CN116908433B - 一种nexn化学发光检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种NEXN化学发光检测试剂盒及其应用。本发明的试剂盒包括第一试剂和第二试剂；其中，所述第一试剂包含缓冲液A、磁珠和生物素酯标记的兔抗NEXN多克隆一抗；所述第二试剂包含缓冲液B、化学发光物标记的兔抗NEXN多克隆二抗。采用本发明的试剂盒进行检测，其灵敏度高、特异性好(与类似物的交叉反应率≤0.45％)，且精密度高，批间和批内CV值均小于5％，此外，本发明的NEXN化学发光检测试剂盒制备成本低、操作简便、快速，更易于推广，可用于心血管疾病的早期诊断和监测。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域，尤其是涉及一种NEXN化学发光检测试剂盒及其应用。
背景技术
心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是一种发病率和死亡率极高的疾病，其严重危害人类健康。心血管疾病的病理基础是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)。AS形成的特征在于血管内有由脂肪、胆固醇、钙和纤维蛋白等物质组成的斑块。当斑块堆积会造成动脉腔隙变窄甚至堵塞、脱落，使动脉供应的组织器官缺血、坏死，从而导致冠心病、心绞痛和中风等。
丝状肌动蛋白结合蛋白(nexilin F-actin binding protein，NEXN)在人体主要分布在骨骼肌中，在心肌中主要对心肌细胞的信号转导中心起稳定作用。NEXN不仅调控肌动蛋白细胞骨架在细胞收缩性、运动性和分裂等方面的功能，还影响细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用。研究表明NEXN基因突变与人类扩张型心肌病和肥厚型心肌病有关。此外，有研究证实NEXN是一种新型的冠状动脉疾病易感基因，表明其突变与冠状动脉疾病相关。
心血管疾病如动脉粥样硬化的识别诊断主要借助于影像学检查，如OCT、MRI、PET等，由于血管不断移动，成像质量不稳定，会影响诊断结果的准确性。AS的临床症状主要决定于血管病变及受累器官的缺血程度，早期诊断困难。当冠状动脉粥样硬化管径狭窄达75％以上，则可发生心绞痛、心肌梗塞、心律失常，甚至猝死，发病后极为凶险，预后不良。因此，现在亟待找寻一种具有特异性且准确的AS早期临床诊断方法。
目前，AS的专利有相关的RNA(miRNA等)诊断标志物的专利，其使用PCR方法进行检查，但是诊断不敏感且实验过程复杂。随着越来越多的研究表明NEXN可用于对患者心血管疾病进行早期诊断，将NEXN与其他心血管疾病标志物联检，还可提高诊断AS的敏感性和特异性。然而，临床上用于测定血液中NEXN蛋白的方法有限，其中ELISA法实验过程受影响的因素很多，容易造成结果失真，且重复性差。
因此，仍需寻求一种具有更高灵敏度、特异度，且检测时间短、测量线性范围宽、稳定性好的NEXN蛋白检测方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种NEXN化学发光检测试剂盒及其应用，其能够特异性检测NEXN蛋白的含量，且检测灵敏性高、稳定性好。
本发明还提出一种上述NEXN化学发光检测试剂盒在检测人血清或血浆中NEXN蛋白中的应用。
本发明的第一方面，提供一种NEXN化学发光检测试剂盒，所述试剂盒包括第一试剂和第二试剂；
其中，所述第一试剂包含缓冲液A、磁珠和生物素酯标记的兔抗NEXN多克隆一抗；
所述第二试剂包含缓冲液B、化学发光物标记的兔抗NEXN多克隆二抗。
在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液A和所述缓冲液B独立选自Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液中一种。
在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液A的浓度为0.05～0.2M。
在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液B的浓度为0.01～0.1M。
