CN115267165A - 一种悬浮芯片系统及其应用以及基于悬浮芯片系统对肿瘤伴随诊断因子检测方法 - Google Patents

一种悬浮芯片系统及其应用以及基于悬浮芯片系统对肿瘤伴随诊断因子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种悬浮芯片系统及其应用以及基于悬浮芯片系统对肿瘤伴随诊断因子检测方法，涉及体外诊断技术领域，包括以下步骤：第一步，将6种不同的肿瘤伴随诊断因子筛选出的捕获抗体分别偶联至带有不同荧光染料的Luminex磁性微球，第二步，将适合的临床样本的抗原与标记有不同肿瘤伴随诊断因子的捕获抗体结合；第三步，将生物素化的检测抗体与已经连接捕获抗体的抗原结合；第四步，将SAPE与第三步中的生物素结合；第五步，基于CCD成像的原理或流式的原理进行检测，通过Luminex磁性微球的荧光编码信号从而确定目标因子的种类，达到高通量的检测目的，通过检测报告荧光信号的强度，确定目标因子的含量，使得本发明具有更优的效率、速度，且所需样本量少。

Description

一种悬浮芯片系统及其应用以及基于悬浮芯片系统对肿瘤伴 随诊断因子检测方法
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及到一种悬浮芯片系统及其应用以及基于悬浮芯片系统对肿瘤伴随诊断因子检测方法。
背景技术
伴随诊断(companion diagnostics，CDx)通常是一种体外诊断设备，它对于患者用药是必需的，它可以为患者使用药物的安全性和有效性提供重要的信息，包括：确定最有可能从药物中受益的患者；确定该药物相关严重不良反应风险较大的患者；确定已经经过充分研究具备安全性和有效性的人群亚组等。
目前已报道的肿瘤伴随诊断因子TGF-α(转化生长因子α)， TGF-β1(转化生长因子β1)，CXCL12(趋化因子配体12)，VEGF (血管内皮生长因子)，GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)， G-CSF(粒细胞集落刺激因子)的检测方法，比如，针对VEGF项目的检测方法有化学发光法、荧光免疫层析法、量子点免疫荧光法，以上 3种方法学只能做到一个测试针对一种蛋白，具有特定性，不具备广泛的适用性，同理，其他几种肿瘤伴随诊断因子对应的项目也是如此。传统流式荧光发光法可以做多项检测，但是相对检测时间耗时长。因此这些检测方法已经不足以满足临床的使用需要，目前迫切需要一种快速、简便、高通量的检测方法，实现对多种肿瘤伴随诊断因子的同时检测。
现有技术中，ELISA实验原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色氧化型，出现颜色反应。通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。通过ELISA检测仪进行定量测定，ELISA是一种既特异又敏感的检测方法。但是由于其方法学重复性不好，不论仪器和手工操作，干扰因素较多，温度和时间影响最大。
因此，存在待改进之处，本发明相对于市场上的现有的针对肿瘤伴随诊断因子(TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF，G-CSF) 的检测方法，本发明的多重检测可通过一个测试检出6个检测结果，检测结果的特异性和灵敏度相当于ELISA，具有更优的效率、速度，且所需样本量少。
发明内容
针对现有技术所存在的不足，本发明目的在于提出一种悬浮芯片系统及其应用以及基于悬浮芯片系统对肿瘤伴随诊断因子检测方法，具体方案如下：
一种悬浮芯片系统，包括分别与TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF， GM-CSF，G-CSF此六种不同的肿瘤伴随诊断因子所对应的捕获抗体偶联的Luminex磁性微球。
使用基于所述的悬浮芯片系统检测样本中TGF-α，TGF-β1， CXCL12，VEGF，GM-CSF，G-CSF的应用。
一种基于悬浮芯片系统对肿瘤伴随诊断因子的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
