CN113533745A - 同型半胱氨酸检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用化学发光免疫分析技术的同型半胱氨酸检测试剂盒,同时本发明还涉及测定同型半胱氨酸浓度的方法、试剂的组成及成分,属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要包括:样品处理液、化学发光标记物标记的S‑腺苷‑高半胱氨酸单克隆抗体、包被在固定载体上的S‑腺苷‑高半胱氨酸、浓缩洗涤液、发光液以及反应管;加入待测样本温育5~10min即完成样品初处理;可通过检测平台进行实验,机器加样会确保每个待测样本添加的试剂剂量、添加顺序,添加试剂间时差保持一致,可提高检测的重复性;采用化学发光免疫方法进行检测,本品具有更高的灵敏度、准确性,特异性、稳定性,与其他检测方法检验结果相符合。
Description
技术领域
本发明涉及一种同型半胱氨酸检测试剂盒,同时本发明还涉及测定同型半胱氨酸浓度的方法,属于医学检验测定技术领域。
背景技术
同型半胱氨酸是一种含硫氨基酸,为蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中产生的重要中间产物,正常情况下,同型半胱氨酸在体内被代谢分解,浓度维持在较低水平,但当同型半胱氨酸浓度处于较高水平时,冠心病、外周血管疾病及脑血管疾病的发病风险会大幅增加。
测定血液中同型半胱氨酸的方法有很多种,包括高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱(GC-MS)联用法、荧光偏振免疫法(FPLA)、酶联免疫分析法(ELISA)及酶法等。高效液相色谱、气相色谱-质谱联用等理化检测方法需要用专业仪器进行操作,分析成本高、日常维护费用昂贵,前处理过程复杂且分析时间长;酶联免疫方法等免疫方法的样品需要提前进行处理,前处理手续繁杂费时,机器难以处理,一般采用人工操作,人工操作会带来操作过程中的失误和误差,包括操作方法不正确、试剂添加的顺序错误、遗漏步骤、加样之间的时差都会对结果产生影响,检测的稳定性和重复性差,并且检测的特异性和灵敏性也较欠缺;酶法是应市场要求发展出的新检验方法,检测同型半胱氨酸通常使用生化循环酶法,生化循环酶法受环境如温度、pH值等影响较大,检测的灵敏度和准确度低。
发明内容
本发现的目的在于提供一种利用化学发光免疫分析技术的同型半胱氨酸检测试剂盒及其检测方法,本品在试剂中加入样品处理液,对待测生物样品进行简单的样品处理即可用于后续检测。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:一种同型半胱氨酸检测试剂盒,包括样品处理液、化学发光标记物标记的S-腺苷-高半胱氨酸单克隆抗体、包被在固定载体上的S-腺苷-高半胱氨酸、浓缩洗涤液、发光液以及反应管;
所述样品处理液包括样品处理液A和样品处理液B;
所述样品处理液A含有浓度为0.001~10mg/mL的S-腺苷-高半胱氨酸水解酶和25~500mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液;所述样品处理液B为含0.1~1.2mg/mL的巯基还原剂的缓冲液。
进一步地,所述巯基还原剂为二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐中的一种或多种。
进一步地,所述发光液包括发光液A液和发光液B液,所述发光液A液为过氧化氢和硝酸的混合液;发光液B液为氢氧化钠溶液。
进一步地,所述化学发光标记物标记的S-腺苷-高半胱氨酸单克隆抗体中化学发光标记物为吖啶酯。
进一步地,所述包被在固定载体上的S-腺苷-高半胱氨酸为包被在磁珠上的S-腺苷-高半胱氨酸。
进一步地,所述样品处理液A和样品处理液B内还含有防腐剂,所述防腐剂为硫柳汞、PC-300或叠氮化钠中的一种或多种。
进一步地,所述样品处理液A、样品处理液B、化学发光标记物标记的S-腺苷-高半胱氨酸单克隆抗体、包被在固定载体上的S-腺苷-高半胱氨酸、发光液A液、发光液B液、浓缩洗涤液均组成单剂试剂。
