CN105408498A - 基因表达生物标志物及其用于潜在需要hdac抑制剂治疗的患者中的诊断和预后应用的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的一个或多个基因作为用于HDAC抑制剂治疗的生物标志物的用途。上述基因的表达和/或变化优选是通过由上述基因表达的各自相应的mRNA或一种或多种蛋白质来测定。

Description

基因表达生物标志物及其用于潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者中的诊断和预后应用的用途
本发明针对可与HDAC抑制剂治疗结合使用的某些特定生物标志物、其中应用所述生物标志物的方法、以及供所述方法使用的试剂盒。
发明背景
对由非基本DNA序列变化的机制所致的表型(表观)或基因表达的可遗传变化的研究被称为表观遗传学。可能的是此类变化通过细胞分裂仍存在于剩余的细胞生命中，并且可以存在多代。所述非遗传因素使得生物体的基因以不同方式表现或表达它们自己(菲利普亨特(PhilipHunter)的专题报告：“基因记住什么”(Specialreport:“Whatgenesremember”)，展望杂志(ProspectMagazine)，2008年5月，146期)。
最近的表观遗传学探究已显示环境因素影响生物体的特征并且可有时被传递到后代。迄今科学表明，涉及分子结构的那些重要因素为染色体的结构组分、组蛋白、为了以有序且紧凑的方式储存DNA而用于DNA的一种包装物。取决于它们所携带的化学基团和相应的修饰，例如如果它们被乙酰化、磷酸化或甲基化，那么它们永久地激活基因或使基因失活。
作为整体，在各种各样的生物体(包括原核生物、植物和动物)中已报告了多于100个跨代表观遗传改变实例(阿波龙卡伊娃(ablonka,Eva)；加尔拉斯(GalRaz),2009,生物学评论季刊(QuarterlyReviewofBiology),84(2):131–176)。
表观遗传机制的分子基础是复杂且多样化的，并且涉及某些基因的激活状态的改变，但非DNA的基本结构和序列的改变。此外，与DNA相关的染色质蛋白可处于由多种蛋白质修饰诱导的激活或沉默状态。如以上提及的，当细胞分化时也保留了例如染色质的此类表观遗传变化。基于这些修饰，围绕组蛋白缠绕的DNA的方式被改变，并且由于此结构修饰，基因表达也被改变。染色质重建的此类机制可通过若干机制完成。
一个重要过程包括组成组蛋白的氨基酸的翻译后修饰，这可能发生为例如乙酰化、甲基化和/或磷酸化。如果氨基酸被修饰，那么组蛋白的总体形状可能被改变。而且，在复制过程中DNA不完全解绕，因此，似乎可能的是此类修饰的组蛋白可被携带到DNA的每个新拷贝中。然后这些修饰的组蛋白可作为模板结构，使得周围的新组蛋白也以修饰的方式成形。
具体地组蛋白的非结构化的N端(也称为“组蛋白尾”)被高度修饰，但是组蛋白修饰可在整个序列上发生。这些修饰包括乙酰化、甲基化、遍在蛋白化、磷酸化以及苏素化。例如，通过组蛋白乙酰转移酶(HAT)进行的组蛋白H3尾的K14和K9赖氨酸的乙酰化通常与转录能力相关。因此脱乙酰作用与转录沉默相关并且通过具有组蛋白脱乙酰酶(HDAC)活性的酶服务来发生。
据认为乙酰化与“激活的”转录相关联的倾向在本质上是生物物理学的。因为赖氨酸残基通常在其末端具有带正电的氮，并且因此可以缔合到DNA主链的带负电的磷酸根。相比之下，一旦乙酰化事件改变赖氨酸侧链上的这个带正电的胺基，所述胺基就转化成中性酰胺键中，从而使得DNA从组蛋白松解。发生这种情况时，转录因子和复合体能够更容易地结合DNA，并且使得转录过程发生。这可被称为表观遗传机制的“顺式”模型，其中组蛋白尾的变化对DNA本身具有直接影响。在表观遗传机制的另一种模型即“反式”模型中，组蛋白尾的变化对DNA起间接作用。例如，赖氨酸乙酰化可产生用于染色质修饰酶(以及基本转录机器)的结合位点，这然后使染色质状态变化。实际上，在许多酶中发现保守的布罗莫结构域，即特异性结合乙酰基-赖氨酸的蛋白质区段(结构域)，帮助激活转录，包括SWI/SNF复合体(在蛋白质多同源调节域蛋白上)。总之，似乎是乙酰化以“顺式”和“反式”两种模型起作用，以修饰转录激活。