第一步，将6种不同的肿瘤伴随诊断因子筛选出的捕获抗体分别偶联至带有不同荧光染料的Luminex磁性微球，其中该6种不同的肿瘤伴随诊断因子分别为TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF， G-CSF；
第二步，将适合的临床样本的抗原与标记有不同肿瘤伴随诊断因子的捕获抗体结合；
第三步，将生物素化的检测抗体与已经连接捕获抗体的抗原结合；
第四步，将SAPE与第三步中的生物素结合；
第五步，基于CCD成像的原理和流式的原理进行检测，分别激发 Luminex磁性微球的荧光编码信号和SAPE的报告荧光信号，再通过 CCD成像装置或流式分析装置并由软件进行Luminex磁性微球分类及结果检测，通过Luminex磁性微球的荧光编码信号从而确定目标因子的种类，达到高通量的检测目的，通过检测报告荧光信号的强度，确定目标因子的含量。
进一步的，在第一步中，肿瘤伴随诊断因子筛选出的捕获抗体偶联至对应的Luminex磁性微球的具体过程如下：
S1，根据微球的产品信息表将保存的未偶联的Luminex磁性微球重悬；
S2，将5.0*106颗Luminex磁性微球转移到离心管中；
S3，将离心管放置在磁力板上30-60秒，将微球与溶液分开，将离心管保持在磁力分离器上，将上清液倒去，保持微球处于静止状态；
S4，移走磁力分离器并用100μL去离子水，振荡及超声20秒重悬微球；
S5，将离心管放在磁力分离器上30-60秒，将离心管保持在磁力分离器上，将上清液倒去，保持微球处于静止状态；
S6，移走磁力分离器并用80μL、100mM、pH6.2的磷酸氢二钠缓冲液，振荡及超声约20秒重悬微球；
S7，加入10μL的50mg/mL的Sulfo-NHS溶液中，轻柔振荡混匀，再加入10μL的50mg/mL的EDC溶液，轻柔振荡混匀，在室温中孵育20分钟，每隔10分钟轻柔振荡混匀一次；
S8，将离心管放在磁力分离器上30-60秒分离微球，将离心管保持在磁力分离器上，将上清液倒去，保持微球处于静止状态；
S9，移走磁力分离器并用250μL的50mM MES、pH 5.0的溶液，振荡及超声20秒重悬微球；
S10，用50mMMES,pH 5.0缓冲液重复S8及S9进行两次清洗；
S11，移走磁力分离器并用100μL的50mM MES、pH 5.0的溶液，振荡及超声20秒重悬活化并清洗后的微球；
S12，分别加入与肿瘤伴随诊断因子对应的蛋白到悬浮的微球溶液中；
S13，用50mM MES、pH 5.0的溶液将总体积增至500μL，振荡混匀进行偶联反应，在室温中边翻转混合边孵育2个小时；
S14，将离心管放在磁力分离器上30-60秒分离微球，将离心管保持在磁力分离器上，将上清液倒去，保持微球处于静止状态；
S15，移走磁力分离器并用500μL的PBS-TBN溶液，振荡及超声20秒重悬偶联后的微球；
S16，将离心管放在磁力分离器上30-60秒分离微球，将离心管保持在磁力分离器上，将上清液倒去，保持微球处于静止状态；
S17，移走磁力分离器并用PBS-TBN溶液，振荡及超声20秒重悬微球；
S18，重复S16及S17，两次清洗总共使用1mL PBS-TBN溶液；
S19，移走磁力分离器并用250μL-1000μL的PBS-TBN溶液，重悬偶联及清洗后的微球；
S20，使用细胞计数器或者血球计数器计算偶联反应后微球的回收数量；
S21，在2-8℃的黑暗环境中保存偶联后的微球。
进一步的，所述检测方法的详细过程如下：
A1，选择偶联了6种不同的肿瘤伴随诊断因子的捕获抗体的微球组，振荡超声20秒来重悬微球；
A2，按每个编号50个微球/μL的终浓度将偶联后的微球混合在一起存储在检测缓冲液中制成检测微球混合液；
A3，吸取50μL检测微球混合液到相应的圆底96孔板的孔中，空白对照孔加入50μL检测缓冲液作为对照；
A4，加入50μL的标准品或者样品到相应的孔中；
A5，盖上96孔板，将其放置在800转/分钟的摇床上室温孵育30分钟；
A6，将96孔板放置在磁性分离板上30-60秒，使用多通道移液器移去每个孔的上清液，不要搅动微球；
A7，将96孔板离开磁性分离板进行清洗；
