CN115656153A - 一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学检测技术领域,公开了一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒。所述检测试剂盒包括包被细胞核成分抗原的磁性微球反应液、吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的抗体和发光底物;所述细胞核成分抗原为JO‑1、SCL‑70、PO、核小体、Cenp‑B、PM‑SCL、Sm、M2、SSA、组蛋白、RNP、RO‑52、RO‑60、dsDNA、SSB、PCNA中的至少一种。本发明的试剂盒采用吖啶酯化学发光体系,具有体系简单、激发液成本低,检测灵敏度高、稳定性好的优势,并采用特定的生物素‑聚乙二醇‑活性酯标记抗原及特定组成的样本稀释液,进一步提高检测准确性、灵敏度和稳定性。
Description
技术领域
本发明属于医学检测技术领域,具体涉及一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒。
背景技术
自身免疫性疾病(Autoimmune Diseases)是由于机体免疫系统对自身存在的抗原发生免疫反应,进而导致自身器官组织损害的一类疾病。其发病过程涉及自身抗原的暴露、机体促炎症的微环境、先天免疫系统的激活、抗原呈递反应激活获得性免疫系统、T细胞的激活以及B细胞释放出大量抗自身抗体等等病理机制。
正常情况下免疫系统只对侵入机体的外来物,如细菌、病毒、寄生虫以及移植物等产生反应,消灭或排斥这些异物。在某些因素影响下,机体的组织成份或免疫系统本身出现了某些异常,致使免疫系统误将自身成份当成外来物来攻击。这时候免疫系统会产生针对机体自身一些成份的抗体及活性淋巴细胞,损害破坏自身组织脏器,导致疾病。如果不加以及时有效的控制,其后果十分严重,最终甚至危害生命。在目前自身免疫疾病发病机理不清楚的情况下,最好办法就是早期发现、早期诊断与早期治疗,这是提高自身免疫疾病疗效的关键。
虽然不同的自身免疫疾病各有其特殊的临床表现和诊断标准,但其常具有一个共同特征就是患者的血清中常可以检测出高滴度的自身抗体或能与自身组织成分起反应的致敏淋巴细胞,其中常通过检测血清中抗核抗体(anti-nucleic antibody,ANA)来诊断自身免疫疾病。抗核抗体是以真核细胞的核成分为靶抗原的自身抗体的总称。所用混合抗原中,JO-1、SCL-70、PO、核小体、Cenp-B、PM-SCL、Sm、M2、SSA、组蛋白、RNP、RO-52、RO-60、dsDNA、SSB、PCNA等是常见抗核抗体的靶成分。
化学发光免疫分析技术(CLIA)具有自动化程度高、检测速度快、灵敏度高和特异性好的优势。CLIA根据发光分子的不同,可以分为金刚烷体系、鲁米诺体系、异鲁米诺体系、钌联吡啶体系以及吖啶酯体系等。鲁米诺、金刚烷体系由于有酶的参与,易受环境pH值、温度等因素影响;钌联吡啶电化学发光体系对仪器设备的性能要求较高,对清洗条件要求苛刻;异鲁米诺较鲁米诺发光体系发光效率低;吖啶酯化学发光体系与其它化学发光体系比较,具有背景低、标记工艺简单、标记后光量子产率不减少、发光时间短、稳定性好等优点,目前广泛应用于体外诊断技术当中。
链霉亲和素是由链霉菌分泌的一种蛋白质,它能与生物素发生特异性结合,它们之间的结合力是目前已知的最强的非共价键结合力。因为这一特性,链霉亲和素-生物素反应体系在纯化和检测领域得到了广泛的应用。
专利CN102565405A公开了一种用吖啶酯标记技术结合通用型磁颗粒进行免疫学检测的方法。以吖啶酯或吖啶磺酰胺类物质标记检测抗原或抗体,以生物素标记捕获抗原或抗体,结合通用的(链酶)亲和素标记磁颗粒,进行生物分子的免疫学测定,具有灵敏度高、检测范围宽、易于实现自动化的优点。专利CN110146692A公开了一种基于吖啶酯化学发光、链霉亲和素磁珠-生物素放大反应体系的检测试剂盒。该试剂盒的反应体系包括:吖啶酯标记的抗体或抗原、生物素标记的抗体或抗原、链霉亲和素包被带有羧基或者Tosyl官能团的磁珠。该发明通过采用不同粒径的磁珠共混或者添加链霉亲和素的方法以及将生物素标记物与链霉亲和素磁珠预混三种方案解决了免疫试剂生物素干扰的问题。
