CN117470819A - 自身免疫性肌炎病检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种自身免疫性肌炎病检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括:由JO‑1抗原、OJ抗原、EJ抗原、PL‑7抗原、PL‑12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi‑2α抗原、Mi‑2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM‑Scl 75抗原和PM‑Scl 100抗原分别包被的荧光编码磁性微球的混悬液和荧光物质标记的二抗溶液;所述JO‑1抗原包括抗原A和抗原B,其中,所述抗原A为天然抗原,所述抗原B为重组抗原。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域,具体而言,涉及一种自身免疫性肌炎病检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
自身免疫性肌炎疾病为一种发病机理不明确的疾病,且与其他疾病有关联。临床上在疾病初期难以准确诊断,因此及时准确检测出自身免疫性肌炎抗体对疾病诊断及进一步的预后有着重要意义。
特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathy,IIM)是以骨骼肌受累为主要表现的异质性免疫病,其存在多种自身抗体,根据抗体的不同可分为多种临床亚型,包括多发性肌炎( polymyositis,PM)、皮肌炎( dermatomyositis,DM)、包涵体肌炎(immune-mediated necrotizing myopathy,IBM)、免疫介导坏死性肌病 (immune-mediatednecrotizing myopathy,IMNM)和幼年特发性肌炎(juvenile idiopathic myositis,JIM)、抗合成酶抗体综合征(antisynthetase syndrome,ASS)等。仅存在于IIM中的自身抗体,被称为肌炎特异性自身抗体( myositis-specific autoantibodies,MSA),部分抗体亦存在于其他疾病中,被称为肌炎相关性自身抗体(myositis-associated autoantibodies,MAA)。
目前,市面上一般用于肌炎检测的方法酶联免疫、化学发光都是单一抗体检测,随着患者的要求越来越高,患者的检测数量日益增大,而医院资源有限的情况下,单一肌炎抗体检测无法满足实际需求,多项目自身免疫性肌炎抗体的检测在应对自身免疫性肌炎疾病方面显得越来越紧迫。
免疫印迹在用于肌炎抗体谱检测中,能够实现同时进行多项目检测的要求,但基于检测原理的限制,检测时间长,且该方法样本用量多,容易出现交叉污染导致试剂重复性不好等问题。因此,亟需一种可高效同时检测多项目自身免疫性肌炎抗体的相关技术和产品。
发明内容
基于此,本申请提供了一种自身免疫性肌炎病的检测试剂盒及其检测方法。
具体通过如下的技术方案实现的:
本申请一方面提供一种自身免疫性肌炎病的检测试剂盒,所述试剂盒包括:由JO-1、OJ、EJ、PL-7、PL-12、SRP、HMGCR、Mi-2α、Mi-2β、TIF1γ、NXP2、SAE1、MDA5、SSA/Ro52kD、Ku、PM-Scl 75和PM-Scl 100抗原分别包被的荧光编码磁性微球的混合液和荧光物质标记的二抗溶液;所述JO-1抗原包括抗原A和抗原B,其中,所述抗原A为天然抗原,所述抗原B为重组抗原。
在其中一些实施例中,包被有JO-1抗原的荧光编码磁性微球上包被的所述抗原A和所述抗原B的质量比为(1~3):1。
在其中一些实施例中,所述抗原A和所述抗原B的氨基酸序列相同,所述抗原A和所述抗原B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在其中一些实施例中,所述荧光物质标记的二抗为抗人IgG抗体,所述抗人IgG抗体选自羊抗人IgG抗体或鼠抗人IgG抗体中的至少一种。
在其中一些实施例中,所述荧光物质包括藻红蛋白、藻红蛋白-Cy7复合染料、异硫氰酸荧光素、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物、别藻青蛋白中的至少一种。
在其中一些实施例中,所述试剂盒中还包括二抗稀释液。
在其中一些实施例中,所述二抗稀释液包括含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液和阻断剂。