A8，移走磁性分离板并加入50μL的检测缓冲液，使用多通道移液器吸放数次混匀；
A9，使用检测缓冲液将生物素化的检测抗体稀释到4μg/mL，每个孔加入50μL稀释后的检测抗体，混匀，盖上96孔板，将其放置在800转/分钟摇床上室温孵育30分钟；
A10，将96孔板放置在磁性分离板上30-60秒，使用多通道移液器移去每个孔的上清液，不要搅动微球；
A11，将96孔板离开磁性分离板进行清洗；
A12，移走磁性分离板并加入50μL的检测缓冲液，使用多通道移液器吸放数次混匀；
A13，将SAPE用检测缓冲液稀释到4μg/mL，每个孔中加入50 μL的稀释后SAPE溶液；
A14，盖上96孔板，将其放置在800转/分钟摇床上室温孵育30 分钟；
A15，将96孔板放置在磁性分离板上30-60秒，使用多通道移液器移去每个孔的上清液，不要搅动微球；
A16，将96孔板离开磁性分离板进行清洗；
A17，移走磁性分离板并加入100μL的检测缓冲液，使用多通道移液器吸放数次混匀；
A18，按照仪器使用说明检测50-75μL反应溶液。
进一步的，所述A7、A11以及A16中，清洗的具体步骤如下：
a.每个孔加入100μL反应缓冲液；
b.用多通道移液器从每个孔吸去上清液，不要搅动微球；
c.重复上面的a和b步骤。
进一步的，所述检测方法在仪器MAGPIX、仪器
Figure BDA0003798717740000071
200或仪器FLEXMAP 3DTM3种仪器中进行。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)通过第一步和第二步，不同的微球通过对应不同肿瘤伴随诊断因子的捕获抗体捕捉到抗原，此时，抗原的一个位点上连接了一种抗体，通过第三步，抗原的另一个位点连接上第二种抗体，即检测抗体，形成双抗体夹心结构，通过第四步，由于SAPE为藻红蛋白标记的链霉亲和素，通过生物素和亲和素的高特异性连接双抗体夹心结构和检测荧光信号，通过第五步，得出目标因子的种类和含量。
(2)基于Luminex xMAP(多分析物谱分析)技术的免疫检测可实现TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF，G-CSF对应的多种肿瘤伴随诊断因子的同时检测和定量，本发明方法的悬浮芯片技术应用到肿瘤领域的伴随诊断、辅助诊断及预后判断等方面，通过对患者样本进行特定蛋白的监测，即肿瘤伴随诊断因子种类、含量的监测，使临床医生和患者全面了解机体健康状况，为患者用药提供使用药物的安全性和有效性提供重要的信息。
(3)在偶联的具体过程中，本发明将6种偶联有抗体的微球组混合并同时工作，摸索出通用性强的缓冲环境，以保证稳定检测环境, 且摸索出配方消除非特异性反应；在检测的详细过程中，设计的6重抗体微球组不影响后期抗原与6重SAPE特异性杂交；设计的多重SAPE 使其能够在保证特异性结合的前提下尽量提高荧光报告分子与磁性微球的杂交信号值。
(4)本发明由于设计了基于生物素-亲和素的放大系统，灵敏度高，检测范围广。相对于市场上的现有的针对肿瘤伴随诊断因子(TGF- α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF，G-CSF)的检测方法，多重检测可一个测试检出6个检测结果，具有更优的效率、速度，且所需样本量少。而且，本发明的单个样本可获得多个指标的高通量技术得到的结果相当于ELISA，但具有更优的效率、速度和检测范围，所需样本量少。此外，采用多重检测能降低每个靶标结果的成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不仅限于此。
现有技术中，链霉亲和素(streptavidin下称SA)是与亲和素 (avidin下称AV)有相似生物学特性的一种蛋白质，是streptomyces avidinii菌的分泌物，其分子量及结合生物素的能力与鸡蛋清中的亲和素相似，等电点6.0，非特异性结合远比亲和素低。藻红蛋白(P-phycoerythrin,PE)是从红藻中分离纯化的，普遍使用地新型荧光标记试剂。在特定波长激发下，藻红蛋白能发射强烈的荧光，其荧光强度是荧光素的30-100倍。具有很好的吸光性能和很高的量子产率，在可见光谱区有很宽的激发及发射范围。用常规的标记方法可以很方便地将其与生物素、亲和素和各种单克隆抗体结合起来制成荧光探针，用于免疫检测、荧光显微技术和流式细胞荧光测定等临床诊断及生物工程技术。
本发明中的SAPE采用的是藻红蛋白标记的链霉亲和素(SA-PE)，源于美国Molecular Probes公司。
现有技术中，磁性微球即羧基化微球，具有低非特异性吸附，可在特殊化学试剂(如EDC)的作用下与多肽、蛋白、抗体、寡聚核苷酸等生物配体共价偶联,尤其适合于细胞分选、亲和层析、免疫分析。羧基化磁微球具有良好的亲水性和单分散性。由于磁性含量比较高，长时间放置后,微球易沉淀在底部,使用前短时间超声,摇晃即可重悬。
本发明中的Luminex磁性微球即上述的羧基化微球，源于美国 Luminex公司。
本发明基于上述的SAPE、Luminex磁性微球与抗原、抗体结合， Luminex磁性微球中携带了双抗体夹心结构，作为悬浮芯片系统，形成一种检测肿瘤伴随诊断因子的手段，Luminex磁性微球基于 Luminex xMAP(多分析物谱分析)技术的免疫检测可实现多种肿瘤伴随诊断因子(TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF，G-CSF)的同时检测和定量，对于生物系统的综合研究而言具有宝贵价值。同时还可制造得出一种包含有TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF， G-CSF中一种或任意几种自由组合组成的检测试剂盒，便于样本的现场检测。
本发明的检测方法得到的结果的特异性和灵敏度相当于ELISA。 TGF-α/TGF-β1/CXCL12/VEGF/GM-CSF/G-CSF联合检测试剂盒,通过特定蛋白的监测，可动态监测肿瘤发生、迁移、浸润以及预后，为临床提供更多患者免疫信息。
基于上述内容，本发明需要同时检测6种目标因子，需把每种因子区分开来，为此本发明采用了Luminex公司整套的磁性微球，对应有产品信息表，在整套磁性微球中筛选出自带信息编号的Luminex 磁性微球。其次，针对6种肿瘤伴随诊断因子各筛选出一对特异性强的抗体，并将捕获抗体偶联至带有信息编码的Luminex磁性微球上。然后，采用双抗体夹心的方法特异性捕获抗原，并通过生物素和亲和素的高特异性连接双抗体夹心结构和检测荧光信号。
检测方法包括以下步骤：
第一步，将6种不同的肿瘤伴随诊断因子筛选出的捕获抗体分别偶联至带有不同比例的荧光染料的Luminex磁性微球，其中该6种不同的肿瘤伴随诊断因子分别为TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF， G-CSF；
第二步，将适合的临床样本的抗原与标记有不同肿瘤伴随诊断因子的捕获抗体结合；
第三步，将生物素化的检测抗体与已经连接捕获抗体的抗原结合；
第四步，将SAPE与第三步中的生物素结合；
第五步，基于CCD成像的原理或流式的原理进行检测，分别激发Luminex磁性微球的荧光编码信号和SAPE的报告荧光信号，再通过高灵敏度的CCD成像装置或流式分析装置并由软件经特定的算法进行Luminex磁性微球分类及结果检测，通过Luminex磁性微球的荧光编码信号从而确定目标因子的种类，依次达到高通量的检测目的，通过检测报告荧光信号的强度，确定目标因子的含量。
其中，在第一步中，肿瘤伴随诊断因子筛选出的捕获抗体偶联至对应的Luminex磁性微球的具体过程如下：
S1，根据微球的产品信息表将保存的未偶联的Luminex磁性微球重悬；
S2，将5.0*106颗Luminex磁性微球转移到离心管中；
S3，将离心管放置在磁力板上30-60秒，将微球与溶液分开，将离心管保持在磁力分离器上，将上清液倒去，保持微球处于静止状态；
S4，移走磁力分离器并用100μL去离子水，振荡及超声20秒重悬微球；
S5，将离心管放在磁力分离器上30-60秒，将离心管保持在磁力分离器上，将上清液倒去，保持微球处于静止状态；
S6，移走磁力分离器并用80μL、100mM、pH6.2的磷酸氢二钠缓冲液，振荡及超声约20秒重悬微球；
