CN111307789B - 一种叶酸检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种叶酸检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学分析技术领域，具体涉及一种叶酸检测试剂盒及检测方法。该试剂盒包括包被有叶酸衍生物的磁微粒混悬液，酶标记的叶酸结合蛋白，样品处理液，化学发光底物；所述样品处理液包括样品处理液1、样品处理液2和样品处理液3。本发明试剂盒采用特定的样品处理液对待测样本进行处理，可温和地将叶酸与蛋白质分离开，检测过程中不会产生蛋白沉淀，也不会对辣根过氧化物酶造成破坏，检测结果精密度好，与罗氏试剂盒相关性良好，检测结果准确可靠；检测速度快，40分钟即可出结果，适用于叶酸含量的临床检测。

Description

一种叶酸检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及医学分析技术领域，具体涉及一种叶酸检测试剂盒及检测方法。
背景技术
叶酸是一组化学结构相似、生化特征相近的化合物的统称，由蝶啶、对氨基苯甲酸与一个或多个谷氨酸结合而成。自然状态下叶酸可存在多种形式，该些形式均可通过同功酶的形式表达它的生物学功能，即转运单个的碳单位，它对于正常细胞的生长和DNA的合成至关重要。
人类食入的叶酸为叶酸多聚谷氨酸，需在空肠黏膜刷状缘被水解为叶酸单聚谷氨酸，方能进入全身循环。在亚甲基四氢叶酸还原酶的作用下，5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，为体内合成代谢提供甲基。在甲硫氨酸合成酶和依赖维生素B12的甲硫氨酸合成还原酶共同作用下5-甲基四氢叶酸转化为四氢叶酸，而相应同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸。当亚甲基四氢叶酸还原酶活性降低，5-甲基四氢叶酸生成减少，同型半胱氨酸转化率降低，体内同型半胱氨酸堆积；DNA、蛋白质、脂质甲基化不足，染色体不稳定，影响机体合成代谢，导致疾病发生。
目前对叶酸的测定方法有：
1、比色法和薄层层析法：适合于测定植物材料、药剂及复合维生素制剂中的叶酸。
2、微生物改良法：可用于检测血清、全血、纸血片叶酸，但检测结果受样品中所含抗叶酸药物或抗生素成分的影响。
3、同位素放射免疫法：不适用于检测单谷氨酸叶酸衍生混合物，难以得到准确的叶酸含量值，但此方法具有快速、简便的特点，广泛应用于临床实验室。
4、气相色谱－质谱法：特异性好、灵敏度高、结果准确。国内主要应用于蔬菜、血浆、保健食品，国外主要用于强化叶酸的产品的检测。
5、高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)法：快速、高效地分离叶酸化合物,灵敏度高、样品用量少、自动化程度高。但操作相对复杂，不适合做大量筛查。
化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术，是继放射免疫分析(RIA)和酶免疫分析(EIA)之后发展起来的一种超高灵敏度的微量测定技术，具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染、仪器简单经济等优点。磁微粒化学发光分析法将化学发光免疫分析技术和免疫磁微粒技术相结合，大大提高了检测灵敏度和准确性，然而，叶酸在血液中以叶酸与蛋白质的结合态存在，检测时需要在检测前将其分离出来。而目前常用的方法是强碱配合还原剂，使蛋白发生变性，从而释放出叶酸。但是，这种剧烈的变性方式会影响后续反应，如pH骤降产生蛋白沉淀，导致磁珠凝集；同时，过量的还原剂对辣根过氧化物酶造成破坏，导致反应不充分，从而降低检测结果的精密度、可靠性等。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种叶酸试剂盒及检测方法。该叶酸检测试剂盒精密性好，检测结果准确可靠。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种叶酸检测试剂盒，包被有叶酸衍生物的磁微粒混悬液，酶标记的叶酸结合蛋白，样品处理液，化学发光底物；
所述样品处理液包括样品处理液1、样品处理液2和样品处理液3；