在其中一些实施例中,所述阻断剂包括主动阻断剂和被动阻断剂,所述主动阻断剂选自人抗鼠抗体HAMA阻断剂、异嗜性抗体阻断剂和类风湿因子RF阻断剂中的至少一种;所述被动阻断剂选自鼠IgG、绵羊IgG、山羊IgG和牛IgG中的至少一种。
在其中一些实施例中,所述试剂盒中还包括样本稀释液;所述样本稀释液包括含蛋白血清的磷酸盐缓冲液和tris缓冲液中的至少一种。
本申请相对于传统技术,能够同时对肌自身免疫性肌炎谱17项抗体进行定量检测,样本用量低,灵敏度高,操作方便易于自动化,其中JO-1采用蛋白构象不同的天然抗原和重组抗原混合包被的方式来提高检出效率,为临床上自身免疫性肌炎病的筛查、诊断与治疗提供参考。
本申请的另一方面,还提供一种检测自身免疫性肌炎病的方法,包括以下步骤:取待测样本,使用上述的试剂盒进行抗原-抗体反应,通过对反应产物进行荧光强度检测,分析检测结果。
通过本申请上述检测自身免疫性肌炎病的方法,实现测试同一份样本可以同时对肌自身免疫性肌炎谱17项抗体进行定量检测。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本申请的一种自身免疫性肌炎病的检测试剂盒作进一步详细的说明。本申请可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施方式。相反地,提供这些实施方式的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本申请。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目,也包括相关所列项目的任意的和所有的组合,所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本申请中,涉及到数值区间(也即数值范围),如无特别说明,可选的数值分布在上述数值区间内视为连续,且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值),以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明,当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时,包括该数值范围的两个端点整数,以及两个端点之间的每一个整数,在本文中,相当于直接列举了每一个整数,比如t为选自1-10的整数,表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外,当提供多个范围描述特征或特性时,可以合并这些范围。换言之,除非另有指明,否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本申请中的温度参数,如无特别限定,既允许为恒温处理,也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是,所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
自身免疫性肌炎谱一般包括人血清中的IgG类JO-1、OJ、EJ、PL-7、PL-12、SRP、HMGCR、Mi-2α、Mi-2β、TIF1γ、NXP2、SAE1、MDA5、SSA/Ro52kD、Ku、PM-Scl 75和PM-Scl 100抗体。其中MSAs包括黑素瘤分化相关基因(melanoma differentiation-associated gene,MDA) -5抗体、抗转录中介因子(transcriptional intermediary factor,TIF) -1γ抗体、抗核基质蛋白(nuclear matrix protein,NXP) -2抗体、抗组氨酰-tRNA合成酶(histidyl-tRNA synthetase,JO-1)抗体、抗小泛素样修饰剂激活酶(small ubiquitin-like modifier activating enzyme,SAE)抗体、抗核小体重塑和组蛋白脱乙酰酶蛋白复合物(Mi-2)抗体等,上述肌炎特异性抗体的检测有助于IIM的诊断、临床分型、治疗及预后评估。
本申请一实施方式提供一种自身免疫性肌炎病的检测试剂盒,试剂盒包括:由JO-1抗原、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl 100抗原分别包被的荧光编码磁性微球的混悬液和荧光物质标记的二抗溶液;JO-1抗原包括抗原A和抗原B,其中,抗原A为天然抗原,抗原B为重组抗原。
