CN115541741A - 同时检测多种血压升高相关的典型生物标记物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测多种血压升高相关的典型生物标记物的方法；生物标记物包括：a)同型半胱氨酸或其类似物，b)醛固酮和/或皮质醇，以及c)多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3‑甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素中至少一种；检测时，在待测生物样品中加入三(2‑甲酰乙基)膦盐酸盐；加入丙酸酐或者乙酸酐，接入化学基团‑C3H5O或者‑C2H3O；加入(1‑(2‑肼基‑2‑氧乙基)吡啶翁氯化物)，接入化学基团‑C7H8N3O；注入液相色谱质谱联用仪进行分析。通过本发明的方法，成功地实现了和血压升高相关的10种生物标记物同时检测的目的，提高了解决血压升高原因分析效率，解决了通量和效率问题，也使操作过程大大简化。

Description

同时检测多种血压升高相关的典型生物标记物的方法
技术领域
本发明属于检测技术领域，涉及一种同时检测多种血压升高相关的典型生物标记物的方法，尤其涉及一种同时检测10种血压升高相关的典型生物标记物的方法。
背景技术
在生物体中，造成血压升高的原因比较复杂，可能和很多的因素有关，不同的原因虽然都会让血压升高，一样的结果并不意味着一样的原因，而了解原因是非常重要的。随着对这种血压升高现象了解和研究的越来越深入，对其有越来越多的了解，终于可以通过不同的生物标记物来对血压升高这一现象来进行不同原因的分析。按照目前技术的最新发展，已经发现和血压升高相关的生物标记物主要包括同型半胱氨酸(以及同型半胱氨酸类似的化合物和代谢通路上的化合物，如半胱氨酸，甲硫氨酸等)、多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素、醛固酮、皮质醇等。不同的生物标记物对应着血压升高不同的原因，检测并得到这些化合物在生物样品中的准确含量，对于确定血压升高的原因至关重要。
尽管目前可以了解到血压升高的生物标记物是什么，分别代表了什么样的血压升高原因，但是，目前最头疼的问题就是这些生物标记物很难同时进行分析和测定。而正是因为这些生物标记物可以成功地代表血压升高的各种各样的不同原因，就造成这些生物标记物本身的差异很大，他们完全不是一类的化合物。如果分别去检测这些化合物，当然可以得到他们各自的分析测定结果，但是这就意味着至少要进行5次左右检测，才能得到这些化合物的检测结果，这样的效率非常低，为了解决这个问题，目前的解决方案可以先把高度怀疑的原因进行测试，如果结果和猜测不符，那么就再继续测试其他的生物标记物，或者就直接花很长时间将以上生物标记物分开进行测定，再将各个生物标记物的分析结果进行汇总后，然后进行生理和病理的分析，但是这种方法特别慢。无论目前的哪种解决方案，都是因为不能实现所有生物标记物的同时测定问题而进行的妥协方案。如果能够实现这些生物标记物的同时检测，将大大提高效率，改变目前的困难状况。
目前的分析方法和难点(不能同时分析的难点)一览表见表1：
表1 10个典型的生物标记物的名称和难以同时分析的难点问题
Figure BDA0003842093720000021
10个生物标记物的结构式如下：
Figure BDA0003842093720000022
Figure BDA0003842093720000031
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术存在的不足，提供一种同时检测多种血压升高相关的典型生物标记物的方法。本发明通过特殊的样品处理方法，解决了10个高血压相关生物标记物同时检测的问题。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种同时检测多种典型生物标记物的方法，所述生物标记物包括组份：a)同型半胱氨酸或其类似物，b)醛固酮和皮质醇中至少一种，以及c)多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素中至少一种；所述方法包括如下步骤：
S1、在待测生物样品中加入还原剂三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐；
S2、加入丙酸酐，接入化学基团-C3H5O；或者加入乙酸酐，接入化学基团-C2H3O；
S3、加入(1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物)，接入化学基团-C7H8N3O；
S4、注入液相色谱质谱联用仪进行分析。该方法非疾病诊断性。
步骤S1中，加入三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐还原同型半胱氨酸，是为了得到同型半胱氨酸的稳定状态，并使其可接入-C3H5O或者-C2H3O；而采用其他巯基还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇也可以得到同型半胱氨酸的稳定状态，但是之后无法接入-C3H5O或者-C2H3O。
作为一个实施方案，同型半胱氨酸类似物包括甲硫氨酸、半胱氨酸中至少一种。
作为一个实施方案，所述生物样品选自血浆、血清、脑脊液、组织匀浆液、干血斑、尿液、毛发、汗液或唾液。
作为一个实施方案，步骤S1中，加入还原剂三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐还原a)组分。
作为一个实施方案，步骤S2中，在b)组分化合物上接入1～n个-C3H5O或者-C2H3O基团。n可以为2、3、4或更多；如n＝2-5。
作为一个实施方案，步骤S3中，在c)组分化合物上接入化学基团-C7H8N3O。
作为一个实施方案，所述生物标记物为同型半胱氨酸或其类似物，多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素、醛固酮和皮质醇的组合。
在一些实施例中，所述生物标记物为同型半胱氨酸、多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素、醛固酮和皮质醇的组合。
本发明还涉及一种用于同时检测多种血压升高相关的典型生物标记物的试剂盒，所述试剂盒包括：多种生物标记物的质控品、标准品、还原剂(三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐)、化学标签接入试剂丙酸酐或者乙酸酐、化学标签接入试剂1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物、缓冲溶液和提取溶液。
作为一个实施方案，所述多种生物标记物包括组份：a)同型半胱氨酸或其类似物，b)醛固酮和皮质醇中至少一种，以及c)多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素中至少一种。
本发明通过重新设计分析流程，最终确定采用三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐+丙酸酐或者乙酸酐+(1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物)，3种试剂的组合是实验成功的关键，这3个试剂联用最终实现在同1份样品中，采用同1个前处理方法，不需要将1份样品分成几份或者采用不同的前处理方法，使得同型半胱氨酸(以及同型半胱氨酸类似的化合物和代谢通路上的化合物，如半胱氨酸，甲硫氨酸等)、多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素、醛固酮、皮质醇可以快速进行同时分析。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)通过重新设计整个分析方法，实现了高血压相关的10种生物标记物同时检测，大大提高了检测的效率；
2)通过新型还原剂的使用，确保不影响其他9种生物标记物同时检测的还原剂，实现了同型半胱氨酸的还原，改变了同型半胱氨酸只能和类似化合物，如半胱氨酸、甲硫氨酸等化合物一起检测，不能和不同性质的化合物一起检测的问题，特别是不能和高血压其他生物标记物一起检测的难题；
3)接入了特定的化学基团，改变了多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素的性质，使得其能够和左旋多巴、醛固酮、皮质醇一起分析，解决了多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素需要弱阳离子固相吸附材料富集，而左旋多巴、醛固酮、皮质醇难以被弱阳离子固相吸附材料富集的问题；
4)在醛固酮上接入了更强的电离基团，获得更高的检测灵敏度。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为试剂1异硫氰酸苯酯和试剂2(1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物)依次接入后的效果图；
图2为实施例1的同时检测高血压相关的10种生物标记物的液相色谱质谱图谱(步骤二接入丙酸酐)；
图3为实施例1的同时检测高血压相关的10种生物标记物的液相色谱质谱图谱(步骤二接入乙酸酐)。
具体实施方式
本发明所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。所述方法选择了典型的10种高血压生物标记物的同时检测，虽然本发明仅分析了典型的10种生物标记物，只要和这10种化合物的类似，例如和同型半胱氨酸类似的甲硫氨酸、半胱氨酸等，都可以采用该方法进行分析，属于该发明的保护范围。
本发明通过重新设计整个分析方法，实现了高血压相关的10种生物标记物同时检测，步骤如下：
步骤一：在待分析的生物样品中，加入还原剂三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐，还原同型半胱氨酸(其他类似同型半胱氨酸的化合物也在该步骤中被还原，例如甲硫氨酸、半胱氨酸等等)，得到同型半胱氨酸的稳定状态，以便下一步的分析做准备。尝试了不同的还原剂，包括还原剂DL-二硫苏糖醇、3,3'-二硫代二丙酸、锌粉、四氢硼酸钠等，以上还原剂全部都会影响到和其他试剂的配合，进而影响到其他的9个化合物的检测，不能用于实现10个化合物的同时测定。
以还原剂三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐的结构式和DL-二硫苏糖醇结构式作为举例如下，采用还原剂DL-二硫苏糖醇，还原剂DL-二硫苏糖醇结构上带有2个硫醇基团，这个基团会和丙酸酐或者乙酸酐发生反应，用作还原剂的DL-二硫苏糖醇是大大过量的，它的存在会马上封闭住丙酸酐或者乙酸酐，接下来的反应不再能够进行，会全部停在第一步。通过大量尝试，只有三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐作为还原剂，才能实现所有10个化合物的同时含量测定。
DL-二硫苏糖醇：
Figure BDA0003842093720000061
三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐：
Figure BDA0003842093720000062
生物样品包括但不限于血浆、血清、脑脊液、组织匀浆液、干血斑、尿液、毛发、汗液、唾液等。