在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液A为Tris-HCl缓冲液；所述缓冲液B为PBS缓冲液。
在本发明的一些实施方式中，所述磁珠为链霉亲和素磁珠。
在本发明的一些实施方式中，所述第一试剂中所述磁珠的终浓度为0.2mg/mL～0.8mg/mL。
在本发明的一些实施方式中，所述化学发光物选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述生物素酯为生物素聚乙二醇活性酯，其结构式如式(I)所示：
其中，n为2、3或4。
在本发明的一些实施方式中，所述生物素聚乙二醇活性酯的结构式如式(II)所示：
本发明发现采用生物素聚乙二醇活性酯标记兔抗NEXN多克隆一抗，其相对于传统的生物素酯标记，空间臂长更长，能够有效改善空间位阻效应，有助于提高抗体蛋白在水中的溶解性和检测试剂的灵敏性。
在本发明的一些实施方式中，所述第一试剂和/或所述第二试剂中还包含蛋白保护剂、表面活性剂、防腐剂和糖。
在本发明的一些实施方式中，所述蛋白保护剂选自牛血清白蛋白和酪蛋白中的至少一种；
和/或，所述表面活性剂选自TX-100和Tween-20中的至少一种；
和/或，所述防腐剂选自PC-300、PC-950、叠氮钠中的至少一种；
和/或，所述糖选自蔗糖和海藻糖中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，在所述第一试剂和/或所述第二试剂中，所述蛋白保护剂的终浓度为5g/L～20g/L，所述表面活性剂的终浓度为0.1mL/L-1mL/L，所述防腐剂的终浓度为0.1mL/L～0.5mL/L。
在本发明的一些实施方式中，所述第一试剂包含0.05M～0.2M Tris-HCl缓冲液、0.5g/L～5g/L牛血清白蛋白(BSA)、0.5g/L～5g/L蔗糖、0.01mL/L～1mL/L Tween-20、0.1mL/L～0.5mL/L Proclin950、0.2mg/mL～0.8mg/mL链霉亲和素磁珠和2μg/mL～12μg/mL生物素聚乙二醇活性酯标记的兔抗NEXN多克隆一抗。
在本发明的一些实施方式中，所述第二试剂包含0.01M～0.1M PBS缓冲液、0.1g/L～2g/L酪蛋白、0.5g/L～5g/L海藻糖、0.01mL/L～1mL/L Tween-20、0.1mL/L～0.5mL/LProclin950、1μg/mL～5μg/mL化学发光物标记的兔抗NEXN多克隆二抗。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括标准品、质控品、化学发光底物液、分析缓冲液和浓缩洗涤液。
在本发明的一些实施方式中，所述标准品包括0.01M～0.1M PBS缓冲液、0.1g/L～2g/L酪蛋白、0.5g/L～5g/L海藻糖、0.01mL/L～1mL/L Tween-20、0.1mL/L～0.5mL/LProclin950和0.5ng/mL～200ng/mL NEXN重组抗原。
在本发明的一些实施方式中，所述化学发光底物液为3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷或鲁米诺。
在本发明的一些实施方式中，所述分析缓冲液包括pH值为7.2～7.4的10mmol/LPBST缓冲液、0.5g/L～1.5g/L BSA和0.1mL/L～0.2mL/L Proclin300。
在本发明的一些实施方式中，所述浓缩洗涤液包括pH值为7.2～7.4的20mmol/LPBS缓冲液和0.5mL/L～1.5mL/L Tween-20。
本发明的第二方面，提供了本发明第一方面的NEXN化学发光检测试剂盒在检测人血清或血浆中NEXN蛋白中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述NEXN化学发光检测试剂盒用于非诊断和治疗目的。
根据本发明实施例的NEXN化学发光检测试剂盒及其应用，至少具有如下有益效果：
(1)采用本发明的NEXN化学发光检测试剂盒进行检测，其灵敏度高、准确度好，并且特异性好，与类似物的交叉反应率≤0.45％。
(2)本发明的NEXN化学发光检测试剂盒稳定性好，无需低温保藏，在常温下保存不会对影响检测结果的准确性。
(3)在本发明的NEXN化学发光检测试剂盒采用了生物素聚乙二醇活性酯标记兔抗NEXN多克隆一抗，其相对于传统的生物素酯标记，由于聚乙二醇的引入，使得其空间臂长更长，能够有效改善空间位阻效应，有助于提高抗体蛋白在水中的溶解性和检测试剂的灵敏性。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明NEXN化学发光检测试剂盒制备的技术路线图。
图2为本发明试剂盒的标准品的标准曲线图。
图3为采用本发明试剂盒检测的血浆NEXN蛋白的浓度结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
检测原理
本发明的化学发光试剂盒采用磁微粒和化学发光技术，按照双抗体夹心法进行免疫检测，定量测定受试者血清或血浆中NEXN的浓度。本发明的试剂盒的制备技术路线图如图1所示，具体检测原理如下：
首先通过将包被NEXN抗体的磁微粒、样本和吖啶酯标记的兔抗NEXN混匀后孵育，形成双抗体夹心复合物，然后通过洗涤将未被结合的物质被去除，并加入底物液，使其发生化学发光反应，最后测量相对发光值(RLU)，相对发光值与样本中的NEXN浓度呈正比关系。
样本中NEXN活性(mg/L)＝CS×ΔAT/ΔAS(mg/L)；
式中：ΔAT以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值，ΔAS以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值，CS校准液中NEXN的浓度。
实施例1：NEXN化学发光检测试剂盒的制备
本发明实施例的NEXN化学发光检测试剂盒包括校准品和质控品、包被载体、吖啶酯标记物、化学发光底物液、分析缓冲液、浓缩洗涤液。
一、制备NEXN校准品和质控品
用20mmol/L PBS缓冲液(pH为7.4)与胎牛血清按体积比3:1比例混合配制成基础缓冲液，然后用基础缓冲液将NEXN重组抗原稀释成浓度为100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、10ng/mL、2ng/mL、0.5ng/mL、0ng/mL的校准品，并绘制标准曲线，具体如图2所示。
用基础缓冲液将NEXN重组抗原稀释成浓度为30ng/mL作为高值质控品，用标准品缓冲液将NEXN重组抗原稀释成浓度为3ng/mL作为低值质控品，其中高低值质控品的浓度测定范围为30±4.5ng/mL，低值质控品的浓度测定范围为3±0.45ng/mL。
在本发明具体实施方式中，标准品或质控品用缓冲液中的PBS缓冲液可以替换为Tris-HCl、MES、HEPES，其浓度范围优选为0.01～0.1M。
二、包被载体的制备
1、生物素化抗体制备
Nexn结合蛋白(NEXN)多克隆抗体(兔抗)与生物素聚乙二醇活性酯(2.5mM)室温反应30min，加入1M Tris室温反应10min，终止反应，用0.02M PBS缓冲液(pH7.4)透析过夜，透析完成后加入等体积甘油混匀，即得生物素化抗体，置于-10℃～-25℃保存。
在本实施例中，生物素聚乙二醇活性酯的结构式(II)如下所示：
2、包被载体制备
链霉亲和素磁珠用R1缓冲液清洗3次，加入上述生物素化NEXN兔多克隆抗体反应30min，再加入封闭剂反应30min，R1缓冲液清洗3次，用R1缓冲液稀释至工作浓度即得，置于2～8℃保存。
其中，R1缓冲液为0.1M Tris-HCl(pH7.4)溶液，其中含有1g/L牛血清白蛋白、2g/L蔗糖、0.05mL/LTween-20、0.3mL/LProclin950。
在本发明具体实施方式中，链霉亲和素磁珠的粒径为0.8～3μm，磁珠在包被载体中的终浓度为0.2mg/mL～0.8mg/mL。
在本发明具体实施方式中，R1缓冲液中的Tris-HCl溶液可以替换为PBS或MES溶液，其终浓度可以为0.05～0.2M。
三、结合物制备
1、吖啶酯抗体制备
将Nexn结合蛋白(NEXN)多克隆抗体(兔抗)与吖啶酯(5mM)于室温条件下避光混匀反应1h，加入L-赖氨酸室温混匀反应10min，终止反应，脱盐柱纯化后加入等体积甘油混匀，即得吖啶酯抗体，置于-10℃～-25℃保存。
2、结合物制备
用R2缓冲液将上述吖啶酯抗体稀释至工作浓度，置于2～8℃保存。