本申请相对于传统技术,能够同时对肌自身免疫性肌炎谱17项抗体进行定量检测,样本用量低,灵敏度高,操作方便易于自动化,其中JO-1采用蛋白构象不同的天然抗原和重组抗原混合包被的方式来提高检出效率,为临床上自身免疫性肌炎病的筛查、诊断与治疗提供参考。
在其中一些实施例中,包被有JO-1抗原的荧光编码磁性微球上包被的抗原A和抗原B的质量比为(1~3):1。
在其中一些实施例中,抗原A和抗原B的氨基酸序列相同,抗原A和抗原B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
具体地,如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列为:MAERAALEELVKLQGERVRGLKQQKASAELIEEEVAKLLKLKAQLGPDESKQKFVLKTPKGTRDYSPRQMAVREKVFDVIIRCFKRHGAEVIDTPVFELKETLMGKYGEDSKLIYDLKDQGGELLSLRYDLTVPFARYLAMNKLTNIKRYHIAKVYRRDNPAMTRGRYREFYQCDFDIAGNFDPMIPDAECLKIMCEILSSLQIGDFLVKVNDRRILDGMFAICGVSDSKFRTICSSVDKLDKVSWEEVKNEMVGEKGLAPEVADRIGDYVQQHGGVSLVEQLLQDPKLSQNKQALEGLGDLKLLFEYLTLFGIDDKISFDLSLARGLDYYTGVIYEAVLLQTPAQAGEEPLGVGSVAAGGRYDGLVGMFDPKGRKVPCVGLSIGVERIFSIVEQRLEALEEKIRTTETQVLVASAQKKLLEERLKLVSELWDAGIKAELLYKKNPKLLNQLQYCEEAGIPLVAIIGEQELKDGVIKLRSVTSREEVDVRREDLVEEIKRRTGQPLCIC。
天然抗原是从动物组织或微生物体外等提取纯化出来的抗原;重组抗原是指在将抗原基因链接载体转入原核或真核细胞中,体外重组表达纯化得来的;通常,重组抗原的基因序列、氨基酸组成、分子量大小与天然抗原是一样的。而不同种类的抗原A和抗原B的抗原的决定簇可能是由一级结构决定的线性连续的,也可能是由三级结构决定的不连续的空间构象。线性表位即使蛋白变性,也具有免疫原性;而构象表位只有在空间结构完整的情况下才具有免疫原性。重组抗原的构象和修饰有别于天然抗原,天然抗原具有天然序列,抗原表位全面;重组抗原可人工设计序列,突出重点表位,产量大可控制,易提纯,可加上标签利于检测。
在其中一些实施例中,上述抗原A为取自小牛胸腺的天然抗原,抗原B为由昆虫细胞表达的重组抗原。
在其中一些实施例中,上述混悬液中,JO-1抗原与荧光编码磁性微球的包被比例为:10μg~200μg的抗原包被1×106个磁性荧光编码微球。
在其中一些实施例中,荧光物质标记的二抗为抗人IgG抗体。
在其中一些实施例中,抗人IgG抗体选自羊抗人IgG抗体或鼠抗人IgG抗体中的至少一种。
在其中一些实施例中,荧光物质包括荧光素、荧光蛋白及其他可以发荧光的物质。
在其中一些实施例中,上述荧光物质包括藻红蛋白(PE)、藻红蛋白PE-Cy7复合染料、异硫氰酸荧光素(FITC)、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物(PerCP)、别藻青蛋白(APC)中的至少一种。
在其中一些实施例中,试剂盒中还包括二抗稀释液。
在其中一些实施例中,二抗稀释液包括含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液和阻断剂。
在其中一个实施例中,以荧光物质标记的二抗稀释液总质量为基准,上述阻断剂的质量百分比含量为0.1%~10%。
在其中一些实施例中,上述阻断剂包括主动阻断剂和被动阻断剂,上述主动阻断剂选自人抗鼠抗体(HAMA)阻断剂、异嗜性抗体阻断剂和类风湿因子(RF)阻断剂中的至少一种。
在其中一个实施例中,上述被动阻断剂选自鼠IgG、绵羊IgG、山羊IgG和牛IgG中的至少一种。
在其中一些实施例中,试剂盒中还包括样本稀释液,样本稀释液包括含蛋白血清的磷酸盐缓冲液或tris缓冲液中的至少一种。
在其中一些实施例中,上述混悬液中还包括血清蛋白、表面活性剂、大分子聚合物、糖或醇及防腐剂。
可理解,混悬液中加入血清蛋白、表面活性剂、大分子聚合物、糖或醇及防腐剂等物质以保证荧光编码磁性微球混悬液的稳定性。
本申请一实施方式还提供一种检测自身免疫性肌炎病的方法。在一个具体示例中,检测方法包括以下步骤S10、步骤S20。
步骤S10:获取待测样本,使用样本稀释液稀释待测样本,得到稀释样本。
