JP3010385B2 - γ−ＧＴＰ測定試薬 - Google Patents
γ−ＧＴＰ測定試薬Info
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はγ−ＧＴＰ測定試薬に関
し、詳細には長期間保存しても測定値の誤差が少ないγ
−ＧＴＰ測定試薬に関する。
し、詳細には長期間保存しても測定値の誤差が少ないγ
−ＧＴＰ測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】血中のγ−ＧＴＰ活性の測定は、肝・胆
道疾患の診断、予後の観察、アルコール中毒症の診断等
に広く利用されており、ＧＯＴ、ＧＰＴ等と共に肝・胆
道系の主要な検査項目の一つである。
道疾患の診断、予後の観察、アルコール中毒症の診断等
に広く利用されており、ＧＯＴ、ＧＰＴ等と共に肝・胆
道系の主要な検査項目の一つである。
【０００３】従来、γ−ＧＴＰ測定試薬としてはγ−グ
ルタミル基供与体及びγ−グルタミル基受容体からなる
試薬が最も一般的に用いられている。この試薬の測定原
理は、被検体中のγ−ＧＴＰがγ−グルタミル基供与体
及びγ−グルタミル基受容体に作用し、γ−グルタミル
基を供与体から受容体に転移させる際に、γ−グルタミ
ル基供与体から遊離する芳香族化合物等を吸光度変化等
により測定するというものである。
ルタミル基供与体及びγ−グルタミル基受容体からなる
試薬が最も一般的に用いられている。この試薬の測定原
理は、被検体中のγ−ＧＴＰがγ−グルタミル基供与体
及びγ−グルタミル基受容体に作用し、γ−グルタミル
基を供与体から受容体に転移させる際に、γ−グルタミ
ル基供与体から遊離する芳香族化合物等を吸光度変化等
により測定するというものである。
【０００４】この方法においてγ−グルタミル基受容体
としてはグリシルグリシンが古くから用いられており、
現在市販の血中γ−ＧＴＰ測定試薬のほとんどはこれを
使用している。そして、グリシルグリシンは、γ−ＧＴ
Ｐ活性測定時の反応系のpHが８付近であることから、利
便性を考慮してpH８付近の溶液として提供されている。
としてはグリシルグリシンが古くから用いられており、
現在市販の血中γ−ＧＴＰ測定試薬のほとんどはこれを
使用している。そして、グリシルグリシンは、γ−ＧＴ
Ｐ活性測定時の反応系のpHが８付近であることから、利
便性を考慮してpH８付近の溶液として提供されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】このようなγ−グルタ
ミル基供与体及びγ−グルタミル基受容体からなるγ−
ＧＴＰ測定試薬においては、測定値の施設間差等が生
じ、大きな問題となっている。この測定値の差異自体は
大きいものではないが、陽性と陰性のボーダーライン付
近にある患者にとっては、肝炎か正常かの診断となって
表われるため極めて重要である。
ミル基供与体及びγ−グルタミル基受容体からなるγ−
ＧＴＰ測定試薬においては、測定値の施設間差等が生
じ、大きな問題となっている。この測定値の差異自体は
大きいものではないが、陽性と陰性のボーダーライン付
近にある患者にとっては、肝炎か正常かの診断となって
表われるため極めて重要である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】かかる実状において、本
発明者らは、かかる測定値の差の生じる原因について種
々検討してきた結果、グリシルグリシンはpH８付近の溶
液中に長期保存すると加水分解されること、さらに当該
加水分解により生じたグリシンは極く微量でγ−ＧＴＰ
活性を阻害することを見出した。
発明者らは、かかる測定値の差の生じる原因について種