S7，加入10μL的50mg/mL的Sulfo-NHS溶液中，轻柔振荡混匀，再加入10μL的50mg/mL的EDC溶液，轻柔振荡混匀，在室温中孵育20分钟，每隔10分钟轻柔振荡混匀一次；Sulfo-NHS溶液即N-羟基琥珀酰亚胺溶液，EDC即1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，是一种有机化合物，化学式为C8H17N3，溶于水中，形成溶液；
S8，将离心管放在磁力分离器上30-60秒分离微球，将离心管保持在磁力分离器上，将上清液倒去。保持微球处于静止状态；
S9，移走磁力分离器并用250μL的50mM MES、pH 5.0的溶液，振荡及超声20秒重悬微球；2-(N-吗啉)乙磺酸简称MES，分子式为 C6H13NO4S，50mM即50mmol/L；
S10，用50mMMES,pH 5.0缓冲液重复S8及S9进行两次清洗；
S11，移走磁力分离器并用100μL的50mM MES、pH 5.0的溶液，振荡及超声20秒重悬活化并清洗后的微球；
S12，分别加入与肿瘤伴随诊断因子对应的蛋白到悬浮的微球溶液中；
S13，用50mM MES、pH 5.0的溶液将总体积增至500μL，振荡混匀进行偶联反应，在室温中边翻转混合边孵育2个小时；
S14，将离心管放在磁力分离器上30-60秒分离微球，将离心管保持在磁力分离器上，将上清液倒去，保持微球处于静止状态；
S15，移走磁力分离器并用500μL的PBS-TBN溶液，振荡及超声 20秒重悬偶联后的微球；PBS-TBN为0.01M PBS+0.1％BSA+0.05％ NaN3+0.02％Tween-20；
S16，将离心管放在磁力分离器上30-60秒分离微球，将离心管保持在磁力分离器上，将上清液倒去，保持微球处于静止状态；
S17，移走磁力分离器并用PBS-TBN溶液，振荡及超声20秒重悬微球；
S18，重复S16及S17，两次清洗总共使用1mL PBS-TBN溶液；
S19，移走磁力分离器并用250μL-1000μL的PBS-TBN溶液，重悬偶联及清洗后的微球；
S20，使用细胞计数器或者血球计数器计算偶联反应后微球的回收数量；
S21，在2-8℃的黑暗环境中保存偶联后的微球。
需要说明的是，S1-S5的功能为清洗磁性微球，将磁性微球中残留的物质清除，避免对后续反应造成交叉影响。S6-S7的功能为为通过EDC溶液、Sulfo-NHS溶液将磁性微球羧基活化。S8-S10的功能为通过MES溶液多次清洗清磁性微球，洗去多余的成分。S11-S14 的功能为正式将肿瘤伴随诊断因子筛选出的捕获抗体与磁性微球进行偶联反应。S15-S19的功能为再次清洗完成偶联后的磁性微球。S20 的功能为计数回收数量。最后，在S21将磁性微球保存，便于进行后续检测。
需要说明的是，每个肿瘤伴随诊断因子与磁性微球对应的偶联反应是独立进行的，不同的肿瘤伴随诊断因子对应在S12中蛋白的使用量不同，实际上，会使用1到150μg的蛋白量梯度来决定每种蛋白的最佳偶联使用量。具体如下：
TGF-α对应采用的使用量为75μg；
TGF-β1对应采用的使用量为75μg；
CXCL12对应采用的使用量为50μg；
VEGF对应采用的使用量为90μg；
GM-CSF对应采用的使用量为75μg；
G-CSF对应采用的使用量为90μg
而且，根据肿瘤伴随诊断因子的不同，偶联反应中，使用到的溶液的参数会存在不同，具体如下：
TGF-α对应偶联缓冲液为50mM MES PH5.0；
TGF-β1对应偶联缓冲液为50mM MES PH5.0；
CXCL12对应偶联缓冲液为50mM MES PH6.0；
VEGF对应偶联缓冲液为100mM MES PH5.0；
GM-CSF对应偶联缓冲液为50mM PB PH6.0；
G-CSF对应偶联缓冲液为100mM PB PH7.0
完成偶联后才把六种磁性微球混合形成微球组。
磁性微球完成偶联后，针对第二步至第五步，检测方法的详细过程如下：
A1，选择偶联了6种不同的肿瘤伴随诊断因子的捕获抗体的微球组，振荡超声20秒来重悬微球；
A2，按每个编号50个微球/μL的终浓度将偶联后的微球混合在一起存储在检测缓冲液中制成检测微球混合液；
A3，吸取50μL检测微球混合液到相应的圆底96孔板的孔中，空白对照孔加入50μL检测缓冲液作为对照；
