CN109444408A - 一种检测动物血液皮质醇的试剂盒 - Google Patents

一种检测动物血液皮质醇的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN109444408A
CN109444408A CN201811254343.5A CN201811254343A CN109444408A CN 109444408 A CN109444408 A CN 109444408A CN 201811254343 A CN201811254343 A CN 201811254343A CN 109444408 A CN109444408 A CN 109444408A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cortisol
buffer
concentration
tris
capillary
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811254343.5A
Other languages
English (en)
Inventor
高翠华
冉鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengdu Pulitai Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Chengdu Pulitai Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengdu Pulitai Biological Technology Co Ltd filed Critical Chengdu Pulitai Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201811254343.5A priority Critical patent/CN109444408A/zh
Publication of CN109444408A publication Critical patent/CN109444408A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/552—Glass or silica
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测动物血液皮质醇的试剂盒，其包括皮质醇单克隆抗体包被的毛细管、碱性磷酸酶标记的皮质醇抗原类似物、催化碱性磷酸酶发光的化学发光底物、ANS盐释放剂、皮质醇校准品和清洗液。本发明在测定犬、猫等动物血液皮质醇含量时，具有操作简单、灵敏度高、特异性强、线性范围宽、稳定性好和试剂用量小的优点。

Description

一种检测动物血液皮质醇的试剂盒
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，尤其涉及一种检测动物血液中皮质醇的试剂盒。
背景技术
皮质醇（cortisol），亦称氢化可的松，是从肾上腺皮质分泌的对糖类代谢具有最强作用的肾上腺皮质激素。皮质醇的分泌主要受垂体分泌的促肾上腺皮质激素的调节，其分泌有明显的昼夜节律，上午8时左右分泌达高峰，以后逐渐下降，午夜零点达到最低值。皮质醇在操纵情绪和健康、免疫细胞和炎症、血管和血压间联系，以及维护缔结组织等方面具有特别重要的功效。
皮质醇在血液中以结合态和游离态两种形式存在。游离状态的皮质醇仅占10%左右，具有生物活性；结合态者主要与糖皮质类固醇结合蛋白（CBG）相结合，少量与白蛋白结合，无生物活性。因此要准确测试血液中皮质醇含量，如何释放出游离态的皮质醇显得格外重要。
目前市售的测定犬、猫等动物血液皮质醇含量均为elisa试剂盒，其方法学为酶联免疫法，使皮质醇抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，使抗原某种酶连接成酶标抗原，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。
采用酶联免疫法来测定犬、猫等动物血液皮质醇含量存在如下不足之处：该方法灵敏度不足，适合定性和半定量测定，且操作步骤繁琐，诸多试剂需要客户自行配置，对实验操作人员的实验技能要求高，试剂用量大，由于手工操作步骤较多，易出现错误。
申请公布号为CN106501535A，公布日为2017年3月15日的中国发明专利申请公布了一种ANS盐复合释放剂与检测血液中皮质醇的试剂盒，试剂盒包括以下组分：包被皮质醇抗体的磁珠、吖啶酯标记的皮质醇BSA复合物、ANS盐复合释放剂和皮质醇校准品。该发明ANS盐复合释放剂将人体血液样本中结合形式的皮质醇转变为游离形式的皮质醇，并通过吖啶酯化学发光检测游离皮质醇的含量。ANS盐复合释放剂可与不同糖皮质类固醇蛋白相结合，能够将血液中结合态的皮质醇充分释放出来。吖啶酯化学发光为闪光型发光，发光用时少，能够完全捕捉反应所产生的光子；吖啶酯为人工合成物质，对样本干扰物质的抗干扰性较高，利用吖啶酯标记检测游离皮质醇的含量非常灵敏，使血液样本中总皮质醇的含量测定更为准确。
