JP3365848B2 - リムルス試薬およびリムルス試薬反応性物質の測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、エンドトキシン（以
下、Ｅｔということもある）、（１→３）−β−Ｄ−グ
ルカン（以下、β−グルカンということもある）などの
リムルス試薬反応性物質を測定するに際して、リムルス
試薬を溶液状態で長時間安定に保持することができるリ
ムルス試薬、およびそれを用いてリムルス試薬反応性物
質を測定する測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】カブトガニ・アメボサイト・ライセート
（以下単にライセートともいう）を使用して、Ｅｔを測
定する方法（この測定法は一般的に「リムルステスト」
と呼ばれ、この測定に関与するライセートの反応は「リ
ムルス反応」と呼ばれている）が従来から知られてお
り、検出感度が非常に高いため、医薬品、水などの汚染
試験、臨床検査など多方面に汎用されている。この方法
は、微量のＥｔによりライセートが凝固することに基づ
いているが、その後の生化学的解明により、該反応はい
くつかの凝固因子の段階的活性化より成ることが明らか
にされている（J. Protein Chem., 5, 255-268(1986))
。

【０００３】この反応を、例えば日本産カブトガニ（Ta
chypleus tridentatus）から得られるライセートによ
り、図１を用いて説明すると、ライセートにＥｔが加わ
ると、ライセート中に存在するＣ因子（Ｅｔ感受性因
子、分子量１２３，０００）が活性化され、生成した活
性型Ｃ因子がＢ因子（分子量６４，０００）の特定箇所
を限定水解して活性型Ｂ因子を生成し、活性型Ｂ因子は
プロクロッティングエンザイム（分子量５４，０００）
を活性化してクロッティングエンザイムに変換し、クロ
ッティングエンザイムはコアギュローゲン（凝固タンパ
ク、分子量１９，７２３）のジスルフィド結合で架橋さ
れたループ内の特定箇所を、すなわち…Ａｒｇ¹⁸−Ｔｈ
ｒ¹⁹…の間および…Ａｒｇ⁴⁶−Ｇｌｙ⁴⁷…の間を限定水
解してＨ−Ｔｈｒ¹⁹…Ａｒｇ⁴⁶−ＯＨで表されるペプチ
ドＣ（アミノ酸２８残基）を遊離しつつ残余の部分がコ
アギュリンゲルに変換される、という一連の反応（カス
ケード反応とも呼ばれる；以下Ｅｔによる活性化に起因
するカスケード反応をＣ因子系反応という）である。

【０００４】一方、ライセートはＥｔだけでなくβ−グ
ルカンが加わっても反応することが明らかになった。す
なわち、図１におけるＧ因子（β−グルカン感受性因
子）が活性化され、生成する活性型Ｇ因子がプロクロッ
ティングエンザイムをクロッティングエンザイムに活性
化し、コアギュリンゲルを生成するというカスケード反
応が起こる（以下β−グルカンによる活性化に起因する
カスケード反応をＧ因子系反応という）。

【０００５】また、上記の各カスケード反応により生成
するクロッティングエンザイムは、反応系に別に添加さ
れる合成基質、例えばｔ−ブトキシカルボニル−ロイシ
ル−グリシル−アルギニン−パラニトロアニリド（Ｂｏ
ｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）のアミド結合を
水解してパラニトロアニリンを遊離させる。したがっ
て、生成した発色物質（パラニトロアニリン）の吸光度
を測定することによりＥｔまたはβ−グルカンの定量が
行われている。

【０００６】さらに、ＥｔによるＣ因子の活性化及びβ
−グルカンによるＧ因子の活性化に際しては、カルシウ
ムやマグネシウムのような２価金属イオンの適当量が必
須であることも知られている。

【０００７】これらの反応原理に基づいて調製され市販
されているリムルス試薬は、通常、ライセ−トと２価金
属塩あるいはこれらにさらに合成基質を添加して凍結乾
燥したものである。測定に際しては、これら凍結乾燥物
を水、検体溶液または緩衝液で溶解して用いている。

