロピレン製では
エンドトキシンの吸着があるため適当ではなく、硬質ガ
ラスかポリスチレン製の容器が好適に使用できる。
【００２９】本発明の処理を施した試料について、リム
ルステストでエンドトキシン活性を測定する。
ルステストでエンドトキシン活性を測定する。
【００３０】リムルステストの方法としては、ゲル化転
倒法、比濁法、比色法等、現在実施されている方式のい
ずれも使用可能であり、既知の方法で測定でき特に限定
されない。リムルステスト試薬は和光純薬製「リムルス
−ＥＳ−Ｔｅｓｔ−Ｗａｋｏ」や生化学工業製「エンド
スペシー」など市販のものを使うことができる。測定試
料を所定量分注しリムルステスト試薬に添加した後、試
薬と試料をよく攪拌し速やかに測定を開始するが、攪拌
後の放置が長いと試料とリムルス試薬との反応が進み正
確な測定ができなくなるので、数十秒内で開始すること
が望ましい。当然のことながら、これらの処理は無菌且
つパイロジェンフリー下で実施する。界面活性剤はリム
ルステストによるエンドトキシン活性測定において、こ
れまで阻害的に寄与すると考えられていたが、本発明の
通り、混合後の界面活性剤濃度が０．０１％未満となる
ように検査対象試料に界面活性剤を微量添加して得られ
る混合液を超音波処理することで、逆に試薬あるいは試
料の阻害や促進を抑制することができる。
倒法、比濁法、比色法等、現在実施されている方式のい
ずれも使用可能であり、既知の方法で測定でき特に限定
されない。リムルステスト試薬は和光純薬製「リムルス
−ＥＳ−Ｔｅｓｔ−Ｗａｋｏ」や生化学工業製「エンド
スペシー」など市販のものを使うことができる。測定試
料を所定量分注しリムルステスト試薬に添加した後、試
薬と試料をよく攪拌し速やかに測定を開始するが、攪拌
後の放置が長いと試料とリムルス試薬との反応が進み正
確な測定ができなくなるので、数十秒内で開始すること
が望ましい。当然のことながら、これらの処理は無菌且
つパイロジェンフリー下で実施する。界面活性剤はリム
ルステストによるエンドトキシン活性測定において、こ
れまで阻害的に寄与すると考えられていたが、本発明の
通り、混合後の界面活性剤濃度が０．０１％未満となる
ように検査対象試料に界面活性剤を微量添加して得られ
る混合液を超音波処理することで、逆に試薬あるいは試
料の阻害や促進を抑制することができる。
【００３１】
【実施例】［実施例１］中空糸型人工腎臓である東レ株
式会社製「トレスルホンＢＳ−１．６ＵＬ」の血液側充
填液を抜き出し、これにエンドトキシン標準品（日本薬
局方標準品２００００ＥＵ／バイアル）をパイロジェン
フリーの注射用水（日本薬局方注射用水：大塚製薬、以
下同じ）に溶解したものを順次パイロジェンフリーの注
射用水で希釈し、０．１２ＥＵ／ｍＬの濃度に調整した
溶液と１：１でポリスチレン製テストチューブ（ファル
コン社製）にて混合して、エンドトキシンの活性が０．
０６ＥＵ／ｍＬである試料を調製した。さらに上記試料
を調製後５日間放置し、リムルステストに対する妨害効
果が充分にみられる状態にした。この試料に１ｍＬ対
し、陰イオン界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム
（１級試薬：和光純薬、以下ＳＤＳと略す）のパイロジ
ェンフリーな溶液を０．１ｍＬ添加した。添加したＳＤ
Ｓの溶液の濃度は０．０５％とした。ＳＤＳ溶液を添加
した試料を卓上ラボミキサー（ＮＳ−８：井内盛栄堂）
で５秒程度攪拌した後、超音波処理器（Ｂ２２１０Ｊ−
ＭＴＨ：ＢＲＡＮＳＯＮ、出力９０Ｗ）でテストチュー
ブごと３０分間超音波処理を行った。超音波処理後、試
料を室温にて１時間放置、冷却した後、リムルステスト
用チューブ（透析液用リムルス試薬０．２ｍＬ用：和光
純薬）に０．２ｍＬ添加し、軽く振とうして試薬を溶解
後、速やかにトキシノメーター（ＥＴ―３０１：和光純
薬）にセットして比濁法にてエンドトキシン活性の測定
を行った。コントロールとして、エンドトキシン標準品
をパイロジェンフリーの注射用水に溶解したものを順次
パイロジェンフリーの注射用水で希釈し、エンドトキシ
ンの活性が０．０６ ＥＵ／ｍＬである試料を調製
し、上記と同様の処理を施して測定を実施した。
式会社製「トレスルホンＢＳ−１．６ＵＬ」の血液側充
填液を抜き出し、これにエンドトキシン標準品（日本薬
局方標準品２００００ＥＵ／バイアル）をパイロジェン
フリーの注射用水（日本薬局方注射用水：大塚製薬、以
下同じ）に溶解したものを順次パイロジェンフリーの注
射用水で希釈し、０．１２ＥＵ／ｍＬの濃度に調整した
溶液と１：１でポリスチレン製テストチューブ（ファル