该申请提供的试剂盒存在如下不足之处：
1、只能用于人体血液中皮质醇含量的测定，而并不适用于动物血液中皮质醇含量的测定；
2、用该试剂盒测定血液中皮质醇含量时，还是存在操作步骤繁琐，诸多试剂需要客户自行配置，对实验操作人员的实验技能要求高，试剂用量大，易出现错误的问题。
发明内容
鉴于采用elisa试剂盒来测定犬、猫等动物血液皮质醇含量存在的上述缺陷，本发明提供了一种检测动物血液皮质醇的试剂盒，通过该试剂盒测定犬、猫等动物血液皮质醇含量时，具有操作简单、灵敏度高、特异性强、线性范围宽、稳定性好和试剂用量小的优点。
为了达到上述技术目的，本发明所采用的技术方案是：
一种检测动物血液皮质醇的试剂盒，其特征在于：包括皮质醇单克隆抗体包被的毛细管、碱性磷酸酶标记的皮质醇抗原类似物、催化碱性磷酸酶发光的化学发光底物、ANS盐释放剂、皮质醇校准品和清洗液。
所述毛细管为高精度毛细管，其外径为1.18±0.02mm，内径为0.7±0.005m、长度为30±1mm；材质为高硼硅3.3玻璃。
所述皮质醇单克隆抗体包被的毛细管是通过如下方法制成的：
步骤1，在毛细管内表面均匀包裹氨基
步骤2，包被毛细管
首先用MES缓冲液溶解EDC，制成溶液Ⅰ；然后用溶液Ⅰ稀释皮质醇单克隆抗体，制成包被液；最后用包被液包被经过步骤1处理后的毛细管，包被完成后倒去包被液；
MES缓冲液包括如下成分：
MES 0.05～1.5M
NaCl 0.05～1.5M
MgCl2 1～5mM
ZnCl2 0.01～0.1mM
BSA 0.2～1.5%（质量百分比）
吐温20 0.2～0.6%（体积百分比）；
步骤3，第一次清洗
用Tris-HCl缓冲液清洗毛细管，清洗完成后吹干毛细管内外表面液体；
步骤4，封闭
用封闭液封闭处理经过步骤3的毛细管，封闭处理完成后，倒去封闭液；
步骤5，第二次清洗
用清洗液剂清洗经过步骤4处理后的毛细管，清洗完成后，吹干毛细管内外表面。
步骤2中，包被的温度为35～40℃，包被时间为0.5～1小时，包被的方式为将毛细管浸没在包被液中。
步骤2中，所述MES缓冲液的pH=6.4~6.6，浓度为0.05～0.2M；所述溶液Ⅰ中EDC浓度为0.02~0.8 mg/mL；所述包被液中，皮质醇单克隆抗体的浓度为2~20 ug/mL。
步骤3中，所述Tris-HCl缓冲液的pH=7.4，浓度为25~100mM。
步骤4中，用封闭液封闭处理时间为1~5h，封闭处理温度为15～40℃。
步骤4中，所述封闭液包括如下成分：
BSA 1~5%（质量百分比）
蔗糖 2~10%（质量百分比）
Tris 20~200M
甘氨酸 0.05~0.5M
吐温20 0.01~0.1%（体积百分比）。
步骤5中，所述清洗剂中包含Tris、NaCl、CHAPS和Trition 100，其中Tris的浓度为25~200 mmol/L，NaCl的质量百分比为0.5~1.5%，CHAPS的质量百分比为0.05~0.2%，Trition100的体积百分比为0.05~0.2%。
所述碱性磷酸酶标记的皮质醇抗原类似物通过如下方法制成，该方法包括皮质醇抗原类似物制备步骤、碱性磷酸酶制备步骤、标记步骤和稀释步骤；
所述皮质醇抗原类似物制备步骤具体为：
将皮质醇抗原类似物与含2-IT的TSE缓冲液混合进行反应，反应温度为15~25℃，反应时间为20~50min，反应完成后加入终止剂终止反应，所述皮质醇抗原类似物与含2-IT的TSE缓冲液的体积比为：1:70~150，所述含2-IT的TSE缓冲液中，2-IT的浓度为10-15mg/mL。
所述TSE缓冲液包括如下成分：
三乙醇胺 0.05~0.2M
氯化钠 0.05~0.2M
EDTA.2Na.2H2O 0.5~1.5mM
氯化镁 0.5~1.5mM
氯化锌 0.05~0.13mM。
所述碱性磷酸酶制备步骤具体为：
首先将0.4~0.6mg的碱性磷酸酶溶解在0.15~0.3 mL碱性磷酸酶溶解液中，然后在溶解液中加入SMCC缓冲液10~30uL，在温度为20~25℃条件下反应20~40min后，加入终止剂终止反应制成碱性磷酸酶。
所述SMCC缓冲液的浓度为3~8mg/mL。
所述标记步骤具体为：
按照摩尔比例为1:0.7~1:1.5分别加入皮质醇抗原类似物和碱性磷酸酶，在温度为2~8℃的条件下，摇床混匀，反应18~28h后加入终止剂终止反应得到复合物，然后对复合物进行纯化处理。
所述稀释步骤具体为：按照质量百分比计，将经过标记步骤的复合物稀释到0.2~2ug/mL。
所述催化碱性磷酸酶发光的化学发光底物为APS-5。
所述ANS盐释放剂包括ANS盐、Tris、NaCl和KV300，其中，ANS盐浓度为0.5~30mg/mL，Tris浓度为25~100mM，NaCl浓度为 50~200mM，KV300体积百分比为0.1~0.5%。
所述ANS盐释放剂的pH=7.05～7.15。
所述皮质醇校准品配置：将皮质醇抗原纯品溶解于已灭活去皮质醇激素血清，至最终抗原浓度为1、4、8、16、40g/dL，加入0.1%KV300作为生物防腐剂。