【０００８】しかし、このようなリムルス試薬は、その
溶解時に最適な反応条件（ｐＨ７．０〜８．５）に近い
状態となっているため、いったん溶解したリムルス試薬
を保存すると、溶液状態ではきわめて安定性が悪い。つ
まり、リムルス試薬調製時にごく微量混入したリムルス
試薬反応性物質のために、低温に保存しておいても時間
の経過とともに前記の各因子が活性化され、ブランク値
が高まり、検体測定時に一定の反応値が得られなくな
る。また、ｐＨ６．０以下で保存すると（特開平２−１
８７６６３）、逆に失活して、反応性が低下する場合も
あり、同様に一定の反応値が得られなくなる。したがっ
て、リムルス試薬は溶解後は直ちに使用し残りは捨てる
のが一般的である。そのため、検体数が少ない場合は非
常に高価な測定法であり、また、人工透析におけるＥｔ
値の経時変化のモニタリングのような長時間にわたって
何度もＥｔ量を測定する場合、特に自動的に測定する場
合には、よい方法がなかった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、リム
ルス試薬を用いて検体中のリムルス試薬反応性物質を測
定するに際し、いったん溶解したリムルス試薬溶液の安
定性を高め、長時間経ても一定の反応値が得られるよう
なリムルス試薬及びそのリムルス試薬を使用するリムル
ス試薬反応性物質の測定方法を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために、ライセート中の各凝固因子を失活
も活性化もさせることなく特に溶液状態で長時間安定に
保つことのできるリムルス試薬及びその試薬を用いてリ
ムルス試薬反応性物質を測定する方法について検討し
た。その結果、ライセ−トを特定の化合物と共存させ、
溶液状態の時、特定のｐＨを示すように調整されれば、
リムルス試薬溶液を長時間安定に保持できること、さら
にそのリムルス試薬溶液に適当な緩衝液、２価金属塩、
ペプチド合成基質等を添加するのみで通常のリムルス反
応を惹起させ、リムルス試薬反応性物質を、リムルス試
薬溶解後長時間経ても正確に測定する方法を見出し、本
発明に至った。

【００１１】本発明は、 カブトガニ・アメボサイト・ライセ−トと下記一般
式（１）で表される化合物を含有し、溶液としたときの
ｐＨが６．１〜６．５となるように調整され、溶液状態
において室温で少なくとも３時間安定であるカブトガニ
・アメボサイト・ライセ−ト組成物からなることを特徴
とするリムルス試薬、 Ａ−（Ｒ¹ ）_n −Ｘ （１） （式中、Ａは、Ｈ（水素原子）または下記式Ｂで表され
る有機基であり、ｎは０または１で、Ｒ¹ は、−ＣＨ₂
−、−（ＣＨ₂ ）₂ −、または−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂
−を表し、Ｘは、−ＳＯ₃ Ｈ、−ＣＯＯＨ、または−Ｏ
Ｈを表す。

【００１２】 Ｂ：Ｒ² −Ｃ（Ｒ³ ）₂ −Ｎ（Ｒ⁴ ）−ＣＨ₂ − 式Ｂ中、Ｒ² は、−ＣＯ−ＮＨ₂ または−ＣＨ₂ ＯＨを
表し、Ｒ³ は単独でＨまたは−ＣＨ₂ ＯＨを表し、Ｒ⁴
は単独でＨ、−ＣＨ₂ ＣＯＯＨ、または−ＣＨ₂ ＣＨ₂
ＯＨを表すか、あるいはＲ³ およびＲ⁴ が一緒になって
６員環を形成するための−ＣＨ₂ −Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −
または−ＣＨ₂ −Ｎ（ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＳＯ₃ Ｈ）−ＣＨ₂
ＣＨ₂ −で表される２価の基を形成する。） カブトガニ・アメボサイト・ライセ−トと下記化合
物群から選択される化合物を含有し、溶液としたときの
ｐＨが６．１〜６．５となるように調整され、溶液状態
において室温で少なくとも３時間安定であるカブトガニ
・アメボサイト・ライセ−ト組成物からなることを特徴
とするリムルス試薬。 （ 酢酸、２−モルホリノエタンスルホン酸、２−ヒドロ
キシ−３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、Ｎ
−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン
酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、ピペラジ
ン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、および２
−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−ヒドロキ
シメチル−１，３−プロパンジオ−ル）、 カブトガ
ニ・アメボサイト・ライセ−ト組成物が溶液または凍結
乾燥物であることを特徴とする前記またはに記載の
リムルス試薬、 測定用ｐＨ調整剤、ペプチド合成基
質および２価金属塩からなる群から選ばれた１種または
２種以上と前記〜のいずれか１項に記載のリムルス
試薬からなることを特徴とするリムルス試薬キット、
リムルス試薬を用いて検体中のリムルス試薬反応性物
質を測定するに際し、前記記載のリムルス試薬を用
い、リムルス反応時の反応混液のｐＨがリムルス反応を
惹起する範囲のｐＨとなるように調整することを特徴と
するリムルス試薬反応性物質の測定法、 リムルス反
応を惹起する範囲のｐＨが７．０〜８．５である前記
に記載のリムルス試薬反応性物質の測定法、 ｐＨを
リムルス反応を惹起する範囲のｐＨに調整する際または
調整前、リムルス反応を惹起することができる２価金属
イオン濃度になるように２価金属塩を添加する前記に
記載のリムルス試薬反応性物質の測定法、および ｐ
Ｈをリムルス反応を惹起する範囲のｐＨに調整する際、
調整前または調整後、カブトガニ・アメボサイト・ライ
セ−トに含まれるクロッティングエンザイムのアミダ−
ゼ活性を測定するためのペプチド合成基質を添加してリ
ムルス反応を起こさせる前記に記載のリムルス試薬反
応性物質の測定法であり、これにより上記課題を解決で
きる。