常用的胺反应性的生物素化试剂有NHS-biotin、NHS-LC-biotin、Sulfo-NHS-LC-biotin等。其中Sulfo-NHS-LC-biotin相比NHS-biotin和NHS-LC-biotin具有更好的与蛋白分子的结合力及水溶性,因此广泛用于抗原或抗体的标记。但对于抗核抗体检测的靶成分抗原,Sulfo-NHS-LC-biotin存在易破坏抗原结构的缺陷,导致检测准确性、灵敏度和重复性的降低。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处,本发明的目的在于提供一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供上述检测试剂盒的制备方法。
本发明目的通过以下技术方案实现:
一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒,包括包被细胞核成分抗原的磁性微球反应液、吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的抗体和发光底物;所述细胞核成分抗原为JO-1、SCL-70、PO、核小体、Cenp-B、PM-SCL、Sm、M2、SSA、组蛋白、RNP、RO-52、RO-60、dsDNA、SSB、PCNA中的至少一种;
所述包被细胞核成分抗原的磁性微球反应液通过如下方法制备得到:
(1)抗原的生物素标记:将生物素-聚乙二醇-活性酯(Biotin-PEG-NHS)与抗原溶液混合孵育,得到生物素标记的抗原溶液;
(2)将步骤(1)所得生物素标记的抗原溶液与链霉亲和素磁性微球溶液混合孵育,得到包被细胞核成分抗原的磁性微球反应液。
进一步地,所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的抗体是指吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体。其通过如下方法制备得到:
将吖啶酯或吖啶磺酰胺与羊抗人IgG抗体在磷酸盐缓冲溶液中混合孵育,得到吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的抗体。
进一步地,所述发光底物由NaOH溶液(A液)和H2O2溶液(B液)组成。优选地,所述NaOH溶液的浓度为0.05~0.25mol/L,所述H2O2溶液的浓度为0.05~0.2mol/L。
进一步地,所述试剂盒还包括样本稀释液,所述样本稀释液为含有牛血清白蛋白(BSA)和聚醚改性聚硅氧烷的Tris缓冲液。
进一步优选地,所述样本稀释液中BSA的质量浓度为1%~2%;所述聚醚改性聚硅氧烷的质量浓度为1%~2%。
进一步地,所述试剂盒还包括阳性校准液;所述阳性校准液为含有抗核抗体的阳性混合血清。
进一步地,步骤(1)中所述Biotin-PEG-NHS的重均分子量(Mw)为500~5000。
进一步地,步骤(1)中所述Biotin-PEG-NHS与抗原混合的摩尔比为1~5:1。
进一步地,步骤(2)中所述链霉亲和素磁性微球的粒径为0.05~1μm。
进一步地,步骤(2)中所述生物素标记的抗原与链霉亲和素磁性微球混合孵育的质量比为1:2~2:1。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
(1)本发明的抗核抗体谱检测试剂盒采用吖啶酯化学发光体系,具有体系简单、激发液成本低,检测灵敏度高、稳定性好的优势。
(2)本发明采用特定的生物素-聚乙二醇-活性酯标记抗原,相比Sulfo-NHS-LC-biotin标记的抗原,在本发明的检测体系中可以显著提高检测准确度、灵敏度和重复性。
(3)本发明通过在样本稀释液中加入一定量聚醚改性聚硅氧烷,相比现有常规表面活性剂,具有一定的降黏和消泡效果,在本发明的检测体系中经验证可以显著提高试剂储存稳定性和检测准确度。
附图说明
图1为本发明实施例的检测试剂盒的标准曲线图。
图2为本发明实施例的检测试剂盒的线性范围曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例的一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒,通过如下方法制备得到:
(1)包被细胞核成分抗原的磁性微球反应液的制备:
将生物素-聚乙二醇-活性酯Biotin-PEG4-NHS分别与抗原JO-1、SCL-70、PO、核小体、Cenp-B、PM-SCL、Sm、M2、SSA、组蛋白、RNP、RO-52、RO-60、dsDNA、SSB、PCNA磷酸盐缓冲溶液混合孵育,Biotin-PEG4-NHS与抗原混合的摩尔比为2:1,纯化后得到生物素标记的抗原溶液;然后将所得生物素标记的抗原溶液分别与链霉亲和素磁性微球溶液(超顺磁性Dynabeads链霉亲和素磁珠,平均粒径为0.5μm)按质量比为1:2混合孵育,洗涤后磁分离,重悬于Tris缓冲液中,得到包被细胞核成分抗原的磁性微球反应液。