A4，加入50μL的标准品或者样品到相应的孔中；
A5，盖上96孔板，将其放置在800转/分钟的摇床上室温孵育30分钟；
A6，将96孔板放置在磁性分离板上30-60秒，使用多通道移液器移去每个孔的上清液，不要搅动微球；
A7，将96孔板离开磁性分离板进行清洗；
A8，移走磁性分离板并加入50μL的检测缓冲液，使用多通道移液器吸放数次混匀；
A9，使用检测缓冲液将生物素化的检测抗体稀释到4μg/mL，每个孔加入50μL稀释后的检测抗体，混匀，盖上96孔板，将其放置在800转/分钟摇床上室温孵育30分钟；
A10，将96孔板放置在磁性分离板上30-60秒，使用多通道移液器移去每个孔的上清液，不要搅动微球；
A11，将96孔板离开磁性分离板进行清洗；
A12，移走磁性分离板并加入50μL的检测缓冲液，使用多通道移液器吸放数次混匀；
A13，将SAPE用检测缓冲液稀释到4μg/mL，每个孔中加入50 μL的稀释后SAPE溶液；
A14，盖上96孔板，将其放置在800转/分钟摇床上室温孵育30 分钟；
A15，将96孔板放置在磁性分离板上30-60秒，使用多通道移液器移去每个孔的上清液，不要搅动微球；
A16，将96孔板离开磁性分离板进行清洗；
A17，移走磁性分离板并加入100μL的检测缓冲液，使用多通道移液器吸放数次混匀；
A18，按照仪器使用说明检测50-75μL反应溶液。
需要说明的是，在A7、A11以及A16中，清洗的具体步骤如下：
a.每个孔加入100μL反应缓冲液；
b.用多通道移液器从每个孔吸去上清液，或者使用手工翻转的清洗方法注意不要搅动微球；
c.重复上面的a和b步骤。
其中，A1-A5完成后，标准品或者样品中的抗原与磁性微球中的抗体结合，标准品或者样品即临床样本，此时，抗原的一个位点上连接了一种抗体。A6-A7完成后，实现对此时的磁性微球进行清洗，将多余的成分去除。A8-A9完成后，此时，抗原的另一个位点连接上第二种抗体，即检测抗体，形成双抗体夹心结构。A10-A11完成后，实现对此时的磁性微球进行二次清洗，将多余的成分去除。A12-A14完成后，此时，SAPE通过生物素和亲和素的高特异性连接双抗体夹心结构和检测荧光信号。A15-A16完成后，实现对此时的磁性微球进行三次清洗，将多余的成分去除。最后进行A17-A18，使用基于CCD成像的仪器进行对目标因子的种类和含量的检测。
在第五步中，检测仪器可以是Luminex的影像学原理的仪器 MAGPIX，即CCD成像装置，基于CCD成像的原理进行检测。MAGPIX 仪器通过较少的鞘液将待检测的磁性微球带入暗室腔中并形成单层磁性微球后进行微球采集，磁性微球被其中的磁珠捕获板所采集，分类及检测LED光源聚焦干暗室腔中被捕获的磁性微球。分别激发磁性微球的荧光编码信号和报告荧光信号，再通过高灵敏度的CCD成像并由软件经特定的算法进行磁性微球分类及结果检测。检测仪器也可以是Luminex应用流式原理的分析仪器
Figure BDA0003798717740000171
200和仪器FLEXMAP 3DTM。应用流式原理分析仪器中均使用鞘液带动样本，内部具有激光用以激发荧光，微球在鞘液中以单颗排列通过激光，分类激光用来激发微球中特殊的荧光染料，报告激光则用来激发实验中的报导基团；分析仪内具有相应的荧光接收部件，藉由收集微球被激发后发射出的光，换算得出微球编号及微球上的实验荧光值。
检测计算软件为仪器内置软件，实验结果自动保存在桌面上的对应的文件夹中。
实施例：基于悬浮芯片系统对六种肿瘤伴随诊断因子的检测方法的建立
基于上述内容，对悬浮芯片系统检测条件进行全面的优化后的基础上，取96孔板(酶标板)，设定相应的阴性对照孔和重复孔，用配置好的标准品稀释液将TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF， G-CSF抗原稀释成不同的浓度梯度，并等比例混合；每孔取标准品50ul将第一步所获得的6种联抗体的微球等比例混合并用稀释缓冲液补足体积，取50ul，检测酶标板漩涡中速振荡0.5h(即在800转 /分钟摇床上室温孵育30分钟)，加入等比例混合的检测抗体50ul, 旋涡中速振荡0.5h,然后每孔加入稀释好的SA-PE 50ul，中速反应0.5h，悬浮芯片读取70-75ul反应溶液，获得MFI0(对应阴性对照孔)，以减去本底值所获得的MFI值(荧光信号强度值)为Y轴，以标志物的浓度为X轴，做出6种肿瘤伴随诊断因子的悬浮芯片多元标准回归曲线方程(如表1所示)，从而建立6种肿瘤伴随诊断因子的多元检测方法。