本发明还提供一种同型半胱氨酸的检测方法,所述检测方法包括以下步骤:
S1、提供待测生物样品、如上所述的同型半胱氨酸检测试剂盒、以及具有自动化液体处理装置的检测平台;
S2、将所述待测生物样品、所述样品处理液A、及所述样品处理液B分别放置在所述自动化液体处理装置内,设置程序启动自动移液系统,将所述样品处理液A和所述样品处理液B加入到所述待测生物样品中形成待测样本,将所述待测样本在37℃下反应5min~10min,;
S3、将所述待测样本通过所述自动移液系统加入所述的反应管中,在所述检测平台上设置程序对所述待测样本添加样液、孵育、清洗;
S4、将所述反应管移动至检测平台的信号产生和检测系统内进行检测。
进一步地,所述生物样品为血清或血浆。
进一步地,所述检测平台还包括温育反应系统、清洗和分离系统以及计算机数据处理和控制系统。
本发明的有益效果在于:本发明的同型半胱氨酸检测试剂盒中含有样品处理液A和样品处理液B,将样品处理液A和样品处理液B按体积比1:1混匀后加入待测生物样品温育5~10min即完成样品初处理;本发明所有试剂均可通过检测平台进行实验,机器加样会确保每个待测样本添加的试剂剂量、添加顺序,添加试剂间时差保持一致,本发明可提高检测的重复性;且本发明采用化学发光免疫方法进行检测,本品具有更高的灵敏度、准确性,特异性、稳定性。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本发明所示的同型半胱氨酸试剂盒的定标曲线图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
此外,下面所描述的本申请不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本申请提供一种同型半胱氨酸试剂盒,其包括样品处理液、化学发光标记物标记的S-腺苷-高半胱氨酸单克隆抗体、包被在固定载体上的S-腺苷-高半胱氨酸、浓缩洗涤液、发光液以及反应管;
样品处理液包括样品处理液A和样品处理液B;
样品处理液A含有浓度为0.001~10mg/mL的S-腺苷-高半胱氨酸水解酶和25~500mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液;样品处理液B为含0.1~1.2mg/mL的巯基还原剂的缓冲液。
其中,样品处理液A和样品处理液B都是为水溶液。且所述样品处理液A和样品处理液B内都还含有防腐剂,该防腐剂为硫柳汞、PC-300或叠氮化钠中的一种或多种,但不仅限于此。
所述巯基还原剂为二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐中的一种或多种,但不仅限于此,还可以其他试剂,在此不一一列举。
所述发光液包括发光液A液和发光液B液,所述发光液A液可以为过氧化氢和硝酸的混合液;发光液B液可以为氢氧化钠溶液,但不仅限于此,发光液A液和发光液B液还可为其他发光反应剂,可根据实际需要进行选择。所述发光液A与所述发光液B各取用1个单位样液混匀后使用。
所述化学发光标记物标记的S-腺苷-高半胱氨酸单克隆抗体中化学发光标记物为吖啶酯,所述化学标记物还可以为吖啶盐或吖啶酰肼等发光材料。
所述包被在固定载体上的S-腺苷-高半胱氨酸为包被在磁珠上的S-腺苷-高半胱氨酸,通过生物素-链霉亲和素系统进行包被,此系统为现有技术,在此不再赘述。
所述试剂盒还含有校准品用以对检测仪器、检测方法进行校准,使检测系统检验的结果可靠有依据。
需要说明的是,所述样品处理液A、样品处理液B、化学发光标记物标记的S-腺苷-高半胱氨酸单克隆抗体、包被在固定载体上的S-腺苷-高半胱氨酸、发光液A液、发光液B液、浓缩洗涤液以及校准品均组成单剂试剂,从而收容在试剂盒内。
本申请还提供一种同型半胱氨酸检测方法,该方法依靠检测平台,包括以下步骤:
S1、初处理:将试剂盒中样液加入自动移液处理装置中,设置实验程序,将100μL样品处理液A和100μL样品处理液B同时注入40μL待测生物样品中,在37℃环境下孵育5~10min,本申请所有试剂均通过检测平台进行加样实验,机器加样会确保每个待测样本添加的试剂剂量、添加顺序,添加试剂间时差保持一致,本发明可提高检测的重复性;