在其中一个实施例中,步骤S10中,待测样本选自血清或血浆样本。
在其中一个实施例中,上述样本稀释液与待测样本的体积比为(30~100):1。
步骤S20:取步骤S10中得到的稀释样本,采用上述的试剂盒进行抗原-抗体反应,通过对反应产物进行荧光强度检测,分析检测结果。
具体地,步骤S20中,采用上述的试剂盒进行反应,通过对反应产物进行荧光强度检测,分析检测结果的步骤包括步骤S21、步骤S22、步骤S23、步骤S24。
步骤S21:将步骤S10中得到的稀释样本与由JO-1抗原、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl 100抗原分别包被的荧光编码磁性微球的混悬液混合,进行特异性抗体反应,用微球清洗液进行磁分离清洗,制备磁性微球-抗原-特异性IgG自身抗体复合物。
在其中一个实施例中,稀释样本和荧光编码磁性微球的混悬液的体积比为(0.5~1):1。
在其中一个实施例中,上述反应温度为37±1℃。
在其中一个实施例中,上述反应时间为15 min ~60min。
可选地,上述由JO-1抗原、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl 100抗原分别包被的荧光编码磁性微球的混悬液的制备方法包括步骤a、步骤b、步骤c、步骤d、步骤e。
步骤a:分别取100μL~150μL荧光编码磁性微球悬浮液(约1.25*10^6个微球)于离心管中,并将离心管置于磁力架上,进行磁性吸附,分离弃去上清液;分别加入200μL~1000μL微球洗涤液进行清洗,重复两次;将清洗后的荧光编码磁性微球分别用100μL~500μL重悬液重悬,得到重悬液A。
步骤b:别向微球重悬液A中加入活化剂,使活化剂浓度为5mg/mL,室温下避光反应10-60min;分别加入200μL~1000μL微球洗涤液进行清洗,重复两次;将清洗后的荧光编码磁性微球分别用100μL~1000μL重悬液重悬,得到重悬液B。
步骤c:分别向微球重悬液B中加入相应抗原,使抗原浓度为10-100μg/mL,室温下避光反应1-12h;分别加入200-1000μL微球封闭液进行清洗,重复两次;将清洗后的荧光编码磁性微球分别用100-1000μL封闭液重悬,得到重悬液C。
步骤d:将清洗后的荧光编码磁性微球分别加入等体积的封闭液,室温下避光反应1-12h,进行封闭反应,将反应后的荧光编码磁性微球进行磁分离清洗。
步骤e:将清洗后的荧光编码磁性微球分别加入微球保存液进行重悬,得到荧光编码磁性微球重悬液;分别将包被不同抗原的荧光编码磁性微球重悬液加入到微球保存液中,使每种微球的个数在2000-5000个之间,制备包被不同抗原的荧光编码磁性微球的混悬液。
步骤S22:将步骤 S21中得到的磁性微球-抗原-特异性IgG自身抗体复合物与荧光物质标记的二抗溶液混合,进行检测抗体反应,用微球清洗液进行磁分离清洗,制备磁性微球-抗原-特异性IgG自身抗体-荧光物质标记二抗复合物。
在其中一个实施例中,上述二抗溶液为浓度1μg/mL~20μg/mL的羊抗人IgG抗体。
步骤S23:向磁性微球-抗原-特异性IgG自身抗体-荧光物质标记二抗复合物中加入磁性清洗液进行重悬,得到重悬的磁性微球-抗原-特异性IgG自身抗体-荧光物质标记二抗复合物。
步骤S24:对重悬的磁性微球-抗原-特异性IgG自身抗体-荧光物质标记二抗复合物进行上样检测,得出荧光信号值,分析检测结果。
采用本申请的上述检测自身免疫性肌炎病的试剂盒,实现测试同一份样本可以同时对肌自身免疫性肌炎谱17项抗体进行定量检测,为临床上自身免疫性肌炎病的筛查和治疗提供参考。
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加简洁明了,本申请用以下具体实施例进行说明,但本申请绝非仅限于这些实施例。以下所描述的实施例仅为本申请较好的实施例,可用于描述本申请,不能理解为对本申请的范围的限制。应当指出的是,凡在本申请的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
为了更好地说明本申请,下面结合实施例对本申请内容作进一步说明。以下为具体实施例。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明,均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
1、提供一种自身免疫性肌炎病的检测试剂盒
试剂盒包括由JO-1抗原、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl 100抗原分别包被的荧光编码磁性微球的混悬液、荧光物质标记的二抗溶液和样本稀释液和荧光物质标记的二抗稀释液。
