JPH0875751A - エンドトキシン安定化剤、エンドトキシン組成物およびエンドトキシンの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】検体および標準品中のエンドトキシン(Et)活性
を長期間にわたって安定に保持、かつ標準品ではバイア
ル間差を低減、溶液状態で長時間安定、何度も使用でき
るEt標準品を調製するために有用なEt安定化剤、該安定
化剤とEtからなるEt組成物、およびそれらを用いたEtの
測定法の提供。 【構成】アミノアルコール、多価アルコール 、非イオン 性界面活性
剤、ポリスクロースおよびキレート剤の１種以上を有効成分
としてなるEt安定化剤、有効成分として、更にポリエ
チレングリコールを含むのEt安定化剤、有効成分が
ポリスクロースであるとき、さらにアルカリ土類金属塩およ
び／またはポリエチレングリコールを含有するのEt安
定化剤、ポリエチレングリコールとアルカリ土類金属塩を
有効成分として含有するEt安定化剤、〜のEt安
定化剤とEtからなるEt組成物、〜のEt安定化剤
を検体に添加し、検体中のEtを安定化するEtの測定法、
〜のEt安定化剤とリムルス試薬とを少なくとも含む
Et測定用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は検体中に存在する、また
は標準品として使用されるエンドトキシンの安定化に関
する。例えば、カブトガニ・アメボサイト・ライセート
を用いたリムルス反応によるエンドトキシンの測定にお
いて使用されるエンドトキシン標準品または検体中のエ
ンドトキシンを安定化するためのエンドトキシン安定化
剤、エンドトキシンと安定化剤からなるエンドトキシン
組成物、およびそれらを用いたエンドトキシンの測定法
に関し、特に、定量に使用するエンドトキシン標準品の
分散性を一定に保持し、リムルス反応に対するエンドト
キシン活性を安定に保ち、さらに、日常管理を必要とす
る臨床検査用検体、主として血液透析（人工透析）にお
ける透析液等の安全管理を目的とした透析液中のエンド
トキシン測定を行う際に、透析液中のエンドトキシン活
性を安定に保持し、適切な医療管理を実施するための改
善手段に関する。

【０００２】

【従来の技術】カブトガニ・アメボサイト・ライセート
（以下単にライセートという）を使用して、発熱物質で
あるエンドトキシンを測定する方法が知られており、ウ
サギの発熱性試験の代替法として公定法にも採用されて
いる。この方法は、微量のエンドトキシンによりライセ
ートが凝固する反応（以下、このような反応を「リムル
ス反応」という。）に基づいているが、その後の生化学
的解明により、該反応はいくつかの凝固因子の段階的活
性化より成ることが明かにされている（図１）（中村隆
範、日本細菌学雑誌、３８、７８１ー８０３（１９８
３））。この反応の引き金となるエンドトキシンは、グ
ラム陰性菌細胞壁の外膜成分で、リポ多糖（リポポリサ
ッカライド、ＬＰＳ）ともよばれており、親水性の糖鎖
と疎水性のリピドＡ部分が分子内に局在した両親媒性物
質である。ＬＰＳのサブユニットは、通常の条件では、
疎水結合、イオン結合等で１０⁸ダルトンにも及ぶ巨大
な分子集合状態（会合体）を形成し、共存蛋白やリピド
等とも複雑なミセルを形成することが知られており、こ
のミセル構造は、ＬＰＳのリムルス反応に対する反応性
（以下、「リムルス活性」という。）にも大きく影響
し、最大活性を示す分子サイズとそのミセル構造が存在
する。そして、コール酸、デオキシコール酸等の陰イオ
ン性界面活性剤添加により該会合体は完全に単量体もし
くは二量体に解離し、リムルス活性は完全に失われる。
また、不安定なミセルは、測定の際のデータ変動を引き
起こすのみならず、エンドトキシン溶液そのものの安定
性を損なわせる原因となる。米国ＦＤＡ（食品医薬品
局）では、１９８１年に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）０１１
３株由来のエンドトキシン標準品を改良し、従来の添加
剤であるアルブミンからラクトース及びポリエチレング
リコールに変更し、エンドトキシン活性の安定化をはか
った。現在該標品は、米国薬局方（ＵＳＰ）標準品、Ｅ
Ｃ−５としてＦＤＡから頒布されている。また日本で
は、１９８８年に、国立衛生試験所において、大腸菌Ｕ
ＫＴ−Ｂ由来のエンドトキシン標準品のエンドトキシン
活性の安定化のため、賦形剤としてマンニトールが採用
され、今日、日本薬局方（日局）標準品として広く使用
されている。