所述清洗液包括Tris、NaCl、CHAPS和Trition 100，所述Tris摩尔浓度为50~200mM，NaCl的质量百分比为0.5~2%，CHAPS的质量百分比为0.05~0.2%，Trition 100的体积百分比为0.05~0.2%。
所述检测动物血液皮质醇的试剂盒还包括毛细管化学发光检检测装置，该毛细管化学发光检测装置采用授权公告号为CN107091923B，授权公告日为2018年1月30日的中国发明专利公开的毛细管化学发光检测装置。将碱性磷酸酶标记的皮质醇抗原类似物、催化碱性磷酸酶发光的化学发光底物、ANS盐释放剂、皮质醇校准品和清洗液装在其液体试剂杯里，而将皮质醇单克隆抗体包被的毛细管替换下该专利中的毛细管本体即可。然后按照专利中公开的检测方法检测即可。
本发明相对于现有技术具有如下优点：
1、本发明克服酶联免疫法的缺点与不足，以毛细管为反应载体，使用化学发光法检测皮质醇含量，具有操作简便、灵敏度高、特异性强、线性范围宽、稳定性好和试剂用量小等特点。
2、本发明是用于动物皮质醇检测的试剂盒，该试剂盒里面包括了皮质醇单克隆抗体包被的毛细管、碱性磷酸酶标记的皮质醇抗原类似物、催化碱性磷酸酶发光的化学发光底物、ANS盐释放剂、皮质醇校准品和清洗液。由于采用了毛细管为反应载体，相对于与其他方法，加样量大大减少，大大节约了样本使用量和成本。
3、本发明提供的试剂盒，可以用于动物血液中皮质醇含量的测定，用该试剂盒测定血液中皮质醇含量时，操作简单方便，各种试剂已经提前配置好，对实验操作人员的实验技能要求低，试剂使用量小，不易出现错误。
4、本发明对试剂盒中的皮质醇单克隆抗体包被的毛细管、碱性磷酸酶标记的皮质醇抗原类似物、催化碱性磷酸酶发光的化学发光底物、ANS盐释放剂、皮质醇校准品和清洗液的配方，制作方法都进行了多种参数的限定和要求，通过这些参数的限定和要求，使得制备出来的试剂盒能够以毛细管为载体，用化学发光法检测皮质醇含量，检测结果精确，而且具有操作简便、灵敏度高、特异性强、线性范围宽、稳定性好和试剂用量小等特点。
附图说明
图1为检测本发明提供的试剂盒的线性相关系数图。
具体实施方式
本发明提出了一种检测动物血液皮质醇的试剂盒，该包括皮质醇单克隆抗体包被的毛细管、碱性磷酸酶标记的皮质醇抗原类似物、催化碱性磷酸酶发光的化学发光底物、ANS盐释放剂、皮质醇校准品和清洗液。
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，并不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所用实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
一、皮质醇单克隆抗体包被的毛细管的制备
皮质醇单克隆抗体包被的毛细管具体为：
毛细管选用高精度毛细管，其外径为1.18±0.02mm，内径为0.7±0.005m、长度为30±1mm；材质为高硼硅3.3玻璃。
皮质醇单克隆抗体包被的毛细管是通过如下方法制成的：
步骤1，在毛细管内表面均匀包裹氨基
步骤2，包被毛细管
首先用MES缓冲液溶解EDC，制成溶液Ⅰ；然后用溶液Ⅰ稀释皮质醇单克隆抗体，制成包被液；最后用包被液浸泡经过步骤1处理后的毛细管，浸泡温度为37℃，浸泡时间为40min，浸泡完成后倒去包被液；
所述MES缓冲液的pH=6.4，浓度为0.1M；所述溶液Ⅰ中EDC浓度为0.1 mg/mL；所述包被液中，皮质醇单克隆抗体的浓度为5 ug/mL；
MES缓冲液包括如下成分：MES 0.05M、NaCl 0.05M、MgCl2 5mM、ZnCl2 0.1mM
、BSA 1.5%、吐温20 0.6%；
步骤3，第一次清洗
用Tris-HCl缓冲液清洗毛细管3次，清洗完成后吹干毛细管内外表面液体，所述Tris-HCl缓冲液的pH=7.4，浓度为50mM；
步骤4，封闭
用封闭液封闭处理经过步骤3的毛细管，封闭处理时间为2h，封闭处理温度为37℃，封闭处理完成后，倒去封闭液；所述封闭液包括如下成分：BSA 1%、蔗糖 2%、Tris 200M、甘氨酸 0.5M、吐温20 0.1%；
步骤5，第二次清洗
用清洗剂清洗经过步骤4处理后的毛细管3次，清洗完成后，吹干毛细管内外表面，所述清洗剂中包含Tris、NaCl、CHAPS和Trition 100，其中Tris的浓度为 50mM，NaCl的质量百分比为1%，CHAPS的质量百分比为0.1%，Trition 100的体积百分比为0.05%。
二、碱性磷酸酶标记的皮质醇抗原类似物的制备
碱性磷酸酶标记的皮质醇抗原类似物通过如下方法制成：该方法包括皮质醇抗原类似物制备步骤、碱性磷酸酶溶解液制备步骤、标记步骤和稀释步骤；
所述皮质醇抗原类似物制备步骤具体为：
将皮质醇抗原类似物与含2-IT的TSE缓冲液混合进行反应，反应温度为15℃，反应时间为30min，反应完成后加入终止剂终止反应，加入的皮质醇抗原类似物2 uL与含2-IT的TSE缓冲液为200uL，所述含2-IT的TSE缓冲液中，2-IT的浓度为10mg/mL。所述TSE缓冲液包括如下成分：三乙醇胺 0.05M、氯化钠 0.05M、EDTA.2Na.2H2O 1.5mM、氯化镁 1.5mM、氯化锌0.13mM。