其中JO-1抗原包括:取自小牛胸腺的天然抗原A和由昆虫细胞(Sf9)表达的重组抗原B;抗原A和抗原B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、检测原理
在检测过程中,具有不同荧光编码的磁性微球表面共价交联着不同的肌炎谱抗原,先将待测样本与混悬液混匀,通过样本中特异性IgG抗体与荧光编码磁性微球表面上的特定抗原识别并结合,形成磁性编码微球-抗原-特异性IgG自身抗体复合物。磁分离作用下,分离出磁性微球-抗原-特异性IgG自身抗体复合物,随后加入荧光物质标记的二抗,最终形成磁性微球-抗原-特异性IgG自身抗体-荧光物质标记二抗复合物。磁分离作用下,分离出磁性微球-抗原-特异性IgG自身抗体-荧光物质标记二抗复合物。
对复合物进行检测时,两束激光聚焦于编码微球上,一束判定微球的荧光编码,确定待测项目;另一束测定微球上荧光物质的荧光强度,即荧光值,该荧光值与样本中相应的分析物浓度成正相关。通过各项目的校准曲线得到各项目IgG抗体的浓度。
3、制备混悬液
3.1预处理:分别取100μL 荧光编码磁性微球悬浮液于17个离心管中,并将17个离心管置于磁力架上,进行磁性吸附,分离弃去上清液;分别加入200μL微球洗涤液进行清洗,重复两次;将清洗后的荧光编码磁性微球分别用200μL重悬液重悬,得到17个重悬液A。
3.2 活化:分别向17个微球重悬液A中加入活化剂,使活化剂浓度为5mg/mL,室温下避光反应30min;分别加入200μL微球洗涤液进行清洗,重复两次;将清洗后的荧光编码磁性微球分别用200μL重悬液重悬,得到17个重悬液B。
3.3 标记:分别向17个微球重悬液B中加入相应抗原,使抗原浓度为20μg/mL,室温下避光反应2h;分别加入200μL微球封闭液进行清洗,重复两次;将清洗后的荧光编码磁性微球分别用200μL封闭液重悬,得到17个重悬液C。
3.4 封闭:将清洗后的荧光编码磁性微球分别加入等体积的封闭液,室温下避光反应2 h,进行封闭反应,将反应后的荧光编码磁性微球进行磁分离清洗。
3.5 保存:将清洗后的荧光编码磁性微球分别加入微球保存液进行重悬,得到17种荧光编码磁性微球重悬液;分别将17种荧光编码磁性微球重悬液加入到微球保存液中,使每种微球的个数在2000个,即为荧光编码磁性微球混悬液。
4、检测过程
4.1样本准备:待测样本来源于从医院收回的血浆,使用样本稀释液稀释待测样本,稀释液与待测样本比例为30:1,得到稀释样本;
4.2特异性抗体反应:取稀释样本30μL与荧光编码磁性微球混悬液50μL混合,37℃反应15min后,用微球清洗液进行磁分离清洗两次,得到磁性微球-抗原-特异性IgG自身抗体复合物;
4.3检测抗体反应:向磁性微球-抗原-特异性IgG自身抗体复合物中添加藻红蛋白标记二抗溶液100μL,37℃反应15 min后,用微球清洗液进行磁分离清洗两次,得到磁性微球-抗原-特异性IgG自身抗体-藻红蛋白标记二抗复合物;其中藻红蛋白标记二抗溶液为终浓度10μg/mL的羊抗人IgG抗体(原液购自于Solarbio)。
4.4检测:向磁性微球-抗原-特异性IgG自身抗体-藻红蛋白标记二抗复合物中加入50μL磁性清洗液进行重悬,得到重悬的磁性微球-抗原-特异性IgG自身抗体-藻红蛋白标记二抗复合物。使用流式分析仪对重悬的磁性微球-抗原-特异性IgG自身抗体-藻红蛋白标记二抗复合物进行检测,并分析。
按照步骤3制备一种由 JO-1(A和B两种)抗原、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl 100抗原包被的荧光编码磁性微球的混悬液,将待测样本按照步骤4进行检测,荧光二抗中不添加阻断剂,具体试剂种类及配方请见表1~表2,具体测试结果请见表3~6。
实施例2:
实施例2与实施例1的检测自身免疫性肌炎病的方法基本相同,不同之处在于:荧光二抗中添加阻断剂组合。按照步骤3制备一种由 JO-1(A和B两种,质量比为2:1)抗原、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl 100抗原包被的荧光编码磁性微球混悬液,将待测样本按照步骤4进行检测,荧光二抗中添加2种阻断剂,具体试剂种类及配方请见表2,具体测试结果请见表5~6。
实施例3
实施例3与实施例1的检测自身免疫性肌炎病的方法基本相同,不同之处在于:荧光二抗中添加阻断剂组合。按照步骤3制备一种由 JO-1(A和B两种,质量比为2:1)抗原、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl 100抗原包被的荧光编码磁性微球混悬液,将待测样本按照步骤4进行检测,荧光二抗中添加2种阻断剂,具体试剂种类及配方请见表2,具体测试结果请见表5~6。