S2、免疫反应:取50μL经过初处理的待测生物样品,加入100μL标记有吖啶酯的S-腺苷-高半胱氨酸单克隆抗体和40μL包被有S-腺苷-高半胱氨酸的磁珠,在37℃环境下孵育5~10min,洗涤出游离的标记有吖啶酯的S-腺苷-高半胱氨酸单克隆抗体等物质;
S3、化学发光反应:按照检测样品数量选取适量体积发光液配置,在每个待测样本中先加入发光液A,再加入发光液B,在加入发光液B后应立即进行测量,测量时间为5s;
S4、处理数据:通过信号产生和检测系统检测待测生物样品中的发光强度,通过计算机数据处理和控制系统确定待测生物样品的同型半胱氨酸的浓度。
其中,所述生物样品为血清或血浆。
下面以具体实施例对上述的同型半胱氨酸试剂盒和同型半胱氨酸检测方法进行详细说明:
实施例1
本实施例的同型半胱氨酸试剂盒,它包括样品处理液、化学发光标记物标记的S-腺苷-高半胱氨酸单克隆抗体、包被在固定载体上的S-腺苷-高半胱氨酸、浓缩洗涤液、发光液以及反应管;
样品处理液包括样品处理液A和样品处理液B;
样品处理液A含有浓度为5mg/mL的S-腺苷-高半胱氨酸水解酶和500mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液;样品处理液B为含0.8mg/mL的二硫苏糖醇的缓冲液。
发光液包括发光液A液和发光液B液,发光液A液为过氧化氢和硝酸的混合溶液;发光液B液为氢氧化钠溶液。发光液A与所述发光液B各取用50μL样液混匀后使用。
样品处理液A和样品处理液B内含有硫柳汞作为防腐剂。
试剂盒中所有试剂均组成单剂试剂。
实施例2
本实施例的同型半胱氨酸检测方法,包括以下操作步骤:
S1、将试剂盒中样液加入自动移液处理装置中,设置实验程序,将100μL样品处理液A和100μL样品处理液B同时注入40μL待测生物样品中,在37℃环境下孵育9min;
S2、取50μL经过初处理的待测生物样品,加入单克隆抗体和酶标记物各50μL,在37℃环境下孵育9min,洗涤出游离的酶标记物等物质;
S3、按照检测样品数量选取适量体积发光液配置,设置程序将发光液A液和发光液B液按体积比1:1配置,在每个待测样本中先加入50μL发光液A,再加入50μL发光液B,在加入发光液B后立即进行测量,测量时间为5s;
S4、通过信号产生和检测系统检测待测生物样品中的发光强度,通过计算机数据处理和控制系统确定待测生物样品的同型半胱氨酸的浓度。
根据上述实施例1~2的技术方案得到的实验测定结果:
(1)本发明同型半胱氨酸测定方法达到的技术指标:
a.测定参考范围:正常人体血清及血浆中的同型半胱氨酸浓度正常参考值范围为5~15μmol/L,通常小于6μmol/L为最佳健康数值,同型半胱氨酸水平为男性高于女性,会随着人体年龄的增长出现逐步上升。
b.检测范围:本试剂盒可检测0~50μmol/L浓度范围内的同型半胱氨酸。
c.参考曲线:使用标准品溶解后稀释得到0μmol/L、2.3μmol/L、4.7μmol/L、9.4μmol/L、18.8μmol/L、50.0μmol/L的同型半胱氨酸标准溶液,对这些标准品溶液测定其发光强度,绘制出定标曲线图,具体见图1。
d.精密度:
批内变异系数:使用同一批次的试剂盒进行试验,对相同质控样品进行检测,其中样本1为3.2μmol/L,样本2为14μmol/L,每份样品做10次重复。10次试验结果的统计学分析如下,计算结果见表1所示。
表1:批内精密度
批间变异系数:分别使用三个批次的试剂盒,进行相同质控样品的检测。其中样本1为3.2μmol/L,样本2为14μmol/L,每份样品做10次重复。10次试验结果的统计学分析如下,计算结果见表2和表3所示。
表2:批间精密度
表3:不同样品间批间总精密度
样本1 | 样本2 | |
总均值 | 3.2 | 14.07 |
总SD | 0.11 | 0.38 |
总精密度 | 3.33% | 2.70% |
结果显示本试剂盒批内CV%<5%,批间CV%<5%,均体现了良好的精密度。
(2)试剂盒稳定性测试结果:
使用校准品1:0μmol/L、校准品2:2μmol/L、校准品3:5μmol/L、校准品4:10μmol/L、校准品5:25μmol/L、校准品6:50μmol/L不同含量的校准品进行试剂盒稳定性测定,在第1个月、第3个月、第5个月、第7个月、第9个月、第13个月、第15个月、第18十八个月以及第19个月分别对上述不同浓度的校准品进行测量,计算出与第0个月之间的偏差,计算结果见表4所示。
表4:试剂盒稳定性
结果显示,本发明的试剂盒放置在2-8℃环境中,放置不同时间后进行检测,在18个月内的测得结果偏差最大为-5%,在第19个月中测得结果偏差最大为-8%,体现了该试剂盒在正确保存条件下,试剂盒具有良好的稳定性。
综上,本发明的同型半胱氨酸检测试剂盒中含有样品处理液A和样品处理液B,将样品处理液A和样品处理液B按体积比1:1混匀后加入待测生物样品温育5~10min即完成样品初处理;本发明所有试剂均可通过检测平台进行实验,机器加样会确保每个待测样本添加的试剂剂量、添加顺序,添加试剂间时差保持一致,本发明可提高检测的重复性;且本发明采用化学发光免疫方法进行检测,本品具有更高的灵敏度、准确性、特异性、稳定性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种同型半胱氨酸检测试剂盒,其特征在于,包括样品处理液、化学发光标记物标记的S-腺苷-高半胱氨酸单克隆抗体、包被在固定载体上的S-腺苷-高半胱氨酸、浓缩洗涤液、发光液以及反应管;
所述样品处理液包括样品处理液A和样品处理液B;
所述样品处理液A含有浓度为0.001~10mg/mL的S-腺苷-高半胱氨酸水解酶和25~500mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲液;所述样品处理液B为含0.1~1.2mg/mL的巯基还原剂的缓冲液。
2.如权利要求1所述的同型半胱氨酸检测试剂盒,其特征在于,所述巯基还原剂为二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的同型半胱氨酸检测试剂盒,其特征在于,所述发光液包括发光液A液和发光液B液,所述发光液A液为过氧化氢和硝酸的混合液;发光液B液为氢氧化钠溶液。
4.如权利要求1所述的同型半胱氨酸的检测方法,其特征在于,所述化学发光标记物标记的抗体中化学发光标记物为吖啶酯。
5.如权利要求1所述的同型半胱氨酸检测试剂盒,其特征在于,所述包被在固定载体上的S-腺苷-高半胱氨酸为包被在磁珠上的S-腺苷-高半胱氨酸。
6.如权利要求1所述的同型半胱氨酸检测试剂盒,其特征在于,所述样品处理液A和样品处理液B内还含有防腐剂,所述防腐剂为硫柳汞、PC-300或叠氮化钠中的一种或多种。
7.如权利要求1所述的同型半胱氨酸检测试剂盒,其特征在于,所述样品处理液A、样品处理液B、化学发光标记物标记的S-腺苷-高半胱氨酸单克隆抗体、包被在固定载体上的S-腺苷-高半胱氨酸、发光液A液、发光液B液、浓缩洗涤液均组成单剂试剂。
8.一种同型半胱氨酸的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括以下步骤:
S1、提供待测生物样品、如权利要求1~7项中任一项所述的同型半胱氨酸检测试剂盒、以及具有自动化液体处理装置的检测平台;
S2、将所述待测生物样品、所述样品处理液A、及所述样品处理液B分别放置在所述自动化液体处理装置内,设置程序启动自动移液系统,将所述样品处理液A和所述样品处理液B加入到所述待测生物样品中形成待测样本,将所述待测样本在37℃下反应5~10min;
S3、将所述待测样本通过所述自动移液系统加入所述的反应管中,在所述检测平台上设置程序对所述待测样本添加样液、孵育、清洗;
S4、将所述反应管移动至检测平台的信号产生和检测系统内进行检测。
9.如权利要求8所述的同型半胱氨酸的检测方法,其特征在于,所述生物样品为血清或血浆。
10.如权利要求8所述的同型半胱氨酸的检测方法,其特征在于,所述检测平台还包括温育反应系统、清洗和分离系统以及计算机数据处理和控制系统。
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