CN116047056A - 一种用于测定游离甲状腺素的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于测定游离甲状腺素的试剂盒,属于试剂盒检测技术领域。其包括磁珠工作液R1、酶工作液R2和分析缓冲液R3;所述磁珠工作液R1含有链霉亲和素磁珠,且所述磁珠上无生物素标记;所述酶工作液R2含有碱性磷酸酶标记的T4抗体;所述分析缓冲液R3含有生物素化T4抗原。本发明提供的用于测定游离甲状腺素的试剂盒,未将抗体包被于固相载体磁珠上,让抗原与抗体的反应在一个稳定均匀的液相体系下进行,使得抗原抗体结合更加充分,再让反应后的抗原抗体复合物连接于磁珠上,同时也避免了抗原抗体的反应受到来自固相载体空间位阻的影响。经此改良后试剂的精密度和灵敏度都比常规的FT4测定试剂高。
Description
技术领域
本发明涉及试剂盒检测技术领域,具体涉及一种用于测定游离甲状腺素的试剂盒。
背景技术
甲状腺素(T4)是由甲状腺滤泡上皮细胞合成分泌的主要甲状腺素,一般作为前体物质或激素原。分泌入血的T4大部分与各类蛋白结合,只有0.03%具有生物活性以游离状态(FT4)存在于血液循环中。FT4测定不受血液循环中结合蛋白浓度和结合力特性的影响。因此,血液中FT4的测定更能如实评价甲状腺合成分泌甲状腺激素的状况,可用于反映机体的甲状腺功能,作为甲状腺功能亢进、减退、甲状腺肿、重症感染发热等疾病的辅助诊断。现有的FT4测定试剂在灵敏度以及精密度上有所欠缺,容易导致检测结果不准确,影响临床使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于测定游离甲状腺素的试剂盒,旨在改善现有技术中FT4测定试剂的灵敏度及精密度,解决临床使用时因精密度差导致临床样本测值异常等情况。
本发明通过下述技术方案实现:
本发明提供一种用于测定游离甲状腺素的试剂盒,包括磁珠工作液R1、酶工作液R2和分析缓冲液R3;
所述磁珠工作液R1含有链霉亲和素磁珠,且所述磁珠上无生物素标记;
所述酶工作液R2含有碱性磷酸酶标记的T4抗体;
所述分析缓冲液R3含有生物素化T4抗原。
进一步地,在所述的用于测定游离甲状腺素的试剂盒中,所述磁珠工作液R1由蛋白缓冲液和链霉亲和素磁珠组成,所述链霉亲和素磁珠的浓度为0.4mg/mL-0.87mg/mL。
进一步地,在所述的用于测定游离甲状腺素的试剂盒中,述链霉亲和素磁珠的浓度为0.67mg/mL。
进一步地,在所述的用于测定游离甲状腺素的试剂盒中,所述酶工作液R2由蛋白缓冲液和碱性磷酸酶标记的T4抗体组成,T4抗体的浓度范围为0.017μg/mL-0.5μg/mL。
进一步地,在所述的用于测定游离甲状腺素的试剂盒中,所述分析缓冲液R3由蛋白缓冲液和生物素化T4抗原组成,生物素化T4抗原的浓度范围为0.01μg/mL-0.4μg/mL。
进一步地,在所述的用于测定游离甲状腺素的试剂盒中,所述蛋白缓冲液包括12.11g/L Tris、9.00g/L NaCl、5.4mL/L浓HCl、10.00g/L BSA、1mL/L PC-950、0.5mL/LTween-20。
进一步地,在所述的用于测定游离甲状腺素的试剂盒中,所述蛋白缓冲液pH调节至7.95-8.05。
进一步地,在所述的用于测定游离甲状腺素的试剂盒中,磁珠工作液R1、酶工作液R2和分析缓冲液R3反应体系加入量体积比为1:1:1。
本发明与现有技术相比,具有如下的优点和有益效果:
本发明提供的用于测定游离甲状腺素的试剂盒,未将抗体包被于固相载体磁珠上,让抗原与抗体的反应在一个稳定均匀的液相体系下进行,使得抗原抗体结合更加充分,再让反应后的抗原抗体复合物连接于磁珠上,同时也避免了抗原抗体的反应受到来自固相载体空间位阻的影响。经此改良后试剂的精密度和灵敏度都比常规的FT4测定试剂高。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白,下面结合实施例,对本发明作进一步的详细说明,本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明,并不作为对本发明的限定。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是,本发明下面实施例和对照例中采用蛋白缓冲液,包括:12.11g/LTris、9.00g/L NaCl、约5.4mL/L浓HCl、10.00g/L BSA、1mL/L PC-950、0.5mL/L Tween-20,缓冲液pH调节至7.95-8.05。