其中，R2缓冲液为0.02M PBS(pH7.4)溶液，其含有1g/L酪蛋白、1g/L海藻糖、0.05mL/LTween-20、0.3mL/LProclin950。
在本发明具体实施方式中，R2缓冲液中的PBS溶液可以替换为Tris-HCl或MES溶液，其终浓度可以为0.01～0.1M。
在本发明具体实施方式中，R2缓冲液中酪蛋白可以替换为牛血清白蛋白，酪蛋白的浓度在1g/L～20g/L。
四、化学发光底物液
化学发光底物液为3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3’-磷酰氧基)苯基-1,2-二氧乙烷或鲁米诺。
五、制备分析缓冲液
分析缓冲液为pH7.4、10mmol/L PBST缓冲液，内含1g/L BSA、0.1mL/LProclin300。
六、制备浓缩洗涤液
浓缩洗涤液为pH7.2～7.4、20mmol/L PBS缓冲液，内含1mL/L吐温-20。
七、组装NEXN化学发光检测试剂盒
将上述标准品和质控品、包被载体、吖啶酯标记物、化学发光底物液、分析缓冲液及浓缩洗涤液组装，即得NEXN化学发光检测试剂盒。
实施例2：NEXN化学发光检测试剂盒的使用方法
本发明NEXN化学发光检测试剂盒的使用方法具体包括以下步骤：
步骤S1、首先用分析缓冲液将酶标板预湿，然后分别加入待测样本与生物素化兔抗NEXN多克隆抗体1包被的链霉亲和素磁珠，混合，并于37℃下孵育1h，使其充分反应；
步骤S2、反应完成后用稀释10倍后的浓缩洗涤液冲洗，并加入吖啶酯标记的兔抗NEXN结合物于37℃下继续孵育以生成反应混合物；
步骤S3、反应完成后再次用稀释10倍后的浓缩洗涤液冲洗，并向反应混合物中加入化学发光底物液；
步骤S4、测量产生的化学发光反应，以相对发光单位(RLUs)表示，其中待测样本中的NEXN的浓度与RLUs值成正比；
步骤S5、根据待测样本中NEXN活性(mg/L)＝CS×ΔAT/ΔAS(mg/L)计算浓度。
式中：ΔAT为以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值，ΔAS为以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值，CS为校准液中NEXN的浓度(即在标准曲线中相应的RLU值对应的浓度)。
对比例1
本对比例与实施例1相比区别在于：在生物素化抗体制备过程中采用的是市面购买的生物素酯(Thermo ScientificTM，货号:21336)对兔抗NEXN多克隆抗体进行处理，其余条件不变。
检测例1：灵敏度检测
本检测例分别对上述实施例1和对比例1制得的NEXN化学发光检测试剂盒的灵敏性进行检测。
采用上述实施例的NEXN化学发光检测试剂盒和检测方法分别对NEXN蛋白浓度为0.04ng/mL、0.05ng/mL、0.06ng/mL、0.07ng/mL和0.08ng/mL的待测样本进行重复性检测，其检测结果如表1所示。
表1实施例1试剂盒灵敏性检测
结果显示，当测定NEXN蛋白浓度为0.05ng/mL附近的样本，无低于空白限0.015ng/mL的结果，且检测的稳定性好，故本发明的试剂盒检出限LOD为0.05ng/mL。
进一步地，采用同样的方法用上述对比例1的NEXN化学发光检测试剂盒分别对NEXN蛋白浓度为0.04ng/mL、0.05ng/mL、0.06ng/mL、0.07ng/mL和0.08ng/mL的待测样本进行重复性检测。结果显示，当测定NEXN蛋白浓度为0.06ng/m附近的样本，存在低于空白限0.015ng/mL的结果，该试剂盒的灵敏性检出限LOD为0.07ng/m，且检测的稳定性也相对实施例1的试剂盒低。
检测例2：精密度测定
采用本发明实施例1的试剂盒制备方法分别制备若干个检测试剂盒，然后分别使用同批次和不同批次的检测试剂盒检测相同样本，考察其批内和批间差异。
精密度用样品测定值的变异系数CV表示，其中CV(％)＝SD/mean×100。
批间差异检测结果如表2所示。
表2批间检测结果
| 样本编号 | 批次1 | 批次2 | 批次3 |
| 1 | 0.33 | 0.32 | 0.32 |
| 1 | 0.33 | 0.33 | 0.33 |
| 1 | 0.33 | 0.33 | 0.33 |
| 1 | 0.32 | 0.33 | 0.33 |