コン社製）にて混合して、エンドトキシンの活性が０．
０６ＥＵ／ｍＬである試料を調製した。さらに上記試料
を調製後５日間放置し、リムルステストに対する妨害効
果が充分にみられる状態にした。この試料に１ｍＬ対
し、陰イオン界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム
（１級試薬：和光純薬、以下ＳＤＳと略す）のパイロジ
ェンフリーな溶液を０．１ｍＬ添加した。添加したＳＤ
Ｓの溶液の濃度は０．０５％とした。ＳＤＳ溶液を添加
した試料を卓上ラボミキサー（ＮＳ−８：井内盛栄堂）
で５秒程度攪拌した後、超音波処理器（Ｂ２２１０Ｊ−
ＭＴＨ：ＢＲＡＮＳＯＮ、出力９０Ｗ）でテストチュー
ブごと３０分間超音波処理を行った。超音波処理後、試
料を室温にて１時間放置、冷却した後、リムルステスト
用チューブ（透析液用リムルス試薬０．２ｍＬ用：和光
純薬）に０．２ｍＬ添加し、軽く振とうして試薬を溶解
後、速やかにトキシノメーター（ＥＴ―３０１：和光純
薬）にセットして比濁法にてエンドトキシン活性の測定
を行った。コントロールとして、エンドトキシン標準品
をパイロジェンフリーの注射用水に溶解したものを順次
パイロジェンフリーの注射用水で希釈し、エンドトキシ
ンの活性が０．０６ ＥＵ／ｍＬである試料を調製
し、上記と同様の処理を施して測定を実施した。
【００３２】［実施例２］実施例１の試料１ｍＬに対
し、０．０１％のＳＤＳパイロジェンフリー溶液を０．
１ｍＬ添加し、実施例１と同様の超音波処理を経た後に
実施例１と同様に比濁法にてエンドトキシン活性の測定
を行った。コントロールについては、実施例１と同様に
調製した濃度０．０６ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン溶液
に、本例の試料と同様の処理を施し、測定を実施した。
し、０．０１％のＳＤＳパイロジェンフリー溶液を０．
１ｍＬ添加し、実施例１と同様の超音波処理を経た後に
実施例１と同様に比濁法にてエンドトキシン活性の測定
を行った。コントロールについては、実施例１と同様に
調製した濃度０．０６ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン溶液
に、本例の試料と同様の処理を施し、測定を実施した。
【００３３】［実施例３］実施例１の試料１ｍＬに対
し、陰イオン界面活性剤であるデオキシコール酸ナトリ
ウム（生化学用：和光純薬、以下ＳＤOCと略す）パイロ
ジェンフリー溶液を０．１ｍＬ添加した。添加したＳＤ
Ｓの溶液の濃度は０．０５％とした。この後、実施例１
と同様の超音波処理を経た後に実施例１と同様に比濁法
にてエンドトキシン活性の測定を行った。コントロール
については、実施例１と同様に調製した濃度０．０６Ｅ
Ｕ／ｍＬのエンドトキシン溶液に、本例の試料と同様の
処理を施し、測定を実施した。
し、陰イオン界面活性剤であるデオキシコール酸ナトリ
ウム（生化学用：和光純薬、以下ＳＤOCと略す）パイロ
ジェンフリー溶液を０．１ｍＬ添加した。添加したＳＤ
Ｓの溶液の濃度は０．０５％とした。この後、実施例１
と同様の超音波処理を経た後に実施例１と同様に比濁法
にてエンドトキシン活性の測定を行った。コントロール
については、実施例１と同様に調製した濃度０．０６Ｅ
Ｕ／ｍＬのエンドトキシン溶液に、本例の試料と同様の
処理を施し、測定を実施した。
【００３４】［実施例４］実施例１の試料１ｍＬに対
し、０．０１％のＳＤOCのパイロジェンフリー溶液を
０．１ｍＬ添加し、実施例１と同様の超音波処理を経た
後に実施例１と同様に比濁法にてエンドトキシン活性の
測定を行った。コントロールについては、実施例１と同
様に調製した濃度０．０６ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン
溶液に、本例の試料と同様の処理を施し、測定を実施し
た。
し、０．０１％のＳＤOCのパイロジェンフリー溶液を
０．１ｍＬ添加し、実施例１と同様の超音波処理を経た
後に実施例１と同様に比濁法にてエンドトキシン活性の
測定を行った。コントロールについては、実施例１と同
様に調製した濃度０．０６ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン
溶液に、本例の試料と同様の処理を施し、測定を実施し
た。
【００３５】［比較例１］実施例１の試料１ｍＬに対
し、０．０１％のＳＤＳのパイロジェンフリー溶液を
０．１ｍＬ添加した。このＳＤＳ溶液を添加した試料を
卓上ラボミキサー（ＮＳ−８：井内盛栄堂）で５秒程度
攪拌した後、リムルステスト用チューブ（透析液用リム
ルス試薬０．２ｍＬ用：和光純薬）に０．２ｍＬ添加
し、軽く振とうして試薬を溶解後、速やかにトキシノメ
ーター（ＥＴ―３０１：和光純薬）にセットして比濁法
にてエンドトキシン活性の測定を行った。コントロール
については、実施例１と同様に調製した濃度０．０６Ｅ
Ｕ／ｍＬのエンドトキシン溶液に、本例の試料と同様の
処理を施し、測定を実施した。
し、０．０１％のＳＤＳのパイロジェンフリー溶液を
０．１ｍＬ添加した。このＳＤＳ溶液を添加した試料を
卓上ラボミキサー（ＮＳ−８：井内盛栄堂）で５秒程度
攪拌した後、リムルステスト用チューブ（透析液用リム
ルス試薬０．２ｍＬ用：和光純薬）に０．２ｍＬ添加
し、軽く振とうして試薬を溶解後、速やかにトキシノメ
ーター（ＥＴ―３０１：和光純薬）にセットして比濁法
にてエンドトキシン活性の測定を行った。コントロール
については、実施例１と同様に調製した濃度０．０６Ｅ
Ｕ／ｍＬのエンドトキシン溶液に、本例の試料と同様の
処理を施し、測定を実施した。
【００３６】［比較例２］実施例１の試料１ｍＬに対
し、０．０５％のＳＤＯＣパイロジェンフリー溶液を
０．１ｍＬ添加し、比較例１と同様の超音波処理を経た
後に比較例１と同様に比濁法にてエンドトキシン活性の
測定を行った。コントロールについては、比較例１と同
様に調製した濃度０．０６ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン
溶液に、本例の試料と同様の処理を施し、測定を実施し
た。
し、０．０５％のＳＤＯＣパイロジェンフリー溶液を
０．１ｍＬ添加し、比較例１と同様の超音波処理を経た
後に比較例１と同様に比濁法にてエンドトキシン活性の
測定を行った。コントロールについては、比較例１と同
様に調製した濃度０．０６ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン
溶液に、本例の試料と同様の処理を施し、測定を実施し
た。
【００３７】［比較例３］実施例１の試料１ｍＬに対
し、０．０１％のＳＤＯＣパイロジェンフリー溶液を
０．１ｍＬ添加し、比較例１と同様の超音波処理を経た
後に比較例１と同様に比濁法にてエンドトキシン活性の
測定を行った。コントロールについては、実施例１と同
様に調製した濃度０．０６ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン
溶液に、本例の試料と同様の処理を施し、測定を実施し
た。
し、０．０１％のＳＤＯＣパイロジェンフリー溶液を
０．１ｍＬ添加し、比較例１と同様の超音波処理を経た
後に比較例１と同様に比濁法にてエンドトキシン活性の
測定を行った。コントロールについては、実施例１と同
様に調製した濃度０．０６ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン
溶液に、本例の試料と同様の処理を施し、測定を実施し
た。
【００３８】［比較例４］実施例１の試料１ｍＬに対
し、パイロジェンフリーな注射用水を０．１ｍＬ添加
し、比較例１と同様の超音波処理を経た後に比較例１と
同様に比濁法にてエンドトキシン活性の測定を行った。
コントロールについては、実施例１と同様に調製した濃
度０．０６ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン溶液に、本例の
試料と同様の処理を施し、測定を実施した。
し、パイロジェンフリーな注射用水を０．１ｍＬ添加
し、比較例１と同様の超音波処理を経た後に比較例１と
同様に比濁法にてエンドトキシン活性の測定を行った。
コントロールについては、実施例１と同様に調製した濃
度０．０６ＥＵ／ｍＬのエンドトキシン溶液に、本例の
試料と同様の処理を施し、測定を実施した。
【００３９】いずれの実施例、比較例について以下の式
１に従って回収率を算出し、測定結果の正確性を評価し
た。第十三改正日本薬局方などによると、実施例及び比
較例において採用された比濁法によるエンドトキシン活
性の測定において、許容される回収率は５０％〜２００
％の範囲内であるとされており、該実施例、比較例にお
いても回収率がこの範囲に収まるかをもって正確性を判
断した。 （式１） 回収率 ＝ (試料のエンドトキシン活性)／(コントロー
ルのエンドトキシン活性)×１００(％) 結果を表１にまとめて示す。（表１）
１に従って回収率を算出し、測定結果の正確性を評価し
た。第十三改正日本薬局方などによると、実施例及び比
較例において採用された比濁法によるエンドトキシン活
性の測定において、許容される回収率は５０％〜２００
％の範囲内であるとされており、該実施例、比較例にお
いても回収率がこの範囲に収まるかをもって正確性を判
断した。 （式１） 回収率 ＝ (試料のエンドトキシン活性)／(コントロー
ルのエンドトキシン活性)×１００(％) 結果を表１にまとめて示す。（表１）
【００４０】
【表１】
【００４１】
【発明の効果】本発明の測定方法を用いれば、リムルス
テストを妨害するような物質が混在する試料において
も、正確にかつ迅速にエンドトキシンの活性を測定出来
る。
テストを妨害するような物質が混在する試料において
も、正確にかつ迅速にエンドトキシンの活性を測定出来
る。
Claims (7)
- 【請求項１】リムルステストによるエンドトキシン活性
の測定方法において、検査対象試料中に界面活性剤を添
加してなる混合液を超音波処理した後にリムルステスト
にて測定することを特徴とするエンドトキシン活性の測
定方法。 - 【請求項２】該混合液の界面活性剤濃度が０．０１％未
満であることを特徴とする請求項１記載のエンドトキシ
ン活性の測定方法。 - 【請求項３】該界面活性剤が陰イオン界面活性剤である
ことを特徴とする請求項１又は２記載のエンドトキシン
活性の測定方法。 - 【請求項４】該界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウ
ムであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記
載のエンドトキシン活性の測定方法。 - 【請求項５】該試料が中空糸型人工腎臓の充填液である
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のエン
ドトキシン活性の測定方法。 - 【請求項６】該試料が放射線滅菌された中空糸型人工腎
臓の充填液であることを特徴とする請求項１〜５のいず
れかに記載のエンドトキシン活性の測定方法。 - 【請求項７】比濁法によってエンドトキシン活性を測定
することを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載
のエンドトキシン活性の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002030691A JP2003232794A (ja) | 2002-02-07 | 2002-02-07 | エンドトキシン活性の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002030691A JP2003232794A (ja) | 2002-02-07 | 2002-02-07 | エンドトキシン活性の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003232794A true JP2003232794A (ja) | 2003-08-22 |
Family
ID=27774345
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002030691A Pending JP2003232794A (ja) | 2002-02-07 | 2002-02-07 | エンドトキシン活性の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003232794A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103454235A (zh) * | 2013-09-13 | 2013-12-18 | 广州康盛生物科技有限公司 | 一种超声辅助测定血浆中细菌内毒素含量的方法 |
| JP7002712B2 (ja) | 2017-07-06 | 2022-01-20 | 国立大学法人信州大学 | エンドトキシンの検出方法および検出装置 |
-
2002
- 2002-02-07 JP JP2002030691A patent/JP2003232794A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103454235A (zh) * | 2013-09-13 | 2013-12-18 | 广州康盛生物科技有限公司 | 一种超声辅助测定血浆中细菌内毒素含量的方法 |
| CN103454235B (zh) * | 2013-09-13 | 2016-04-20 | 广州康盛生物科技有限公司 | 一种超声辅助测定血浆中细菌内毒素含量的方法 |
| JP7002712B2 (ja) | 2017-07-06 | 2022-01-20 | 国立大学法人信州大学 | エンドトキシンの検出方法および検出装置 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3242733B2 (ja) | エンドトキシン特異的測定剤 | |
| JP3322700B2 (ja) | 固相系反応用エンドトキシン特異的測定剤 | |
| CN107907691A (zh) | 一种肌红蛋白检测试剂盒及其使用方法 | |
| WO2018071813A1 (en) | Devices and methods to reduce interfering compounds in biological samples | |
| CN111141909B (zh) | 一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法 | |
| EP2713162B1 (en) | Measurement method and measurement kit of antibiotics concentration | |
| JP2007064895A (ja) | 生体適用材料のエンドトキシン測定のための前処理方法及びエンドトキシンの測定方法 | |
| JP2003232794A (ja) | エンドトキシン活性の測定方法 | |
| US4141856A (en) | Reference material for establishing anion concentrations in analytical chemistry tests | |
| JP2006194606A (ja) | エンドトキシン活性の測定方法 | |
| US5876955A (en) | Endotoxin stabilizing agent, endotoxin composition and method for assaying endotoxin | |
| AU2015328052B2 (en) | Dissolution testing of hydrophobic active pharmaceutical ingredients such as avermectins with or without pyrantel | |
| CN105445467B (zh) | 焦亚硫酸钠细菌内毒素的检测方法 | |
| CN105985871A (zh) | 一种清洗剂 | |
| Nightingale et al. | Physiologic surface‐active agents and drug absorption III: Effect of bile salt on drug absorption in goldfish | |
| CN114875114A (zh) | 一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1质控品及其制备方法 | |
| Li et al. | Preparation and application of a trimethoprim ion-selective piezoelectric sensor | |
| JP3825812B2 (ja) | 固体表面の処理剤 | |
| JP2000137030A (ja) | 免疫測定方法 | |
| JP3365848B2 (ja) | リムルス試薬およびリムルス試薬反応性物質の測定法 | |
| JPH11201973A (ja) | エンドトキシン特異的ライセートの製造方法 | |
| Bryant | Divalent cation requirements for leukocyte adhesiveness | |
| Lou et al. | One-step Electronic Monitoring of Tetracycline Residue within 5 min Based on the Competitive Displacement Reaction between the Antigen and Pseudo Hapten for the Target Antibody | |
| JP3512524B2 (ja) | リムルステスト試薬およびリムルステスト反応性物質の測定法 | |
| JP2007199056A (ja) | エンドトキシン活性の測定方法 |