【００１３】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
リムルス試薬は、基本的にはライセートと一般式（１）
で表される化合物を含むカブトガニ・アメボサイト・ラ
イセ−ト組成物（以下、単にライセート組成物ともい
う）からなり、このライセート組成物を溶液とした時に
ｐＨが６．１〜６．５を示すものであれば、その保存形
態は制限されず固体、好ましくは凍結乾燥物でも溶液で
もかまわない。リムルス試薬が固体の場合、リムルス試
薬を溶液とする時に使用する溶媒は、測定対象物を含ま
ない水自体が最も好ましいが、上記ｐＨに影響を与えな
い範囲の緩衝液等でもよい。

【００１４】また、一般式（１）で表される化合物は、
緩衝作用を有する化合物であり、本発明においては１種
以上を使用し得る。また、一般式（１）において、−Ｓ
Ｏ₃Ｈまたは−ＣＯＯＨは塩の形態であってもよい。該
塩としては、ナトリウム塩などのアルカリ金属塩、アル
カリ土類金属塩等が挙げられる。本発明のリムルス試薬
に含まれる一般式（１）の化合物として、好ましいの
は、酢酸、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥ
Ｓ）、２−ヒドロキシ−３−（Ｎ−モルホリノ）プロパ
ンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミ
ド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−
（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラ
ジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰ
ＥＳ）、および２−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミ
ノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオ−ル
（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）等が挙げられる。

【００１５】本発明のリムルス試薬のライセート組成物
に使用されるライセートとしては、上記条件を満足すれ
ば、特に制限はない。該ライセートとしては、リムルス
・ポリフェムス（Limulus polyphemus）、タキプレウ
ス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）、タ
キプレウス・ギガス（T. gigas）、カルシノスコルピウ
ス・ロツンディカウダ（Carcinoscorpius rotundicaud
a）等のカブトガニ血リンパ液から、通常の方法（例え
ば、J. Biochem., 80, 1011-1021(1976)参照）により調
製した血球抽出物またはその加工物を挙げることができ
る。

【００１６】また、本発明のリムルス試薬の主体である
ライセート組成物は、種々の化学物質を包含し得る。具
体的には、ライセート組成物は、前記血球抽出物または
その加工物にＣ因子及びＧ因子の活性化に有効な２価金
属塩［例えば、マグネシウム、カルシウム、ストロンチ
ウムなどのアルカリ土類金属のハロゲン化水素酸塩（塩
化物など）、硫酸塩等〕、クロッティングエンザイムの
基質（例えば、前記のＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−ｐＮＡのようなペプチド合成基質）を必要に応じて添
加したものであってもよい。好ましくは、これら２価金
属塩やペプチド合成基質を添加せず、別途、使用時に使
えるようにキット化したものが挙げられる。また、リム
ルス試薬反応性物質の測定に際し、リムルス反応を惹起
させるためのｐＨに調整するためのｐＨ調整剤（以下、
測定用ｐＨ調整剤という。）は、例えば、トリス−塩酸
緩衝液、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピ
ペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液な
どの緩衝剤等が挙げられ、本発明のキットに添付され
る。

【００１７】上記加工物とは、例えば、ライセ−トをク
ロロホルム等の有機溶媒で抽出処理したり、界面活性剤
を添加してＥｔに対する感受性を向上させたものが挙げ
られる。また、ライセ−トには、通常、Ｅｔ感受性因子
（Ｃ因子）およびβ−グルカン感受性因子（Ｇ因子）の
両方が含まれるが、上記加工物としては、デキストラン
硫酸、スルホプロピル基等を結合した担体または特異的
な吸着担体等を用いてライセ−トを処理し、上記Ｃ因子
またはＧ因子の何れか一方の因子を分画もしくは除去し
てＥｔまたはβ−グルカンの一方のみに特異的に反応す
るように加工されたものが挙げられる。