实施例1:
本实施例的一种用于测定游离甲状腺素(FT4)的试剂盒,包括磁珠工作液R1、分析缓冲液R3和酶工作液R2。
所述磁珠工作液R1由链霉亲和素磁珠直接用1%BSA的缓冲液稀释至0.67mg/mL。
所述酶工作液R2制备方法为:
A、取2mg碱性磷酸酶按厂家说明书方法进行活化,得到活化的ALP。
B、称取1.0mg T4抗原于按厂家说明书方法进行活化,得到活化的T4抗原。
C、将活化后的ALP转移到适当的容器中,用CB(pH 9.5)将ALP稀释至2.5mg/ml,取69μL活化的T4抗原,加入到稀释成2.5mg/mL的ALP溶液中,充分混匀,室温混匀反应120min。
D、准确量取反应液的体积,用CB(pH 9.5)缓冲液定容至1mL,用商品化的柱子进行过柱纯化,最终收集液体的体积约3mL,再用3mL含蛋白缓冲液进行稀释,于-20℃保存备用。
E、将ALP标记好的T4抗原用含蛋白缓冲液进行稀释,T4抗原的最终浓度约0.009μg/mL-0.04μg/mL。
所述分析缓冲液R3制备方法为:
A、取0.5mg T4抗体,用0.02M PBS(PH7.4)缓冲液5L进行2~8℃透析过夜。
B、取出透析好的T4抗体于适当容器,准确量取体积并记录,将T4抗体稀释为0.5mg/mL备用。
C、称取1.0mg的BNHS,用217μL DMSO充分溶解,配制成10mmol/L的BNHS溶液。
D、将配制好的BNHS按相应比例加入到透析后的T4抗体中,充分混匀后室温反应30min。
E、取1mol/LTris缓冲液进行终止反应,加入1mol/LTris缓冲液于反应液中。加入Tris的体液为上述反应液终体积的百分之一,充分混匀,室温反应10min。
F、取出终止后的反应液装入透析袋,用0.02M PBS(PH7.4)缓冲液5L进行2~8℃透析过夜。
G、将透析好的生物素抗体取出,并准确量取体积,加入等体积的丙三醇,贴签,并记录浓度,于-20℃保存,备用。
H、将生物素标记好的生物素抗体用1%BSA的缓冲液稀释至0.01μg/mL-0.2μg/mL,于-20℃保存备用。
上述试剂盒磁珠工作液、分析缓冲液与酶工作液反应体系加入量比例为1:1:1
实施例2:
本实施例的一种用于测定游离甲状腺素(FT4)的试剂盒,包括磁珠工作液R1、分析缓冲液R3和酶工作液R2。
所述磁珠工作液由链霉亲和素磁珠直接用1%BSA的缓冲液稀释至0.67mg/mL。
所述酶工作液R2制备方法为:
A、取3mg碱性磷酸酶按厂家说明书方法进行活化,得到活化的ALP。
B、将按照相应方法活化后的2mg T4抗体转移到适当的容器中,加入2.4mg活化的ALP(浓度:5mg/mL),边滴加边混匀,室温混匀反应120min。
C、用含蛋白缓冲液将标记好的T4抗体稀释至0.5mg/mL,于-20℃保存备用。
所述分析缓冲液制备方法为:
A、在商品化的T4-BSA中加入0.02M PBS(PH7.4)至BSA浓度为1mg/mL,用0.02M PBS(PH7.4)缓冲液5L进行2~8℃透析过夜。
B、取出透析好的T4-BSA于适当容器,准确量取体积并记录,将其稀释为0.5mg/mL备用。
C、称取1.0mg的BNHS,用217μL DMSO充分溶解,配制成10mmol/L的BNHS溶液。
D、将配制好的BNHS按相应比例加入到透析后的T4-BSA中,充分混匀后室温反应30min。即1.0mg的BSA加入10mmol/L BNHS 30μL。2mg加入配置好的10mmol/L BNHS 60μL。
E、取1mol/LTris缓冲液进行终止反应,加入1mol/LTris缓冲液于反应液中。加入Tris的体液为上述反应液终体积的百分之一,充分混匀,室温反应10min。