【０００３】一方、これらの標準品はいずれもエンドト
キシン含量が、バイアル当たりそれぞれ、ＵＳＰ標準品
では１０，０００エンドトキシン単位（ＥＵ）、日本薬
局方では１６，０００ＥＵと高く、測定の際にかなり希
釈する必要があり、その際の希釈誤差も大きく、定量的
リムルス試験のような高い精度と再現性が要求される測
定には大きな障害となっていた。したがって、非常に低
含量で調製した状態から使用する方が好ましく、そのた
めの安定で再現性のある添加剤が望まれていた。

【０００４】また、エンドトキシン粉末を単に水に溶解
したエンドトキシン水溶液の状態で放置しておくと、低
濃度ではとくにその活性は短期間のうちに低下すること
が知られている。したがって、エンドトキシンを溶液と
して使用する場合は、用時調製するのが一般的で、使用
後は不安定なため、廃棄せざるを得なく、面倒で、かつ
不経済であった。

【０００５】そこで、このような水溶液状態での不安定
性の問題点を回避するためにエンドトキシンを凍結乾燥
して保存しようと試みると、特にエンドトキシン濃度が
希薄である場合、エンドトキシン粉末の飛散により各バ
イアル間でエンドトキシン量が大きく異なる、いわゆる
バイアル間差が大きくなるという問題が生じた。また、
凍結乾燥品を用時に溶解するときに十分に溶解できない
場合が生じるという問題もあった。

【０００６】さらに、医療の場においても、体液中のエ
ンドトキシンの日常管理は、感染症、特に敗血症の病態
把握と治療および予後の判定、術後のモニタリング等に
重要となる他、血液透析患者における透析液の安全管理
にも不可欠な項目であることが知られているが、近年、
透析液中のエンドトキシン活性が不安定で時間と共に低
下することが指摘されている。そのため、透析液中のエ
ンドトキシンを正確に測定することが困難で、透析液を
正しく管理する上で、大きな障害となっていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、検体および
標準品中のエンドトキシン活性を長期間にわたって安定
に保持するために有用で、かつ特に標準品ではバイアル
間差を低減し、特に溶液状態で長時間安定であり、何度
も使用できるエンドトキシン標準品を調製するために有
用なエンドトキシン安定化剤、そのようなエンドトキシ
ン安定化剤とエンドトキシンからなるエンドトキシン組
成物、およびそれらを用いたエンドトキシンの測定法を
提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、以下に
より達成することができる。 １）アミノアルコール、多価アルコール、非イオン性界
面活性剤、ポリスクロースおよびキレート剤からなる群
から選ばれた１種または２種以上を有効成分として含有
することからなるエンドトキシン安定化剤。

【０００９】２）有効成分としてアミノアルコールと多
価アルコールとを含有する前記１）記載のエンドトキシ
ン安定化剤。 ３）多価アルコールがグリセロールまたはその誘導体で
ある前記１）または２）記載のエンドトキシン安定化
剤。 ４）有効成分として、更にポリエチレングリコールを含
むことを特徴とする前記１）〜３）のいずれか１項に記
載のエンドトキシン安定化剤。

【００１０】５）有効成分がポリスクロースであると
き、さらにアルカリ土類金属塩および／またはポリエチ
レングリコールを含有する前記１）記載のエンドトキシ
ン安定化剤。 ６）ポリエチレングリコールとアルカリ土類金属塩を有
効成分として含有するエンドトキシン安定化剤。

【００１１】７）前記１）〜６）のいずれか１項に記載
のエンドトキシン安定化剤とエンドトキシンからなるこ
とを特徴とするエンドトキシン組成物。

【００１２】８）乾燥物または液体である前記７）のエ
ンドトキシン組成物。 ９）前記１）〜６）のいずれか１項に記載のエンドトキ
シン安定化剤を検体に添加し、検体中のエンドトキシン
を安定化することを特徴とするエンドトキシンの測定
法。 １０）エンドトキシンの測定が、リムルス試薬を用いて
行う方法である前記９）記載のエンドトキシンの測定
法。

【００１３】１１）検体が血液透析における透析液であ
る前記９）記載のエンドトキシンの測定法。 １２）前記１）〜６）のいずれか１項に記載のエンドト
キシン安定化剤とリムルス試薬とを少なくとも含むエン
ドトキシン測定用キット。 本発明のエンドトキシンの具体的安定化剤としては、好
ましくは、以下が例示される。