所述碱性磷酸酶制备步骤具体为：
首先将0.4mg的碱性磷酸酶溶解在0.15 mL碱性磷酸酶溶解液中，然后在溶解液中加入SMCC缓冲液10uL，在温度为20℃条件下反应20min后，加入终止剂终止反应制成碱性磷酸酶。
所述SMCC缓冲液的浓度为3mg/mL。
所述标记步骤具体为：
按照摩尔比例为1:0.7分别加入皮质醇抗原类似物和碱性磷酸酶，在温度为2℃的条件下，摇床混匀，反应18h后加入终止剂终止反应得到复合物，然后对复合物进行纯化处理。
所述稀释步骤具体为：按照质量百分比计，将经过标记步骤的复合物稀释到0.2ug/mL。
三、催化碱性磷酸酶发光的化学发光底物
催化碱性磷酸酶发光的化学发光底物为APS-5。
四、ANS盐释放剂
所述ANS盐释放剂包括ANS盐、Tris、NaCl和KV300，其中，ANS盐浓度为0.5mg/mL，Tris浓度为25mM，NaCl浓度为200mM，KV300体积百分比为0.5%。
所述ANS盐释放剂的pH=7.05。
五、皮质醇校准品
所述皮质醇校准品配置：将皮质醇抗原纯品溶解于已灭活去皮质醇激素血清，至最终抗原浓度为1、4、8、16、40g/dL，加入0.1%KV300作为生物防腐剂。
六、清洗液
所述清洗液包括Tris、NaCl、CHAPS和Trition 100，所述Tris摩尔浓度为50mM，NaCl的质量百分比为0.5%，CHAPS的质量百分比为0.2%，Trition 100的体积百分比为0.2%。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，不同的是：MES缓冲液包括如下成分：MES： 1.5M、NaCl：1.5M、MgCl2：1mM、ZnCl2：0.01mM、BSA：0.2%、吐温20：0.2%；
包被的温度为40℃，包被时间为1小时，包被的方式为将毛细管浸没在包被液中。
MES缓冲液的pH=6.6，浓度为0.2M；溶液Ⅰ中EDC浓度为0.8 mg/mL；所述包被液中，皮质醇单克隆抗体的浓度为20 ug/mL。
Tris-HCl缓冲液的pH=7.4，浓度为100mM。
封闭液封闭处理时间为5h，封闭处理温度为40℃。
封闭液包括如下成分：BSA： 5%、蔗糖：10%、Tris ：20M、甘氨酸 ：0.05M、吐温20：0.01%。
所述清洗剂中包含Tris、NaCl、CHAPS和Trition 100，其中Tris的浓度为 200mmol/L，NaCl的质量百分比为1.5%，CHAPS的质量百分比为0.05%，Trition 100的体积百分比为0.05%。
将皮质醇抗原类似物与含2-IT的TSE缓冲液混合进行反应时，反应温度为25℃，反应时间为20min，反应完成后加入终止剂终止反应，所述皮质醇抗原类似物与含2-IT的TSE缓冲液的体积比为：1: 150，所述含2-IT的TSE缓冲液中，2-IT的浓度为15mg/mL。
所述TSE缓冲液包括如下成分：三乙醇胺：0.2M、氯化钠：0.2M、EDTA.2Na.2H2O ：0.5M、氯化镁： 0.5mM、氯化锌： 0.05mM。
碱性磷酸酶制备时，首先将0.5mg的碱性磷酸酶溶解在0.2 mL碱性磷酸酶溶解液中，然后在溶解液中加入SMCC缓冲液20uL，在温度为22℃条件下反应30min后，加入终止剂终止反应制成碱性磷酸酶，所述SMCC缓冲液的浓度为5mg/mL。
标记时，按照摩尔比例为1: 1分别加入皮质醇抗原类似物和碱性磷酸酶，在温度为5℃的条件下，摇床混匀，反应24h后加入终止剂终止反应得到复合物，然后对复合物进行纯化处理。
稀释时：按照质量百分比计，将经过标记步骤的复合物稀释到0.5ug/mL。
所述ANS盐释放剂包括ANS盐、Tris、NaCl和KV300，其中，ANS盐浓度为10mg/mL，Tris浓度为50mM，NaCl浓度为 80mM，KV300体积百分比为0.2%。所述ANS盐释放剂的pH=7.1。
所述清洗液包括Tris、NaCl、CHAPS和Trition 100，所述Tris摩尔浓度为100mM，NaCl的质量百分比为1%，CHAPS的质量百分比为0.1%，Trition 100的体积百分比为0.1%。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，不同的是：MES缓冲液包括如下成分：MES： 1M、NaCl：1M、MgCl2:2mM、ZnCl2:0.05mM、BSA：:0.8%、吐温20：0.4%；
包被的温度为38℃，包被时间为1小时，包被的方式为将毛细管浸没在包被液中。
MES缓冲液的pH=6.5，浓度为0.1M；溶液Ⅰ中EDC浓度为0.3 mg/mL；所述包被液中，皮质醇单克隆抗体的浓度为6 ug/mL。
Tris-HCl缓冲液的pH=7.4，浓度为40mM。
封闭液封闭处理时间为3h，封闭处理温度为22℃。
封闭液包括如下成分：BSA:3%、蔗糖 :5%、Tris :120M、甘氨酸 :0.4M、吐温20 :0.06%。