【００１８】さらに、ライセ−トに、例えば（１→３）
−β−Ｄ−グルコシド構造単位が特定個数結合したポリ
グルコシドを共存させることによって、Ｇ因子の活性化
を阻害し、Ｅｔにのみ反応するように加工したものも上
記加工物に包含される。尚、ライセートとしては、市販
のものも使用することができる。本発明のリムルス試薬
を使用してリムルス試薬反応性物質を測定するには、一
般式（１）の化合物によりｐＨ６．１〜６．５に調整さ
れたライセート組成物をリムルス反応を惹起するｐＨ、
通常、７．０〜８．５に測定用ｐＨ調整剤により調整す
る。

【００１９】また、本発明のリムルス試薬は上記ｐＨ範
囲に調整され、２価金属が共存すると検体に含まれるＥ
ｔまたはβ−グルカンによりリムルス反応が起こる。こ
のリムルス反応は、従来公知の手段により基質の変化か
ら測定される。本発明で使用されるペプチド合成基質は
クロッティングエンザイムの基質になるようなものであ
れば、特に限定されない。すなわち、クロッティングエ
ンザイムのアミダーゼ活性の測定には、基質として、例
えば前記のｐ−ニトロアニリンのような発色性残基を有
するペプチド合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇ−ｐＮＡ）もしくは発色性残基を有するこれと類似の
配列（例えば、Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒ
ｇ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ等）のペプチド合成基質、ま
たはこれと同一もしくは類似の配列のペプチドであっ
て、Ｃ末端のアミノ酸のカルボキシル基に前記発色性残
基の代わりに公知の発蛍光性残基、発光性残基、アンモ
ニアなどがアミド結合により置換したペプチド合成基質
を使用することができる（特公昭５９−１９５３２、特
公昭６１−５４４００、特公昭６３−２６８７１）。ク
ロッティングエンザイムがこれらの合成基質に作用して
生成する反応生成物を測定することによって、アミダー
ゼ活性の測定を行うことができる。具体的には、反応
（カスケード反応および必要に応じて生成物の他色素等
への変換反応）によって生成する色素、蛍光物質または
アンモニアをそれぞれ分光光度計、蛍光光度計、化学発
光測定装置、アンモニア検出用電極（特開昭６２−１４
８８６０）等によって測定する方法を例示することがで
きる。

【００２０】また、クロッティングエンザイムのプロテ
アーゼ活性の測定には、ライセ−ト中に含まれる（もし
くは別途添加した）コアギュローゲン（基質）にクロッ
ティングエンザイムが作用してコアギュリンゲルが生成
する際のゲル形成反応を、例えば適当な機器（例えば、
濁度測定装置、粘度測定装置等）で測定するか、または
肉眼で判定する方法を採用することができる。

【００２１】本発明のリムルス試薬反応性物質測定法に
おいては、上記リムルス反応を惹起する範囲のｐＨに調
整する際または調整前に、リムルス反応を惹起すること
ができる２価金属イオン濃度になるように２価金属塩が
ライセート組成物溶液に添加されることが好ましい。
尚、ライセート組成物が２価金属塩を既に含む場合はそ
の必要はない。

【００２２】また、本発明のリムルス試薬反応性物質測
定法においては、上記リムルス反応を惹起する範囲のｐ
Ｈに調整する際、調整前または調整後、カブトガニ・ア
メボサイト・ライセ−トに含まれるクロッティングエン
ザイムのアミダ−ゼ活性を測定するための基質、好まし
くはペプチド合成基質がライセート組成物溶液に添加さ
れることが好ましい。尚、ライセート組成物が基質を既
に含む場合はその必要はない。

【００２３】ここで、ライセート組成物溶液は、リムル
ス反応に必要な所要量が分取されるような機構を有し
て、その分取量と上記測定用ｐＨ調整剤、２価金属塩、
基質等とが混和されリムルス試薬反応性物質（Ｅｔ、β
−グルカンなど）との接触によりリムルス試薬が活性化
されるようにすることが好ましい。この混和の態様は、
目的に応じて種々選定でき、２価金属塩および基質を混
和して一緒に使用しても、あるいはそれらの少なくとも
一方を測定用ｐＨ調整剤と混和して一緒にして使用して
もよい。測定用検体とリムルス試薬との混合の時期は、
特に制限はないがリムルス試薬を活性化させるときに添
加されることが好ましい。

