JPS5847491A - β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ作用の停止方法 - Google Patents
β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ作用の停止方法Info
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- JPS5847491A JPS5847491A JP14639481A JP14639481A JPS5847491A JP S5847491 A JPS5847491 A JP S5847491A JP 14639481 A JP14639481 A JP 14639481A JP 14639481 A JP14639481 A JP 14639481A JP S5847491 A JPS5847491 A JP S5847491A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- galactosidase
- action
- beta
- measurement
- chelating agent
- Prior art date
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/99—Enzyme inactivation by chemical treatment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/924—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用を阻害して反
応を停止させるための新規方法しこ関する。
応を停止させるための新規方法しこ関する。
近年、β−Ｄ−ガラクトシダーゼは酵素免疫測定法（以
下、「ＥＩＡ法」と略す。）における抗原または抗体の
標識用酵素としての用途が飛躍的ｔこ増大している。こ
のＥＩＡ法ｔこおいてはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性
の実測値が測定一対象成分の存在量に直接反映されるた
め、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の測定１こあたって
は、酵素反応生成物の検出感度が高く且つ正確な測定値
を求める必要がある。従来このＥＩＡ法の分野で採用さ
れているβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性（作用）の測定
方法としては、主として合成基質を用い、且つそのβ−
Ｄ−ガラクトンダーゼ作用の停止手段として反応液のｐ
Ｈ値をβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの至適ｐＨ域から大き
くはずれたアルカリ側Ｖこ移す手法が採用されている。
下、「ＥＩＡ法」と略す。）における抗原または抗体の
標識用酵素としての用途が飛躍的ｔこ増大している。こ
のＥＩＡ法ｔこおいてはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性
の実測値が測定一対象成分の存在量に直接反映されるた
め、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の測定１こあたって
は、酵素反応生成物の検出感度が高く且つ正確な測定値
を求める必要がある。従来このＥＩＡ法の分野で採用さ
れているβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性（作用）の測定
方法としては、主として合成基質を用い、且つそのβ−
Ｄ−ガラクトンダーゼ作用の停止手段として反応液のｐ
Ｈ値をβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの至適ｐＨ域から大き
くはずれたアルカリ側Ｖこ移す手法が採用されている。
しかし乍らβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用停止のための
このｐｔｔ移行の手法は操作的に簡単ではあるものの、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用を完全に停止できる方法
ではなかった。したがって、ｐＨ移行の手法によってβ
−Ｄ−ガラクトンダーゼ作用を停止後直ちに反応生成物
量を実測できない場合には残存基質へのβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ作用が徐４に進行して、正確な反応生成物量
が把握できず、また、測定成績が大きくばらつくことが
極めて多い。殊に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用時ｔ
こおける反応温度が高ければ高い程この測定成績のばら
つき現象は一層増大する。
このｐｔｔ移行の手法は操作的に簡単ではあるものの、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用を完全に停止できる方法
ではなかった。したがって、ｐＨ移行の手法によってβ
−Ｄ−ガラクトンダーゼ作用を停止後直ちに反応生成物
量を実測できない場合には残存基質へのβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ作用が徐４に進行して、正確な反応生成物量
が把握できず、また、測定成績が大きくばらつくことが