据信不同的组蛋白修饰以不同的方式起作用；在一个位置处的乙酰化有可能以不同于另一个位置处的乙酰化的方式起作用。而且，可发生多次修饰，并且这些修饰可一起作用以改变核小体结构(DNA和组蛋白)的行为。对组蛋白的这些基本多次动态修饰以系统性且可再现的方式调控基因转录，并且称之为组蛋白密码。
调节表观遗传机制有希望用于多种潜在的医疗应用。先天性遗传病被很好地理解，但也清楚的是表观遗传学就例如安格曼综合征和普瑞德-威利氏综合征而论是重要的。这些是由基因缺失或基因失活导致的正常遗传病，但它们异乎寻常地常见是因为由于基因组印记，受影响的个体实质上是半合子的，并且因此单个基因敲除足以导致所述疾病，其中大多数情况将需要敲除两个拷贝(在线“人类孟德尔遗传学(MendelianInheritanceinMan)”,OMIM，www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)。
尽管一般认为多细胞生物体中的表观遗传机制参与分化，但在不同物种中观察到一些多代表观遗传改变。这些多代表观遗传性状中的大多数经过若干代后可以逐渐丧失，但仍然有可能的是多代表观遗传改变可以为进化与适应添加另一个方面。与DNA区相关联的表观遗传特征的修饰使得生物体在多代时间范围上在表达和抑制所述特定基因的表型之间转换(O.J.兰多(O.J.Rando)和K.J.韦斯特里彭(K.J.Verstrepen),2007,细胞(Cell)128(4):655–668)。当所述区的DNA序列未突变时，这个变化是可逆的并且为适应过程提供灵活性。
当前研究表明，表观遗传药物制剂可以是用于目前通用的治疗方法如辐射和化疗的公认的代替或辅助疗法，或者能够增强这些目前治疗的效果(Wang,LG；Chiao,JW,2010,国际肿瘤学杂志(Int.J.Oncolo.)3(37):533–9)。已表明通过组蛋白的构象变化实现的对例如原癌基因区和对肿瘤抑制基因序列的表观遗传控制直接影响癌症的形成和进展(伊格莱夏斯-利纳雷斯(Iglesias-Linares)等人,2010,口腔肿瘤学(OralOncology)5(46):323–9)。
此类使用表观遗传学上起作用的药物的新治疗方案提供了可逆性的机会,这是其他癌症治疗未能提供特征(李(Li),LC；卡罗尔R(Carroll,PR)；达希亚R(Dahiya,R),2005.JNCI2(97):103–15)。迄今，表观遗传药物开发主要集中于组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白脱酰酶(HDAC)，包括向市场引进新的HDAC抑制药物伏立诺他(vorinostat)和罗米地辛(omidepsin)(斯潘诺夫A(Spannhoff,A)；斯皮尔W(Sippl,W)；荣格M(Jung,M)(2009)，生物化学与细胞生物学国际期刊1(41):4–11)。特定地HDAC酶已显示在口腔鳞状细胞癌的进展中起到重要作用(伊格莱夏斯-利纳雷斯等人,(2010),口腔肿瘤学5(46):323–9)。近来已将选择HDAC同工酶的过量表达与不同癌症类型的恶化预后关联，如肝癌和其他癌症中的HDAC-1和HDAC-2(李TK(LeeTK)、波赫YP(PohYP)等人,2011:临床研究杂志(TheJournalofClinicalInvestigation),网上公布于2011年2月,www.jci.org)或结肠直肠癌中的HDAC-2(朱(Zhu)P、马丁E(MartinE)、蒙瓦塞尔J(MengwasserJ)、施拉格P(SchlagP)、扬森KP(JanssenKP)、M.,2004,癌细胞(CancerCell.)2004年5月；5(5):455-63)。如上所述，异常HDAC酶表达或活性被认为是与多种人恶性肿瘤相关联，这致使众所周知的肿瘤抑制基因阻抑并且改变对恶性肿瘤进展重要的其他因子的活性。因此，组蛋白脱乙酰酶的抑制代表了在肿瘤学药物开发中有希望的治疗概念。