【００２４】本発明のライセート組成物は、溶液状態で
室温（２０〜２５℃）において少なくとも３時間、４℃
では８時間以上は安定であるから、各種検体に含まれる
Ｅｔ、β−グルカン等の経時変化を長時間にわたってモ
ニタリングする上で非常に有用である。なお、本発明に
おいて、リムルス試薬が「安定である」とは、溶液状態
において室温（２０〜２５℃）で保存したときに３時間
以上、検体添加によらない前記各因子の非特異的な活性
化または失活が実質的にないことである。具体的には
「活性化」によってブランク値が異常に高くなり、「失
活」によって検体の反応値が異常に低くなる。すなわ
ち、換言すれば、そのリムルス試薬を使用してＥｔ、β
−グルカン等のリムルス試薬反応性物質を測定する際
に、ブランク値が十分に低く、検体の反応値が一定であ
る場合、「安定である」といえる。

【００２５】本発明で使用される測定用ｐＨ調整剤は中
性〜アルカリ性のものならば特に限定はされないが、ト
リス−塩酸緩衝液およびグッド緩衝液（例えば、ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液等）が好ましい。ｐＨは７．０〜８．５が好
ましい。本発明によりＥｔまたはβ−グルカンが測定さ
れる検体としては、基本的には特に制限なく、Ｅｔまた
はβ−グルカンの定量の必要があるものあるいはその存
否を確認する必要があるものであればよい。例えば、生
体試料、医薬品、医療分野で使用する水等を挙げること
ができる。

【００２６】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１ １）日本産カブトガニ(T.tridentatus) 血リンパ液１．
０Ｌを４℃、１，５００rpm で１０分間遠心し、その沈
殿部分（アメボサイト）約２１g に０．０２Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２１０ｍＬを加え、ホモゲナ
イザー（ポリトロンＲ ＰＴ１０（商品名）、Kinemati
ca社製造）にて均一に破砕および抽出し、１０，０００
×Ｇで３０分間冷却遠心し、上澄液（ライセート）１９
０ｍＬを得た。

【００２７】 Ａ）このライセート０．０４ｍＬに０．４Ｍ Ｂｉｓ−
Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）０．０１ｍＬと０．８Ｍ
硫酸マグネシウム０．０２ｍＬを加え、ｐＨ６．５の条
件で室温（２５℃）に３時間放置した（２系列放置）。 Ｂ）別の上記１）のライセート０．０４ｍＬに０．５Ｍ
トリス−塩酸緩衝液−０．４Ｍ硫酸マグネシウム（ｐＨ
８．０）０．０４ｍＬと４．０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２ｍＬを加え（通常の発
色合成基質法リムルス試薬溶液；比較例）、ｐＨ８．０
の条件で同様に放置した。

【００２８】Ａの一方には４．０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２ｍＬ及び２Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．０１ｍＬを加え（Ａ−
１）、もう一方には、上記の発色合成基質溶液０．０２
ｍＬおよび蒸留水（以下、ＤＷと略す）０．０１ｍＬを
加えた（Ａ−２）後、Ａ、Ｂに検体として、ＤＷ（これ
をブランクとして用いる）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）０１１１：Ｂ４株由来のＥｔ
（シグマ社販売のＷｅｓｔｐｈａｌ ｔｙｐｅ；５０ｐ
ｇ／ｍＬ）を０．１ｍＬ加え、Ａ−1 とＢはｐＨ８．０
とし、Ａ−２はｐＨ６．５のままとした。それらを３７
℃、３０分間加温して反応させ、生じたパラニトロアニ
リンを０．０４％亜硝酸ナトリウム（０．４８Ｍ塩酸溶
液）、０．３％スルファミン酸アンモニウム、０．０７
％Ｎ−１−ナフチルエチレンジアミン二塩酸塩を各々
０．５ｍＬずつ順次加えてジアゾカップリングさせ、５
４５ｎｍで吸光度を測定した。それらの結果とＡ、Ｂと
も室温に放置せず調製後直ちに測定した結果と合わせて
表１に示した。

【００２９】

【表１】

【００３０】表１から明らかなように、比較例である
Ｂ、即ち、放置時のｐＨ値が本発明のリムルス試薬溶液
のｐＨ範囲より高い通常の発色合成基質法リムルス試薬
溶液を室温に３時間放置するとブランクが非常に高ま
り、Ｅｔ検体溶液の反応値（Ｅｔ検体の吸光度とブラン
クの吸光度との差）が低下し、一定の測定値が得られな
いので濃度未知のＥｔを正確に定量できない。一方、本
発明の実施例Ａ−１では、ブランク値もほとんど上昇せ
ず、Ｅｔ検体の反応値も放置しないときの値とほぼ同一
で、３時間後でも一定の測定値が得られることがわか
る。