極めて多い。殊に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用時ｔ
こおける反応温度が高ければ高い程この測定成績のばら
つき現象は一層増大する。
本発明者は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用の測定方法
における上記問題点を解決すべく鋭意検討した結果、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼの至適作用ｐＨ域以外のアルカ
リ性領域で、β−Ｄ−ガラクトシダーゼとキレート剤と
を接触せしめることにより、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
作用を完全に停止できることを見出し、この発見１こ基
づいて本発明を完成するに至った。
における上記問題点を解決すべく鋭意検討した結果、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼの至適作用ｐＨ域以外のアルカ
リ性領域で、β−Ｄ−ガラクトシダーゼとキレート剤と
を接触せしめることにより、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
作用を完全に停止できることを見出し、この発見１こ基
づいて本発明を完成するに至った。
この方法によれば、操作的に簡便であり、また測定時間
面での制約なしにβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用が把握
できるので、極めて有利である。
面での制約なしにβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用が把握
できるので、極めて有利である。
もちろん、従来のβ−Ｄ−ガラクトンダーゼ作用による
反応生成物の測定条件、方法をそのまま利用することが
できる。
反応生成物の測定条件、方法をそのまま利用することが
できる。
位してキレート化合物を多座配位子であり、塩、八
い。その例として、エチレンジアミン四酢酸（以下、「
ＥＤＴＡ」と略記する。）、エチレンジアミン、しゆう
酸、オキシン類、アミノ酸、アセチル゛アセトン、ビロ
リン酸、ヒドロキシルアミン、キレート高分子、金属吸
着性高分子がある。この中で、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼへの阻１ 作用が極めて強く、かつ劇毒物としての取
扱いを必要としない点で通常ＥＤＴＡが好ましい。一般
的にキレート剤（試薬）は金属イオン１こ配位する官能
基を２個以上有しており、その主たる配位原子である酸
素、窒素および硫黄原子が０．０−ｆ１１位、Ｎ ＋
Ｎ−配位、Ｓ、Ｓ−配位、Ｏ，Ｎ−配位、Ｓ、Ｎ−配位
、０．Ｓ−配位の如く配位してキレート環を形成するこ
とが知られているが、これら各種の配位なもつキレート
剤はいずれも本発明１こ適用しうる。本発明におけるキ
レート剤はキレート剤単独で使用することも出来るが、
通常は他の補助剤、例えば緩衝液と併用するとβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼ作用への阻害効果をより高られる点で
好ましい３．この際、本発明は、キレート剤と併用する
緩衝液の構成成分やその組成、液性ｔこ左右されること
なく、またβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの給源如何や、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用を検出用手段として活用し
た測定対象物の種類如何に何ら制限されることな〈実施
することが出来る。
ＥＤＴＡ」と略記する。）、エチレンジアミン、しゆう
酸、オキシン類、アミノ酸、アセチル゛アセトン、ビロ
リン酸、ヒドロキシルアミン、キレート高分子、金属吸
着性高分子がある。この中で、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼへの阻１ 作用が極めて強く、かつ劇毒物としての取
扱いを必要としない点で通常ＥＤＴＡが好ましい。一般
的にキレート剤（試薬）は金属イオン１こ配位する官能
基を２個以上有しており、その主たる配位原子である酸
素、窒素および硫黄原子が０．０−ｆ１１位、Ｎ ＋
Ｎ−配位、Ｓ、Ｓ−配位、Ｏ，Ｎ−配位、Ｓ、Ｎ−配位
、０．Ｓ−配位の如く配位してキレート環を形成するこ
とが知られているが、これら各種の配位なもつキレート
剤はいずれも本発明１こ適用しうる。本発明におけるキ
レート剤はキレート剤単独で使用することも出来るが、
通常は他の補助剤、例えば緩衝液と併用するとβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼ作用への阻害効果をより高られる点で
好ましい３．この際、本発明は、キレート剤と併用する
緩衝液の構成成分やその組成、液性ｔこ左右されること
なく、またβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの給源如何や、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用を検出用手段として活用し
た測定対象物の種類如何に何ら制限されることな〈実施
することが出来る。
さらに本発明の実施１こあたってはβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼが遊離状態や不溶化状態のいずれであってもよく
、またβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用ｔこよる酵素基質