实施例4
实施例4与实施例1的检测自身免疫性肌炎病的方法基本相同,不同之处在于:荧光二抗中添加阻断剂组合。按照步骤3制备一种由 JO-1(A和B两种,质量比为2:1)抗原、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl 100抗原包被的荧光编码磁性微球混悬液,将待测样本按照步骤4进行检测,荧光二抗中添加2种阻断剂,具体试剂种类及配方请见表2,具体测试结果请见表5~6。
实施例5
实施例5与实施例1的检测自身免疫性肌炎病的方法基本相同,不同之处在于:荧光二抗中添加阻断剂组合。按照步骤3制备一种由 JO-1(A和B两种,质量比为2:1)抗原、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl 100抗原包被的荧光编码磁性微球混悬液,将待测样本按照步骤4进行检测,荧光二抗中添加2种阻断剂,具体试剂种类及配方请见表2,具体测试结果请见表5~6。
实施例6
实施例6与实施例1的检测自身免疫性肌炎病的方法基本相同,不同之处在于:JO-1抗原配比不同。按照步骤3制备一种由 JO-1抗原(A和B两种,质量比为3:1)、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl 100抗原包被的荧光编码磁性微球混悬液,将待测样本按照步骤4进行检测,荧光二抗中不添加阻断剂,具体试剂种类及配方请见表1,具体测试结果请见表4。
实施例7
实施例7与实施例1的检测自身免疫性肌炎病的方法基本相同,不同之处在于:JO-1抗原配比不同。按照步骤3制备一种由 JO-1抗原(A和B两种,质量比为1:1)、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl 100抗原包被的荧光编码磁性微球混悬液,将待测样本按照步骤4进行检测,荧光二抗中不添加阻断剂,具体试剂种类及配方请见表1,具体测试结果请见表4。
对比例1
对比例1与实施例1的检测自身免疫性肌炎病的方法基本相同,不同之处在于:JO-1抗原种类不同。按照步骤3制备一种由 JO-1抗原(A抗原)、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl 100抗原包被的荧光编码磁性微球的混悬液,将待测样本按照步骤4进行检测,荧光二抗中不添加阻断剂,具体试剂种类及配方请见表1,具体测试结果请见表4。
对比例2
对比例2与实施例1的检测自身免疫性肌炎病的方法基本相同,不同之处在于:JO-1抗原种类不同。按照步骤3制备一种由 JO-1抗原(B抗原)、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl 100抗原包被的荧光编码磁性微球混悬液,将待测样本按照步骤4进行检测,荧光二抗中不添加阻断剂,具体试剂种类及配方请见表1,具体测试结果请见表4。
对比例3
对比例3与实施例1的检测自身免疫性肌炎病的方法基本相同,不同之处在于:荧光二抗中添加阻断剂组合。按照步骤3制备一种由 JO-1(A和B两种,质量比为2:1)抗原、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl 100抗原包被的荧光编码磁性微球的混悬液,将待测样本按照步骤4进行检测,荧光二抗中添加1种主动阻断剂,具体试剂种类及配方请见表1,具体测试结果请见表5~6。
对比例4
对比例4与实施例1的检测自身免疫性肌炎病的方法基本相同,不同之处在于:荧光二抗中添加阻断剂组合。按照步骤3制备一种由 JO-1(A和B两种,质量比为2:1)抗原、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl 100抗原包被的荧光编码磁性微球混悬液,将待测样本按照步骤4进行检测,荧光二抗中添加1种被动阻断剂,具体试剂种类及配方请见表1,具体测试结果请见表5~6。
表1不同JO-1抗原配比
表2 不同阻断剂组合
表3不同抗原包被荧光编码磁性微球后检测相应抗体的浓度值
结合表3的结果可知,由JO-1、OJ、EJ、PL-7、PL-12、SRP、HMGCR、Mi-2α、Mi-2β、TIF1γ、NXP2、SAE1、MDA5、SSA/Ro52kD、Ku、PM-Scl 75和PM-Scl 100抗原分别包被不同编码微球得到微球试剂,配合样本稀释液及荧光二抗溶液检测样本,可得到不同样本的17个项目的结果值,一次测试得到17个肌炎项目结果,为临床上自身免疫性肌炎病的筛查、诊断与治疗提供参考。自身免疫性肌炎病是一种发病机制和临床表现极为复杂的疾病,虽然自身抗体的联合检测提高了诊断的敏感性及准确性,但其确诊不仅需要自身抗体的检测,仍同时需要结合临床表现及其他生化指标的检测。