【００３１】また、リムルス反応を惹起するｐＨにせ
ず、放置ｐＨの６．５のままで測定したＡ−２では、Ｅ
ｔ検体反応値はブランク値より少し高い程度で、非常に
反応性が低く、やはり一定の測定値が得られない。 実施例２ Ａ）実施例１で調製したライセ−ト０．０４ｍＬに０．
３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）０．０１ｍＬ
を加え、ｐＨ６．１の条件で室温（２５℃）に４時間放
置した（２系列放置）。

【００３２】Ｂ）実施例１で調製した別のライセ−ト
０．０４ｍＬに０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液−０．４Ｍ
塩化マグネシウム（ｐＨ７．６）０．０４ｍＬと４．０
ｍＭＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２
ｍＬを加え（通常の発色合成基質法リムルス試薬溶液；
比較例）、ｐＨ７．６の条件で同様に放置した。Ａの一
方には０．８Ｍ塩化マグネシウム０．０２ｍＬ、２Ｍ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）０．０１ｍＬ及び４．
０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．
０２ｍＬを加え（Ａ−１）、もう一方には、０．８Ｍ塩
化マグネシウム０．０２ｍＬ、ＤＷ０．０１ｍＬおよび
上記の発色合成基質溶液０．０２ｍＬを加えた（Ａ−
２）後、Ａ、Ｂに検体としてＤＷ（ブランク）または後
述により調製したβ−グルカン（１００ｐｇ／ｍＬ）を
０．１ｍＬ加え、Ａ−1 とＢは、ｐＨ７．６とし、Ａ−
２はｐＨ６．１のままとした。以下、それらを実施例１
と同様にして反応させた。Ａ、Ｂとも室温に放置せず調
製後直ちに測定した結果と合わせて表２に示した。

【００３３】

【表２】

【００３４】表２から明らかなように、比較例Ｂ、即
ち、放置時のｐＨ値が本発明のリムルス試薬溶液のｐＨ
範囲より高い通常の発色合成基質法リムルス試薬溶液を
室温に４時間放置するとブランクが非常に高まり、β−
グルカン検体溶液の反応値が低下し、一定の測定値が得
られない。一方、本発明の実施例Ａ−１では、ブランク
値もほとんど上昇せず、β−グルカン検体の反応値も放
置しないときの値とほぼ同一で、４時間後でも一定の測
定値が得られることがわかる。

【００３５】また、ｐＨ６．１のままで測定したＡ−２
では、β−グルカン検体反応値はブランク値よりやや高
い程度で、ほとんど反応しておらず、やはり一定の測定
値が得られない。

【００３６】（β−グルカンの調製法）ＰＣＴ国際公開
Ｗ０９０／０２９５１に記載の方法に準じ、カードラン
（和光純薬工業（株）販売）の１ｇを約１００ｍＬの５
ｍＭ ＮａＯＨ水溶液に懸濁し、氷冷下で音波発生機、
ソニケーター^TM（大岳製作所、形式５２０２ＰＺＴ、東
京）により２０ＫＨ_Z、８０Ｗで１２分間音波処理によ
る低分子化を行った。処理液を５Ｍ ＮａＯＨ水溶液を
用い、最終０．３Ｍ水溶液とし、ゲルパーミエーション
クロマトグラフィー（ＧＰＣカラム：ＴＳＫ ｇｅｌ
Ｇ３０００ＰＷ_XL２本、Ｇ２５００ＰＷ_XL １本、移動
相：０．３Ｍ ＮａＯＨ水溶液、流速０．５ｍＬ／ｍｉ
ｎ）により分画採取し、再クロマトグラフィーにより分
子量２１６，０００画分を分画採取し、ＧＰＣ分画精製
標品（β−グルカン標品）を得た。

【００３７】尚、以下の実施例に使用されたβ−グルカ
ンも、上記と同様に調製されたものである。

【００３８】実施例３ Ａ）実施例１で調製したライセート０．０４ｍＬに０．
３Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．１）０．０１ｍＬを加
え、ｐＨ６．１の条件で４℃に８時間放置した（２系列
放置）。 Ｂ）実施例１で調製した別のライセート０．０４ｍＬに
０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液−０．４Ｍ硫酸マグネシウ
ム（ｐＨ８．０）０．０４ｍＬと４．０ｍＭＢｏｃ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２ｍＬを加え（通
常の発色合成基質法リムルス試薬溶液；比較例）、ｐＨ
８．０の条件で同様に放置した。