| 1 | 0.33 | 0.30 | 0.34 |
| 1 | 0.33 | 0.33 | 0.33 |
| 1 | 0.31 | 0.31 | 0.33 |
| 1 | 0.33 | 0.33 | 0.29 |
| 2 | 2.11 | 2.11 | 2.11 |
| 2 | 2.11 | 2.10 | 2.11 |
| 2 | 2.07 | 2.11 | 2.08 |
| 2 | 2.11 | 2.11 | 2.11 |
| 2 | 2.10 | 2.11 | 2.11 |
| 2 | 2.11 | 2.10 | 2.12 |
| 2 | 2.11 | 2.13 | 2.11 |
| 2 | 2.10 | 2.11 | 2.12 |
| 3 | 5.29 | 5.29 | 5.27 |
| 3 | 5.29 | 5.29 | 5.29 |
| 3 | 5.32 | 5.29 | 5.33 |
| 3 | 5.29 | 5.29 | 5.29 |
| 3 | 5.29 | 5.29 | 5.29 |
| 3 | 5.26 | 5.17 | 5.30 |
| 3 | 5.29 | 5.29 | 5.29 |
| 3 | 5.29 | 5.29 | 5.29 |
批间差异结果显示，批间的精密度CV为3.51％，说明采用本发明的制备方法制得的试剂盒检测精确性和稳定性好。
进一步地，批内差异检测结果如表3所示。
表3批内检测结果
| - | 同批次1 | 同批次2 |
| Rep1 | 3.323 | 30.591 |
| Rep2 | 3.080 | 29.919 |
| Rep3 | 3.435 | 29.842 |
| Rep4 | 3.200 | 29.957 |
| Rep5 | 3.234 | 30.111 |
| Rep6 | 3.137 | 30.950 |
| Rep7 | 3.078 | 30.318 |
| Rep8 | 3.363 | 29.839 |
| Rep9 | 3.067 | 29.703 |
| Rep10 | 3.037 | 29.864 |
| AVE | 3.195 | 30.109 |
| CV | 4.4％ | 1.3％ |
结果显示，同批次1的精确度CV为4.4％，同批次2的精确度CV为1.3％，说明采用本发明方法制得的NEXN化学发光检测试剂盒具有很好的精密度。
检测例3：回收率检测
首先采用上述实施例1制得的试剂盒检测血清样本中抗原(丝状肌动蛋白结合蛋白)的初始浓度，然后向血清样本中继续添加1/10体积的抗原(50ng/mL)，计算回收率，其中回收率结果越接近100％表示分析方法的准确度越高，回收率的计算公式如下：
表4准确性检测结果
| 样本编号 | 浓度(ng/mL) | 回收率 |
| 样本1 | 0.571 | - |
| 添加样本 | 5.622 | 102.2％ |
| 样本2 | 0.243 | - |
| 添加样本 | 5.174 | 99.1％ |
| 样本3 | 0.280 | - |
| 添加样本 | 5.326 | 101.5％ |
可见，采用本发明试剂盒检测的添加回收率在99.1％～102.2％之间，说明本发明的试剂盒具有优异的检测准确性。
检测例4：特异性测定
本检测例采用了实施例1的检测试剂盒分别对其他心肌相关标志物(如BNP、NT-ProBNP、MYO、GDF-15、cTnT、hs-TnI和CK-MB)进行了检测，并观察是否存在交叉反应。检测结果如表5所示。
表5特异性检测结果
| 交叉物质 | 浓度 | 交叉反应率 |
| BNP | 5000pg/mL | 0.45％ |
| NT-ProBNP | 35000pg/mL | 0.00％ |
| MYO | 3000ng/mL | 0.00％ |
| GDF-15 | 30000pg/mL | 0.00％ |
| cTnT | 20000pg/mL | 0.00％ |
| hs-TnI | 200000pg/mL | 0.01％ |
| CK-MB | 1000ng/mL | 0.00％ |
结果显示，采用本发明的检测试剂盒进行检测，其交叉反应率极低，小于0.45％，说明本发明制得的试剂盒特异性好，不会对其他心肌相关标志物产生反应。
检测例5：稳定性测定