所述样品处理液1为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；所述样品处理液2为含0.1～10wt％还原剂的pH4.5～6.5的缓冲液，所述还原剂为DTT、TCEP、美司钠、巯基乙醇、α-硫代甘油中的一种或多种；所述样品处理3为0.1～10wt％中和剂的pH4.0～8.0的缓冲液；所述中和剂为谷胱甘肽、碘乙酰胺、碘酸钠、N-乙基丁烯二亚酰胺、连四硫酸钠、氯化苄、胱氨酸和对氯汞苯甲酸中的一种或多种。
一些实施方案中，所述样品处理液1的浓度为0.3-0.6M。一些具体实施例中，所述样品处理液1的浓度为0.6M。
一些实施方案中，所述样品处理液2为含0.5wt％还原剂的pH5.5的缓冲液，所述还原剂为DTT、TCEP、美司钠、巯基乙醇、α-硫代甘油中的一种或多种；所述样品处理3为含1wt％中和剂的pH5.0的缓冲液。所述中和剂为谷胱甘肽、碘乙酰胺、碘酸钠、N-乙基丁烯二亚酰胺、连四硫酸钠、氯化苄、胱氨酸和对氯汞苯甲酸中的一种或多种。
一些实施方案中，所述样品处理液2中，缓冲液为醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的一种或多种。
一些实施方案中，所述样品处理液3中，缓冲液为Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或多种。
一些具体实施例中，所述样品处理液2为含0.5wt％DTT的0.05M、pH5.5的醋酸盐缓冲液；所述样品处理3为含1wt％碘乙酰胺的0.2M、pH5.0的MES缓冲液。
一些实施方案中，所述包被有叶酸衍生物的磁微粒悬浮液中磁微粒的粒径为0.1～10μm。一些具体实施例中，磁微粒的粒径为1μm。
一些实施方案中，所述叶酸衍生物由叶酸、明胶制得的偶联物。
一些实施方案中，所述酶标记的叶酸结合蛋白为辣根过氧化物酶标记的叶酸结合蛋白。
一些实施方案中，所述化学发光底物为包括A液和B液，其中A液为过氧化氢溶液，B液为鲁米诺溶液或鲁米诺衍生物溶液
本发明提供的试剂盒还包括叶酸校准品，所述叶酸校准品的浓度为0～20ng/ml。
本发明试剂盒检测原理为：样本中的叶酸与磁微粒上包被的叶酸衍生物竞争酶标记的叶酸结合蛋白，磁微粒上包被的叶酸衍生物与酶标记的叶酸结合蛋白结合形成复合物，该复合物催化化学发光底物发光，发光强度与样本中FA的含量成反比，从而定量分析待测样本中叶酸的含量。
本发明还提供一种利用所述叶酸检测试剂盒检测叶酸含量的方法，包括：
依次用样品处理液1、样品处理液2和样品处理液3处理待测样本，然后加入包被有叶酸衍生物的磁微粒混悬液和酶标记的叶酸结合蛋白，37℃温育34分钟后，对反应液进行磁分离，重复清洗5～6次，化学发光底物A液和B液后混匀，1～5分钟检测发光强度，获得叶酸含量。
本发明提供的叶酸检测试剂盒，包括：包被有叶酸衍生物的磁微粒混悬液，酶标记的叶酸结合蛋白，样品处理液，化学发光底物；所述样品处理液包括样品处理液1、样品处理液2和样品处理液3；所述样品处理液1为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；所述样品处理液2为含0.1～10wt％还原剂的pH4.5～6.5的缓冲液，所述还原剂为DTT、TCEP、美司钠、巯基乙醇、α-硫代甘油中的一种或多种；所述样品处理3为含0.1～10wt％中和剂的pH4.0～8.0的缓冲液。所述中和剂为谷胱甘肽、碘乙酰胺、碘酸钠、N-乙基丁烯二亚酰胺、连四硫酸钠、氯化苄、胱氨酸和对氯汞苯甲酸中的一种或多种。本发明试剂盒采用特定的样品处理液对待测样本进行处理，具有如下优势：
(1)样品处理液可温和地将叶酸与蛋白质分离开，检测过程中不会产生蛋白沉淀，也不会对辣根过氧化物酶造成破坏，检测结果精密度好，与罗氏试剂盒相关性良好，检测结果准确可靠；
(2)检测速度快，40分钟即可出结果；
(3)检测方法简单易操作、检测过程稳定、无放射性污染等，在没有磁场存在的情况下，磁性微粒悬浮在液体中，使得抗原抗体反应类似于均相反应，磁性微粒在外加磁场的作用下可方便地分离，洗涤快速。
(4)本发明试剂盒的分析内精密性在6％以内，天间精密性10％以内；和罗氏试剂盒相关性良好，相关系数r＝0.9503，相关性R2可达0.90。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例3中的定标曲线；