【００３９】Ａの一方には２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）０．０１ｍＬ、４．０ｍＭ Ｂｏｃ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ０．０２ｍＬ及び０．８Ｍ硫
酸マグネシウム０．０２ｍＬを加え（Ａ−１）、もう一
方には、ＤＷ０．０１ｍＬ、上記の発色合成基質溶液
０．０２ｍＬおよび０．８Ｍ硫酸マグネシウム０．０２
ｍＬを加えた（Ａ−２）後、Ａ、Ｂに検体として、ＤＷ
（ブランク）またはＥｔ（５０ｐｇ／ｍＬ）を０．１ｍ
Ｌ加え、Ａ−１とＢはｐＨ８．０とし、Ａ−２はｐＨ
６．１のままとした。以下、それらを実施例１と同様に
して反応させた。Ａ、Ｂとも４℃に放置せず調製後直ち
に測定した結果と合わせて表３に示した。

【００４０】

【表３】

【００４１】表３から明らかなように、比較例Ｂ、即
ち、放置時のｐＨ値が本発明のリムルス試薬溶液のｐＨ
範囲より高い通常の発色合成基質法リムルス試薬溶液を
４℃に８時間放置するとブランクが非常に高まり、Ｅｔ
検体溶液の反応値が低下し、一定の測定値が得られな
い。一方、本発明の実施例Ａ−１では、ブランク値もほ
とんど上昇せず、Ｅｔ検体の反応値も放置しないときの
値とほぼ同一で、８時間後でも一定の測定値が得られる
ことがわかる。

【００４２】また、ｐＨ６．１のままで測定したＡ−２
では、Ｅｔ検体反応値はブランク値よりやや高い程度
で、ほとんど反応しておらず、やはり一定の測定値が得
られない。 実施例４ Ａ）実施例１で調製したライセ−ト０．０８ｍＬに０．
４Ｍ ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ６．３）０．０１ｍＬを加
え、ｐＨ６．３の条件で４℃に１０時間放置した（２系
列放置）。

【００４３】Ｂ）実施例１で調製した別のライセ−ト
０．０８ｍＬに１Ｍ トリス−塩酸緩衝液−０．４Ｍ硫
酸マグネシウム（ｐＨ７．４）０．０２ｍＬを加え（通
常のゲル化法リムルス試薬溶液；比較例）、ｐＨ７．４
の条件で同様に放置した。Ａの一方には２Ｍ トリス−
塩酸緩衝液−０．８Ｍ硫酸マグネシウム緩衝液（ｐＨ
７．４）０．０１ｍＬを加え（Ａ−１）、もう一方に
は、０．８Ｍ硫酸マグネシウム０．０１ｍＬを加えた
（Ａ−２）後、Ａ、Ｂに検体としてＤＷ（ブランク）ま
たはβ−グルカン（４００ｐｇ／ｍＬ）を０．１ｍＬ加
え、Ａ−1 とＢはｐＨ７．４とし、Ａ−２はｐＨ６．３
のままとした。比濁時間分析装置「トキシノメ−タ−Ｅ
Ｔ−２０１」（和光純薬工業販売）の専用アナリシスモ
ジュ−ルにセットし、３７℃、９０分加温して反応さ
せ、ゲル化時間（Ｔｇ）を測定した。Ａ、Ｂとも４℃に
放置せず調製後直ちに測定した結果と合わせて表４に示
した。

【００４４】

【表４】

【００４５】表４から明らかなように、比較例Ｂ、即
ち、放置時のｐＨ値が本発明のリムルス試薬溶液のｐＨ
範囲より高い通常のゲル化法リムルス試薬溶液を４℃に
１０時間放置すると活性化され、ブランク溶液が反応
し、β−グルカン検体溶液の一定の測定値が得られな
い。一方、本発明の実施例Ａ−１では、ブランク値もβ
−グルカン値も放置しないときの値とほぼ同一で、１０
時間後でも一定の測定値が得られることがわかる。