表1：肿瘤伴随诊断因子的悬浮芯片多元检测标准方程及参数
Figure BDA0003798717740000181
实际血液样品的检测
患者A：原发性肝癌患者
患者B：子宫颈癌患者
采集这2名患者实际治疗前后的血液样品并编号后，加入抗凝剂并离心后储存-20℃待用；检测，由获得荧光信号强度值代入标准曲线方程中，推算出对应的肿瘤伴随诊断因子的具体浓度，检测结果如表 2所示。
表2：患者治疗前后实际血液样品的检测
Figure BDA0003798717740000182
通过表2的结果对比可知：
患者A(原发性肝癌患者)指标变化有差异，浓度的绝对值高低也一定程度上如何为病变程度提供参考，患者A化疗以后TGF-α， TGF-β1，CXCL12,VEGF这4个因子的浓度均有所下降，GM-CSF，G-CSF 这2个因子的浓度变化不大，且出现略微上升。可知，该患者A从该药物治疗中受益。
患者B(子宫颈癌患者)指标变化有差异，浓度的绝对值高低也一定程度上如何为病变程度提供参考，患者B放疗以后TGF-α，TGF- β1，CXCL12,VEGF这4个因子的浓度均有所下降，GM-CSF，G-CSF这 2个因子的浓度变化不大，且出现略微上升。可知，该患者B从该药物治疗中受益。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种悬浮芯片系统，其特征在于，包括分别与TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF，G-CSF此六种不同的肿瘤伴随诊断因子所对应的捕获抗体偶联的Luminex磁性微球。
2.使用基于权利要求1所述的悬浮芯片系统检测样本中TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF，G-CSF的应用。
3.一种基于权利要求1所述的悬浮芯片系统对肿瘤伴随诊断因子的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
第一步，将6种不同的肿瘤伴随诊断因子筛选出的捕获抗体分别偶联至带有不同荧光染料的Luminex磁性微球，其中该6种不同的肿瘤伴随诊断因子分别为TGF-α，TGF-β1，CXCL12，VEGF，GM-CSF，G-CSF；
第二步，将适合的临床样本的抗原与标记有不同肿瘤伴随诊断因子的捕获抗体结合；
第三步，将生物素化的检测抗体与已经连接捕获抗体的抗原结合；
第四步，将SAPE与第三步中的生物素结合；
第五步，基于CCD成像的原理和流式的原理进行检测，分别激发Luminex磁性微球的荧光编码信号和SAPE的报告荧光信号，再通过CCD成像装置或流式分析装置并由软件进行Luminex磁性微球分类及结果检测，通过Luminex磁性微球的荧光编码信号从而确定目标因子的种类，达到高通量的检测目的，通过检测报告荧光信号的强度，确定目标因子的含量。
4.根据权利要求3所述的基于悬浮芯片系统对肿瘤伴随诊断因子的检测方法，其特征在于，在第一步中，肿瘤伴随诊断因子筛选出的捕获抗体偶联至对应的Luminex磁性微球的具体过程如下：
S1，根据微球的产品信息表将保存的未偶联的Luminex磁性微球重悬；
S2，将5.0*106颗Luminex磁性微球转移到离心管中；
S3，将离心管放置在磁力板上30-60秒，将微球与溶液分开，将离心管保持在磁力分离器上，将上清液倒去，保持微球处于静止状态；
S4，移走磁力分离器并用100μL去离子水，振荡及超声20秒重悬微球；
S5，将离心管放在磁力分离器上30-60秒，将离心管保持在磁力分离器上，将上清液倒去，保持微球处于静止状态；
S6，移走磁力分离器并用80μL、100mM、pH6.2的磷酸氢二钠缓冲液，振荡及超声约20秒重悬微球；