(2)吖啶酯标记抗体的制备:
将吖啶酯(NSP-SA-NHS)与羊抗人IgG抗体在磷酸盐缓冲溶液中混合孵育,纯化后得到吖啶酯标记的IgG抗体。
(3)将步骤(1)所得磁性微球反应液、步骤(2)所得吖啶酯标记抗体,发光底物A液0.1mol/LNaOH溶液、B液0.1mol/LH2O2溶液,样本稀释液(含有1%wt.BSA和1%wt.聚醚改性聚硅氧烷Tris缓冲液)和含有不同抗核抗体的阳性混合血清校准液分别置于试剂盘的微孔中封装,得到基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒。
采用本实施例的检测试剂盒对待测样品进行检测,具体步骤为:
(1)将阳性混合血清校准液采用样本稀释液稀释至一定浓度梯度,然后分别与试剂盒中的包被细胞核成分抗原的磁性微球反应液混合孵育,磁分离并洗涤除去未结合的抗体及杂质;然后加入吖啶酯标记抗体混合孵育,磁分离并洗涤除去未结合的抗体及杂质,再依次加入发光底物A液和B液,测定阳性校准液在不同浓度下的相对发光强度后绘制标准曲线。
(2)取待测的人血清样本采用样本稀释液稀释,然后按步骤(1)的方法测试样本的相对发光强度,根据相应抗体标准曲线计算样本中抗体浓度。
一、标准曲线及线性范围:本实施例的检测试剂盒的标准曲线如图1所示。取接近线性范围上限的高值样本用样本稀释液倍比稀释配制成不同浓度梯度的样本系列,以测值与预期值拟合线性回归方程,计算线性回归相关系数R,结果见图2。
二、准确度:用试剂盒测定两个不同浓度的质控血清,重复测定3次,分别计算相对偏差(B),相对偏差应不超过±10%,结果见表1。
表1
三、重复性:用同一批号试剂盒对两个不同浓度的临床标本或质控血清连续进行10次测定,计算测量值的平均值(M)和标准差(SD),根据式(1)计算其变异系数CV,结果见表2。
CV=SD/M×100%……………………………………………(1)
式中:
CV—变异系数
SD—10次测量结果的标准差
M—10次测量结果的平均值
表2
样本 | 平均值M | 标准差SD | CV |
1 | 134.96 | 0.39 | 0.29% |
2 | 28.8 | 0.68 | 2.4% |
四、储存稳定性:将试剂放置于2-8℃下,分别于3/6/9/12/15个月测试质控品,并将测定结果与第0月测定结果进行比较,结果见表3。
表3
月 | 0 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 |
质控品1(RU/ml) | 10.0 | 9.8 | 9.7 | 9.9 | 10.1 | 9.9 |
偏差% | -2.00 | -1.02 | 2.06 | 2.02 | -1.98 | |
质控品2(RU/ml) | 220.0 | 218.5 | 215.8 | 221.8 | 222.5 | 223.4 |
偏差% | -0.68 | -1.24 | 2.78 | 0.32 | 0.40 |
对比例1
本对比例与实施例1相比,采用Sulfo-NHS-LC-biotin替代Biotin-PEG4-NHS,其余相同。
按照实施例1的方法进行准确度和重复性测试,结果分别如下表4和表5所示。
表4.准确度测试结果
T1 | T2 | T3 | 靶值 | B1 | B2 | B3 |
11.3 | 11.6 | 8.8 | 10 | 13% | 16% | -12% |
238.6 | 205.8 | 236.2 | 220 | 8.45% | -6.45% | 7.36% |
通过表4与表1的对比结果可以看出,在本发明的吖啶酯化学发光检测体系下,采用Biotin-PEG4-NHS标记抗原相比Sulfo-NHS-LC-biotin标记的抗原,可以显著提高检测准确度。且可以看出在低浓度靶值下,对检测准确度的提高作用更为显著。
表5.重复性测试结果
样本 | 平均值M | 标准差SD | CV |
1 | 142.65 | 6.16 | 4.32% |
2 | 37.5 | 4.42 | 11.8% |
通过表5与表2的对比结果可以看出,在本发明的吖啶酯化学发光检测体系下,采用Biotin-PEG4-NHS标记抗原相比Sulfo-NHS-LC-biotin标记的抗原,可以显著提高检测重复性。
对比例2
本对比例与实施例1相比,样本稀释液中采用常规表面活性剂OP-10替代聚醚改性聚硅氧烷(含有1%wt.BSA和1%wt.OP-10的Tris缓冲液),其余相同。