【００４６】また、ｐＨ６．３のままで測定したＡ−２
では、β−グルカン検体の反応値はブランク値と同一で
まったく反応していなかった。

【００４７】

【発明の効果】本発明のリムルス試薬は、溶液状態で室
温でも長時間安定であるから、Ｅｔ及びβ−グルカンを
正確に経時的に測定することができ、例えば透析液中の
Ｅｔを経時的にモニタリングできるので有用である。ま
た、本発明のリムルス試薬は凍結乾燥物とした場合も、
長期間安定に保存し得、必要時に水で溶解するだけで所
定の安定な測定用リムルス試薬溶液を得ることができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】リムルス反応の機構を説明する図である。

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】カブトガニ・アメボサイト・ライセ−トと
   下記一般式（１）で表される化合物を含有し、溶液とし
   たときのｐＨが６．１〜６．５となるように調整され、
   溶液状態において室温で少なくとも３時間安定であるカ
   ブトガニ・アメボサイト・ライセ−ト組成物からなるこ
   とを特徴とするリムルス試薬。 Ａ−（Ｒ¹ ）_n −Ｘ （１） （式中、Ａは、Ｈ（水素原子）または下記式Ｂで表され
   る有機基であり、ｎは０または１で、Ｒ¹ は、−ＣＨ₂
   −、−（ＣＨ₂ ）₂ −、または−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂
   −を表し、Ｘは、−ＳＯ₃ Ｈ、−ＣＯＯＨ、または−Ｏ
   Ｈを表す。 Ｂ：Ｒ² −Ｃ（Ｒ³ ）₂ −Ｎ（Ｒ⁴ ）−ＣＨ₂ − 式Ｂ中、Ｒ² は、−ＣＯ−ＮＨ₂ または−ＣＨ₂ ＯＨを
   表し、Ｒ³ は単独でＨまたは−ＣＨ₂ ＯＨを表し、Ｒ⁴
   は単独でＨ、−ＣＨ₂ ＣＯＯＨ、または−ＣＨ₂ ＣＨ₂
   ＯＨを表すか、あるいはＲ³ およびＲ⁴ が一緒になって
   ６員環を形成するための−ＣＨ₂ −Ｏ−ＣＨ₂ ＣＨ₂ −
   または−ＣＨ₂ −Ｎ（ＣＨ₂ ＣＨ₂ ＳＯ₃ Ｈ）−ＣＨ₂
   ＣＨ₂ −で表される２価の基を形成する。）
2. 【請求項２】カブトガニ・アメボサイト・ライセ−トと
   下記化合物群から選択される化合物を含有し、溶液とし
   たときのｐＨが６．１〜６．５となるように調整され、
   溶液状態において室温で少なくとも３時間安定であるカ
   ブトガニ・アメボサイト・ライセ−ト組成物からなるこ
   とを特徴とするリムルス試薬。 （ 酢酸、２−モルホリノエタンスルホン酸、２−ヒドロ
   キシ−３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、Ｎ
   −（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン
   酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸、ピペラジ
   ン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、および２
   −ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−ヒドロキ
   シメチル−１，３−プロパンジオ−ル）
3. 【請求項３】カブトガニ・アメボサイト・ライセ−ト組
   成物が溶液または凍結乾燥物であることを特徴とする請
   求項１または２に記載のリムルス試薬。
4. 【請求項４】測定用ｐＨ調整剤、ペプチド合成基質およ
   び２価金属塩からなる群から選ばれた１種または２種以
   上と請求項１〜３のいずれか１項に記載のリムルス試薬
   からなることを特徴とするリムルス試薬キット。
5. 【請求項５】リムルス試薬を用いて検体中のリムルス試
   薬反応性物質を測定するに際し、請求項１記載のリムル
   ス試薬を用い、リムルス反応時の反応混液のｐＨがリム
   ルス反応を惹起する範囲のｐＨとなるように調整するこ
   とを特徴とするリムルス試薬反応性物質の測定法。
6. 【請求項６】リムルス反応を惹起する範囲のｐＨが７．
   ０〜８．５である請求項５に記載のリムルス試薬反応性
   物質の測定法。
7. 【請求項７】ｐＨをリムルス反応を惹起する範囲のｐＨ
   に調整する際または調整前、リムルス反応を惹起するこ
   とができる２価金属イオン濃度になるように２価金属塩
   を添加する請求項５に記載のリムルス試薬反応性物質の
   測定法。
8. 【請求項８】ｐＨをリムルス反応を惹起する範囲のｐＨ
   に調整する際、調整前または調整後、カブトガニ・アメ
   ボサイト・ライセ−トに含まれるクロッティングエンザ
   イムのアミダ−ゼ活性を測定するためのペプチド合成基
   質を添加してリムルス反応を起こさせる請求項５に記載
   のリムルス試薬反応性物質の測定法。