S7，加入10μL的50mg/mL的Sulfo-NHS溶液中，轻柔振荡混匀，再加入10μL的50mg/mL的EDC溶液，轻柔振荡混匀，在室温中孵育20分钟，每隔10分钟轻柔振荡混匀一次；
S8，将离心管放在磁力分离器上30-60秒分离微球，将离心管保持在磁力分离器上，将上清液倒去，保持微球处于静止状态；
S9，移走磁力分离器并用250μL的50mM MES、pH 5.0的溶液，振荡及超声20秒重悬微球；
S10，用50mMMES,pH 5.0缓冲液重复S8及S9进行两次清洗；
S11，移走磁力分离器并用100μL的50mM MES、pH 5.0的溶液，振荡及超声20秒重悬活化并清洗后的微球；
S12，分别加入与肿瘤伴随诊断因子对应的蛋白到悬浮的微球溶液中；
S13，用50mM MES、pH 5.0的溶液将总体积增至500μL，振荡混匀进行偶联反应，在室温中边翻转混合边孵育2个小时；
S14，将离心管放在磁力分离器上30-60秒分离微球，将离心管保持在磁力分离器上，将上清液倒去，保持微球处于静止状态；
S15，移走磁力分离器并用500μL的PBS-TBN溶液，振荡及超声20秒重悬偶联后的微球；
S16，将离心管放在磁力分离器上30-60秒分离微球，将离心管保持在磁力分离器上，将上清液倒去，保持微球处于静止状态；
S17，移走磁力分离器并用PBS-TBN溶液，振荡及超声20秒重悬微球；
S18，重复S16及S17，两次清洗总共使用1mL PBS-TBN溶液；
S19，移走磁力分离器并用250μL-1000μL的PBS-TBN溶液，重悬偶联及清洗后的微球；
S20，使用细胞计数器或者血球计数器计算偶联反应后微球的回收数量；
S21，在2-8℃的黑暗环境中保存偶联后的微球。
5.根据权利要求4所述的基于悬浮芯片系统对肿瘤伴随诊断因子的检测方法，其特征在于，所述检测方法的详细过程如下：
A1，选择偶联了6种不同的肿瘤伴随诊断因子的捕获抗体的微球组，振荡超声20秒来重悬微球；
A2，按每个编号50个微球/μL的终浓度将偶联后的微球混合在一起存储在检测缓冲液中制成检测微球混合液；
A3，吸取50μL检测微球混合液到相应的圆底96孔板的孔中，空白对照孔加入50μL检测缓冲液作为对照；
A4，加入50μL的标准品或者样品到相应的孔中；
A5，盖上96孔板，将其放置在800转/分钟的摇床上室温孵育30分钟；
A6，将96孔板放置在磁性分离板上30-60秒，使用多通道移液器移去每个孔的上清液，不要搅动微球；
A7，将96孔板离开磁性分离板进行清洗；
A8，移走磁性分离板并加入50μL的检测缓冲液，使用多通道移液器吸放数次混匀；
A9，使用检测缓冲液将生物素化的检测抗体稀释到4μg/mL，每个孔加入50μL稀释后的检测抗体，混匀，盖上96孔板，将其放置在800转/分钟摇床上室温孵育30分钟；
A10，将96孔板放置在磁性分离板上30-60秒，使用多通道移液器移去每个孔的上清液，不要搅动微球；
A11，将96孔板离开磁性分离板进行清洗；
A12，移走磁性分离板并加入50μL的检测缓冲液，使用多通道移液器吸放数次混匀；
A13，将SAPE用检测缓冲液稀释到4μg/mL，每个孔中加入50μL的稀释后SAPE溶液；
A14，盖上96孔板，将其放置在800转/分钟摇床上室温孵育30分钟；
A15，将96孔板放置在磁性分离板上30-60秒，使用多通道移液器移去每个孔的上清液，不要搅动微球；
A16，将96孔板离开磁性分离板进行清洗；
A17，移走磁性分离板并加入100μL的检测缓冲液，使用多通道移液器吸放数次混匀；
A18，按照仪器使用说明检测50-75μL反应溶液。
6.根据权利要求5所述的基于悬浮芯片系统对肿瘤伴随诊断因子的检测方法，其特征在于，所述A7、A11以及A16中，清洗的具体步骤如下：
a.每个孔加入100μL反应缓冲液；
b.用多通道移液器从每个孔吸去上清液，不要搅动微球；
c.重复上面的a和b步骤。
7.根据权利要求3所述的基于悬浮芯片系统对肿瘤伴随诊断因子的检测方法，其特征在于，所述检测方法在仪器MAGPIX、仪器
Figure FDA0003798717730000051
200或仪器FLEXMAP 3DTM3种仪器中进行。
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