按照实施例1的方法进行储存稳定性测试,结果如下表6所示。
表6.储存稳定性测试结果
对比例3
本对比例与实施例1相比,样本稀释液中不加入表面活性剂(含有1%wt.BSA的Tris缓冲液),其余相同。
按照实施例1的方法进行储存稳定性测试,结果如下表7所示。
表7.储存稳定性测试结果
月 | 0 | 3 | 6 | 9 | 12 | 15 |
质控品1(RU/ml) | 10.0 | 9.4 | 8.3 | 7.9 | 7.7 | 7.6 |
偏差% | -6.00 | -11.70 | -4.82 | -2.53 | -1.30 | |
质控品2(RU/ml) | 220.0 | 208.5 | 182.4 | 168.2 | 160.7 | 157.1 |
偏差% | -5.23 | -12.52 | -7.79 | -4.46 | -2.24 |
通过表6~7与表3的对比结果可以看出,本发明通过在样本稀释液中加入一定量聚醚改性聚硅氧烷,相比不加入表面活性剂及现有常规表面活性剂,可以显著提高试剂的储存稳定性和检测准确性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒,其特征在于,包括包被细胞核成分抗原的磁性微球反应液、吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的抗体和发光底物;所述细胞核成分抗原为JO-1、SCL-70、PO、核小体、Cenp-B、PM-SCL、Sm、M2、SSA、组蛋白、RNP、RO-52、RO-60、dsDNA、SSB、PCNA中的至少一种;
所述包被细胞核成分抗原的磁性微球反应液通过如下方法制备得到:
(1)抗原的生物素标记:将Biotin-PEG-NHS与抗原溶液混合孵育,得到生物素标记的抗原溶液;
(2)将步骤(1)所得生物素标记的抗原溶液与链霉亲和素磁性微球溶液混合孵育,得到包被细胞核成分抗原的磁性微球反应液。
2.根据权利要求1所述的一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒,其特征在于,所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的抗体是指吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的羊抗人IgG抗体,其通过如下方法制备得到:
将吖啶酯或吖啶磺酰胺与羊抗人IgG抗体在磷酸盐缓冲溶液中混合孵育,得到吖啶酯或吖啶磺酰胺标记的抗体。
3.根据权利要求1所述的一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒,其特征在于,所述发光底物由NaOH溶液和H2O2溶液组成;所述NaOH溶液的浓度为0.05~0.25mol/L,所述H2O2溶液的浓度为0.05~0.2mol/L。
4.根据权利要求1所述的一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括样本稀释液,所述样本稀释液为含有BSA和聚醚改性聚硅氧烷的Tris缓冲液;所述样本稀释液中BSA的质量浓度为1%~2%;所述聚醚改性聚硅氧烷的质量浓度为1%~2%。
5.根据权利要求1所述的一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阳性校准液;所述阳性校准液为含有抗核抗体的阳性混合血清。
6.根据权利要求1所述的一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒,其特征在于,步骤(1)中所述Biotin-PEG-NHS的重均分子量Mw为500~5000。
7.根据权利要求1所述的一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒,其特征在于,步骤(1)中所述Biotin-PEG-NHS与抗原混合的摩尔比为1~5:1。
8.根据权利要求1所述的一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒,其特征在于,步骤(2)中所述链霉亲和素磁性微球的粒径为0.05~1μm。
9.根据权利要求1所述的一种基于吖啶酯化学发光的抗核抗体谱检测试剂盒,其特征在于,步骤(2)中所述生物素标记的抗原与链霉亲和素磁性微球混合孵育的质量比为1:2~2:1。
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