CN113985039A - 一种叶酸检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及化学分析检测技术领域，公开一种用于检测叶酸的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒由M试剂、PT1试剂、PT2试剂、R1试剂、R2试剂组成；所述M试剂为含链霉亲和素磁微粒的缓冲液；所述PT1试剂为含还原剂的缓冲液；所述PT2试剂为含蛋白变性剂的水溶液；所述R1试剂为含生物素标记叶酸结合蛋白的缓冲液；所述R2试剂为含吖啶酯标记蝶酸的缓冲液。通过对样本处理液配方以及缓冲体系的优化，为样品中叶酸的解离和再结合提供温和的反应环境；有效消除样本处理过程中产生的不利影响，同时加快了叶酸分子的解离速度，有效缩短反应时间，避免叶酸分子因其结构的不稳定性造成的降解；检测结果精密度好，与罗氏试剂盒相关性好，检测结果准确度高。
Description
技术领域
本发明涉及医学分析技术领域，具体涉及一种叶酸检测试剂盒及检测方法。
技术背景
叶酸是一种重要的B族水溶性维生素，叶酸的结构是由一个蝶啶，通过一个亚甲基桥与对氨基苯甲酸相邻结成为蝶酸，再与谷氨酸结合而成。叶酸在蛋白质合成及细胞分裂与生长过程中具有重要作用，缺乏时可致红细胞中血红蛋白生成减少、细胞成熟受阻，导致巨幼红细胞贫血。因此叶酸检测具有重要的临床意义，准确而高效的叶酸检测手段显得极为重要。
但是，叶酸稳定性差，对其检测分析相当困难。叶酸属于光敏物质，样本在采集、转移和储存过程中需要特别注意环境温度以及避光条件，另外样本中的叶酸与蛋白相结合，检测需要经过解离方可进行下一步的操作。叶酸维持稳定最适宜的pH与和叶酸结合蛋白结合的最适pH存在差异，检测过程中的还原剂、解离剂都会干扰免疫反应和检测。直至今日对于叶酸的检测标准依然未能够达成共识。
发明内容
本发明实施例提供一种用于检测叶酸的试剂盒及其使用方法，解决了检测叶酸操作时步骤复杂，耗时长，干扰多的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明实施例采用的一个技术方案是：
第一方面本发明实施例提供一种用于检测叶酸的试剂盒，所述试剂盒由M试剂、PT1试剂、PT2试剂、R1试剂、R2试剂组成；其中，
所述M试剂为含链霉亲和素磁微粒的缓冲液，所述缓冲液为pH的范围在6.0～8.0的Tris缓冲液，缓冲液中含0.2％～1％的牛血清白蛋白、0.1％的叠氮钠和0.1％的吐温-20。
所述PT1试剂为含还原剂的缓冲液，所述缓冲液为pH的范围在4.0～6.0的柠檬酸钠缓冲液。
所述PT2试剂为含蛋白变性剂的水溶液，所述水溶液pH的范围在10.0～13.0。
所述R1试剂为含生物素标记叶酸结合蛋白的缓冲液，所述生物素标记叶酸结合蛋白为，使用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)通过共价键连接生物素和叶酸结合蛋白所形成的结合蛋白，表示为生物素-(PEG)n-叶酸结合蛋白；所述缓冲液为pH的范围在6.0～8.0的柠檬酸钠缓冲液，缓冲液中含0.2％～1％的牛血清白蛋白、0.1％的叠氮钠和0.1％的吐温-20。
所述R2试剂为含吖啶酯标记蝶酸的缓冲液，所述缓冲液为pH的范围在5.5～7.5的2-(N-吗啉代)乙磺酸(即MES缓冲液)，缓冲液中含0.2％～1％的牛血清白蛋白、0.1％的叠氮钠和0.1％的吐温-20。
可选地，所述链霉亲和素磁微粒为表面偶联链霉亲和素的亲水性磁微粒。
可选地，所述链霉亲和素磁微粒粒径为1.5～3μm。
可选地，每毫克链霉亲和素磁微粒可结合400～800pmol生物素-(PEG)n-叶酸结合蛋白；通过含链霉亲和素-生物素放大系统，可显著地提高试剂盒的灵敏度，同时使用聚乙二醇(PEG)通过共价连接生物素和叶酸结合蛋白，对叶酸结合蛋白进行化学修饰，可改变叶酸结合蛋白生物化学特性，包括分子大小，疏水性及电荷等，从而增加叶酸结合蛋白水溶性和稳定性。
可选地，所述缓冲液中链霉亲和素磁微粒浓度为200～600μg/mL。
可选地，所述PT1试剂的还原剂浓度为40～120g/L。