F、取出终止后的反应液装入透析袋,用0.02M PBS(PH7.4)缓冲液5L进行2~8℃透析过夜。
G、将透析好的生物素T4抗原取出,并准确量取体积,加入等体积的丙三醇,贴签,并记录浓度,于-20℃保存,备用。
上述试剂盒磁珠工作液、分析缓冲液与酶工作液反应体系加入量比例为1:1:1。
对照例1:
本对照例1为一种用于测定游离甲状腺素(FT4)的常规试剂盒,包括T4抗体包被的链霉亲和素磁珠、分析缓冲液和酶工作液。
其中,T4抗体包被的磁珠的制备方法为:
A、取0.5mg T4抗体,用0.02M PBS(PH7.4)缓冲液5L进行2~8℃透析过夜。
B、取出透析好的T4抗体于适当容器,准确量取体积并记录,将T4抗体稀释为0.5mg/mL备用。
C、称取1.0mg的BNHS,用217μL DMSO充分溶解,配制成10mmol/L的BNHS溶液。
D、将配制好的BNHS按相应比例加入到透析后的T4抗体中,充分混匀后室温反应30min。
E、取1mol/LTris缓冲液进行终止反应,加入1mol/LTris缓冲液于反应液中。加入Tris的体液为上述反应液终体积的百分之一,充分混匀,室温反应10min。
F、取出终止后的反应液装入透析袋,用0.02M PBS(PH7.4)缓冲液5L进行2~8℃透析过夜。
G、将透析好的生物素抗体取出,并准确量取体积,加入等体积的丙三醇,贴签,并记录浓度,于-20℃保存,备用。
H、将生物素标记好的生物素抗体包被裸磁珠,包被量范围为0.05μg/mg-1μg/mg,获得T4抗体包被好的磁珠。用1%BSA的缓冲液稀释后,备用。
所述酶工作液制备方法为:
A、取2mg碱性磷酸酶按厂家说明书方法进行活化,得到活化的ALP。
B、称取1.0mg T4抗原于按厂家说明书方法进行活化,得到活化的T4抗原。
C、将活化后的ALP转移到适当的容器中,用CB(pH 9.5)将ALP稀释至2.5mg/ml,取69μL活化的T4抗原,加入到稀释成2.5mg/mL的ALP溶液中,充分混匀,室温混匀反应120min。
D、准确量取反应液的体积,用CB(pH 9.5)缓冲液定容至1mL,用商品化的柱子进行过柱纯化,最终收集液体的体积约3mL,再用3mL含蛋白缓冲液进行稀释,于-20℃保存备用。
E、将ALP标记好的T4抗原用含蛋白缓冲液进行稀释,T4抗原的最终浓度约0.009μg/mL-0.04μg/mL。
所述分析缓冲液由1%BSA的缓冲液组成。
上述试剂盒磁珠工作液、分析缓冲液与酶工作液反应体系加入量比例为1:1:1。
实验一:不同工艺处理的原料组成的试剂盒的灵敏度实验
实验材料:碱性磷酸酶标记T4抗原,碱性磷酸酶标记T4抗体,生物素标记T4抗原,生物素标记T4抗体,含有1%BSA的缓冲液,裸磁珠,FT4校准品cal-1,cal-6(Cal-1到Cal-6的浓度为0,1,11,22,50,100pmol/L),底物液,清洗液,全自动化学发光免疫分析仪LA2000。
采用实施例1、实施例2和对照例1的方法,将上述三种不同磁珠工作液,酶工作液以及分析缓冲液分别组成试剂盒,测定FT4校准品cal-1至cal-6,观察不同试剂盒的测定曲线灵敏度。
实施例1反应模式为:先加入校准品25μL,分缓50μL37℃共同孵育15min后,再加入酶工作液50μL和磁珠工作液50μL 37℃孵育15min,加入底物液37℃孵育5min后,于全自动化学发光免疫分析仪上检测。
实施例2反应模式为:先加入校准品25μL,酶工作液50μL37℃共同孵育15min后,再加入分缓50μL和磁珠工作液50μL 37℃孵育15min,加入底物液37℃孵育5min后,于全自动化学发光免疫分析仪上检测。
对照例1反应模式为:先加入校准品25μL,分缓50μL、磁珠工作液50μL 37℃共同孵育15min后,再加入酶工作液50μL37℃孵育15min,加入底物液37℃孵育5min后,于全自动化学发光免疫分析仪上检测。
实验结果如表1所示:
表1