图2示本发明试剂盒和罗氏试剂的临床相关性分析图；
图3示对照试剂盒3和罗氏试剂的临床相关性分析图。
具体实施方式
本发明公开了一种叶酸试剂盒及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
本发明提供的叶酸检测试剂盒中所用材料或试剂均可由市场购得。其中，全自动磁微粒化学发光仪(AutoLumo A2000Plus)由郑州安图生物工程股份有限公司提供。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明试剂盒的制备
1、制备样本处理液1在1L去离子水中加入24g分析纯NaOH，搅拌均匀，放置2-8℃保存。
2、制备样本处理液2
在0.05M，pH5.5的醋酸缓冲液中加入0.5％DTT，搅拌均匀，放置2-8℃保存。
3、制备样品处理液3
在0.2M，PH5.0的MES缓冲液中加入1％碘乙酰胺，搅拌均匀，放置2-8℃保存。
4、制备包被有叶酸衍生物的磁微粒混悬液
将粒径为1μm的羧基化磁微粒原液充分混匀，取出适量进行磁分离，去除上清，加入0.05M，PH5.5的醋酸缓冲液进行重悬清洗，重复2次，加入交联剂EDC 10mg对磁微粒表面羧基进行活化，加入叶酸衍生物(叶酸-明胶)1μg进行偶联，室温震荡反应1h，磁分离，去除上清，用添加了1％鱼明胶的0.05M，PH7.0的磷酸盐缓冲液做为封保液进行封闭，放置2-8℃保存。
5、酶标记的叶酸结合蛋白
在0.02M，PH7.4的Tris-NaCl缓冲液中加入1％的BSA和0.1％P-300配制成稀释液1L，添加辣根过氧化物酶标记的叶酸结合蛋白1uL，混合均匀，放置2-8℃保存。
6、制备叶酸校准品
在0.02M，PH7.4的磷酸盐缓冲液中加入1％的Casein配制成稀释液1L，分成5等份，分别添加叶酸抗原配制成0ng/mL、1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的系列浓度，放置2-8℃保存。
实施例2本发明试剂盒的检测方法
(1)使用无添加普通管/分离胶管/促凝管采集全血5mL，于37℃静置30min，后用4000转/min的转速离心10min，取离心后的血清做为待测样本。(注：样本收集后在室温放置不可超过8小时，如果不在8小时内检测需将样本放置在2～8℃的冰箱中，若需48小时以上保存或运输，则应冻存于-20℃以下，避免反复冻融。使用前恢复到室温，轻轻摇动混匀)。
(2)将待测样本依次用样品处理液1、样品处理液2和样品处理液3进行处理，取150μl处理后的待测样本(或叶酸校准品)加入20μL磁微粒混悬液以及35μL酶结合物，于37℃温育34分钟，温育完成后，对反应液进行磁分离，使用清洗液进行清洗，重复5次，加入50μL化学发光底物A液和50μL化学发光底物B液，混匀，1～5分钟检测发光强度。
实施例3本发明试剂盒的性能检测
定标曲线：以校准品浓度值的log值为X轴，以校准品发光强度值的log值为Y轴，以四参数拟合方式进行计算，建立定标曲线，拟合的曲线如图1所示。
1、精密性
用同一个批号实施例1试剂盒分别检测高、低两种室内质控品(Q1、Q2)，要求重复测定4天，每天至少5次重复，根据四参数(lin-log)拟合标准曲线计算测量结果，再计算至少20次测量结果的平均值M和标准差SD，根据公式CV＝SD/M*100％得出变异系数CV。检测结果见下表1。
表1
Figure BDA0002323689450000071
从表1可以看出，本发明试剂盒的天间精密性在10％以内，精密度良好。
2、准确度
通过测定回收率来评估试剂盒的准确度
将已知浓度的高水平待测物(A)加入到低浓度血清B(B浓度应不高于A浓度的1/8)中，所加待测物A与血清B之间的体积比例不大于1：9，各重复检测3次，取平均值，根据式(1)计算出回收率，应在85.0％～115.0％范围内。
Figure BDA0002323689450000072
式中：R—回收率
C—向B液中加入A液后检测浓度均值
V0—B液体积
Vs—A液体积
C0—B液浓度均值
Cs—A液浓度
测量结果如下表：
表2回收率测定结果
Figure BDA0002323689450000081
以上结果可以看出，产品回收率为96.41％～105.72％，在85.0％～115.0％范围内，准确度良好。
2、本发明试剂盒和罗氏试剂的临床相关性
取500例待测样本，分别用本发明实施例1试剂盒与市售罗氏试剂盒进行检测，以本发明实施例1试剂盒的测试结果为横坐标自变量，以罗氏试剂盒测试结果为纵坐标应变量，做线性回归曲线，得回归方程为y＝0.9539x+0.1877，相关系数r＝0.9503，比较两种试剂盒的临床相关性，结果见图2。
由图2可知，本发明实施例1提供的试剂盒测定的叶酸含量与罗氏试剂盒测定的叶酸含量具有很好的相关性，测试结果可以有效作为临床检验。
实施例4
对照试剂盒1：样本处理液仅包含实施例1的样本处理液1，试剂盒中其他组分与实施例1相同。
对照试剂盒2：样本处理液仅包含实施例1的样本处理液2，试剂盒中其他组分与实施例1相同。
对照试剂盒3：样本处理液仅包含实施例1的样本处理液1和样本处理液2，试剂盒中其他组分与实施例1相同。
1、取10份待测样本，分别用实施例1试剂盒、对照试剂盒1和对照试剂盒2进行检测，结果见表3。
表3发光值检测结果
Figure BDA0002323689450000091
从表3发光值数据可以看出，仅使用样本处理液1的对照试剂盒1检测的发光值极低，仅使用样本处理液2的对照试剂盒2的检测发光值过高。
2、将本发明试剂盒、对照试剂盒3分别与罗氏试剂盒的检测结果进行相关性分析，以对照试剂盒3的测试结果为横坐标自变量，以罗氏试剂盒测试结果为纵坐标应变量，做线性回归曲线，得回归方程为y＝0.764x+4.2214，相关系数r＝0.8935比较两种试剂盒的临床相关性，结果见图3。
由图3可知，对照试剂盒3与罗氏试剂盒的相关性较差，明显不如本申请与罗氏试剂盒的相关性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种叶酸检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有叶酸衍生物的磁微粒混悬液，酶标记的叶酸结合蛋白，样品处理液，化学发光底物；
所述样品处理液包括样品处理液1、样品处理液2和样品处理液3；
所述样品处理液1为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液；所述样品处理液2为含0.1～10wt％还原剂的pH4.5～6.5的缓冲液，所述还原剂为DTT；所述样品处理3为含0.1～10wt％中和剂的pH4.0～8.0的缓冲液；所述中和剂为碘乙酰胺。
2.根据权利要求1所述的叶酸检测试剂盒，其特征在于，所述样品处理液1的浓度为0.3-0.6M。
3.根据权利要求1所述的叶酸检测试剂盒，其特征在于，所述样品处理液2中，缓冲液为醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的叶酸检测试剂盒，其特征在于，所述样品处理液3中，缓冲液为Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的叶酸检测试剂盒，其特征在于，所述包被有叶酸衍生物的磁微粒悬浮液中磁微粒的粒径为0.1～10μm。
6.根据权利要求1所述的叶酸检测试剂盒，其特征在于，所述叶酸衍生物由叶酸、明胶制得的偶联物。
7.根据权利要求1所述的叶酸检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记的叶酸结合蛋白为辣根过氧化物酶标记的叶酸结合蛋白。
8.根据权利要求1所述的叶酸检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为包括A液和B液，其中A液为过氧化氢溶液，B液为鲁米诺溶液或鲁米诺衍生物溶液。
9.根据权利要求1所述的叶酸检测试剂盒，其特征在于，还包括叶酸校准品，所述叶酸校准品的浓度为0～20ng/ml。
10.利用权利要求1～9任一项所述的叶酸检测试剂盒检测叶酸含量的方法，其特征在于，包括：
依次用样品处理液1、样品处理液2和样品处理液3处理待测样本，然后加入包被有叶酸衍生物的磁微粒混悬液和酶标记的叶酸结合蛋白，37℃温育34分钟后，对反应液进行磁分离，重复清洗5～6次，加入化学发光底物A液和B液后混匀，1～5分钟检测发光强度，获得叶酸含量。
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