步骤二：加入丙酸酐或者乙酸酐，接入化学基团-C3H5O或者-C2H3O，按照不同的化合物结构，可能接入1～n个-C3H5O或者-C2H3O基团，用于改变多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素的化学性质，实现和其他生物标记物同时检测的目的。尝试了其他的化学基团接入试剂，包括异硫氰酸苯酯、丹酰氯、4-(N-甲基)吡啶硼酸、9-芴甲基氯甲酸酯等很多种试剂，这些试剂虽然都能为多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素接入特定的化学基团，改变多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素的化学性质，但是因为各种原因，都不能和其他化合物实现同时检测。以异硫氰酸苯酯为例：
式Ⅰ1-式Ⅰ6给出了试剂1异硫氰酸苯酯和多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素反应的结构式，在异硫氰酸苯酯接入试剂1的化学基团之后，严重干扰了醛固酮和皮质醇的测定。图1给出了化学标签试剂1异硫氰酸苯酯和化学标签试剂2(1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物)依次接入后的效果图，从图中可以看出，醛固酮和皮质醇的色谱峰消失，醛固酮和皮质醇的测定收到了严重影响。
Figure BDA0003842093720000071
式Ⅰ1多巴胺接入化学标签试剂1候选试剂异硫氰酸苯酯
Figure BDA0003842093720000072
式Ⅰ2肾上腺素接入化学标签试剂1候选试剂异硫氰酸苯酯
Figure BDA0003842093720000073
式Ⅰ3去甲肾上腺素接入化学标签试剂1候选试剂异硫氰酸苯酯
Figure BDA0003842093720000074
式Ⅰ4变肾上腺素接入化学标签试剂1候选试剂异硫氰酸苯酯
Figure BDA0003842093720000075
式Ⅰ5去甲变肾上腺素接入化学标签试剂1候选试剂异硫氰酸苯酯
Figure BDA0003842093720000076
式Ⅰ6 3-甲氧基酪氨接入化学标签试剂1候选试剂异硫氰酸苯酯
图1为试剂1异硫氰酸苯酯和试剂2(1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物)依次接入后的效果图，从图1中可以看出，醛固酮和皮质醇的色谱峰消失，醛固酮和皮质醇的检测受到了严重的影响。
以丹酰氯为例，试验了丹酰氯作为化学基团接入试剂，丹酰氯和多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、变肾上腺素、去甲变肾上腺素、3-甲氧基酪胺反应接入化学基团，但是该反应在相对中性的、有水存在的环境反应很慢，不能满足要求。
以4-(N-甲基)吡啶硼酸为例，化学标签试剂1候选试剂4-(N-甲基)吡啶硼酸是很好的化学标签试剂，但是4-(N-甲基)吡啶硼酸只有在无水环境下才能发生反应。式Ⅱ1-式Ⅱ3给出了4-(N-甲基)吡啶硼酸和多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素反应的反应式，该反应也是专属性很高的快速的标签接入反应，但是该反应需要无水的环境，在有水的环境中，反应不能发生。
Figure BDA0003842093720000081
式Ⅱ1多巴胺接入化学标签试剂1候选试剂4-(N-甲基)吡啶硼酸
Figure BDA0003842093720000082
式Ⅱ2肾上腺素接入化学标签试剂1候选试剂4-(N-甲基)吡啶硼酸
Figure BDA0003842093720000083
式Ⅱ3去甲肾上腺素接入化学标签试剂1候选试剂4-(N-甲基)吡啶硼酸
其他多种化学基团接入试剂，各自都有各自存在的问题，不能实现在同1个样品中，采用同1个前处理方法，对10个化合物同时测定的目的。
丙酸酐或者乙酸酐是能够实现10个化合物同时检测的关键试剂。
步骤三：加入(1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物)，接入化学基团-C7H8N3O，改变醛固酮和皮质醇的性质，实现和其他生物标记物同时检测的目的。
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
同时检测血浆中同型半胱氨酸、多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素、醛固酮和皮质醇。
步骤一、取血浆200微升，加入20微升多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素、醛固酮和皮质醇的同位素内标混合溶液，加入20微升还原剂三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐，混合均匀，还原同型半胱氨酸；
步骤二、加入50微升丙酸酐或者乙酸酐，加入200微升碳酸氢铵缓冲盐溶液，混合均匀，放置10分钟，为同型半胱氨酸、多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素接入-C3H5O基团或者-C2H3O基团；
步骤三、加入叔丁基甲醚1毫升，提取接入丙酸酐或者乙酸酐后的化合物，以及醛固酮和皮质醇，将以上成分提取入叔丁基甲醚层，分离叔丁基甲醚层；
步骤四、加入醋酸5微升，加入(1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物)10微升，混合均匀，室温下放置10分钟，为醛固酮和皮质醇接入-C7H8N3O基团；
步骤五、反应后的溶液室温下氮气吹干，采用25％的甲醇溶液50微升复溶，注入液质联用仪进行分析。
采用色谱质谱仪对10种接入了化学标签的化合物进行分析；