【００１４】（１）アミノアルコールを有効成分として
含み、さらに多価アルコールおよび／またはポリエチレ
ングリコールを含むことを特徴とするエンドトキシン安
定化剤（以下、安定化剤という）。 （２）グリセロールまたはその誘導体を有効成分として
含有することを特徴とするエンドトキシン安定化剤（以
下、安定化剤という）。 （３）キレート剤および非イオン性界面活性剤の少なく
とも１種を有効成分として含有することを特徴とするエ
ンドトキシン安定化剤（以下、安定化剤という）。 （４）アミノアルコール、キレート剤および非イオン性
界面活性剤からなる群から選ばれた１種以上を有効成分
として含有し、かつ少なくともポリエチレングリコール
を含むことを特徴とするエンドトキシン安定化剤（以
下、安定化剤という）。 （５）ポリエチレングリコールおよびアルカリ土類金属
塩を有効成分として含有するエンドトキシン安定化剤
（以下、安定化剤という）。 （６）ポリスクロース、ポリエチレングリコールおよび
アルカリ土類金属塩を有効成分として含有するエンドト
キシン安定化剤（以下、安定化剤という）。

【００１５】本発明のエンドトキシン安定化剤（以下、
安定化剤〜を含む本発明のエンドトキシン安定化剤
を総称する場合は、単に安定化剤ともいう）は、エンド
トキシン測定用標準品にも一般の測定用検体中のエンド
トキシンの安定化にも適宜使用できる。該安定化剤の使
用方法は任意であり、そのままの固形物を使用しても、
該溶液、好ましくは水溶液を使用してもよい。該固形物
の場合は、適量を分取して検体に添加してもよいが、好
ましくは予め容器に所定量を分取しておくと都合がよ
い。この分取される安定化剤は溶液であってもよい。

【００１６】本発明のエンドトキシン組成物を、定量的
なエンドトキシン測定用の標準品として用いる場合は、
エンドトキシン含量が既知でなければならないが、その
他の目的、例えば、定性的測定に用いる場合は既知でな
くともかまわない。また、該標準品のエンドトキシン含
量の決定は、通常、エンドトキシン組成物形成前に行う
が、該形成後でもかまわない。該エンドトキシンの由来
は、特に制限はないが、通常、大腸菌（Escherichia co
li; E. coli)、サルモネラ(Salmonella)属等のグラム陰
性菌から公知の方法により調製されたものを使用するこ
とができる。

【００１７】本発明のエンドトキシン組成物は、上記エ
ンドトキシン調製物の水懸濁液あるいはその凍結乾燥物
に安定化剤を混和することにより溶液としてまたは凍結
乾燥物として調製することができる。この混和時のエン
ドトキシン組成物の各成分は、任意の順序で混和するこ
とができる。本発明により調製したエンドトキシン組成
物は、水に懸濁した状態において、均一な分散性を有
し、長期間安定したリムルス活性を示す他、凍結乾燥粉
末においても、長期間室温以上の比較的高温の条件下
で、同様に安定な性質を有する。

【００１８】例えば、エンドトキシン組成物を水に懸濁
した状態では、４℃で少なくとも２週間、凍結乾燥状態
では、４０℃で少なくとも２週間、４℃で少なくとも３
年間安定である。

【００１９】さらに本発明の安定化剤は、検体に含まれ
るエンドトキシンを安定化する場合にも使用される。具
体的には、例えば、血液透析における透析液等の臨床検
査用検体を採取する際に、特に容器は限定されないが、
ガラス、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン
等の素材の適当な容器に予め安定化剤（固体もしくは溶
液の形態）を含ませておくことによって検体中のエンド
トキシンを安定化することが挙げられる。この様にして
保存したエンドトキシン溶液は、検体を採取する際に混
入する金属イオン（例、鉄イオン）や容器由来の極微量
の影響物質に対しても全く干渉を受けず、均一な分散性
と活性を保持し得る。例えば、このような検体を本発明
の安定化剤で安定化する本発明のエンドトキシンの測定
法においては、このような安定化した検体を通常、４℃
で少なくとも１５日間、安定に維持することができる。
エンドトキシンの測定は、リムルス反応を利用して行う
ことができる。

【００２０】本発明のエンドトキシン安定化剤の有効成
分について順次説明する。アミノアルコールは、アミノ
基と水酸基を有する化合物であれば特に限定されない
が、好ましくはトリエタノールアミン、ジエタノールア
ミン、または２ーアミノエタノール（モノエタノールア
ミン）等を挙げることができる。多価アルコールとして
は、３価以上のアルコールが挙げられる。低分子の多価
アルコールとしては、特に３〜５価のアルコールが好ま
しく、分子量としては、５０〜５００の範囲のもの、あ
るいは高分子の多価アルコールとしては、ポリビニルア
ルコール等の水酸基を有する高分子化合物等が挙げられ
る。具体的には、マンニトール、キシリトール等の糖ア
ルコール、グリセロール及びその誘導体（例えば、グリ
セロール α−モノクロロヒドリン等）などの低分子の
多価アルコール、または平均分子量５００〜３５００の
ポリビニルアルコール等の高分子の多価アルコールを挙
げることができる。

【００２１】非イオン性界面活性剤としては、ポリオキ
シエチレンエーテル類（ブリジ系界面活性剤等；通常、
重合度８〜４０、特に末端基がイソオクチルフェニルエ
ーテル基であるものが好ましい。）、ポリオキシエチレ
ンソルビタンアルキルエステル類〔ツィーン系界面活性
剤等；モノラウレート（ツィーン２０、２１）、モノパ
ルミテート（ツィーン４０）、モノステアレート（ツィ
ーン６０、８０）等〕、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オ
クチルフェニルエーテル類（トリトン系界面活性剤等；
好ましくは、トリトンＸ−１００等）、アルキルグルコ
シド類（n-オクチルグルコピラノシド、n-ドデシルグル
コピラノシド等）等を挙げることができる。

【００２２】ポリスクロース（Ｐｏｌｙｓｕｃｒｏｓ
ｅ）は、ケミカルアブストラクトサービス登録番号（Ｃ
ＡＳ ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｎｕｍｂｅｒ）９０１２−９
５−７で特定される物質で、フィコール（Ｆｉｃｏｌ
ｌ；商品名，ファルマシア社）またはスクロースポリマ
ー（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒ）とも呼ばれる物
質である。通常、ショ糖（スクロース）とエピクロルヒ
ドリンを共重合することによって合成される。ポリスク
ロースとして種々の分子量のものが市販されているが、
本発明に使用するポリスクロースの分子量は特に限定さ
れない。具体的には、フィコール４００（分子量４０
０，０００）、フィコール７０（分子量７０，０００）
が例示される。

【００２３】キレート剤としては、金属イオンに配位し
て安定な錯化合物を形成するものであればとくに制限は
ないが、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸）、ＧＥＤ
ＴＡ（ビス（２−アミノエチル）エチレングリコール４
酢酸；グリコールエーテルジアミノ４酢酸）、ＢＡＰＴ
Ａ（アミノフェニルエチレングリコール４酢酸）、クエ
ン酸、クエン酸ナトリウム、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）
等が使用できる。なお、血液透析においては、透析装置
の配管部分等に金属（例、鉄）が使用されることが多
く、従って透析液中に微量の金属イオンが混入する場合
がある。このような場合、検体中のエンドトキシンのリ
ムルス活性は低下するが、上記のようなキレート剤を含
む安定化剤を検体中に添加すれば、金属イオンによるエ
ンドトキシンの活性の低下を防止することができる。

【００２４】アルカリ土類金属塩としては、塩化カルシ
ウム、塩化ストロンチウム、塩化マグネシウム等が挙げ
られる。本発明の安定化剤として、上記成分と併用する
と特に好ましい効果を奏するポリエチレングリコールと
しては、二価アルコールであるエチレングリコールの重
合体で平均分子量が、２００〜２，０００，０００、好
ましくは２，０００〜４０，０００、さらに好ましくは
４, ０００〜２０, ０００のものを挙げることができ
る。

【００２５】本発明の安定化剤〜に使用される各成
分の種類、エンドトキシンに対する濃度等は、各安定化
剤で最適なものを選択することができるが、ほぼ各成分
の種類は上記の範囲から共通に選択できる。本発明の安
定化剤は、アミノアルコールを有効成分として含み、
さらに多価アルコールおよび／またはポリエチレングリ
コールを含む。即ち、本発明の安定化剤として、次の
−１〜４の組成が挙げられる。 −１：アミノアルコール −２：アミノアルコール、多価アルコール −３：アミノアルコール、ポリエチレングリコール −４：アミノアルコール、多価アルコール、ポリエチ
レングリコール また、本発明の安定化剤を含むエンドトキシン組成物
の各安定化剤成分の濃度、または検体に添加した場合の
各成分の濃度を例示すれば、多価アルコールは、０．０
１〜１重量／容量％（以下、％と略記）、好ましくは、
０．０５〜０．２％の範囲であり、アミノアルコール
は、０．０００１〜０．１％、好ましくは、０．０００
５〜０．０５％の範囲であり、ポリエチレングリコール
は、０．００１〜０．０２％、好ましくは、０．００２
〜０．００６％の範囲である。

【００２６】本発明の安定化剤は、グリセロールまた
はその誘導体を有効成分として含有する。また、エンド
トキシン組成物あるいは検体に添加される安定化剤の
量としては、安定化剤と同様の範囲が使用される。本
発明の安定化剤は、キレート剤および非イオン性界面
活性剤の少なくとも１種を有効成分として含有する。

【００２７】また、本発明の安定化剤を含むエンドト
キシン組成物の各安定化剤成分の濃度、または検体に添
加した場合の各成分の濃度を例示すれば、キレート剤
は、０．０１〜０．５ｍＭ、好ましくは、０．０２〜
０．２ｍＭの範囲であり、非イオン性界面活性剤は、
０．０００５〜０．２％、好ましくは、０．００１〜
０．０４％の範囲である。

【００２８】本発明の安定化剤は、アミノアルコー
ル、キレート剤および非イオン性界面活性剤からなる群
から選ばれた１種以上を有効成分として含有し、かつ少
なくともポリエチレングリコールを含む。即ち、本発明
の安定化剤として、好ましくは、次の−１〜４の組
成が挙げられる。 −１：ポリエチレングリコール、キレート剤 −２：ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性
剤 −３：ポリエチレングリコール、キレート剤、非イオ
ン性界面活性剤 −４：ポリエチレングリコール、キレート剤、アミノ
アルコール また、エンドトキシン組成物に含有、あるいは検体に添
加される各安定化剤の各成分の量としては、前記安定
化剤、の濃度の項と同様の範囲が使用される。

【００２９】本発明の安定化剤は、ポリエチレングリ
コールおよびアルカリ土類金属塩を有効成分として含有
する。本発明の安定化剤を含むエンドトキシン組成物
の各安定化剤成分の濃度、または検体に添加した場合の
各成分の濃度を例示すれば、ポリエチレングリコール
は、０．００１〜０．０５％、好ましくは、０．００２
〜０．０１％の範囲であり、アルカリ土類金属塩は、
０．００１〜５ｍＭ、好ましくは、０．００５〜０．５
ｍＭの範囲である。

【００３０】本発明の安定化剤は、ポリスクロース、
ポリエチレングリコールおよびアルカリ土類金属塩を有
効成分として含有する。本発明の安定化剤を含むエン
ドトキシン組成物の各安定化剤成分の濃度、または検体
に添加した場合の各成分の濃度を例示すれば、ポリスク
ロースは、０．００５〜０．５％、好ましくは、０．０
１〜０．１％の範囲であり、ポリエチレングリコール
は、０．００１〜０．０５％、好ましくは、０．００２
〜０．０１％の範囲であり、アルカリ土類金属塩は、
０．００１〜５ｍＭ、好ましくは、０．００５〜０．５
ｍＭの範囲である。

【００３１】本発明は安定化剤によって安定化された検
体中のエンドトキシンを測定するに際し、通常のリムル
ス試薬を用いる。即ち、該検体とリムルス試薬を接触さ
せて前記リムルス反応を惹起させることによりエンドト
キシンを測定することができる。リムルス試薬として
は、従来公知のものを使用することができる。具体的に
は、カブトガニ、例えば、リムルス・ポリフェムス（Li
mulus polyphemus）、タキプレウス・トリデンタツス
（Tachypleus tridentatus）、タキプレウス・ギガス
（T. gigas）、カルシノスコルピウス・ロツンディカウ
ダ（Carcinoscorpius rotundicauda）等の血リンパ液か
ら通常の方法（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８０，
１０１１−１０２１（１９７６）参照）により調製した
血球抽出物（ライセート）またはその加工物を挙げるこ
とができる。該加工物としては、例えば、ライセートを
クロロホルム等の有機溶媒で抽出処理したり、界面活性
剤を添加してＥｔに対する感受性を向上させたもの等が
挙げられる。また、ライセートには、通常、Ｅｔ感受性
因子（Ｃ因子）およびβ−グルカン感受性因子（Ｇ因
子）の両方が含まれるが、上記加工物としては、デキス
トラン硫酸、スルホプロピル基等を結合した特異的な吸
着担体または通常の担体等を用いてライセートを処理
し、上記Ｃ因子またはＧ因子の何れか一方の因子を分画
もしくは除去してＥｔのみに特異的に反応するように加
工されたものが挙げられる。

【００３２】さらに、ライセートに、例えば（１→３）
−β−Ｄ−グルコシド構造単位が特定個数結合したポリ
グルコシド等を共存させることによって、Ｇ因子の活性
化を阻害し、Ｅｔにのみ特異的に反応するように加工し
たものも上記加工物に包含される。尚、ライセートとし
ては、市販のものも使用することができる。

【００３３】本発明は、安定化剤とリムルス試薬とを少
なくとも含むエンドトキシン測定用キットを提供する。
このキットは上述したような各種リムルス試薬の１種以
上を各々収容した１個以上の容器と安定化剤を収容した
容器と、所望により前記エンドトキシン組成物、リムル
ス反応に必須の２価金属塩、リムルス反応のクロッティ
ングエンザイム活性をみるための発色合成基質、安定化
剤あるいはエンドトキシン組成物を希釈するための蒸留
水または緩衝液、リムルス反応におけるｐＨを調整する
ためのｐＨ調整用緩衝液等を各々収容した容器とから構
成される。２価金属塩としては、マグネシウム、カルシ
ウム、ストロンチウムなどのアルカリ土類金属のハロゲ
ン化水素酸塩（塩化物など）、硫酸塩等が、発色合成基
質としては、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
のようなペプチド合成基質が、エンドトキシン組成物の
希釈用あるいはｐＨ調整用緩衝液としては、トリス−塩
酸緩衝液、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−
ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液
などが各々挙げられる。

【００３４】本発明に用いるエンドトキシン組成物を調
製する方法としては、前述したようにエンドトキシン溶
液に後で上記安定化剤の各成分をそれぞれ別々に、ある
いは予め混合して加えるか、予め安定化剤の混合液を調
製し、これにエンドトキシンを添加する方法等を挙げる
ことができるが、その順番はいずれであっても良く、更
に、安定化剤の各成分の添加順序もとくに制限を受ける
ものではない。また組成物を調製する際の温度は０〜５
０℃が適当で、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは
１０〜２５℃である。一方、各成分を混合後は、通常、
マグネティックスターラー等で１０秒〜１５分間均一に
なるまで攪拌するが、異常熱の発生を抑制するだけで、
エンドトキシンのリムルス活性の低下を抑え、均一な分
散液を得ることが可能である。

【００３５】更に本発明のエンドトキシン組成物を乾燥
物とするための手段は、エンドトキシンの活性を低下さ
せない方法であれば特に限定されないが、低温下で脱水
できる方法が好ましく、特に真空凍結乾燥が好ましい。
使用する真空凍結乾燥機は、卓上、床置き等形状は問わ
ず、所定の真空度を有していれば良い。本発明における
安定化剤の濃度はエンドトキシンのリムルス活性に影響
を与えない程度に上述の通り極めて低く調製されるが、
前述した安定化剤の各成分は、ガラス製のバイアル等の
容器へのエンドトキシンの付着能を高め、物理的な振動
による組成物の容器からの離脱を完全に抑えることがで
きるため、従来問題となった凍結乾燥時に粉末の一部が
飛散するという問題を解消できた。

【００３６】従って、本発明はエンドトキシンのリムル
ス活性測定値のバイアル間差の小さい安定したエンドト
キシン組成物を容易に得ることができ、リムルステスト
の精度を著しく高めることができる。

【００３７】本発明の安定化剤を使用して検体、例え
ば、透析液中のエンドトキシンを安定に保つ方法として
は、適当な容器に予め安定化剤水溶液を少量分注した後
凍結乾燥するか、もしくは液状のまま密栓すれば良く、
とくに容器の材質や加える順番に限定されるものではな
い。

【００３８】本発明では、このように調製したエンドト
キシン組成物または安定化剤を含む水溶液（エンドトキ
シン含有）は無色透明かつ無臭で、均一な分散性と高い
リムルス反応性を有するのみならず、長時間溶液状態で
安定である。さらに本発明のエンドトキシン組成物は、
１バイアル中の含量が非常に低いにもかかわらず、測定
変動が極めて少なく、高精度のエンドトキシン標準品と
して使用され、該組成物は大量かつ簡便、容易に調製す
ることが可能である。

【００３９】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。

【００４０】実施例１ 低含量エンドトキシン組成物の
調製及び安定性試験 Ｅ．ｃｏｌｉ ＵＫＴ−Ｂ株より調製したエンドトキシ
ン（日局標準品、１６，０００ＥＵ／バイアル、国立衛
生試験所頒布品）に１．６ｍｌの注射用蒸留水（大塚製
薬（株））を加え、良く攪拌溶解した（１０，０００Ｅ
Ｕ／ｍｌ）。これを原液とし蒸留水で適宜希釈した後、
０．００１％トリエタノールアミン（東京化成
（株））、０．００４％ポリエチレングリコール６，０
００（和光純薬工業（株））、０．１％グリセロール
（和光純薬工業（株））或いは、表１に記載の種々添加
剤を含むエンドトキシン溶液（３ＥＵ／ｍｌ）を調製し
た。この混合液０．５ｍｌずつをガラスバイアルに分注
し、真空凍結乾燥機（ラボコンコ（株））を用いて凍結
乾燥した。この様にして調製した低含量エンドトキシン
組成物のバイアル間誤差を検討する目的で、それぞれの
方法で調製した低含量エンドトキシンの６バイアルを
３．０ｍｌの上記蒸留水に溶解した。エンドトキシンフ
リーの９６穴マイクロプレート（トキシペットプレート
９６Ｆ；生化学工業（株））にそれぞれのバイアルより
１０μｌずつとり、５．８ｍｌの０．１Ｍトリス塩酸緩
衝液、ｐＨ８．０に溶解したエンドトキシン特異的リム
ルス試薬（図１でエンドトキシンにのみ反応する因子を
用いる高感度発色合成基質法リムルス試薬：エンドスぺ
シーＥＳ−２００（生化学工業（株）））１００μｌを
加え、恒温槽と解析プログラム内蔵のマイクロプレート
リーダー（ウェルリーダーＳＫ６０１、生化学工業
（株））で３７℃、３０分間反応させ、４０５ｎｍ（対
照波長４９２ｎｍ）における吸光度変化率を算出し（カ
イネティックアッセイ）、ＵＳＰ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅ
ｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）標準エ
ンドトキシンに対する換算値を算出した。この試験を６
回繰り返し、合計３６サンプル数の分析値を得た。この
分析値の平均値と標準偏差を算出し、変動係数（ＣＶ）
を求め、分析値のバイアル間差の指標とした。またこれ
とは別に、それぞれの方法で調製した低含量エンドトキ
シン４バイアルを３ｍｌの蒸留水に溶解し、４℃で７日
及び１４日間保存した。この保存溶液につき、保存後の
エンドトキシンの力価をリムルス活性としてエンドスペ
シーを用いて測定し、保存前の同測定法によるリムルス
活性に対する相対値（残存リムルス活性（％））として
表し、溶液状態での保存安定性を評価した。また、前記
低含量エンドトキシン組成物（凍結乾燥物）を、４０
℃、１４日間及び７０℃、３日間の２条件で保存した
後、上記と同様に残存リムルス活性（％）を求め、乾燥
状態での保存安定性を評価した。

【００４１】

【表１】

【００４２】表１に示したように、本発明の安定化剤
〜を含むエンドトキシン組成物は、安定剤としてポリ
エチレングリコール単独を含む比較例または添加剤なし
の比較例に比べ、エンドトキシンの保存安定性およびバ
イアル間差が改善された。本発明は、希薄溶液でも長期
間安定でかつ凍結乾燥品の高温下における保存安定性に
優れた低含量エンドトキシン組成物を容易に調製するこ
とができる。さらに、本発明では、極微量のエンドトキ
シンを分注、凍結乾燥するにもかかわらず、バイアル間
変動の著しく小さい乾燥状態のエンドトキシン組成物を
再現性良く得ることができる。

【００４３】実施例２ 透析液中のエンドトキシン安定
性に及ぼす種々添加剤の効果 通常の血液透析の透析回路において、コンソールの透析
液供給側カプラーより、透析液を種々添加剤入りのガラ
ス試験管に採取し、表２、表３記載の添加剤濃度に調整
し、４℃下で１日、５日及び１５日間保存し、エンドス
ペシーを用いて実施例１と同様にエンドトキシンの力価
を測定し、添加剤なしをコントロールとして残存活性を
算出した。

【００４４】

【表２】

【００４５】

【表３】

【００４６】表２、表３に示したように、予め容器の中
に本発明の安定化剤を添加しておいたものは、４℃、５
日間保存後においてもそのリムルス活性にほとんど変化
はなく、添加しないものに比べ著しい保護効果が認めら
れることが分かる。さらに、混合液Ａ（安定化剤使
用）、混合液Ｂ（安定化剤使用）及び混合液Ｃ、Ｄ又
はＥ（安定化剤使用）に関しては、１５日間の長期に
わたり、一定の活性を保持し得ることが明かである。

【００４７】

【発明の効果】以上説明したように、本発明では微量の
エンドトキシンを特定の安定化剤を含む溶媒に分散させ
ることによりミセル構造を安定に保持し、長期間溶液状
態においても安定した活性を発現できるように調製され
た低含量標品のエンドトキシン組成物を容易に提供でき
る。本発明により、エンドトキシン測定の変動も小さ
く、希釈に必要な器具もほとんど不要になり、測定に要
する時間も短縮でき、また一度溶解した該溶液を破棄す
ることなく再度使用することもできるため、リムルステ
ストの測定精度を著しく高めるだけでなく、時間的にも
コスト的にも多くの利点を提供することができる。

【００４８】また、近年特に血液透析医療現場におい
て、透析液中のエンドトキシンを精度良く測定するため
の大きな障害となっている検体中のエンドトキシンの安
定性に関し、本発明では以下に示す飛躍的な解決策を提
示することができる。すなわち、通常の透析液を前記特
定の安定化剤を含む適当な溶媒と混合させることによ
り、透析液中に含有するエンドトキシンのミセル構造を
安定に保ち、かつ容器への吸着も完全に抑えることがき
るため、長期間その活性を保持させることが可能であ
る。これにより、透析液中のエンドトキシン量を正確に
測定することができるため、透析システムの安全管理を
適切に行うことができる。特に、近年中空糸のポアサイ
ズを大きくして有害物の除去率を高めたハイフラックス
膜（ハイパフォーマンス膜）が多用されているため、そ
れにともなうエンドトキシンの生体への逆流（バックフ
ィルトレーション）が問題になっているが、本発明は、
この様な重大な弊害をも未然に防止し、人体の安全をよ
り的確に確保するための有用で効果的な保存法及びツー
ルを提供する。

【図面の簡単な説明】

【図１】カブトガニ・アメボサイト・ライセートのエン
ドトキシン及び（１→３）−β−Ｄ−グルカンによる反
応機構を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｍ 1/14 ５１７

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミノアルコール、多価アルコール、非
   イオン性界面活性剤、ポリスクロースおよびキレート剤
   からなる群から選ばれた１種または２種以上を有効成分
   として含有することからなるエンドトキシン安定化剤。
2. 【請求項２】 有効成分としてアミノアルコールと多価
   アルコールとを含有する請求項１記載のエンドトキシン
   安定化剤。
3. 【請求項３】 多価アルコールがグリセロールまたはそ
   の誘導体である請求項１または２記載のエンドトキシン
   安定化剤。
4. 【請求項４】 有効成分として、更にポリエチレングリ
   コールを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか
   １項に記載のエンドトキシン安定化剤。
5. 【請求項５】 有効成分がポリスクロースであるとき、
   さらにアルカリ土類金属塩および／またはポリエチレン
   グリコールを含有する請求項１記載のエンドトキシン安
   定化剤。
6. 【請求項６】 ポリエチレングリコールとアルカリ土類
   金属塩を有効成分として含有するエンドトキシン安定化
   剤。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載のエ
   ンドトキシン安定化剤とエンドトキシンからなることを
   特徴とするエンドトキシン組成物。
8. 【請求項８】 乾燥物または液体である請求項７記載の
   エンドトキシン組成物。
9. 【請求項９】 請求項１〜６のいずれか１項に記載のエ
   ンドトキシン安定化剤を検体に添加し、検体中のエンド
   トキシンを安定化することを特徴とするエンドトキシン
   の測定法。
10. 【請求項１０】 エンドトキシンの測定が、リムルス試
    薬を用いて行う方法である請求項９記載のエンドトキシ
    ンの測定法。
11. 【請求項１１】 検体が血液透析における透析液である
    請求項９記載のエンドトキシンの測定法。
12. 【請求項１２】 請求項１〜６のいずれか１項に記載の
    エンドトキシン安定化剤とリムルス試薬とを少なくとも
    含むエンドトキシン測定用キット。