所述清洗剂中包含Tris、NaCl、CHAPS和Trition 100，其中Tris的浓度为 120mmol/L，NaCl的质量百分比为1.2%，CHAPS的质量百分比为0.12%，Trition 100的体积百分比为0.15%。
将皮质醇抗原类似物与含2-IT的TSE缓冲液混合进行反应时，反应温度为20℃，反应时间为30min，反应完成后加入终止剂终止反应，所述皮质醇抗原类似物与含2-IT的TSE缓冲液的体积比为：1:130，所述含2-IT的TSE缓冲液中，2-IT的浓度为13mg/mL。
所述TSE缓冲液包括如下成分：三乙醇胺： 0.15M、氯化钠 ：0.15M、EDTA.2Na.2H2O ：1.2mM、氯化镁 ：:0.8 mM、氯化锌：0.13mM。
碱性磷酸酶制备时，首先将:0.6mg的碱性磷酸酶溶解在0.3 mL碱性磷酸酶溶解液中，然后在溶解液中加入SMCC缓冲液30uL，在温度为22℃条件下反应35min后，加入终止剂终止反应制成碱性磷酸酶，所述SMCC缓冲液的浓度为7mg/mL。
标记时，按照摩尔比例为1: 1.5分别加入皮质醇抗原类似物和碱性磷酸酶，在温度为8℃的条件下，摇床混匀，反应20h后加入终止剂终止反应得到复合物，然后对复合物进行纯化处理。
稀释时：按照质量百分比计，将经过标记步骤的复合物稀释到2ug/mL。
所述ANS盐释放剂包括ANS盐、Tris、NaCl和KV300，其中，ANS盐浓度为20mg/mL，Tris浓度为75mM，NaCl浓度为150mM，KV300体积百分比为0.35%。所述ANS盐释放剂的pH=7.12。
所述清洗液包括Tris、NaCl、CHAPS和Trition 100，所述Tris摩尔浓度为60mM，NaCl的质量百分比为1.5%，CHAPS的质量百分比为0.08%，Trition 100的体积百分比为0.18%。
实施例4
本实施例与实施例1基本相同，不同的是：MES缓冲液包括如下成分：MES： 1.5M、NaCl：1M、MgCl2 ：3mM、ZnCl2 :0.08mM、BSA:0.8%、吐温20:0.3%；
包被的温度为35℃，包被时间为1小时，包被的方式为将毛细管浸没在包被液中。
MES缓冲液的pH=6.6，浓度为0.05M；溶液Ⅰ中EDC浓度为0.5 mg/mL；所述包被液中，皮质醇单克隆抗体的浓度为18 ug/mL。
Tris-HCl缓冲液的pH=7.4，浓度为100mM。
封闭液封闭处理时间为5h，封闭处理温度为25℃。
封闭液包括如下成分：BSA:3%、蔗糖 ：10%、Tris：160M、甘氨酸 ：0.05M、吐温20 ：0.06%。
所述清洗剂中包含Tris、NaCl、CHAPS和Trition 100，其中Tris的浓度为 125mmol/L，NaCl的质量百分比为0.8%，CHAPS的质量百分比为0.2%，Trition 100的体积百分比为0.2%。
将皮质醇抗原类似物与含2-IT的TSE缓冲液混合进行反应时，反应温度为25℃，反应时间为20min，反应完成后加入终止剂终止反应，所述皮质醇抗原类似物与含2-IT的TSE缓冲液的体积比为：1:120，所述含2-IT的TSE缓冲液中，2-IT的浓度为15mg/mL。
所述TSE缓冲液包括如下成分：三乙醇胺：0.08M、氯化钠：0.2M、EDTA.2Na.2H2O ：1.5mM、氯化镁：1.2mM、氯化锌:0.07mM。
碱性磷酸酶制备时，首先将0.6mg的碱性磷酸酶溶解在0.25 mL碱性磷酸酶溶解液中，然后在溶解液中加入SMCC缓冲液25uL，在温度为25℃条件下反应40min后，加入终止剂终止反应制成碱性磷酸酶，所述SMCC缓冲液的浓度为8mg/mL。
标记时，按照摩尔比例为1:1.2分别加入皮质醇抗原类似物和碱性磷酸酶，在温度为8℃的条件下，摇床混匀，反应18h后加入终止剂终止反应得到复合物，然后对复合物进行纯化处理。
稀释时：按照质量百分比计，将经过标记步骤的复合物稀释到1.5ug/mL。
所述ANS盐释放剂包括ANS盐、Tris、NaCl和KV300，其中，ANS盐浓度为30mg/mL，Tris浓度为100mM，NaCl浓度为 120mM，KV300体积百分比为0.4%。所述ANS盐释放剂的pH=7.05。
所述清洗液包括Tris、NaCl、CHAPS和Trition 100，所述Tris摩尔浓度为50mM，NaCl的质量百分比为1.5%，CHAPS的质量百分比为0.15%，Trition 100的体积百分比为0.015%。
本发明用到的终止剂选用甘氨酸、乙醇胺。
英文缩写解释：
EDC ：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
MES：2-(N-吗啉代)乙烷磺酸一水
Tris：三羟甲基氨基甲烷
BSA：牛血清白蛋白
2-IT：2-亚氨基硫烷盐酸盐
SMCC：4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯
CHAPS：3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐
Trition- 100 ：吐温100
KV300：KroVin 300M
Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCl缓冲液中仅含有Tris，用盐酸调节pH
APS-5：（4-氯苯巯基）（10-甲基-9,10-二氢化吖啶亚甲基）磷酸二钠盐。
对上述实施例制成的试剂盒进行相关检测得到如下数据：
项目标准
表一 项目标准
线性范围
测定理论浓度分别为1、4、8、16、40g/dL的皮质醇校准品，线性相关系数为R2=0.999，结果如表二所示。
表二 线性范围
精密度
测试试剂盒配套的低值质控品和高值质控品，每种质控品测试10次，计算10次测试的均值和变异系数，结果如表三所示。
表三 精密度
准确度
将五种不同浓度水平的皮质醇加入1个低水平皮质醇的血清样本中，得到如下数据，如表四所示：
表四 准确度
批间差
取3批次试剂盒，测试同一试剂盒中的低值质控品和高值质控品，每个质控品重复测试10次，计算3批次试剂，共计30个数据的均值和变异系数，结果如表五所示：
表五 批间差

Claims (10)

1.一种检测动物血液皮质醇的试剂盒，其特征在于：包括皮质醇单克隆抗体包被的毛细管、碱性磷酸酶标记的皮质醇抗原类似物、催化碱性磷酸酶发光的化学发光底物、ANS盐释放剂、皮质醇校准品和清洗液。
2.根据权利要求1所述的一种检测动物血液皮质醇的试剂盒，其特征在于：所述皮质醇单克隆抗体包被的毛细管是通过如下方法制成的：
步骤1，在毛细管内表面均匀包裹氨基；
步骤2，包被毛细管
首先用MES缓冲液溶解EDC，制成溶液Ⅰ；然后用溶液Ⅰ稀释皮质醇单克隆抗体，制成包被液；最后用包被液包被经过步骤1处理后的毛细管，包被完成后倒去包被液，包被的温度为35~40℃，包被时间为0.5～1h，包被的方式为将毛细管浸没在包被液中；
步骤3，第一次清洗
用Tris-HCl缓冲液清洗毛细管，清洗完成后吹干毛细管内外表面液体；
步骤4，封闭
用封闭液封闭处理经过步骤3的毛细管，封闭处理完成后，倒去封闭液，封闭处理时间为1~5h，封闭处理温度为15～40℃；
步骤5，第二次清洗
用清洗剂清洗经过步骤4处理后的毛细管，清洗完成后，吹干毛细管内外表面。
3.根据权利要求2所述的一种检测动物血液皮质醇的试剂盒，其特征在于：步骤2中，所述MES缓冲液的pH=6.4~6.6，浓度为0.05~0.2M；所述溶液Ⅰ中EDC浓度为0.02~0.8 mg/mL；所述包被液中皮质醇单克隆抗体的浓度为2~20 ug/mL。
4.根据权利要求2所述的一种检测动物血液皮质醇的试剂盒，其特征在于：步骤2中，所述MES缓冲液包括如下成分：
MES 0.05～1.5M
NaCl 0.05～1.5M
MgCl2 1～5mM
ZnCl2 0.01～0.1mM
BSA 0.2～1.5%
吐温20 0.2～0.6%。
5.根据权利要求2所述的一种检测动物血液皮质醇的试剂盒，其特征在于：步骤3中，Tris-HCl缓冲液的pH=7.4，浓度为25~100mM。
6.根据权利要求2所述的一种检测动物血液皮质醇的试剂盒，其特征在于：步骤4中，所述封闭液包括如下成分：
BSA 1~5%
蔗糖 2~10%
Tris 20~200M
甘氨酸 0.05~0.5M
吐温20 0.01~0.1%。
7.根据权利要求2所述的一种检测动物血液皮质醇的试剂盒，其特征在于：步骤5中，所述清洗剂中包含Tris、NaCl、CHAPS和Trition 100，其中Tris的浓度为 25~200 mM，NaCl的质量百分比为0.5~1.5%，CHAPS的质量百分比为0.05~0.2%，Trition 100的体积百分比为0.05~0.2%。
8.根据权利要求1所述的一种检测动物血液皮质醇的试剂盒，其特征在于：所述碱性磷酸酶标记的皮质醇抗原类似物通过如下方法制成，该方法包括皮质醇抗原类似物制备步骤、碱性磷酸酶制备步骤、标记步骤和稀释步骤；
所述皮质醇抗原类似物制备步骤具体为：将皮质醇抗原类似物与含2-IT的TSE缓冲液混合进行反应，反应温度为15~25℃，反应时间为20~50min，反应完成后加入终止剂终止反应，所述皮质醇抗原类似物与含2-IT的TSE缓冲液的体积比为：1:70~1:150，所述含2-IT的TSE缓冲液中，2-IT的浓度为10-15mg/mL；
所述碱性磷酸酶制备步骤具体为：首先将碱性磷酸酶溶解在碱性磷酸酶溶解液中，然后在加入SMCC缓冲液，在温度为20~25℃条件下反应20~40min后，加入终止剂终止反应制成碱性磷酸酶；
所述标记步骤具体为：按照摩尔比例为1:0.7~1:1.5分别加入皮质醇抗原类似物和碱性磷酸酶，在温度为2~8℃的条件下，混匀，反应18~28h后加入终止剂终止反应得到复合物，然后对复合物进行纯化处理；
所述稀释步骤具体为：按照质量百分比计，将经过标记步骤的复合物稀释到0.2~2ug/mL。
9.根据权利要求1所述的一种检测动物血液皮质醇的试剂盒，其特征在于：所述ANS盐释放剂包括ANS盐、Tris、NaCl和KV300，其中，ANS盐浓度为0.5~30mg/mL，Tris浓度为25~100mM，NaCl浓度为 50~200mM，KV300体积百分比为0.1~0.5%，所述ANS盐释放剂的pH=7.05～7.15。