本检测例将实施例1方法制得的检测试剂盒分别放置于37℃下和2～8℃下储存7天，然后对比两种不同储存条件下检测结果的差异，其中标准品检测曲线测定信息如表6所示，不同温度下的检测结果如表7所示。
表6标准品主曲线测定
| 标准品(ng/mL) | RLU |
| 0 | 387 |
| 0.5 | 1408 |
| 2 | 4657 |
| 10 | 22453 |
| 25 | 58439 |
| 50 | 114793 |
| 100 | 221212 |
表7不同温度对检测结果的影响
| 样本编号 | 2～8℃试剂 | 37℃试剂 |
| 1 | 0.33 | 0.32 |
| 2 | 3.29 | 3.23 |
| 3 | 0.88 | 0.91 |
| 4 | 1.04 | 1.05 |
| 5 | 0.43 | 0.44 |
| 6 | 2.24 | 2.14 |
| 7 | 1.11 | 1.06 |
| 8 | 0.45 | 0.43 |
| 9 | 5.55 | 5.29 |
| 10 | 2.18 | 2.07 |
| 11 | 2.11 | 2.16 |
| 12 | 0.87 | 0.88 |
| 13 | 1.33 | 1.29 |
| 14 | 0.81 | 0.79 |
| 15 | 0.66 | 0.64 |
| 16 | 0.92 | 0.96 |
| 17 | 0.21 | 0.21 |
| 18 | 1.00 | 1.00 |
| 19 | 1.79 | 1.72 |
| 20 | 0.39 | 0.41 |
| 21 | 0.40 | 0.41 |
| 22 | 0.18 | 0.18 |
| 23 | 3.04 | 3.13 |
| 24 | 0.74 | 0.71 |
不同温度下的检测结果显示：采用37℃下储存的试剂盒与采用2-8℃下储存的试剂盒同时测定24例临床样本，其相关系数r＝0.9990，说明在2～37℃范围内采用本发明的检测试剂进行检测不会对检测结果造成显著影响，本发明制得的试剂盒具有优异的稳定性。
应用例
采用上述实施例1中制备的NEXN化学发光检测试剂盒检测22份健康或心血管病人血清样本，其中22份健康或心血管病人血清样本采集自广东省中医院，在22例样本中动脉粥样硬化患者11例，冠心病患者11例。
检测结果如图3所示，与预期一致，结果显示：与健康对照比，动脉粥样硬化患者的血浆NEXN蛋白降低了0.669倍，具有显著的差异。
综上所述，本发明提供了种NEXN化学发光检测试剂盒及其制备方法与应用，本发明制备的一种NEXN化学发光检测试剂盒成本低廉，操作简便、快速，更易于推广；可用于心血管疾病的早期诊断和监测。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (3)
1.一种NEXN化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一试剂和第二试剂；
其中，所述第一试剂由0.05M~0.2M Tris-HCl缓冲液、1g/L牛血清白蛋白、2g/L蔗糖、0.05mL/L Tween-20、0.1mL/L~0.5mL/L Proclin950、0.2mg/mL~0.8mg/mL链霉亲和素磁珠和2μg/mL~12μg/mL生物素聚乙二醇活性酯标记的兔抗NEXN多克隆一抗组成；所述链霉亲和素磁珠的粒径为0.8~3μm；所述生物素聚乙二醇活性酯的结构式如式（II）所示：
；
所述第二试剂由0.01M~0.1M PBS缓冲液、0.1%~2%酪蛋白、1g/L海藻糖、0.05mL/LTween-20、0.1%~0.5%Proclin950和1μg/mL~5μg/mL化学发光物标记的兔抗NEXN多克隆二抗组成。
2.根据权利要求1所述的NEXN化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光物选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的NEXN化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准品、质控品、化学发光底物液、分析缓冲液和浓缩洗涤液。
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