からの反応生成物の測定手段が比色分析法、分光分析法
、蛍光分析法、発光分析法等のいずれの方法ｔこよって
もよい。次に、本発明におけるキレート剤の使用量は極
めて少量でβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用への阻害効果
を示す為に殊に使用量に特別な制限はないが、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ使用量との関係を考慮しながら通常は
１ｍＭ以上存在させることが望ましい。
ダーゼが遊離状態や不溶化状態のいずれであってもよく
、またβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用ｔこよる酵素基質
からの反応生成物の測定手段が比色分析法、分光分析法
、蛍光分析法、発光分析法等のいずれの方法ｔこよって
もよい。次に、本発明におけるキレート剤の使用量は極
めて少量でβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用への阻害効果
を示す為に殊に使用量に特別な制限はないが、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ使用量との関係を考慮しながら通常は
１ｍＭ以上存在させることが望ましい。
β−Ｄ−ガラクトシダーゼとキレート剤、とを接触させ
る条件は、酵素の至適作用ｐＨ域外のアルカリ性領域で
あるが、例えばｐＨ９〜１１．５、好ましくはｐＨ１０
〜１０．５である。
る条件は、酵素の至適作用ｐＨ域外のアルカリ性領域で
あるが、例えばｐＨ９〜１１．５、好ましくはｐＨ１０
〜１０．５である。
以下、実施例により本発明の詳細な説明する。
実施例１：各種起源のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用に
対するＢＤＴＡの阻害効果 ０．１ Ｍ −Ｎａｃｌおよび５ Ｘ １０ Ｍ Ｍ
ｇ ｃ ｌ＊を含む０．０１ Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ
７，３）の０．３ｍｌｍｌ中太腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃａｌｆ）由来β−Ｄ−ガラクトンダーゼの０
．２ミリユニツトを含む液〔Ａ液〕、０、ｏ ５ Ｍ−
ｆ ！Ｊ シフ緩衝液（ｐ’）ｌ ３，５ ） （Ｄ
Ｏ，３ｍｅ中＋、−１，（い％ ＩＹ４ Ｃ＾綽いｔ
＋ｒｇｉｌｌｕｍ ＋＋ｉｉｎ ）１１１ １
β −い −−−ガラクト７ダーゼの約１１−５４リユ
ニノ１を含む液〔Ｂ液〕および０．０５ Ｍ−クエン酸
ノーダ緩ｍｌ（ｐＨ４，５）の０．３ａｌ中にた′ちな
たまめ（Ｊａｃｋｂｅａｎ）由来β−Ｄ−ガラクト７ダ
ーゼ約３０ミリユニットを含む液〔Ｃ液〕の３種を用意
する。この缶液にｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラク
トシドの２ｍＭ液（Ａ、Ｂ、Ｃ缶液に対応した緩衝液で
溶解させたもの。）の１ ｍｌを加えてからＡ液は３７
Ｃ下、Ｂ液およびＣ液は２５ｃ下で１時間反応させた後
、０．２Ｍ−ホウ酸ソーダ緩衝液（ＰＴ（９，８） Ｃ
Ｄ液〕またはＥＤＴＡｌｍＭを含む０．２Ｍ−ホウ酸ソ
ーダ緩衝液（ｐＨ９，８）（Ｅ液〕の３ ｍｌを加え、
生成したｐ−ニトロフェノール量を波長４２０ｎｍｔこ
おける吸光値で測定した（１次測定と略す）。次いで１
次測定の終了した上記各溶液を上記反応条件下に更に一
夜装置した後、再度波長４２０ｎｍにおける吸光度を測
定した（２次測定）。
対するＢＤＴＡの阻害効果 ０．１ Ｍ −Ｎａｃｌおよび５ Ｘ １０ Ｍ Ｍ
ｇ ｃ ｌ＊を含む０．０１ Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ
７，３）の０．３ｍｌｍｌ中太腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃａｌｆ）由来β−Ｄ−ガラクトンダーゼの０
．２ミリユニツトを含む液〔Ａ液〕、０、ｏ ５ Ｍ−
ｆ ！Ｊ シフ緩衝液（ｐ’）ｌ ３，５ ） （Ｄ
Ｏ，３ｍｅ中＋、−１，（い％ ＩＹ４ Ｃ＾綽いｔ
＋ｒｇｉｌｌｕｍ ＋＋ｉｉｎ ）１１１ １
β −い −−−ガラクト７ダーゼの約１１−５４リユ
ニノ１を含む液〔Ｂ液〕および０．０５ Ｍ−クエン酸
ノーダ緩ｍｌ（ｐＨ４，５）の０．３ａｌ中にた′ちな
たまめ（Ｊａｃｋｂｅａｎ）由来β−Ｄ−ガラクト７ダ
ーゼ約３０ミリユニットを含む液〔Ｃ液〕の３種を用意
する。この缶液にｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラク
トシドの２ｍＭ液（Ａ、Ｂ、Ｃ缶液に対応した緩衝液で
溶解させたもの。）の１ ｍｌを加えてからＡ液は３７
Ｃ下、Ｂ液およびＣ液は２５ｃ下で１時間反応させた後
、０．２Ｍ−ホウ酸ソーダ緩衝液（ＰＴ（９，８） Ｃ
Ｄ液〕またはＥＤＴＡｌｍＭを含む０．２Ｍ−ホウ酸ソ
ーダ緩衝液（ｐＨ９，８）（Ｅ液〕の３ ｍｌを加え、
生成したｐ−ニトロフェノール量を波長４２０ｎｍｔこ
おける吸光値で測定した（１次測定と略す）。次いで１
次測定の終了した上記各溶液を上記反応条件下に更に一
夜装置した後、再度波長４２０ｎｍにおける吸光度を測
定した（２次測定）。
以上、１次測定の結果を１０１１とし、２次測定の成績
を相対値で示すと となった。即ち、１次測定時従来のホウ酸ソーダ緩衝液
のみを用いた場合は１次測定後１こおいてもβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ作用が更１こ進行したのに対し、ＥＤＴ
Ａ１ｍＭ添加時におい添加−ずれの起源由来のβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼ作用についてもその作用は完全に停止
した。
を相対値で示すと となった。即ち、１次測定時従来のホウ酸ソーダ緩衝液
のみを用いた場合は１次測定後１こおいてもβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ作用が更１こ進行したのに対し、ＥＤＴ
Ａ１ｍＭ添加時におい添加−ずれの起源由来のβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼ作用についてもその作用は完全に停止
した。
実施例２：不溶化β−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用をこ対
する各種キレート剤の阻害効果 加藤らの方法（加藤兼房ら、化学と生物１４（扁１１）
７３７、Ｌユ（Ｊｆ６１２）８１７（１９７６））にし
たがってＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）抗体を不溶化せ
しめたガラスピーズ（６關ψｘ ６ ｍｍ ）および大
腸菌Ｎ’＋’□生のβ−１） −／／ラクトシダーゼを
標識したＴＳＨ−酵素複合体を調製した後、加藤らの方
法の緩衝液Ａ液０．３ｍ／中ｔこ前記ビーズ１ヶおよび
前記のＴＳＨ−酵素複合体の希釈液Ｑ、０１ｍ／を加え
て３７Ｃ下−夜装置して反応させた。次いで、このビー
ズを緩衝液Ａ液の１ ｍｅを用いて３回洗浄した後、同
Ａ液０．３−を含す他の試験管へ移してから、酵素基質
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドの
３Ｘ １０−’ Ｍ液０．０５−を加えて３７Ｃ下１時
間静置して反応させた。この反応１時間緩１こ、０．１
Ｍ−グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，３）または
この緩衝液に後述の如き各種試薬の１種を１ｍＭあて加
えてからｐＨ４０，３ｔこ再調整した緩衝液の１種を２
．５＊／ずつ添加して励起波長３６０ｎｍ１蛍光波長４
５０ ｎｍで生成した４−メチルウンベリフェリルの蛍
光値を測定した（１次測定）。次いで１次測定の終了し
た上記各溶液を室温下更に２４時間放・置した後、再度
上記の如く蛍光値を測定した（２次測定）。以上の如く
して１次測定で得られた蛍光値を１００とし、２次測定
の成績を相対値で示すと となり、不溶化したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ酵素作用
に対しても各種キレート剤の顕著な阻害現象が認められ
た。
する各種キレート剤の阻害効果 加藤らの方法（加藤兼房ら、化学と生物１４（扁１１）
７３７、Ｌユ（Ｊｆ６１２）８１７（１９７６））にし
たがってＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）抗体を不溶化せ
しめたガラスピーズ（６關ψｘ ６ ｍｍ ）および大
腸菌Ｎ’＋’□生のβ−１） −／／ラクトシダーゼを
標識したＴＳＨ−酵素複合体を調製した後、加藤らの方
法の緩衝液Ａ液０．３ｍ／中ｔこ前記ビーズ１ヶおよび
前記のＴＳＨ−酵素複合体の希釈液Ｑ、０１ｍ／を加え
て３７Ｃ下−夜装置して反応させた。次いで、このビー
ズを緩衝液Ａ液の１ ｍｅを用いて３回洗浄した後、同
Ａ液０．３−を含す他の試験管へ移してから、酵素基質
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドの
３Ｘ １０−’ Ｍ液０．０５−を加えて３７Ｃ下１時
間静置して反応させた。この反応１時間緩１こ、０．１
Ｍ−グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，３）または
この緩衝液に後述の如き各種試薬の１種を１ｍＭあて加
えてからｐＨ４０，３ｔこ再調整した緩衝液の１種を２
．５＊／ずつ添加して励起波長３６０ｎｍ１蛍光波長４
５０ ｎｍで生成した４−メチルウンベリフェリルの蛍
光値を測定した（１次測定）。次いで１次測定の終了し
た上記各溶液を室温下更に２４時間放・置した後、再度
上記の如く蛍光値を測定した（２次測定）。以上の如く
して１次測定で得られた蛍光値を１００とし、２次測定
の成績を相対値で示すと となり、不溶化したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ酵素作用
に対しても各種キレート剤の顕著な阻害現象が認められ
た。
実施例３：不溶化β−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用に対す
るＥＤＴＡの阻害効果 大腸菌の産生するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを抗体への
標識用酵素とするＥＩＡ法を応用した市販のα−フェト
プロティン測定キット、免疫グロブリンＥ測定キットを
用いて、ガラスピーズまたはポリスチレンビーズ上に不
溶化されたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性な０−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを酵素基質として実施
例１の手順に準じて測定し次表の結果を得た。
るＥＤＴＡの阻害効果 大腸菌の産生するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを抗体への
標識用酵素とするＥＩＡ法を応用した市販のα−フェト
プロティン測定キット、免疫グロブリンＥ測定キットを
用いて、ガラスピーズまたはポリスチレンビーズ上に不
溶化されたβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性な０−ニトロ
フェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを酵素基質として実施
例１の手順に準じて測定し次表の結果を得た。
即ち、不溶化したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの酵素作用
は、その不溶化状態が異ってもまた不溶化したβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼの活性測定方法が可視部吸光法であっ
てもＥＤＴＡ添加によるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用
への阻害効果は極めて大であった。
は、その不溶化状態が異ってもまた不溶化したβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼの活性測定方法が可視部吸光法であっ
てもＥＤＴＡ添加によるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用
への阻害効果は極めて大であった。
実施例４：ＥＤＴＡによるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ作
用の阻害効果とｐＨの関係 実施例２の如くして、ＴＳ）Ｉ抗体を不溶化せしめたガ
ラスピーズの表面上に大腸菌産生のβ−り一ガラクトシ
ダーゼを標識したＴＳＨ−酵素複合り 体を結合せして結果的ｔこβ−Ｄ−ガラクトシダー＾ ゼな不溶化せしめたビーズを調製した。次に０．１チー
牛血清アルブミン、０．１％−ＮａＮ３ １．０−Ｉ
Ｍ−Ｎａｃｌ 、１０ ｍＭ Ｎａｃｌ２を含む０．０
１ Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７，３）の０．３０−を分
注した試験管中に前記のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ不溶
化ビーズを移した後、実施例２で用いた酵素基質液ｏ、
ｏｓ＊ｅを加えてから３７Ｃ下靜置して反応させた。１
時間反応後に、ＥＤＴＡｌｍＭを含み、且つｐＨ７，３
、ｐＨ８，５、ｐ）（９，４、ｐＨ１０，３に調製され
た０、１Ｍ−グリシン−ＮａＯＨ緩衝液の１種を２．５
１１／ずつ添加して実施例２０手法で生成した４−メチ
ルウンベリフエーンの蛍光値を測定した（１次測定）。
用の阻害効果とｐＨの関係 実施例２の如くして、ＴＳ）Ｉ抗体を不溶化せしめたガ
ラスピーズの表面上に大腸菌産生のβ−り一ガラクトシ
ダーゼを標識したＴＳＨ−酵素複合り 体を結合せして結果的ｔこβ−Ｄ−ガラクトシダー＾ ゼな不溶化せしめたビーズを調製した。次に０．１チー
牛血清アルブミン、０．１％−ＮａＮ３ １．０−Ｉ
Ｍ−Ｎａｃｌ 、１０ ｍＭ Ｎａｃｌ２を含む０．０
１ Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７，３）の０．３０−を分
注した試験管中に前記のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ不溶
化ビーズを移した後、実施例２で用いた酵素基質液ｏ、
ｏｓ＊ｅを加えてから３７Ｃ下靜置して反応させた。１
時間反応後に、ＥＤＴＡｌｍＭを含み、且つｐＨ７，３
、ｐＨ８，５、ｐ）（９，４、ｐＨ１０，３に調製され
た０、１Ｍ−グリシン−ＮａＯＨ緩衝液の１種を２．５
１１／ずつ添加して実施例２０手法で生成した４−メチ
ルウンベリフエーンの蛍光値を測定した（１次測定）。
この１次測定の終了した上記各溶液を３７Ｃ下更に３時
間放置した後、再度上記の如く蛍光値を測定した（２次
測定）。１次測定で得られた各区における蛍光値を１０
０とし、２次測定における測定結果を相対値で示した。
間放置した後、再度上記の如く蛍光値を測定した（２次
測定）。１次測定で得られた各区における蛍光値を１０
０とし、２次測定における測定結果を相対値で示した。
即ち、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ作用に対するＥＤＴＡ
の阻害効果は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの至適作用ｐ
Ｈ域であるｐＨ７，３から大きくずれた強アルカリ性ｐ
Ｈ領域１こおいて顕著１こ発現した。
の阻害効果は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの至適作用ｐ
Ｈ域であるｐＨ７，３から大きくずれた強アルカリ性ｐ
Ｈ領域１こおいて顕著１こ発現した。
特許出願人 味の素株式会社
富士臓器製薬株式会社
Claims (1)
- β−Ｄ−ガラクトシダーゼの至適作用ｐＨ域域外外アル
カリ性領域で、β−Ｄ−ガラクトシダーゼとキレート剤
とを接触せしめることを特徴とするβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ作用の停止方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14639481A JPS5847491A (ja) | 1981-09-18 | 1981-09-18 | β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ作用の停止方法 |
| EP82108604A EP0075293B1 (en) | 1981-09-18 | 1982-09-17 | Method for inhibiting beta-d-galactosidase |
| DE8282108604T DE3273032D1 (en) | 1981-09-18 | 1982-09-17 | Method for inhibiting beta-d-galactosidase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14639481A JPS5847491A (ja) | 1981-09-18 | 1981-09-18 | β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ作用の停止方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5847491A true JPS5847491A (ja) | 1983-03-19 |
| JPS643477B2 JPS643477B2 (ja) | 1989-01-20 |
Family
ID=15406702
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14639481A Granted JPS5847491A (ja) | 1981-09-18 | 1981-09-18 | β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ作用の停止方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0075293B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5847491A (ja) |
| DE (1) | DE3273032D1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57111903A (en) * | 1981-07-02 | 1982-07-12 | Riyuudenshiya Kk | Wire for lifting gear for illuminator |
| JPS63313585A (ja) * | 1987-06-15 | 1988-12-21 | Amano Pharmaceut Co Ltd | ガラクトシダ−ゼの酵素活性停止法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4778755A (en) * | 1983-08-08 | 1988-10-18 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Immunoassay method |
| WO1985001747A1 (en) * | 1983-10-17 | 1985-04-25 | Inomedix, Incorporated | Device for rapid quantitative analysis of a fluid |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5710453A (en) * | 1981-04-16 | 1982-01-20 | Toyo Jozo Co Ltd | Method for improving immunity determination |
| GB2102946B (en) * | 1981-06-30 | 1984-11-28 | Wellcome Found | Enzyme immunoassay |
-
1981
- 1981-09-18 JP JP14639481A patent/JPS5847491A/ja active Granted
-
1982
- 1982-09-17 EP EP82108604A patent/EP0075293B1/en not_active Expired
- 1982-09-17 DE DE8282108604T patent/DE3273032D1/de not_active Expired
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57111903A (en) * | 1981-07-02 | 1982-07-12 | Riyuudenshiya Kk | Wire for lifting gear for illuminator |
| JPS603723B2 (ja) * | 1981-07-02 | 1985-01-30 | 株式会社龍電社 | 照明具昇降装置用のワイヤ |
| JPS63313585A (ja) * | 1987-06-15 | 1988-12-21 | Amano Pharmaceut Co Ltd | ガラクトシダ−ゼの酵素活性停止法 |
| JP2640941B2 (ja) * | 1987-06-15 | 1997-08-13 | 天野製薬株式会社 | ガラクトシダーゼの酵素活性停止法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0075293B1 (en) | 1986-09-03 |
| EP0075293A3 (en) | 1983-09-14 |
| JPS643477B2 (ja) | 1989-01-20 |
| DE3273032D1 (en) | 1986-10-09 |
| EP0075293A2 (en) | 1983-03-30 |
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