10.根据权利要求1所述的一种检测动物血液皮质醇的试剂盒，其特征在于：所述清洗液包括Tris、NaCl、CHAPS和Trition 100，所述Tris摩尔浓度为50~200mM，NaCl的质量百分比为0.5~2%，CHAPS的质量百分比为0.05~0.2%，Trition 100的体积百分比为0.05~0.2%。
CN201811254343.5A 2018-10-26 2018-10-26 一种检测动物血液皮质醇的试剂盒 Pending CN109444408A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811254343.5A CN109444408A (zh) 2018-10-26 2018-10-26 一种检测动物血液皮质醇的试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811254343.5A CN109444408A (zh) 2018-10-26 2018-10-26 一种检测动物血液皮质醇的试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109444408A true CN109444408A (zh) 2019-03-08

Family

ID=65548234

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811254343.5A Pending CN109444408A (zh) 2018-10-26 2018-10-26 一种检测动物血液皮质醇的试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109444408A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117129668A (zh) * 2023-10-27 2023-11-28 江西赛基生物技术有限公司 一种用于化学发光免疫分析的清洗液及其制备方法和应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989000290A1 (en) * 1987-07-02 1989-01-12 In Vitro Technologies, Inc. Capillary device for immunoassay of multiple analytes
US5976896A (en) * 1994-06-06 1999-11-02 Idexx Laboratories, Inc. Immunoassays in capillary tubes
US6020209A (en) * 1997-04-28 2000-02-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Microcapillary-based flow-through immunosensor and displacement immunoassay using the same
CN101076731A (zh) * 2004-12-15 2007-11-21 金伯利-克拉克环球有限公司 样品的高效侧流免疫测定
US20110262940A1 (en) * 2008-12-19 2011-10-27 Hideaki Hisamoto Capillary for immunoassay, and capillary immunoassay method using same
CN105181680A (zh) * 2015-09-28 2015-12-23 成都博奥新景医学科技有限公司 一种三聚氰胺的磁珠分离化学发光免疫检测方法
CN106501535A (zh) * 2016-11-30 2017-03-15 长春迪瑞医疗科技股份有限公司 一种ans盐复合释放剂与检测血液中皮质醇的试剂盒
CN107091923A (zh) * 2017-06-02 2017-08-25 成都普利泰生物科技有限公司 一种毛细管化学发光检测装置及其检测方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989000290A1 (en) * 1987-07-02 1989-01-12 In Vitro Technologies, Inc. Capillary device for immunoassay of multiple analytes
US5976896A (en) * 1994-06-06 1999-11-02 Idexx Laboratories, Inc. Immunoassays in capillary tubes
