JP3512524B2 - リムルステスト試薬およびリムルステスト反応性物質の測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、エンドトキシン（以
下、Ｅｔということもある）、（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカン（以下、β−グルカンということもある）などの
リムルステスト反応性物質を測定するに際して、リムル
ステスト試薬を溶液状態で長時間安定に保持することが
できるリムルステスト試薬、およびそれを用いてリムル
ステスト反応性物質を測定する測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】カブトガニ・アメボサイト・ライセート
（以下単にライセートともいう）を使用して、Ｅｔを測
定する方法（この測定法は一般的に「リムルステスト」
と呼ばれ、この測定に関与するライセートの反応は「リ
ムルス反応」と呼ばれている）が従来から知られてお
り、検出感度が非常に高いため、医薬品、水などの汚染
試験、臨床検査など多方面に汎用されている。この方法
は、微量のＥｔによりライセートが凝固することに基づ
いているが、その後の生化学的解明により、該反応はい
くつかの凝固因子の段階的活性化より成ることが明らか
にされている（J. Protein Chem., 5, 255-268(1986))
。

【０００３】この反応を、例えば日本産カブトガニ（Ta
chypleus tridentatus）から得られるライセートによ
り、図１を用いて説明すると、ライセートにＥｔが加わ
ると、ライセート中に存在するＣ因子（Ｅｔ感受性因
子、分子量１２３，０００）が活性化され、生成した活
性型Ｃ因子がＢ因子（分子量６４，０００）の特定箇所
を限定水解して活性型Ｂ因子を生成し、活性型Ｂ因子は
プロクロッティングエンザイム（分子量５４，０００）
を活性化してクロッティングエンザイムに変換し、クロ
ッティングエンザイムはコアギュロゲン（凝固タンパ
ク、分子量１９，７２３）のジスルフィド結合で架橋さ
れたループ内の特定箇所、すなわち…Ａｒｇ¹⁸−Ｔｈｒ
¹⁹…の間および…Ａｒｇ⁴⁶−Ｇｌｙ⁴⁷…の間を限定水解
してＨ−Ｔｈｒ ¹⁹…Ａｒｇ⁴⁶−ＯＨで表されるペプチド
Ｃ（アミノ酸２８残基）を遊離しつつ残余の部分がコア
ギュリンゲルに変換される、という一連の反応（カスケ
ード反応とも呼ばれる；以下Ｅｔによる活性化に起因す
るカスケード反応をＣ因子系反応という）である。

【０００４】一方、ライセートはＥｔだけでなくβ−グ
ルカンが加わっても反応することが知られている。すな
わち、図１におけるＧ因子（β−グルカン感受性因子）
が活性化され、生成する活性型Ｇ因子がプロクロッティ
ングエンザイムをクロッティングエンザイムに活性化
し、コアギュリンゲルを生成するというカスケード反応
が起こる（以下β−グルカンによる活性化に起因するカ
スケード反応をＧ因子系反応という）。

【０００５】また、上記の各カスケード反応により生成
するクロッティングエンザイムは、反応系に別に添加さ
れる合成基質、例えばｔ−ブトキシカルボニル−ロイシ
ル−グリシル−アルギニン−パラニトロアニリド（Ｂｏ
ｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）のアミド結合を
水解してパラニトロアニリンを遊離させる。したがっ
て、生成した発色物質（パラニトロアニリン）の吸光度
を測定することによりＥｔまたはβ−グルカンの定量が
行われている。

【０００６】さらに、ＥｔによるＣ因子の活性化及びβ
−グルカンによるＧ因子の活性化に際しては、カルシウ
ムやマグネシウムのような２価金属イオンの適当量が必
須であることも知られている。これらの反応原理に基づ
いて調製され市販されているリムルステスト試薬は、通
常、ライセートと２価金属塩あるいはこれらにさらに合
成基質を添加して凍結乾燥したものである。測定に際し
ては、これら凍結乾燥物を水、検体溶液または緩衝液で
溶解して用いている。

【０００７】しかし、このようなリムルステスト試薬
は、その溶解時に最適な反応条件（ｐＨおよび２価金属
イオン濃度等）状態となっているため、いったん溶解し
たリムルステスト試薬を保存すると、溶液状態ではきわ
めて安定性が悪い。つまり、リムルステスト試薬調製時
にごく微量混入したリムルステスト反応性物質のため
に、低温に保存しておいても時間の経過とともに前記の
各因子が活性化され、ブランク値が高まり、検体測定時
に一定の反応値が得られなくなる。