从表1实验结果来看,相比于抗体包被于磁珠组成的常规试剂盒,当抗体与抗原处于液态均相中并充分反应后,再连接于磁珠上,试剂盒整体曲线及灵敏度会更好,无论是游离生物素化抗体与碱性磷酸酶标记抗原组合还是碱性磷酸酶标记抗体与游离生物素化抗原组合,两组试剂盒在曲线上无较大的差异,均与FT4校准品有较好的反应性,曲线均能满足使用要求。
实验二:不同工艺处理的原料组成的试剂盒精密度验证实验。
实验材料:碱性磷酸酶标记T4抗原,碱性磷酸酶标记T4抗体,生物素标记T4抗原,生物素标记T4抗体,含有1%BSA的缓冲液,裸磁珠,FT4校准品cal-1,cal-6(Cal-1到Cal-6的浓度为0,1,11,22,50,100pmol/L),样本S1-S40,底物液,清洗液,全自动化学发光免疫分析仪LA2000。
反应模式参照实验一;实验结果如表2和表3所示:
表2
表3
从表2和表3的曲线精密度来看,三组试剂盒相比之下,当抗体抗原游离于试剂体系中,生物素标记抗体与碱性磷酸酶标记抗原组合和碱性磷酸酶标记抗体与生物素标记抗原组合均能有效的提高曲线精密度;从测试临床样本来看,碱性磷酸酶标记抗体与游离生物素化抗原配制而成的试剂盒的测值与罗氏测值的差异最小,结合曲线灵敏度验证,因此选定碱性磷酸酶标记抗体与游离生物素化抗原组成FT4试剂体系进行下一步试剂稳定性验证。
实验三:不同工艺处理的原料组成的试剂盒稳定性验证实验
实验材料:碱性磷酸酶标记T4抗原,碱性磷酸酶标记T4抗体,生物素标记T4抗原,生物素标记T4抗体,含有1%BSA的缓冲液,裸磁珠,FT4校准品cal-1,cal-6(Cal-1到Cal-6的浓度为0,1,11,22,50,100pmol/L),底物液,清洗液,全自动化学发光免疫分析仪LA2000。
反应模式参照实验一;实验结果如表4:
表4
从表4结果来看,碱性磷酸酶标记抗体与游离生物素化抗原组成FT4试剂体系稳定性满足使用要求。
综上三个实验可以得出:表明FT4采用碱性磷酸酶标记抗体与生物素标记抗原,且生物素抗原游离于试剂体系有利于灵敏度和精密度的提高,试剂盒稳定性也满足要求,因此该体系更能满足临床的需求。
以上所述的具体实施方式,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施方式而已,并不用于限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种用于测定游离甲状腺素的试剂盒,其特征在于,包括磁珠工作液R1、酶工作液R2和分析缓冲液R3;
所述磁珠工作液R1含有链霉亲和素磁珠,且所述磁珠上无生物素标记;
所述酶工作液R2含有碱性磷酸酶标记的T4抗体;
所述分析缓冲液R3含有生物素化T4抗原。
2.根据权利要求1所述的用于测定游离甲状腺素的试剂盒,其特征在于,所述磁珠工作液R1由蛋白缓冲液和链霉亲和素磁珠组成,所述链霉亲和素磁珠的浓度为0.4mg/mL-0.87mg/mL。
3.根据权利要求2所述的用于测定游离甲状腺素的试剂盒,其特征在于,述链霉亲和素磁珠的浓度为0.67mg/mL。
4.根据权利要求1所述的用于测定游离甲状腺素的试剂盒,其特征在于,所述酶工作液R2由蛋白缓冲液和碱性磷酸酶标记的T4抗体组成,T4抗体的浓度范围为0.017μg/mL-0.5μg/mL。
5.根据权利要求1所述的用于测定游离甲状腺素的试剂盒,其特征在于,所述分析缓冲液R3由蛋白缓冲液和生物素化T4抗原组成,生物素化T4抗原的浓度范围为0.01μg/mL-0.4μg/mL。
6.根据权利要求2-5任一项所述的用于测定游离甲状腺素的试剂盒,其特征在于,所述蛋白缓冲液包括12.11g/L Tris、9.00g/L NaCl、5.4mL/L浓HCl、10.00g/L BSA、1mL/L PC-950、0.5mL/L Tween-20。
7.根据权利要求6所述的用于测定游离甲状腺素的试剂盒,其特征在于,所述蛋白缓冲液pH调节至7.95-8.05。
8.根据权利要求1所述的用于测定游离甲状腺素的试剂盒,其特征在于,磁珠工作液R1、酶工作液R2和分析缓冲液R3反应体系加入量体积比为1:1:1。
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