色谱条件：
流动相A相：甲醇
流动相B相：0.1％甲酸水溶液
梯度条件：
表1-A(步骤二接入丙酸酐)
时间/分钟 A相/％ B相/％ 梯度曲线
0 98 25 /
6.0 70 65 6
6.1 10 90 6
7.0 10 90 6
8.0 98 25 1
表1-B(步骤二接入乙酸酐)
Figure BDA0003842093720000091
Figure BDA0003842093720000101
结果表明，该方法可以同时检测10种血压升高相关的生物标记物，图谱如图2(步骤二接入丙酸酐)和图3(步骤二接入乙酸酐)所示。图2中各个化合物从上到下依次为去甲肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、同型半胱氨酸、皮质醇、醛固酮、左旋多巴、多巴胺、肾上腺素。图3中各个化合物从上到下依次为去甲肾上腺素、变肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、同型半胱氨酸、皮质醇、醛固酮、左旋多巴、肾上腺素和多巴胺。
测定结果，3个血浆样品中同型半胱氨酸、多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素、醛固酮和皮质醇含量测定结果见表2。
表2、3个血浆样品中10个生物标记物的含量
样品1 样品2 样品3
同型半胱氨酸(nmol/mL) 4.2 5.6 1.5
去甲变肾上腺素(pg/mL) 65.9 63 91.7
3-甲氧基酪氨(pg/mL) 5.9 10.1 4.4
变肾上腺素(pg/mL) 43.9 26.4 26.7
去甲肾上腺素(pg/mL) 97.5 148.2 370.4
肾上腺素(pg/mL) 1.8 2.1 17.3
多巴胺(pg/mL) 2.3 4.9 8.3
左旋多巴(ng/mL) 1.2 2.2 0.8
醛固酮(pg/mL) 6.9 5.1 4.9
皮质醇(ng/mL) 120.4 118.6 134.7
综上所述，通过本发明的方法，成功地实现了和血压升高相关的10种生物标记物同时检测的目的，大大提高了解决血压升高原因分析的效率，解决了通量和效率的问题，也使操作过程大大简化。基于该方法，本发明还提供一种用于同时检测多种血压升高相关的典型生物标记物的试剂盒，多种生物标记物的质控品、标准品、还原剂(三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐)、化学标签接入试剂丙酸酐或者乙酸酐、化学标签接入试剂1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物、缓冲溶液和提取溶液。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (9)

1.一种同时检测多种典型生物标记物的方法，其特征在于，所述生物标记物包括组份：a)同型半胱氨酸或其类似物，b)醛固酮和皮质醇中至少一种，以及c)多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素中至少一种；所述方法包括如下步骤：
S1、在待测生物样品中加入还原剂三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐；
S2、加入丙酸酐，接入化学基团-C3H5O；或者加入乙酸酐，接入化学基团-C2H3O；
S3、加入(1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物)，接入化学基团-C7H8N3O；
S4、注入液相色谱质谱联用仪进行分析。
2.根据权利要求1所述的同时检测多种典型生物标记物的方法，其特征在于，同型半胱氨酸类似物包括甲硫氨酸、半胱氨酸中至少一种。
3.根据权利要求1所述的同时检测多种典型生物标记物的方法，其特征在于，所述生物样品选自血浆、血清、脑脊液、组织匀浆液、干血斑、尿液、毛发、汗液或唾液。
4.根据权利要求1所述的同时检测多种典型生物标记物的方法，其特征在于，步骤S1中，加入还原剂三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐还原a)组分。
5.根据权利要求1所述的同时检测多种典型生物标记物的方法，其特征在于，步骤S2中，在b)组分化合物上接入1～n个-C3H5O基团或者-C2H3O基团，n＝2-5。
6.根据权利要求1所述的同时检测多种典型生物标记物的方法，其特征在于，步骤S3中，在c)组分化合物上接入化学基团-C7H8N3O。
7.根据权利要求1所述的同时检测多种典型生物标记物的方法，其特征在于，所述生物标记物为同型半胱氨酸或其类似物，多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素、醛固酮和皮质醇的组合。
8.一种用于同时检测多种血压升高相关的典型生物标记物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：多种生物标记物的质控品、标准品、还原剂(三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐)、化学标签接入试剂丙酸酐或者乙酸酐、化学标签接入试剂1-(2-肼基-2-氧乙基)吡啶翁氯化物、缓冲溶液和提取溶液。
9.根据权利要求8所述的用于同时检测多种血压升高相关的典型生物标记物的试剂盒，其特征在于，所述多种生物标记物包括组份：a)同型半胱氨酸或其类似物，b)醛固酮和皮质醇中至少一种，以及c)多巴胺、左旋多巴、肾上腺素、去甲肾上腺素、3-甲氧基酪氨、去甲变肾上腺素、变肾上腺素中至少一种。
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