【０００８】ライセートの活性化をあらかじめ抑制し、
ライセートを安定化する方法については、特開平２−１
８７６６３号公報に記載されている。これはライセート
または凝固酵素前駆体を含有するその抽出物の水性分散
液を、試料中の内毒素を分析する方法に使用する前に、
水溶液のｐＨを６．０以下の値または８．０以上の値に
維持する方法である。また該公報には、欧州特許第７４
７１６１号明細書においては凍結乾燥前にライセートを
ｐＨ６．５〜７．５に緩衝し、米国特許第４０３８０２
９号明細書においては凍結乾燥前にライセートをｐＨ
６．５〜６．８に緩衝すること、また米国特許第４３２
２２１７号明細書では、凍結乾燥前にライセートを活性
ｐＨ範囲に、好ましくは６．５〜７．５に緩衝すべきで
あること、またライセートをｐＨ５．５〜８．５内に緩
衝し得るとも記述している旨の記載がある。また、欧州
特許出願第０２２４８３０号明細書には２タイプの固相
状態のデバイスが開示されており、第１の実施態様にお
いてはライセートを乾燥前にｐＨ６．３〜７．５に緩衝
し、第２の実施態様においてはライセートをｐＨ７．５
〜８．５に緩衝することが記述されている旨の記載があ
る。これらは全てｐＨを調整することによるライセート
の時期尚早な活性化を抑制する方法である。

【０００９】また特開平２−１８７６６３号公報中に
は、「米国特許第４３０１２４５号明細書において、凍
結乾燥前に溶解物にヘパリンを加えて時期尚早のゲル化
を防止することにより溶解物の安定性を向上する。」と
記載されており、また「従来技術における全ての溶解物
安定化方法についての問題点は、保管寿命及び他の処理
操作に際しての安定性の向上が依然として満足の行くも
のではないことである」と記載されている。

【００１０】また、ライセートは、リムルス反応の最適
な反応条件ではない溶液状態で保存すると、失活して逆
に反応性が低下する場合もあり、一定の反応値が得られ
なくなる。従来の安定化されたライセートは、溶液（溶
解物分散液）状態においては低温で保持する必要があっ
た。例えば特開平２−１８７６６３号公報に記載された
発明の方法により処理されたライセート（ＬＡＬ）は、
「通常は約４℃といった低温で１就業日の終日、即ち７
時間維持され得る適当な安定性を有する」との記載があ
る。室温での安定性に関しては言及されていないが、低
温での安定性には及ばないと思われる。

【００１１】このようにライセートは非常に不安定なも
のであり、従ってリムルステスト試薬は溶解後は直ちに
使用し、残りは捨てるのが一般的であった。そのため、
検体数が少ない場合は非常に高価な測定法となってしま
っていた。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】ライセートの活性化を
抑制し、かつ失活を抑制した状態で長時間安定に保つこ
とができれば、従来であれば捨ててしまっていたリムル
ステスト試薬をも有効に活用することができるので、測
定のコストを下げることができる。また人工透析におけ
るＥｔ値の経時変化のモニタリングのように、長時間に
わたって自動的にＥｔ量を測定するためには、室温状態
において長時間ライセートが活性化せず、かつ失活もし
ないリムルステスト試薬が必要であり、この開発が望ま
れていた。

【００１３】本発明は上記観点からなされたものであ
り、リムルステスト試薬を用いて検体中のリムルステス
ト反応性物質を測定するに際し、いったん溶解したリム
ルステスト試薬溶液の安定性を高め、室温で長時間経て
も一定の反応値が得られるようなリムルステスト試薬及
びそのリムルステスト試薬を使用するリムルステスト反
応性物質の測定方法を提供することを課題とする。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の課題
を解決するために、ライセート中の各凝固因子を活性化
させることもなく、かつ失活させることなく、特に溶液
状態かつ室温で長時間安定に保つことのできるリムルス
テスト試薬及びその試薬を用いるリムルステスト反応性
物質を測定する方法について鋭意検討した。その結果、
ライセートをキレート剤と共存させ、溶液状態の時特定
のｐＨを示すように調整されれば、リムルス試薬溶液を
活性化させることもなく、かつ失活させることもなく、
室温で長時間安定に保持できること、さらにそのリムル
ステスト試薬溶液に適当な２価金属塩を添加し、リムル
ス反応を惹起するｐＨに調整し、ペプチド合成基質等を
添加するのみで通常のリムルス反応を惹起させることが
でき、リムルステスト反応性物質を、リムルステスト試
薬溶解後長時間経ても正確に測定する方法を見出し、本
発明に到達した。