々検討してきた結果、グリシルグリシンはpH８付近の溶
液中に長期保存すると加水分解されること、さらに当該
加水分解により生じたグリシンは極く微量でγ−ＧＴＰ
活性を阻害することを見出した。
【０００７】そして、このグリシルグリシンの分解を防
止するため、グリシルグリシンを凍結乾燥品として提供
することを検討したが、凍結乾燥品は剤型確保が困難で
あること、測定時の溶解が困難であること、大量生産に
は不向きであること等の欠点を有しているため、γ−Ｇ
ＴＰ測定試薬としては好ましくないことが判明した。
止するため、グリシルグリシンを凍結乾燥品として提供
することを検討したが、凍結乾燥品は剤型確保が困難で
あること、測定時の溶解が困難であること、大量生産に
は不向きであること等の欠点を有しているため、γ−Ｇ
ＴＰ測定試薬としては好ましくないことが判明した。
【０００８】そこで、更に検討した結果、グリシルグリ
シン溶液のpHを３〜７に調整すれば、グリシルグリシン
は長期保存しても加水分解を受けないこと、及びこれに
測定反応系のpHをアルカリ側に調整するためのアルカリ
剤及びγ−グルタミル基供与体を組み合わせれば、長期
保存しても測定値の差の生じないγ−ＧＴＰ測定試薬が
得られることを見出し、本発明を完成した。
シン溶液のpHを３〜７に調整すれば、グリシルグリシン
は長期保存しても加水分解を受けないこと、及びこれに
測定反応系のpHをアルカリ側に調整するためのアルカリ
剤及びγ−グルタミル基供与体を組み合わせれば、長期
保存しても測定値の差の生じないγ−ＧＴＰ測定試薬が
得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明はγ−グルタミル基供与
体、γ−グルタミル基受容体としてのpH３〜７のグリシ
ルグリシン溶液、及び測定反応系のpHを7.5 〜8.5 とす
るアルカリ剤からなるγ−ＧＴＰ測定試薬を提供するも
のである。
体、γ−グルタミル基受容体としてのpH３〜７のグリシ
ルグリシン溶液、及び測定反応系のpHを7.5 〜8.5 とす
るアルカリ剤からなるγ−ＧＴＰ測定試薬を提供するも
のである。
【００１０】本発明に用いるグリシルグリシン溶液は、
そのpHが３〜７であることが必要であり、好ましくはpH
５〜６である。この溶液のpHが３未満又は７を超えると
グリシルグリシンの分解が生じ、特にpH８を超えると分
解が顕著に認められ好ましくない（図１）。この溶液の
pHは３〜７であれば特に他の物質を加えて調整する必要
はないが、必要に応じて、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤
等を加えてもよい。
そのpHが３〜７であることが必要であり、好ましくはpH
５〜６である。この溶液のpHが３未満又は７を超えると
グリシルグリシンの分解が生じ、特にpH８を超えると分
解が顕著に認められ好ましくない（図１）。この溶液の
pHは３〜７であれば特に他の物質を加えて調整する必要
はないが、必要に応じて、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤
等を加えてもよい。
【００１１】また、γ−グルタミル基供与体としては、
特に限定はなく、具体例としてはγ−グルタミル−３−
カルボキシ−４−ニトロアニリド、γ−グルタミル−ｐ
−ニトロアニリド等が挙げられる。なおこの溶液のpHは
８以下とすることが好ましい。アルカリ剤としては反応
系のpHを7.5 〜8.5 の範囲とするものであれば特に限定
されず、この具体例としては、水酸化ナトリウム、トリ
ス緩衝液等が挙げられる。
特に限定はなく、具体例としてはγ−グルタミル−３−
カルボキシ−４−ニトロアニリド、γ−グルタミル−ｐ
−ニトロアニリド等が挙げられる。なおこの溶液のpHは
８以下とすることが好ましい。アルカリ剤としては反応
系のpHを7.5 〜8.5 の範囲とするものであれば特に限定
されず、この具体例としては、水酸化ナトリウム、トリ
ス緩衝液等が挙げられる。
【００１２】本発明試薬を用いて血液等の検体のγ−Ｇ
ＴＰ活性を測定するには、例えば上記３成分を混合し、
これに検体を加え一定時間インキュベーションした後、
γ−グルタミル基供与体から遊離する芳香族化合物の特
性に応じた波長における吸光度を測定すればよい。この
測定値を用い、予め作成しておいた検量線あるいは分子
吸光係数より検体のγ−ＧＴＰ活性を算出する。
ＴＰ活性を測定するには、例えば上記３成分を混合し、
これに検体を加え一定時間インキュベーションした後、
γ−グルタミル基供与体から遊離する芳香族化合物の特
性に応じた波長における吸光度を測定すればよい。この
測定値を用い、予め作成しておいた検量線あるいは分子
吸光係数より検体のγ−ＧＴＰ活性を算出する。
【００１３】このときのγ−グルタミル基供与体の濃度
は検体中のγ−ＧＴＰよりも過剰であれば特に制限され
ないが、通常0.5 〜50mM、好ましくは１〜20mMである。
一方、グリシルグリシンの濃度も特に限定されないが、
通常25〜500 mM、好ましくは50〜200 mMである。また、
反応は検体が血清の場合、25〜37℃、特に30℃又は37℃
で行なうのが好ましい。
は検体中のγ−ＧＴＰよりも過剰であれば特に制限され
ないが、通常0.5 〜50mM、好ましくは１〜20mMである。
一方、グリシルグリシンの濃度も特に限定されないが、
通常25〜500 mM、好ましくは50〜200 mMである。また、
反応は検体が血清の場合、25〜37℃、特に30℃又は37℃
で行なうのが好ましい。
【００１４】
【発明の効果】本発明のγ−ＧＴＰ測定試薬は、長期間
保存しても安定であるため、測定値の誤差が少なく、更
に需要の高い大容量品としての安定的供給を可能とし
た。
保存しても安定であるため、測定値の誤差が少なく、更
に需要の高い大容量品としての安定的供給を可能とし
た。
【００１５】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１６】試験例１ グリシルグリシンのpH安定性：１規定水酸化ナトリウム
又は１規定塩酸を用いてpH３〜９に調整した 100mMのグ
リシルグリシン液を50℃で２週間保存し、グリシルグリ
シン分解によるグリシン生成量を下記測定法により測定
し、比較した。結果を図１に示す。 （１）グリシルグリシン液中のグリシン量の測定 グリシルグリシンを含む試料中のグリシン測定はＰＴＣ
化法によるアミノ酸分析にて実施した（続生化学実験講
座２ タンパク質の化学 上 210 頁から215頁 日本
生化学会編 東京化学同人）。アミノ酸分析により得た
グリシルグリシンとグリシンのピーク面積比と、試料の
代わりに既知濃度のグリシンを含むグリシルグリシン液
を用い同様に操作して得た検量線から試料中のグリシン
量を求めた。50℃で２週間保存した時のグリシン生成量
について図１に示した。この結果より、グリシルグリシ
ンはpH３〜７で安定であることが判る。
又は１規定塩酸を用いてpH３〜９に調整した 100mMのグ
リシルグリシン液を50℃で２週間保存し、グリシルグリ
シン分解によるグリシン生成量を下記測定法により測定
し、比較した。結果を図１に示す。 （１）グリシルグリシン液中のグリシン量の測定 グリシルグリシンを含む試料中のグリシン測定はＰＴＣ
化法によるアミノ酸分析にて実施した（続生化学実験講
座２ タンパク質の化学 上 210 頁から215頁 日本
生化学会編 東京化学同人）。アミノ酸分析により得た
グリシルグリシンとグリシンのピーク面積比と、試料の
代わりに既知濃度のグリシンを含むグリシルグリシン液
を用い同様に操作して得た検量線から試料中のグリシン
量を求めた。50℃で２週間保存した時のグリシン生成量
について図１に示した。この結果より、グリシルグリシ
ンはpH３〜７で安定であることが判る。
【００１７】試験例２ グリシンのγ−ＧＴＰ活性に与える影響：既知濃度のグ
リシンを含む試薬を用い、γ−ＧＴＰに対するグリシン
の影響について下記の如く検討した。結果を図２に示
す。 （１）γ−ＧＴＰ活性測定 グリシルグリシン100mM 、及びγ−グルタミル−３−カ
ルボキシ−４ニトロアニリド３mM、を含む 100mMトリス
緩衝液（pH8.2) 400μｌにγ−ＧＴＰを含む試料10μｌ
を加え攪拌後、37℃で加温し 405nmにおける１分後から
４分後までの３分間の吸光度変化量を測定した。これと
試料の代わりに精製水10μｌを加え、同様に操作して得
た試薬盲検量との差から試料吸光度変化量を求める。求
めた試料吸光度変化量と検出色素である５−アミノ−ニ
トロ安息香酸の分子吸光係数からγ−ＧＴＰ活性を算出
した。 （２）γ−ＧＴＰ活性に対するグリシンの影響 （１）の試薬に、グリシン濃度0.5mM から10mMとなるよ
うにグリシンを加えた試薬を調製し同様に操作して
（１）の試薬を用いた時のγ−ＧＴＰ活性値と比較した
相対値を図２に示した。
リシンを含む試薬を用い、γ−ＧＴＰに対するグリシン
の影響について下記の如く検討した。結果を図２に示
す。 （１）γ−ＧＴＰ活性測定 グリシルグリシン100mM 、及びγ−グルタミル−３−カ
ルボキシ−４ニトロアニリド３mM、を含む 100mMトリス
緩衝液（pH8.2) 400μｌにγ−ＧＴＰを含む試料10μｌ
を加え攪拌後、37℃で加温し 405nmにおける１分後から
４分後までの３分間の吸光度変化量を測定した。これと
試料の代わりに精製水10μｌを加え、同様に操作して得
た試薬盲検量との差から試料吸光度変化量を求める。求
めた試料吸光度変化量と検出色素である５−アミノ−ニ
トロ安息香酸の分子吸光係数からγ−ＧＴＰ活性を算出
した。 （２）γ−ＧＴＰ活性に対するグリシンの影響 （１）の試薬に、グリシン濃度0.5mM から10mMとなるよ
うにグリシンを加えた試薬を調製し同様に操作して
（１）の試薬を用いた時のγ−ＧＴＰ活性値と比較した
相対値を図２に示した。
【００１８】実施例１ γ−ＧＴＰ活性測定値の経時変化：本発明のグリシルグ
リシン液を構成成分とするγ−ＧＴＰ測定試薬と、pH８
付近のグリシルグリシン液を構成試薬とする従来法のγ
−ＧＴＰ測定試薬とを共に図３に示す条件下に保存し、
γ−ＧＴＰ活性を測定したときの測定値の推移を下記測
定法により測定した。結果を図３に示す。
リシン液を構成成分とするγ−ＧＴＰ測定試薬と、pH８
付近のグリシルグリシン液を構成試薬とする従来法のγ
−ＧＴＰ測定試薬とを共に図３に示す条件下に保存し、
γ−ＧＴＰ活性を測定したときの測定値の推移を下記測
定法により測定した。結果を図３に示す。
【００１９】（１）本発明法によるγ−ＧＴＰ活性測定 試薬 試薬１ グリシルグリシン 152 mM 液（pH5.5) 試薬２ NaOH 135mMを含むトリスヒドロキシメチルアミ
ノメタン 1000 mM 液（pH13） 試薬３ γ−グルタミル−3 −カルボキシ−4 −ニトロ
アニリド0.427g 試薬４ 50 mM トリス緩衝液（pH7.0) 測定 試薬１の90mlと試薬２の10mlを混合し、第１試薬（pH8.
15）とする。試薬３を試薬４の100ml で溶解し、第２試
薬とする。第１試薬300 μｌにγ−ＧＴＰを含む試料10
μｌを加え攪拌後、37℃で５分間加温し、第２試薬を加
え攪拌し、その後37℃、405nm における１分後から４分
後までの３分間の吸光度変化量を測定した。これと、試
料の代わりに精製水を10μｌを加え、同様に操作して得
た試薬盲検値との差から試料吸光度変化量を求めた。求
めた試料吸光度変化量と検出色素である５−アミノ−２
−ニトロ安息香酸の分子吸光係数からγ−ＧＴＰ活性を
算出した。 （２）従来法によるγ−ＧＴＰ活性測定 試薬 試薬１ グリシルグリシン 137 mM を含む100 mMトリス
緩衝液（pH8.15） 試薬２ γ−グルタミル−3 −カルボキシ−4 −ニトロ
アニリド0.427g 試薬３ 50 mM トリス緩衝液（pH7.0) 測定 試薬１をそのまま使用し、第１試薬とする。試薬２を試
薬３の100ml で溶解し、第２試薬とする。第１試薬300
μｌにγ−ＧＴＰを含む試料10μｌを加え攪拌後、37℃
で５分間加温し、第２試薬を 100μｌ加え攪拌し、その
後、37℃、405nm における１分後から４分後までの３分
間の吸光度変化量を測定した。これと、試料の代わりに
精製水10μｌを加え、同様に操作して得た試薬盲検値と
の差から試料吸光度変化量を求めた。求めた試料吸光度
変化量と検出色素である５−アミノ−２−ニトロ安息香
酸の分子吸光係数からγ−ＧＴＰ活性を算出した。
ノメタン 1000 mM 液（pH13） 試薬３ γ−グルタミル−3 −カルボキシ−4 −ニトロ
アニリド0.427g 試薬４ 50 mM トリス緩衝液（pH7.0) 測定 試薬１の90mlと試薬２の10mlを混合し、第１試薬（pH8.
15）とする。試薬３を試薬４の100ml で溶解し、第２試
薬とする。第１試薬300 μｌにγ−ＧＴＰを含む試料10
μｌを加え攪拌後、37℃で５分間加温し、第２試薬を加
え攪拌し、その後37℃、405nm における１分後から４分
後までの３分間の吸光度変化量を測定した。これと、試
料の代わりに精製水を10μｌを加え、同様に操作して得
た試薬盲検値との差から試料吸光度変化量を求めた。求
めた試料吸光度変化量と検出色素である５−アミノ−２
−ニトロ安息香酸の分子吸光係数からγ−ＧＴＰ活性を
算出した。 （２）従来法によるγ−ＧＴＰ活性測定 試薬 試薬１ グリシルグリシン 137 mM を含む100 mMトリス
緩衝液（pH8.15） 試薬２ γ−グルタミル−3 −カルボキシ−4 −ニトロ
アニリド0.427g 試薬３ 50 mM トリス緩衝液（pH7.0) 測定 試薬１をそのまま使用し、第１試薬とする。試薬２を試
薬３の100ml で溶解し、第２試薬とする。第１試薬300
μｌにγ−ＧＴＰを含む試料10μｌを加え攪拌後、37℃
で５分間加温し、第２試薬を 100μｌ加え攪拌し、その
後、37℃、405nm における１分後から４分後までの３分
間の吸光度変化量を測定した。これと、試料の代わりに
精製水10μｌを加え、同様に操作して得た試薬盲検値と
の差から試料吸光度変化量を求めた。求めた試料吸光度
変化量と検出色素である５−アミノ−２−ニトロ安息香
酸の分子吸光係数からγ−ＧＴＰ活性を算出した。
【図１】図１は、グリシルグリシンのpH安定性を示す図
面である。
面である。
【図２】図２は、グリシンのγ−ＧＴＰ活性に与える影
響を示す図面である。
響を示す図面である。
【図３】図３は、γ−ＧＴＰ活性測定値の経時変化を示
す図面である。
す図面である。
Claims (1)
- 【請求項１】 γ−グルタミル基供与体、γ−グルタミ
ル基受容体としてのpH３〜７のグリシルグリシン溶液、
及び測定反応系のpHを7.5〜8.5 とするアルカリ剤から
なるγ−ＧＴＰ測定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3063405A JP3010385B2 (ja) | 1991-03-27 | 1991-03-27 | γ−ＧＴＰ測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3063405A JP3010385B2 (ja) | 1991-03-27 | 1991-03-27 | γ−ＧＴＰ測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04299997A JPH04299997A (ja) | 1992-10-23 |
| JP3010385B2 true JP3010385B2 (ja) | 2000-02-21 |
Family
ID=13228363
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3063405A Expired - Lifetime JP3010385B2 (ja) | 1991-03-27 | 1991-03-27 | γ−ＧＴＰ測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3010385B2 (ja) |
-
1991
- 1991-03-27 JP JP3063405A patent/JP3010385B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04299997A (ja) | 1992-10-23 |
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