可选地，所述还原剂为二硫苏糖醇、2-巯基乙磺酸钠、抗坏血酸钠中的一种或多种组合。
可选地，所述PT2试剂的蛋白变性剂浓度为1～6mol/L。
可选地，所述变性剂为氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸钾、盐酸胍中的一种或多种组合水溶液。
可选地，所述生物素-(PEG)n-叶酸结合蛋白中，PEG的重复单元10～24个不等；在生物素-(PEG)n-叶酸结合蛋白中PEG的作用是，减少空间位组，避免生物素-(PEG)n-叶酸结合蛋白和磁珠上的链霉亲和素结合后，磁珠对叶酸结合蛋白产生影响，因为磁珠离叶酸结合蛋白太近，会影响其活性，进而影响叶酸结合蛋白与样品中叶酸或吖啶酯标记蝶酸的结合，因此，本发明实施例加入PEG把磁珠与叶酸结合蛋白的距离拉长，有效保护了叶酸结合蛋白；有效消除样本处理过程中产生的不利影响，同时加快了叶酸分子的解离速度，有效缩短反应时间，避免叶酸分子因其结构的不稳定性造成的降解，提高了反应的有效性和准确性。
可选地，所述生物素标记叶酸结合蛋白浓度为1～5μg/mL。
可选地，所述吖啶酯标记蝶酸的浓度为8～20ng/mL；吖啶酯是一类可用作化学发光标记物的化学物质；在全自动化学发光免疫分析仪中进行检测时，加入预激发液和激发液后吖啶酯被激发发光，从而依据发光信号强度和定标曲线定量分析待测样本中叶酸的含量。之所以采用吖啶酯标记蝶酸，是因为叶酸分子质量小且结构不稳定，用于标记吖啶酯工艺复杂；而采用吖啶酯标记蝶酸，工艺更为简单且标记后标记物稳定性更好；另外，相对于酶促反应体系中酶对反应的pH值的敏感程度，本发明中所用的吖啶酯，其对反应的pH值没那么敏感；从而可有效提高试剂盒的稳定性。
可以理解的是，本发明实施例采用直接化学发光分析法，有效降低了样本处理过程中产生对反应体系pH和电解质环境的影响，同时避免了样本中内源性物质对反应体系的干扰，反应结束后即可进行光信号检测，无需再进行孵育，缩短检测时长。
第二方面，本发明实施例提供一种检测叶酸的方法，应用如上所述的试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将血清样本加入反应杯中；
步骤2：在上述反应杯中加入PT1试剂和PT2试剂，混匀后进行孵育；
步骤3：在步骤2结束后，继续往反应杯中加入R1试剂和M试剂，混匀后进行孵育；
步骤4：在步骤3结束后，进行磁分离并使用清洗液清洗；
步骤5：在重复执行步骤4四次以后，继续往反应杯中加入R2试剂，混匀后进行孵育；
步骤6：在步骤5结束后，进行磁分离，磁分离后用清洗液清洗；
步骤7：在重复执行步骤6四次以后，向反应杯中加入预激发液和激发液并检测发光信号；
步骤8：根据所述发光信号和定标曲线，计算所述血清样本中的叶酸含量。
与现有技术相比，本发明实施例的有益效果为：通过对样本处理液配方以及缓冲体系的优化，缓冲液组合能为样品中叶酸的解离和再结合提供温和的反应环境；所选的试剂组合有效消除样本处理过程中产生的不利影响，同时加快了叶酸分子的解离速度，有效缩短反应时间，避免叶酸分子因其结构的不稳定性造成的降解；反应结束可立即进行光信号检测，无需再孵育，缩短检测时长。检测结果精密度好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明实施例提供的应用本发明实施例的叶酸检测试剂盒检测样品中叶酸的流程图；
图2是本发明实施例提供的发光强度与叶酸含量的定标曲线；
图3是本发明实施例提供的本发明试剂盒和罗氏试剂盒的临床相关性分析图；
图4是本发明实施例提供的本发明试剂盒和罗氏试剂盒的Bland-Altam一致性分析图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种用于检测叶酸的试剂盒，所述试剂盒包括：M试剂、PT1试剂、PT2试剂、R1试剂和R2试剂；
所述M试剂为含有链霉亲和素磁微粒的缓冲液，所述链霉亲和素磁微粒为表面偶联有链霉亲和素的亲水性磁微粒；
在一些实施例中，所述M试剂中的缓冲液为pH为7.4的Tris缓冲液，缓冲液含0.5％的牛血清白蛋白、0.1％的叠氮钠和0.1％的吐温-20。
在一些实施例中，所述链霉亲和素磁微粒粒径为1.5μm。
在一些实施例中，所述M试剂中的链霉亲和素磁微粒浓度为400μg/mL。
所述PT1试剂为含有还原剂的缓冲液；
在一些实施例中，所述PT1试剂的缓冲液为pH为5.5的柠檬酸钠缓冲液；
在一些实施例中，所述PT1试剂的还原剂为，80g/L二硫苏糖醇和20g/L抗坏血酸钠。
所述PT2试剂为含蛋白变性剂的水溶液；
在一些实施例中，所述PT2试剂的pH值为13.0；
在一些实施例中，所述PT2试剂的蛋白变性剂为1.2mol/L氢氧化钠和3mol/L盐酸胍。
所述R1试剂为含有生物素标记叶酸结合蛋白的缓冲液；
在一些实施例中，所述R1试剂的缓冲液为pH为7.2的柠檬酸钠缓冲液，缓冲液含1％的牛血清白蛋白、0.1％的叠氮钠和0.1％的吐温-20；
在一些实施例中，所述生物素标记叶酸结合蛋白为生物素-(PEG)12-叶酸结合蛋白，PEG的重复单元为12；
在一些实施例中，所述生物素标记叶酸结合蛋白浓度为2μg/mL；
在一些实施例中，每毫克所述链霉亲和素磁微粒可结合800pmol所述生物素标记叶酸结合蛋白；
所述R2试剂为含有吖啶酯标记蝶酸的缓冲液；
在一些实施例中，所述吖啶酯标记蝶酸的浓度为9.8ng/mL。
在一些施例中，所使用的缓冲液包括：M试剂中pH为7.4的Tris缓冲液，PT1试剂中pH为5.5的柠檬酸钠缓冲液，R1试剂中pH为7.2的柠檬酸钠缓冲液和R2试剂中pH为6的MES缓冲液。所用试剂中的缓冲液组合能为样品中叶酸的解离和再结合提供温和的反应环境，减少反应过程中对样品及反应试剂产生的不利影响。
本发明实施例还提供一种应用如上所述的试剂盒检测叶酸含量的方法。如图1所示，该方法包括以下步骤：
100、将50μL样本加入反应杯中；
101、在上述反应杯中加入25μLPT1试剂和25μL PT2试剂，混匀后进行孵育；
102、孵育结束后，继续往反应杯中加入50μL R1试剂和50μL M试剂，混匀后进行孵育；
103、孵育结束后，进行磁分离并使用清洗液清洗，重复磁分离和清洗，共4次；
104、继续往反应杯中加入100μL R2试剂，混匀后进行孵育；
105、孵育结束后，进行磁分离并使用清洗液清洗，重复磁分离和清洗，共4次；
106、磁分离和清洗结束后，向反应杯中加300μL入预激发液和300μL激发液并检测发光信号；
107、根据所述发光信号和定标曲线，计算所述血清样本中的叶酸含量。
可以理解的是，采用本发明实施例的试剂盒检测样本中叶酸的含量均通过全自动化学发光免疫分析仪(来源深圳市希莱恒医用电子有限公司)进行检测，其系统中包含清洗液、预激发液、激发液等试剂。
本发明实施例的试剂盒检测原理为：采用直接化学发光技术的竞争免疫检测，吖啶酯标记的蝶酸与样品中叶酸竞争反应生成的链霉亲和素磁微粒-生物素标记叶酸结合蛋白；样本经过预处理后，可释放出样本中内源性结合蛋白中的叶酸，然后与生物素标记叶酸结合蛋白和链霉亲和素磁微粒结合形成复合物，通过磁分离、清洗除去未结合的物质，再加入吖啶酯标记蝶酸试剂孵育反应，再通过磁分离、清洗除去未结合的吖啶酯标记蝶酸试剂。(如图1所示，在步骤102中，链霉亲和素磁微粒-生物素标记叶酸结合蛋白和叶酸结合，磁分离后，剩余未结合的链霉亲和素磁微粒-生物素标记叶酸结合蛋白在步骤105中继续和吖啶酯标记的蝶酸结合，由于叶酸结合蛋白的量是确定的，因此，血清样本中叶酸结合的链霉亲和素磁微粒-生物素标记叶酸结合蛋白越多，吖啶酯标记的蝶酸结合的就越少)在全自动化学发光免疫分析仪中进行检测时，加入预激发液和激发液后吖啶酯被激发发光，如图2所示，发光强度与样本中叶酸的含量成反比，从而依据发光信号强度和定标曲线定量分析待测样本中叶酸的含量。
通过对样本处理液配方以及缓冲体系的优化，缓冲液组合能为样品中叶酸的解离和再结合提供温和的反应环境；所选的试剂组合有效消除样本处理过程中产生的不利影响，同时加快了叶酸分子的解离速度，有效缩短反应时间，避免叶酸分子因其结构的不稳定性造成的降解；反应结束可立即进行光信号检测，无需再孵育，缩短检测时长。检测结果精密度好，与罗氏试剂盒相关性好，检测结果准确度高。
以下提供多个实施例以详细说明本发明实施例提供的叶酸含量检测试剂盒的检测效果和准确性。
实施例1：测量空白限与检出限:
空白限(limit of blank，LoB)：空白样本的系列结果中的最大值；检出限(limitof detection，LOD)：为某特定分析方法在给定的置信度内可从样品中检出待测物质的最小浓度或最小量。所谓“检出”是指定性检出，即判定样品中存有浓度高于空白的待测物质。。
根据CLSI文档EP17-A2中空白限和检出限的评估方法，对试剂盒空白限和检出限进行评估。选择5个空白样本和5个低浓度水平样本，每个样本进行4次重复测量，连续3天；空白样本：指不含检测物的样本；低浓度样本：指含检测物，浓度值范围为空白限的1-5倍的样本。表1列出了空白样本的测量结果，表2列出了低浓度水平样本的测量结果。
表1空白样本检测结果
表2低浓度水平样本检测结果
计算空白限：空白样本结果呈非正态分布，适用如下的非参数分析法计算空白限：
首先将数据由小到大排列。然后，依据排列好的数据估计第95百分位数所在位置为【60×(95/100)+0.5】的值，如果这个值为非整数则进行线性插入。
经计算得出本申请实施例的试剂盒的空白限LoB＝0.41ng/mL。
计算检出限：检出样本结果呈非正态分布，适用非参数分析法计算检出限，计算公式为：
LoD＝LoB+DS-β
其中，DS-β是低浓度水平样本测定中位数和第5百分位数值的间距。
经计算得出本申请实施例的试剂盒的检出限LoD＝0.69ng/mL。
实施例2：精密度分析
根据CLSI文档EP05-A3中精密度的评估方法，对试剂盒精密度进行评估。实验设计遵循经典的20×2×2设计：使用一个测量系统，测试20天，每天测试2批，每批测试2次，具体结果如以下表3所示。
表3精密度评估计算结果
如以上表3的精密度评估计算结果所示，本申请实施例提供的试剂盒具有≤6％CV的实验室内精密度。
实施例3：试剂盒和罗氏试剂盒的相关性分析
罗氏叶酸检测试剂盒(在本申请中简称为罗氏试剂盒)是目前用于检测叶酸的主流方法之一，但是其价格较高。。
以下将本发明实施例的一种叶酸检测试剂盒作为考核试剂，与罗氏试剂盒作对比，采用电化学发光法同时对200例血清样本进行检测，两者的比对结果如下：
回归分析
以对照试剂为自变量X，考核试剂为应变量Y，计算简单线性回归方程，并计算回归系数b和截距a的标准误和置信区间，并进行检验，建立假设：
回归模型F检验和回归系数b的t检验(检验意义相同)：
H0：两种试剂无直线关系，H1：两种试剂直线关系成立，α＝0.05。
截距a的t检验：
H0：截距与0值无显著性差异，H1：截距与0值有显著性差异，α＝0.05。
计算结果如下：
表4数据直线回归分析结果
散点图，以对照试剂为自变量(X)，考核试剂为应变量(Y)，散点图见图3。
从表4和图3中可以看出，回归方程为Y＝0.9945X-0.0082，斜率b＝0.9945(95％置信区间0.9847～1.0044)，P<0.05，拒绝H0，接受H1，即两种试剂直线关系成立，检测结果不存在比例差异。截距a＝-0.0082(95％置信区间-0.1274～0.1111)，P>＝0.05,拒绝H1，接受H0，即截距与0值无显著性差异，检测结果不存在系统差异。
实施例4：本发明试剂盒和罗氏试剂盒的Bland-Altam一致性分析
Bland-Altman图是一种一致性测量的可视化展示方法。Bland-Altman图的横坐标为两种方法的平均值，纵坐标为两种方法的差值。其将测量数据经过相关计算后，用散点展示出来，如果说散点在可信区间范围内(一般是差值的1.96个标准差范围内)，那么就说明数据具有较好的一致性水平。
以对照试剂和考核试剂配对检测均值为横度坐标，检测差值为纵坐标，进行分析和作图，结果如下：
表5Bland-Altam分析基本数据
| 编号 | 计算值 |
| 差值均值 | 0.062 |
| 差值标准差 | 0.494 |
| 95％界值 | -0.906～1.030 |
| 界外点数(比率) | 9(4.50％) |
如表5和图4所示，经Bland-Altman图解分析，95.5％的点落在均值±1.96SD范围内，说明采用考核试剂检测血清样本的检测结果与对照试剂的检测结果具有一致性。
本发明实施例的有益效果为：通过对样本处理液配方以及缓冲体系的优化，缓冲液组合能为样品中叶酸的解离和再结合提供温和的反应环境；所选的试剂组合有效消除样本处理过程中产生的不利影响，同时加快了叶酸分子的解离速度，有效缩短反应时间，避免叶酸分子因其结构的不稳定性造成的降解；反应结束即可进行光信号检测，无需再孵育，缩短检测时长。
一致性分析结果显示，本申请实施例提供的试剂盒与罗氏试剂盒之间的相关性好，检测结果相近，显示本申请实施例提供的试剂盒具有检测结果精密度好，检测结果准确度高的特点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于检测叶酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：M试剂、PT1试剂、PT2试剂、R1试剂和R2试剂；
所述M试剂为含有链霉亲和素磁微粒的缓冲液；
所述PT1试剂为含有还原剂的缓冲液；
所述PT2试剂为含有蛋白变性剂的水溶液，所述PT2试剂pH的范围在10.0～13.0；
所述R1试剂为含有生物素标记叶酸结合蛋白的缓冲液；
所述R2试剂为含有吖啶酯标记蝶酸的缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述M试剂中的链霉亲和素磁微粒为表面偶联有链霉亲和素的亲水性磁微粒，所述亲水性磁微粒的粒径为1.5～3μm。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述M试剂中的缓冲液为pH的范围在6.0～8.0的Tris缓冲液，所述M试剂中的链霉亲和素磁微粒浓度为200～600μg/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PT1试剂中的缓冲液为pH的范围在4.0～6.0的柠檬酸钠缓冲液，所述PT1试剂中的还原剂选自二硫苏糖醇、2-巯基乙磺酸钠、抗坏血酸钠中的一种或多种，所述PT1试剂中的还原剂浓度为40～120g/L。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白变性剂选自氢氧化钠、氢氧化钾、磷酸钾、盐酸胍中的一种或多种，所述蛋白变性剂浓度为1～6mol/L。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中的缓冲液为pH的范围在6.0～8.0的柠檬酸钠缓冲液，
所述R1试剂中的生物素标记叶酸结合蛋白为：使用聚乙二醇通过共价键连接生物素和叶酸结合蛋白所形成的结合蛋白。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记叶酸结合蛋白的浓度为1～5μg/mL，其中，所述生物素标记叶酸结合蛋白之中，聚乙二醇的重复单元数量为10～24个。
8.根据权利要求2或7所述的试剂盒，其特征在于，每毫克所述链霉亲和素磁微粒可结合400～800pmol所述生物素标记叶酸结合蛋白。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中的缓冲液为pH的范围在5.5～7.5的2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液，所述吖啶酯标记蝶酸浓度为8～20ng/mL。
10.一种检测叶酸的方法，应用如权利要求1-9任一项权利要求所述的试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将血清样本加入反应杯中；
步骤2：在上述反应杯中加入PT1试剂和PT2试剂，混匀后进行孵育；
步骤3：在步骤2结束后，继续往反应杯中加入R1试剂和M试剂，混匀后进行孵育；
步骤4：在步骤3结束后，进行磁分离并使用清洗液清洗；
步骤5：在重复执行步骤4四次以后，继续往反应杯中加入R2试剂，混匀后进行孵育；
步骤6：在步骤5结束后，进行磁分离，磁分离后用清洗液清洗；
步骤7：在重复执行步骤6四次以后，向反应杯中加入预激发液和激发液并检测发光信号；
步骤8：根据所述发光信号和定标曲线，计算所述血清样本中的叶酸含量。
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