【００１５】すなわち本発明は、 カブトガニ・アメボサイト・ライセートとキレート
剤とからなる、溶液状態において室温で少なくとも８時
間安定であるカブトガニ・アメボサイト・ライセート組
成物からなることを特徴とするリムルステスト試薬、 カブトガニ・アメボサイト・ライセート組成物が溶
液状態においてｐＨ５．０〜９．０となるように調整さ
れることを特徴とする前記記載のリムルステスト試
薬、 カブトガニ・アメボサイト・ライセート組成物が溶
液または凍結乾燥物であることを特徴とする前記また
はに記載のリムルステスト試薬、 ２価金属塩、測定用ｐＨ調整剤およびペプチド合成
基質からなる群から選ばれた１種または２種以上と前記
〜のいずれか１項に記載のリムルステスト試薬から
なることを特徴とするリムルステスト試薬キット、 リムルステスト試薬を用いて検体中のリムルステス
ト反応性物質を測定するに際し、前記記載のリムルス
テスト試薬を用い、リムルス反応時の反応混液のｐＨが
リムルス反応を惹起する範囲のｐＨとなるように調整す
ることを特徴とするリムルステスト反応性物質の測定
法、 リムルス反応を惹起する範囲のｐＨが７．０〜８．
５である前記に記載のリムルステスト反応性物質の測
定法、 ｐＨをリムルス反応を惹起する範囲のｐＨに調整す
る際または調整前、リムルス反応を惹起することができ
る２価金属イオン濃度になるように２価金属塩を添加す
る前記またはに記載のリムルステスト反応性物質の
測定法、および ｐＨをリムルス反応を惹起する範囲のｐＨに調整す
る際、調整前または調整後、カブトガニ・アメボサイト
・ライセートに含まれるクロッティングエンザイムのア
ミダ−ゼ活性を測定するためのペプチド合成基質を添加
してリムルス反応を起こさせる前記〜のいずれか１
項に記載のリムルステスト試薬反応性物質の測定法であ
り、これにより上記課題を解決できる。

【００１６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
リムルステスト試薬は、基本的にはライセートとキレー
ト剤を含むカブトガニ・アメボサイト・ライセート組成
物（以下、単にライセート組成物ともいう）からなり、
このライセート組成物を溶液とした時にｐＨが５．０〜
９．０、好ましくはｐＨ６．０〜８．５を示すものであ
れば、その保存形態は制限されず溶液でも固体でもかま
わない。固体の場合は凍結乾燥物が好ましい。また、リ
ムルステスト試薬が固体の場合、リムルステスト試薬を
溶液とする時に使用する溶媒は、測定対象物を含まない
水自体が最も好ましいが、上記ｐＨに影響を与えない範
囲の緩衝液等でもよい。

【００１７】本発明のリムルス試薬のライセート組成物
に使用されるライセートとしては、上記条件を満足すれ
ば、特に制限はない。該ライセートとしては、リムルス
・ポリフェムス（Limulus polyphemus）、タキプレウ
ス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）、タ
キプレウス・ギガス（T. gigas）、カルシノスコルピウ
ス・ロツンディカウダ（Carcinoscorpius rotundicaud
a）等のカブトガニ血リンパ液から、通常の方法（例え
ば、J. Biochem., 80, 1011-1021(1976)参照）により調
製した血球抽出物またはその加工物を挙げることができ
る。

【００１８】また、本発明のリムルス試薬の主体である
ライセート組成物は、種々の化学物質を包含し得る。具
体的には、ライセート組成物は、前記血球抽出物または
その加工物にＣ因子及びＧ因子の活性化に有効な２価金
属塩〔例えば、マグネシウム、カルシウム、ストロンチ
ウムなどのアルカリ土類金属のハロゲン化水素酸塩（塩
化物など）、硫酸塩等〕、クロッティングエンザイムの
基質（例えば、前記のＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−ｐＮＡのようなペプチド合成基質）を必要に応じて添
加したものであってもよい。好ましくは、これら２価金
属塩やペプチド合成基質を添加せず、別途、使用時に使
えるようにキット化したものが挙げられる。また、リム
ルステスト反応性物質の測定に際し、リムルス反応を惹
起させるためのｐＨに調整するためのｐＨ調整剤（本明
細書において、測定用ｐＨ調整剤という）は、例えば、
トリス−塩酸緩衝液、２−〔４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥ
Ｓ）緩衝液などの緩衝剤等が挙げられ、本発明のキット
に添付される。

【００１９】上記加工物とは、例えば、ライセートをク
ロロホルム等の有機溶媒で抽出処理したり、界面活性剤
を添加してＥｔに対する感受性を向上させたものが挙げ
られる。また、ライセートには、通常、Ｅｔ感受性因子
（Ｃ因子）およびβ−グルカン感受性因子（Ｇ因子）の
両方が含まれるが、上記加工物としては、デキストラン
硫酸、スルホプロピル基等を結合した担体または特異的
な吸着担体等を用いてライセートを処理し、上記Ｃ因子
またはＧ因子の何れか一方の因子を分画もしくは除去し
てＥｔまたはβ−グルカンの一方のみに特異的に反応す
るように加工されたものが挙げられる。

【００２０】さらに、ライセートに、例えば（１→３）
−β−Ｄ−グルコシド構造単位が特定個数結合したポリ
グルコシドを共存させることによって、Ｇ因子の活性化
を阻害し、Ｅｔにのみ反応するように加工したものも上
記加工物に包含される。尚、ライセートとしては、市販
のものも使用することができる。本発明のリムルステス
ト試薬を構成するライセート組成物に含まれるキレート
剤としては、金属イオンに配位して安定な錯化合物を形
成するものであればとくに制限はないが、ＥＤＴＡ（エ
チレンジアミン４酢酸）、ＧＥＤＴＡ（ビス（２−アミ
ノエチル）エチレングリコ−ル４酢酸；グリコ−ルエ−
テルジアミノ４酢酸）、ＢＡＰＴＡ（アミノフェニルエ
チレングリコ−ル４酢酸）、クエン酸塩、ＮＴＡ（ニト
リロ三酢酸）、リン酸等が使用でき、ＥＤＴＡ、ＧＥＤ
ＴＡ、クエン酸塩が特に好ましい。また、クエン酸塩と
しては、クエン酸のアルカリ金属塩が特に好ましい。

【００２１】本発明のリムルステスト試薬を使用してリ
ムルステスト反応性物質を測定するには、ｐＨ５．０〜
９．０、好ましくはｐＨ６．０〜８．５に調整されたラ
イセート組成物を、リムルス反応時の反応混液のｐＨが
リムルス反応を惹起する範囲のｐＨ、通常、７．０〜
８．５になるように測定用ｐＨ調整剤により調整する、
及びそのｐＨ調整の際または調整前に、リムルス反応を
惹起することができる２価金属イオン濃度になるように
２価金属塩を添加する。

【００２２】また、本発明のリムルステスト試薬は上記
ｐＨ範囲に調整され、２価金属が共存すると検体に含ま
れるリムルステスト反応性物質によりリムルス反応が起
こる。このリムルス反応は、従来公知の手段により基質
の変化から測定される。なお、本発明においてリムルス
テスト反応性物質とは、リムルス反応を惹起する物質を
意味し、具体的にはＥｔ、β−グルカン等が挙げられ
る。

【００２３】本発明で使用されるペプチド合成基質はク
ロッティングエンザイムの基質になるようなものであれ
ば、特に限定されない。すなわち、クロッティングエン
ザイムのアミダーゼ活性の測定には、基質として、例え
ば前記のｐ−ニトロアニリンのような発色性残基を有す
るペプチド合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−ｐＮＡ）もしくは発色性残基を有するこれと類似の配
列（例えば、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ、
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ等）のペプチド合成基質、または
これと同一もしくは類似の配列のペプチドであって、Ｃ
末端のアミノ酸のカルボキシル基に前記発色性残基の代
わりに公知の発蛍光性残基、発光性残基、アンモニアな
どがアミド結合により置換したペプチド合成基質を使用
することができる（特公昭５９−１９５３２、特公昭６
１−５４４００、特公昭６３−２６８７１）。クロッテ
ィングエンザイムがこれらの合成基質に作用して生成す
る反応生成物を測定することによって、アミダーゼ活性
の測定を行うことができる。具体的には、反応（カスケ
ード反応および必要に応じてその、他色素等への変換反
応）によって生成する色素、蛍光物質またはアンモニア
をそれぞれ分光光度計、蛍光光度計、化学発光測定装
置、アンモニア検出用電極（特開昭６２−１４８８６
０）等によって測定する方法を例示することができる。

【００２４】また、クロッティングエンザイムのプロテ
アーゼ活性の測定には、ライセート中に含まれる（もし
くは別途添加した）コアギュロゲン（基質）にクロッテ
ィングエンザイムが作用してコアギュリンゲルが生成す
る際のゲル形成反応を、例えば適当な機器（例えば、濁
度測定装置、粘度測定装置等）で測定するか、または肉
眼で判定する方法を採用することができる。

【００２５】本発明のリムルステスト反応性物質測定法
においては、上記リムルス反応を惹起する範囲のｐＨに
調整する際、調整前または調整後、カブトガニ・アメボ
サイト・ライセートに含まれるクロッティングエンザイ
ムのアミダ−ゼ活性を測定するための基質、好ましくは
ペプチド合成基質がライセート組成物溶液に添加される
ことが好ましい。尚、ライセート組成物が基質を既に含
む場合はその必要はない。

【００２６】ここで、ライセート組成物溶液は、リムル
ス反応に必要な所要量が分取されるような機構を有し
て、その分取量と上記２価金属塩、測定用ｐＨ調整剤、
基質等とが混和されリムルステスト反応性物質との接触
によりリムルステスト試薬が活性化されるようにするこ
とが好ましい。この混和の態様は、目的に応じて種々選
定でき、２価金属塩および基質を混和して一緒に使用し
ても、あるいはそれらの少なくとも一方を測定用ｐＨ調
整剤と混和して一緒にして使用してもよい。測定用検体
とリムルステスト試薬との混合の時期は、特に制限はな
いがリムルステスト試薬を活性化させるときに添加され
ることが好ましい。

【００２７】本発明のライセート組成物は、溶液状態で
室温（２０〜２５℃）において少なくとも８時間、４℃
では１６時間以上は安定であるから、各種検体に含まれ
るＥｔ、β−グルカン等の濃度の経時変化を長時間にわ
たってモニタリングする上で非常に有用である。なお、
本発明においてリムルステスト試薬が「安定である」と
は、検体を添加しない時、ライセート中の前記各因子の
非特異的な活性化および失活が実質的にないことであ
る。具体的には「活性化」によってブランク値が異常に
高くなり、「失活」によって検体の反応値が異常に低く
なる。換言すれば、そのリムルステスト試薬を使用して
Ｅｔ、β−グルカン等のリムルステスト反応性物質を測
定する際に、ブランク値が十分に低く、検体の反応値が
一定である場合、「安定である」といえる。

【００２８】本発明で使用される測定用ｐＨ調整剤は中
性〜アルカリ性のものならば特に限定はされないが、ト
リス−塩酸緩衝液やグッド緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ
緩衝液等）等が好ましい。ｐＨは７．０〜８．５が好ま
しい。本発明によりリムルステスト反応性物質が測定さ
れる検体としては、基本的には特に制限なく、リムルス
テスト反応性物質の定量の必要があるものあるいはその
存否を確認する必要があるものであればよい。例えば、
生体試料、医薬品、透析液、医療分野で使用する水等を
挙げることができる。

【００２９】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１ T.tridentatus 血リンパ液１．０Ｌを４℃、１，５００
rpm で１０分間遠心し、その沈殿部分（アメボサイト）
約２１g に０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）２１０ｍＬを加え、ホモゲナイザー（ポリトロンＲ
ＰＴ１０（商品名）、Kinematica社製造）にて均一に
破砕および抽出し、１０，０００×Ｇで３０分間冷却遠
心し、上澄液（ライセート）１９０ｍＬを得た。

【００３０】Ａ）このライセート０．０４ｍＬに０．４
Ｍ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）０．０１ｍ
Ｌと０．０２１Ｍ ＥＤＴＡ−４Ｎａ ０．０２ｍＬを
加え、ｐＨ６．５の条件で室温（２０℃）に８時間放置
した（２系列放置）。 Ｂ）別のライセート０．０４ｍＬに０．４Ｍ硫酸マグネ
シウム含有０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
０．０４ｍＬと４．０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２ｍＬを加え（通常の発色合成基
質法リムルステスト試薬溶液；比較例）、ｐＨ８．０の
条件で同様に放置した。

【００３１】Ａの一方には１．６Ｍ硫酸マグネシウム含
有２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．０１ｍＬ
及び４．０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ
ＮＡ０．０２ｍＬを加え（Ａ−１）、もう一方には、
１．６Ｍ硫酸マグネシウム０．０１ｍＬ、上記の発色合
成基質溶液０．０２ｍＬを加えた（Ａ−２）後、Ａ、Ｂ
に検体として、蒸留水（以下、ＤＷ、これをブランクと
して用いる）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）０１１１：Ｂ４株由来のＥｔ（シグマ社販売
のＷｅｓｔｐｈａｌ ｔｙｐｅ；５０ｐｇ／ｍＬ）を
０．１ｍＬ加え、Ａ−1 とＢはｐＨ８．０とし、Ａ−２
はｐＨ６．５のままとした。それらを３７℃、３０分間
加温して反応させ、生じたパラニトロアニリンを０．０
４％亜硝酸ナトリウム（０．４８Ｍ塩酸溶液）、０．３
％スルファミン酸アンモニウム、０．０７％Ｎ−１−ナ
フチルエチレンジアミン二塩酸塩を各々０．５ｍＬずつ
順次加えてジアゾカップリングさせ、５４５ｎｍで吸光
度を測定した。それらの結果とＡ、Ｂとも室温に放置せ
ず調製後直ちに測定した結果と合わせて表１に示した。

【００３２】

【表１】

【００３３】表１から明らかなように、比較例である
Ｂ、即ち、放置時にリムルス反応の最適な反応条件とな
っている通常の発色合成基質法リムルステスト試薬溶液
を室温に８時間放置すると活性化されてブランク値が非
常に高まり、Ｅｔ検体溶液の反応値（Ｅｔ検体の吸光度
とブランクの吸光度との差）が低下し、一定の測定値が
得られないため濃度未知のＥｔを正確に定量できない。
一方、本発明の実施例Ａ−１では、ブランク値もほとん
ど上昇せず、Ｅｔ検体の反応値も放置しないときの値と
ほぼ同一で、８時間後でも活性化も失活も起こらず一定
の測定値が得られることがわかる。

【００３４】また、リムルス反応を惹起するｐＨにせ
ず、放置ｐＨの６．５のままで測定したＡ−２では、Ｅ
ｔ検体反応値はブランク値より少し高い程度で、非常に
反応性が低く、正確な定量値が得られない。 実施例２ Ａ）実施例１で調製したライセート０．０４ｍＬに０．
０６Ｍ ＧＥＤＴＡ０．０１ｍＬと０．３Ｍ ２−モル
ホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．
１）０．０１ｍＬを加え、ｐＨ６．１の条件で４℃に２
４時間放置した（２系列放置）。

【００３５】Ｂ）実施例１で調製した別のライセート
０．０４ｍＬに０．４Ｍ塩化マグネシウム含有０．５Ｍ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）０．０４ｍＬと４．
０ｍＭＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０
２ｍＬを加え（通常の発色合成基質法リムルス試薬溶
液；比較例）、ｐＨ７．６の条件で同様に放置した。Ａ
の一方には１．６Ｍ塩化マグネシウム０．０１ｍＬ、２
Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）０．０１ｍＬ及び
４．０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
０．０２ｍＬを加え（Ａ−１）、もう一方には、１．６
Ｍ塩化マグネシウム０．０１ｍＬ、ＤＷ０．０１ｍＬお
よび上記の発色合成基質溶液０．０２ｍＬを加えた（Ａ
−２）後、Ａ、Ｂに検体としてＤＷ（ブランク）または
後述により調製したβ−グルカン（１００ｐｇ／ｍＬ）
を０．１ｍＬ加え、Ａ−1 とＢは、ｐＨ７．６とし、Ａ
−２はｐＨ６．１のままとした。以下、それらを実施例
１と同様にして反応させた。Ａ、Ｂとも４℃に放置せず
調製後直ちに測定した結果と合わせて表２に示した。

【００３６】

【表２】

【００３７】表２から明らかなように、比較例Ｂ、即
ち、放置時にリムルス反応の最適な反応条件となってい
る通常の発色合成基質法リムルステスト試薬溶液を４℃
に２４時間放置すると活性化されてブランク値が非常に
高まり、β−グルカン検体溶液の反応値が低下し、一定
の測定値が得られない。一方、本発明の実施例Ａ−１で
は、ブランク値もほとんど上昇せず、β−グルカン検体
の反応値も放置しないときの値とほぼ同一で、２４時間
後でも活性化も失活も起こらず一定の測定値が得られる
ことがわかる。

【００３８】また、ｐＨ６．１のままで測定したＡ−２
では、β−グルカン検体反応値はブランク値よりやや高
い程度で、ほとんど反応しておらず、正確な定量値が得
られない。 （β−グルカンの調製法）ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／０
２９５１に記載の方法に準じ、カードラン（和光純薬工
業（株）販売）の１ｇを約１００ｍＬの５ｍＭ ＮａＯ
Ｈ水溶液に懸濁し、氷冷下で音波発生機、ソニケーター
^TM（大岳製作所、形式５２０２ＰＺＴ、東京）により２
０ＫＨ_Z、８０Ｗで１２分間音波処理による低分子化を
行った。処理液を５Ｍ ＮａＯＨ水溶液を用い、最終
０．３Ｍ水溶液とし、ゲルパーミエーションクロマトグ
ラフィー（ＧＰＣカラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００
ＰＷ_XL２本、Ｇ２５００ＰＷ_XL １本、移動相：０．３
Ｍ ＮａＯＨ水溶液、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ）により
分画採取し、再クロマトグラフィーにより分子量２１
６，０００画分を分画採取し、ＧＰＣ分画精製標品（β
−グルカン標品）を得た。

【００３９】尚、以下の実施例に使用されたβ−グルカ
ンも、上記と同様に調製されたものである。 実施例３ Ａ）実施例１で調製したライセート０．０８ｍＬに０．
１Ｍ ＥＤＴＡ−４Ｎａ含有０．４Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
５．０）０．０１ｍＬを加え、ｐＨ５．０の条件で４℃
に１６時間放置した（２系列放置）。

【００４０】Ｂ）実施例１で調製した別のライセート
０．０８ｍＬに０．４Ｍ硫酸マグネシウム含有１Ｍ ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．０２ｍＬを加え
（通常のゲル化法リムルステスト試薬溶液；比較例）、
ｐＨ７．４の条件で同様に放置した。Ａの一方には０．
８Ｍ硫酸マグネシウム含有２Ｍ トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．４）０．０１ｍＬを加え（Ａ−１）、もう一
方には、０．８Ｍ硫酸マグネシウム０．０１ｍＬを加え
た（Ａ−２）後、Ａ、Ｂに検体としてＤＷ（ブラン
ク）、Ｅｔ（５０ｐｇ／ｍＬ）またはβ−グルカン（４
００ｐｇ／ｍＬ）を０．１ｍＬ加え、Ａ−1 とＢはｐＨ
７．４とし、Ａ−２はｐＨ５．０のままとした。比濁時
間分析装置「トキシノメ−タ−ＥＴ−２０１」（和光純
薬工業（株）販売）の専用アナリシスモジュ−ルにセッ
トし、３７℃、９０分加温して反応させ、ゲル化時間
（Ｔｇ）を測定した。Ａ、Ｂとも４℃に放置せず調製後
直ちに測定した結果と合わせて表３に示した。

【００４１】

【表３】

【００４２】表３から明らかなように、比較例Ｂ、即
ち、放置時にリムルス反応の最適な反応条件となってい
る通常のゲル化法リムルステスト試薬溶液を４℃に１６
時間放置すると活性化され、ブランク溶液が反応し、Ｅ
ｔ検体溶液もβ−グルカン検体溶液もどちらも一定の測
定値が得られない。一方、本発明の実施例Ａ−１では、
ブランク、Ｅｔ、及びβ−グルカン値ともすべて放置し
ないときの値とほぼ同一で、１６時間後でも活性化も失
活も起こらず一定の測定値が得られることがわかる。

【００４３】また、ｐＨ５．０のままで測定したＡ−２
では、Ｅｔ検体もβ−グルカン検体もどちらもその反応
値はブランク値と同一でまったく反応していなかった。 実施例４ L.polyphemus血リンパ液１．０Ｌを４℃，1,500rpmで１
０分間遠心し、その沈殿部分（アメボサイト）約２２ｇ
に０．０２Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ８．２）２１０
ｍＬを加え、ホモゲナイザ−にて均一に破砕および抽出
し、10,000×Ｇで３０分間冷却遠心し、上澄液（キレー
ト剤含有ライセート）１９４ｍＬを得た。

【００４４】Ａ）このキレート剤含有ライセート（ｐＨ
８．２）０．０４ｍＬにＤＷ０．０３ｍＬを加え、ｐＨ
８．２の条件で４℃で２０時間放置した（２系列放
置）。 Ｂ）別のキレート剤含有ライセート０．０４ｍＬに０．
１Ｍ硫酸マグネシウム含有０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）０．０４ｍＬと４．０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２ｍＬを加え（通
常の発色合成基質法リムルステスト試薬溶液；比較
例）、ｐＨ８．０の条件で同様に放置した。