US6020209A (en) * 1997-04-28 2000-02-01 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Microcapillary-based flow-through immunosensor and displacement immunoassay using the same
CN101076731A (zh) * 2004-12-15 2007-11-21 金伯利-克拉克环球有限公司 样品的高效侧流免疫测定
US20110262940A1 (en) * 2008-12-19 2011-10-27 Hideaki Hisamoto Capillary for immunoassay, and capillary immunoassay method using same
CN105181680A (zh) * 2015-09-28 2015-12-23 成都博奥新景医学科技有限公司 一种三聚氰胺的磁珠分离化学发光免疫检测方法
CN106501535A (zh) * 2016-11-30 2017-03-15 长春迪瑞医疗科技股份有限公司 一种ans盐复合释放剂与检测血液中皮质醇的试剂盒
CN107091923A (zh) * 2017-06-02 2017-08-25 成都普利泰生物科技有限公司 一种毛细管化学发光检测装置及其检测方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117129668A (zh) * 2023-10-27 2023-11-28 江西赛基生物技术有限公司 一种用于化学发光免疫分析的清洗液及其制备方法和应用
CN117129668B (zh) * 2023-10-27 2024-01-09 江西赛基生物技术有限公司 一种用于化学发光免疫分析的清洗液及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101201354B (zh) 甲状腺素化学发光免疫分析定量测定试剂盒及制备方法
CN108398550B (zh) 一种组合物、芯片及其制备方法和包含有该芯片的检测装置
US20100105071A1 (en) Methods for predicting the onset of menarche
CN108169497A (zh) 人泌乳素检测试剂盒及其制备方法与应用
CN106918708A (zh) 一种用于检测胰岛素的竞争法胶乳增强免疫透射比浊试剂盒
CN113125696B (zh) 一种雌二醇均相化学发光检测试剂盒及其应用
CN108414743A (zh) 一种用于酶联免疫试剂盒的组合物以及肿瘤标志物检测试剂盒及其制备方法
CN111175494A (zh) 一种甲状腺球蛋白抗体检测试剂盒及其使用方法
CN111289758B (zh) 用于h-fabp定量检测的试剂盒、h-fabp定量检测的方法
CN107044977A (zh) 一种酪氨酸磷酸酶抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN109444408A (zh) 一种检测动物血液皮质醇的试剂盒
CN105954509A (zh) 肾素化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN109212193A (zh) 用于临床检测异常凝血酶原的试剂盒
CN105911296A (zh) Ⅳ型胶原化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN107102140A (zh) 一种谷氨酸脱羧酶抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN106198998A (zh) 人甲胎蛋白异质体3化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN116027025A (zh) 一种总甲状腺素荧光免疫层析检测试剂盒及其制备方法
CN116183931A (zh) 一种半乳糖凝集素-3磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒
CN110031635A (zh) 闪光型均相化学发光技术检测心肌肌钙蛋白i/t的方法
CN116008547A (zh) 一种用于肿瘤早期筛查的试剂盒及其制备方法
CN113109325A (zh) 一种胃蛋白酶原i酶促化学发光检测试剂盒及其制备方法与应用
CN113533745A (zh) 同型半胱氨酸检测试剂盒及其检测方法
CN109917130A (zh) 一种犬crp的化学发光免疫检测试剂盒
CN206002550U (zh) 一种人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体的定量装置
CN115128280B (zh) 一种检测前列腺小体外泄蛋白的荧光层析试纸条、试剂盒及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination