CN111175508A - 补体c1抑制剂的检测试剂盒制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种补体C1抑制剂(C1‑INH)的检测试剂盒制备方法，所述试剂盒包括：包被链霉亲和素的载体、生物素标记的C1‑INH反应物、C1‑INH标准品、鼠抗人C1‑INH抗体偶联的辣根过氧化酶试剂、化学发光底物液A和B以及洗涤液。本发明提供的试剂盒及其应用，相比比色法灵敏度和特异性更高，临床上，操作更简单，且操作时间更短，能用于全自动或半自动发光免疫分析仪。

Description

补体C1抑制剂的检测试剂盒制备方法
技术领域
本发明涉及检测试剂盒领域，具体地说，涉及一种补体C1抑制剂的检测试剂盒制备方法。
背景技术
补体C1抑制剂(C1 inhibitor，C1-INH)基因突变导致的C1-INH量的减少和(或)功能缺乏会导致遗传性血管水肿(Hereditary angioedema，HAE)的发生。遗传性血管水肿是一种以反复发作的皮下和(或)黏膜下水肿为主要表现的罕见遗传性疾病。水肿为自发性或由某些因素诱发，具有局限性、非凹陷性、自限性的特点。常见受累部位包括颜面部、四肢、消化道及上呼吸道黏膜。遗传性血管水肿是一种常染色体先行遗传病，发病率1/10000～1/50000。
由于HAE发病率低，临床上易发生误诊、误治，从而导致较高的死亡率。该疾病的诊断除需要了解家族史和根据典型的临床表现外，主要依赖于实验室对C1-INH功能活性检测。近年来，国外较多推荐采用比色法对C1-INH的功能进行检测。但比色法的灵敏度和特异性较低，且操作较复杂，用时较长。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种补体C1抑制剂的检测试剂盒制备方法。为了实现本发明目的，本发明首先提供一种补体C1抑制剂的检测试剂盒，所述试剂盒包括：包被链霉亲和素的载体、生物素标记的C1-INH反应物、C1-INH标准品、抗人C1-INH抗体偶联的辣根过氧化酶试剂、化学发光底物液A和B以及洗涤液
进一步地，所述载体为化学发光板。
进一步地，所述抗人C1-INH抗体选自鼠抗人C1-INH单克隆抗体、兔抗人C1-INH多克隆抗体、羊抗人C1-INH的多克隆抗体、鸡抗人C1-INH多克隆抗体中的一种或多种。作为优选，所述抗人C1-INH抗体选自鼠抗人C1-INH单克隆抗体。
本发明还提供了所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)包被链霉亲和素的载体的制备：
包被链霉亲和素的96孔化学发光板：将包被用包被链霉亲和素加至碳酸盐缓冲液中混匀，加入微孔板内，每孔100μL，包被浓度5～15μg/mL，4℃过夜孵育，用磷酸盐缓冲液洗涤微孔板5遍后，再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液，37℃孵育2小时后，弃去孔内液体，37℃干燥2小时，于铝箔袋真空包装，放2-8℃保存；
(2)生物素标记的C1-INH反应物的制备：用0.1mol/L，pH8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L，pH8.6的硼酸盐缓冲液，对C1-INH反应物充分透析；然后将C1-INH反应物用0.1mol/L，pH8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L，pH8.6的硼酸盐缓冲液稀释到1mg/mL备用；用0.2mLDMSO溶解1mg的NHSB；向1mL C1-INH反应物溶液加入150μl NHSB溶液；在室温下持续搅拌2-4小时；加入9.6μL 1mol/L NH4Cl，在室温下搅拌10分钟；在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素；将样品过1mL的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1mL/管；最后，样品加入叠氮钠及1.0g/LBSA.将结合产物置4℃，避光保存；
(3)鼠抗人C1-INH抗体偶联的辣根过氧化酶试剂的制备：
a称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中，加入1ml新配的0.06M NaIO4溶液，4℃避光孵育30分钟。
b孵育结束后加入0.6mL的200mM乙二醇，室温孵育30分钟。
c孵育结束后加入5mg鼠抗人C1-INH抗体，混合均匀后装入透析袋中，于2L的pH9.6碳酸盐缓冲液中透析，4℃搅拌过夜。
d取出透析液，加入0.5ml的5mg/mlNaBH4水溶液，混合均匀后，放4℃孵育2小时，加等量甘油保存。
本发明还进一步提供了前述试剂盒的应用：
1)在微孔中每孔加入50μL的生物素标记的C1-INH反应物，室温或37℃孵育10min～30min；
2)孵育结束后，洗板3次
3)将浓度分别为0U/mL、0.05U/mL、0.1U/mL、0.5U/mL、2U/mL、6U/mL、12U/mL的C1-INH校准品各100μL依次加入到微孔板中，然后将100μL样品加入微孔中，室温或37℃孵育30min～60min；
4)孵育结束后，洗板5次；
5)加入100μL鼠抗人C1-INH抗体偶联的辣根过氧化酶试剂，室温或37℃孵育15min～30min
6)孵育结束后，洗板5次；
7)加入化学发光底物A液和底物B液各50μL，5min后读数；
8)建立校准品曲线，将样本检测孔化学发光值代入校准品曲线，计算出样本中的补体C1抑制剂浓度
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种化学发光免疫分析法用于C1-INH的检测，达到对补体C1抑制剂疾病的诊断。相比比色法，化学发光免疫分析法，灵敏度和特异性更高，临床上，操作更简单，操作时间更短，能用于全自动或半自动发光免疫分析仪。
附图说明
图1为试剂盒校准曲线
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 试剂盒的制备
(一)化学发光板的制备：
将包被用链霉亲和素加至碳酸盐缓冲液中混匀，加入微孔板内，每孔100μL，包被浓度5～15μg/mL，4℃过夜孵育，用磷酸盐缓冲液洗涤微孔板5遍后，再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液，37℃孵育2小时后，弃去孔内液体，37℃干燥2小时，于铝箔袋真空包装，放2-8℃保存；
(二)生物素标记C1-INH反应物的制备
用0.1mol/L，pH8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L，pH8.6的硼酸盐缓冲液，对C1-INH反应物充分透析；然后将C1-INH反应物用0.1mol/L，pH8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L，pH8.6的硼酸盐缓冲液稀释到1mg/mL备用；用0.2mL DMSO溶解1mg的NHSB；向1mL C1-INH反应物溶液加入150μl NHSB溶液；在室温下持续搅拌2-4小时；加入9.6μL 1mol/LNH4C1，在室温下搅拌10分钟；在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素；将样品过1mL的分子筛柱，以PBS缓慢洗脱，收集1mL/管最后，样品加入叠氮钠及1.0g/LBSA.将结合产物置4℃，避光保存；
(三)鼠抗人C1-INH抗体偶联的辣根过氧化酶试剂的制备
称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中，加入1ml新配的0.06M NaIO4溶液，4℃避光孵育30分钟；孵育结束后加入0.6mL的200mM乙二醇，室温孵育30分钟；孵育结束后加入5mg鼠抗人C1-INH抗体，混合均匀后装入透析袋中，于2L的pH9.6碳酸盐缓冲液中透析，4℃搅拌过夜；取出透析液，加入0.5ml的5mg/ml NaBH4水溶液，混合均匀后，放4℃孵育2小时，加等量甘油保存。
实施例2 分析性能评价
(一)最低检测限
用含5％新生牛血清的PBS溶液作为阴性样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值(相对发光值)，带入到标准曲线中，计算其浓度平均值(M)和标准差(SD)，得出M+3SD为试剂盒最低检测限。
表1：阴性样本浓度值
Figure BSA0000173658460000021
Figure BSA0000173658460000031
表1可计算出0浓度样本浓度均值X＝0.01325U/mL，SD＝0.002149
试剂盒最低检测限X+3SD＝0.019697U/mL
(二)线性
按试剂盒说明书进行操作，建立标准曲线，使用双对数法(将每一校准品浓度化学发光值和校准品浓度值取对数)进行直线拟合，计算线性相关系数R2。
图1可知，线性相关系数为0.9991
(三)精密度评价
(1)批内精密度
将实施例1制备的同一批试剂盒，分别测定低、中、高三种不同浓度的血清，平行检测10次，得出的分析内变异系数为3.85％～6.69％。结果参见表2。
表2：批内精密度
浓度U/mL 测定次数 批内偏差(％)
0.1 10 6.69
0.6 10 6.12
1.2 10 3.85
(2)批间精密度
将实施例1制备的试剂盒取三批，每批试剂盒均测定低、中、高三种不同浓度的血清，平行检测10次，每份血清得到30个浓度值，统计分析变异系数为5.13％～8.66％。结果参见表3
表3：批间精密度
浓度U/mL 测定次数 批间偏差(％)
0.1 30 8.66
0.6 30 6.36
1.2 30 5.13
(四)稳定性评价
对实施例1的试剂盒分别在4℃和37℃放置，置于4℃试剂盒分别于1月、3月、6月、9月、12月和15月取样检测，置于37℃的试剂盒，分别于3天、6天和9天取样检测，结果表明试剂盒的最低检测限、线性、批内精密度、批间精密度等均在正常范围之内，试剂盒有效期可达15个月。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种补体C1抑制剂的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被链霉亲和素的载体、生物素标记的C1-INH反应物、C1-INH标准品、抗人C1-INH抗体偶联的辣根过氧化酶试剂、化学发光底物液A和B以及洗涤液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为化学发光板。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人C1-INH抗体选自鼠抗人C1-INH单克隆抗体、兔抗人C1-INH多克隆抗体、羊抗人C1-INH的多克隆抗体、鸡抗人C1-INH多克隆抗体中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人C1-INH抗体选自鼠抗人C1-INH单克隆抗体。
5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)包被链霉亲和素的载体的制备：包被链霉亲和素的96孔化学发光板：将包被用链霉亲和素加至碳酸盐缓冲液中混匀，加入微孔板内，每孔100μL，包被浓度为5～15μg/mL，4℃过夜孵育，用磷酸盐缓冲液洗涤微孔板5遍后，再加入含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，37℃孵育2小时后，弃去孔内液体，37℃干燥2小时，于铝箔袋真空包装，放2-8℃保存。
(2)生物素标记的C1-INH反应物的制备：用0.1mol/L，pH8.0的碳酸氢钠缓冲液或0.5mol/L，pH8.6的硼酸盐缓冲液，对C1-INH反应物充分透析；然后将C1-INH反应物用0.5mol/L，pH8.6的硼酸盐缓冲液稀释到1mg/mL备用；用0.2mL DMSO溶解1mg的NHSB；向1mLC1-INH反应物溶液加入150μl NHSB溶液；在室温下持续搅拌2-4小时；加入9.6μL 1mol/LNH4Cl，在室温下搅拌10分钟；在4℃，用PBS充分透析，以除去游离的生物素；最后，样品中加入叠氮钠及1.0g/LBSA，将结合产物置4℃，避光保存。
(3)鼠抗人C1-INH抗体偶联的辣根过氧化酶试剂的制备：称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中，加入1ml新配的0.06M NaIO4溶液，4℃避光孵育30分钟；孵育结束后加入0.6mL的200mM乙二醇，室温孵育30分钟；孵育结束后加入5mg鼠抗人C1-INH抗体，混合均匀后装入透析袋中，于2L的pH9.6碳酸盐缓冲液中透析，4℃搅拌过夜；取出透析液，加入0.5ml的5mg/mlNaBH4水溶液，混合均匀后，放4℃孵育2小时，加等量甘油保存。
6.权利要求1-4任一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，所述应用的具体方法为：
1)在微孔中每孔加入50μL的生物素标记的C1-INH反应物，室温或37℃孵育10min～30min；
2)孵育结束后，洗板3次
3)将浓度分别为0U/mL、0.05U/mL、0.1U/mL、0.2U/mL、0.4U/mL、0.8U/mL、1.6U/mL的C1-INH校准品各100μL依次加入到微孔板中，然后将100μL样品加入微孔中，室温或37℃孵育30min～60min；
4)孵育结束后，洗板5次；
5)加入100μL鼠抗人C1-INH抗体偶联的辣根过氧化酶试剂，室温或37℃孵育15min～30min
6)孵育结束后，洗板5次；
7)加入化学发光底物A液和底物B液各50μL，5min后读数；
8)建立校准品曲线，将样本检测孔化学发光值的对数值代入校准品曲线，计算出样本中的补体C1抑制剂浓度。
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