表4 JO-1测试结果与临床结果比对
结合表4的检测结果可知,JO-1混合抗原(A和B两种,质量比为2:1)包被测试结果与临床符合率比对结果比单独包被A或B抗原后与临床符合率的比对结果更好。优选的,实施例6、实施例7与实施例1对比,抗原A与抗原B三种不同质量比的测试结果表明,优选抗原A与抗原B的质量比为2:1时符合率最好。
表5 PL-7测试结果与临床结果比对
表6 RO-52测试结果与临床结果比对
结合表5和表6可知,荧光二抗是否添加阻断剂对结果存在影响,即阻断剂的添加能够减少假阳性结果,但由于样本中的干扰情况复杂,即使添加了阻断剂也不能完全去除所有干扰,但可以减少假阳的例数;同时两种阻断剂混合添加假阳结果的去除比单个阻断剂的去除更明显。对于不同的子项目,阻断剂的最佳搭配选择不同,以Ro 52为例,最优的是1.00%山羊IgG与0.50%异嗜性抗体阻断剂的组合效果最好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。因此,本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种自身免疫性肌炎病的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:由JO-1抗原、OJ抗原、EJ抗原、PL-7抗原、PL-12抗原、SRP抗原、HMGCR抗原、Mi-2α抗原、Mi-2β抗原、TIF1γ抗原、NXP2抗原、SAE1抗原、MDA5抗原、SSA/Ro52kD抗原、Ku抗原、PM-Scl 75抗原和PM-Scl100抗原分别包被的荧光编码磁性微球的混悬液和荧光物质标记的二抗溶液;所述JO-1抗原包括抗原A和抗原B,其中,所述抗原A为天然抗原,所述抗原B为重组抗原。
2.根据权利要求1所述的自身免疫性肌炎病的检测试剂盒,其特征在于,包被有JO-1抗原的荧光编码磁性微球上包被的所述抗原A和所述抗原B的质量比为(1~3):1。
3.根据权利要求1所述的自身免疫性肌炎病的检测试剂盒,其特征在于,所述抗原A和所述抗原B的氨基酸序列相同,所述抗原A和所述抗原B的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的自身免疫性肌炎病的检测试剂盒,其特征在于,所述荧光物质标记的二抗为抗人IgG抗体,所述抗人IgG抗体选自羊抗人IgG抗体或鼠抗人IgG抗体中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的自身免疫性肌炎病的检测试剂盒,其特征在于,所述荧光物质包括藻红蛋白、藻红蛋白-Cy7复合染料、异硫氰酸荧光素、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物、别藻青蛋白中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的自身免疫性肌炎病的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括二抗稀释液。
7.根据权利要求6所述的自身免疫性肌炎病的检测试剂盒,其特征在于,所述二抗稀释液包括含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液和阻断剂。
8.根据权利要求7所述的自身免疫性肌炎病的检测试剂盒,其特征在于,所述阻断剂包括主动阻断剂和被动阻断剂,所述主动阻断剂选自人抗鼠抗体阻断剂、异嗜性抗体阻断剂和类风湿因子阻断剂中的至少一种;所述被动阻断剂选自鼠IgG、绵羊IgG、山羊IgG和牛IgG中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的自身免疫性肌炎病的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括样本稀释液;所述样本稀释液包括含蛋白血清的磷酸盐缓冲液和tris缓冲液中的至少一种。
10.一种检测自身免疫性肌炎病的方法,其特征在于,包括以下步骤:取待测样本,使用如权利要求1~9任一项所述的试剂盒进行抗原-抗体反应,通过对反应产物进行荧光强度检测,分析检测结果。
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