【００４５】Ａの一方には０．４Ｍ硫酸マグネシウム含
有２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．０１ｍＬ
及び４．０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ
ＮＡ０．０２ｍＬを加え（Ａ−１）、もう一方には、Ｄ
Ｗ０．０１ｍＬ、上記の発色合成基質溶液０．０２ｍＬ
を加えた（Ａ−２）後、Ａ、Ｂに検体としてＤＷ（ブラ
ンク）またはＥｔを０．１ｍＬ加え、Ａ−１とＢは２価
金属塩（硫酸マグネシウム）含有のｐＨ８．０とし、Ａ
−２は２価金属塩を含まないｐＨ８．２のままとした。
以下、それらを実施例１と同様にして反応させた。Ａ、
Ｂとも４℃に放置せず調製後直ちに測定した結果と合わ
せて表４に示した。

【００４６】

【表４】

【００４７】表４から明らかなように、比較例Ｂ、即
ち、放置時にリムルス反応の最適な反応条件となってい
る通常の発色合成基質法リムルステスト試薬溶液を４℃
で２０時間放置すると活性化されてブランク値が非常に
高まり、Ｅｔ検体溶液の反応値が低下し、一定の測定値
が得られない。一方、本発明の実施例Ａ−１では、ブラ
ンク値はほとんど上昇せず、Ｅｔ検体の反応値も放置し
ないときの値とほぼ同一で、２０時間後でも活性化も失
活も起こらず一定の測定値が得られることがわかる。

【００４８】また、２価金属塩を加えずに測定したＡ−
２では、Ｅｔ検体の反応値はブランク値よりもわずかに
高い程度で、ほとんど反応しておらず、正確な定量値が
得られない。

【００４９】

【発明の効果】本発明のリムルステスト試薬は、溶液状
態で室温でも長時間安定であるため、リムルステスト反
応性物質を正確に経時的に測定することができ、例えば
医療分野で使用する医薬品の製造工程ならびに透析液中
のＥｔを経時的にモニタリングできるので有用である。
また、本発明のリムルステスト試薬は凍結乾燥物とした
場合も、長期間安定に保存し得、必要時に水で溶解する
だけで所定の安定な測定用リムルステスト試薬溶液を得
ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】リムルス反応の機構を説明する図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−102064（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−141598（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−128337（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−341993（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−65294（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−103982（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/579

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】カブトガニ・アメボサイト・ライセ−トと
   キレート剤とからなる、溶液状態において室温で少なく
   とも８時間安定であるカブトガニ・アメボサイト・ライ
   セート組成物からなることを特徴とするリムルステスト
   試薬。
2. 【請求項２】カブトガニ・アメボサイト・ライセート組
   成物が溶液状態においてｐＨ５．０〜９．０となるよう
   に調整されることを特徴とする請求項１記載のリムルス
   テスト試薬。
3. 【請求項３】カブトガニ・アメボサイト・ライセート組
   成物が溶液または凍結乾燥物であることを特徴とする請
   求項１または２に記載のリムルステスト試薬。
4. 【請求項４】２価金属塩、測定用ｐＨ調整剤およびペプ
   チド合成基質からなる群から選ばれた１種または２種以
   上と請求項１〜３のいずれか１項に記載のリムルステス
   ト試薬からなることを特徴とするリムルステスト試薬キ
   ット。
5. 【請求項５】リムルステスト試薬を用いて検体中のリム
   ルステスト反応性物質を測定するに際し、請求項１記載
   のリムルステスト試薬を用い、リムルス反応時の反応混
   液のｐＨがリムルス反応を惹起する範囲のｐＨとなるよ
   うに調整することを特徴とするリムルステスト反応性物
   質の測定法。
6. 【請求項６】リムルス反応を惹起する範囲のｐＨが７．
   ０〜８．５である請求項５に記載のリムルステスト反応
   性物質の測定法。
7. 【請求項７】ｐＨをリムルス反応を惹起する範囲のｐＨ
   に調整する際または調整前、リムルス反応を惹起するこ
   とができる２価金属イオン濃度になるように２価金属塩
   を添加する請求項５または６に記載のリムルステスト反
   応性物質の測定法。
8. 【請求項８】ｐＨをリムルス反応を惹起する範囲のｐＨ
   に調整する際、調整前または調整後、カブトガニ・アメ
   ボサイト・ライセートに含まれるクロッティングエンザ
   イムのアミダ−ゼ活性を測定するためのペプチド合成基
   質を添加してリムルス反応を起こさせる請求項５〜７の
   いずれか１項に記載のリムルステスト反応性物質の測定
   法。