今天，实际上广泛接受的是，不仅基因组成(即DNA的直接碱基序列，和/或个体的基因的突变)造成各种疾病(特别是癌症)发病，而是此外，例如影响表观遗传二次包装成染色质的环境信号的影响也可以影响或造成致病事件，促使癌发生。
上述表观遗传变化甚至可能从一个细胞子代向前传到另一个细胞子代，或者一般甚至可以传递到后代，因此提供了具有遗传和表观遗传组成的个体。
因此，应注意，不仅仅是基因组成或基因中的突变，而且个体的整体表观遗传组成可以造成疾病的发展，并且可以有助于身体对影响这种表观遗传机制的药物的反应。这样，观察由影响表观遗传机制的药物诱导的身体的任何细胞中个体表观遗传组成的变化可以呈现用以预测个体对治疗的反应的有效方法。这种个体的患病组织有可能响应于对表观遗传水平起作用的药物，其方式为与其中这种药物效应可测量的非患病组织相同或类似。
此类药物例如表现为具有组蛋白脱乙酰酶活性的酶的抑制剂，或者现在一般称为蛋白脱乙酰酶，因为它们的脱乙酰活性常常不限于以组蛋白作为客户蛋白，并且可能更广泛地直接或间接地影响原癌基因和肿瘤抑制蛋白功能。
各种HDAC抑制剂目前正经受在广泛的肿瘤实体(包括恶性血液病和实体瘤)中的临床研究，并且代表了一类具表观遗传活性的、有效的抗增殖、分化诱导和促凋亡剂。组蛋白脱乙酰酶抑制剂家族的两名成员(伏立诺他和罗米地辛)已经被批准用于治疗难治性皮肤T细胞淋巴瘤，在这些患者中它们表现出与单一治疗剂相当的临床益处。
多种另外的HDAC抑制剂现在处于不同阶段的临床开发中，包括帕比司他(panobinostat)、恩替诺特(entinostat)、贝林司他(belinostat)、吉维司他(Givinostat)以及瑞米司他(resminostat)(马克斯PA(Marks,PA)和Wu,W-s,2009,细胞生物化学杂志(J.Cell.Biochem.)；107(4):600-608)(埃利斯L(Ellis,L)和皮利R(Pili,R),2010,药物制剂(Pharmaceuticals)(Basel)；3(8)；2411-2469)。
然而，在本领域中需要在治疗意向或过程中尽早确定HDAC抑制剂治疗的效果。
ZFP64为C2H2型锌指蛋白(ZFP)家族的转录因子，它在许多细胞功能，包括发育、分化、肿瘤发生以及免疫反应中起重要作用。它是TLR信号传导与NF-κB激活以及后续炎症反应以侵入病原体的正调节蛋白(Wang等人，生物化学杂志(JBiolChem)2013，网上公布于年2013年7月15日)。然而，其生物学功能大部分仍是未知的。
基于IHC染色实验(参见http://www.proteinatlas.org/ENSG00000020256/tissue/staining+overview)，ZFP64蛋白优选在某些组织/器官中表达并且主要出现在核中。正常组织/器官中的ZFP64蛋白优选表达于：肝、胰腺和胃肠道，以及睾丸和皮肤。癌组织中的ZFP64蛋白优选在以下癌症类型中表达：肝癌、淋巴癌、胰腺癌、甲状腺癌以及肾癌。相比CRC患者的原发性肿瘤，ZFP64在肝转移中是上调的(李(Li)等人，肝胆胰腺病杂志(HepatobiliaryPancreatDisInt.)2010；9:149-53)。
已确定ZFP64通过Notch1的共激活来调控间充质细胞的分化。据报告ZFP64关联到Notch1的胞内结构域(NICD)上，并且被募集至Notch靶基因Hes1和Hey1的启动子，并且反式激活所述启动子，并且参与Notch1的共激活所致的间充质细胞分化(坂本(Sakamoto)等人,细胞科学杂志(JCellSci.)2008年5月15日；121(Pt10):1613-23.doi:10.1242/jcs.023119)。
发明概述
在临床前和临床研究中确定的是，HDAC抑制剂的使用引起特定基因表达模式的可再现调节。可以看出，HDAC抑制剂在以下各项中以相同方式调控这些基因表达：(i)在各种各样用HDAC抑制剂体外处理的不同癌症细胞类型中，以及(ii)在临床研究背景下在用HDAC抑制剂处理的癌症患者的外周血细胞中，以及(iii)在用HDAC抑制剂活体外处理的健康供体的PBMC中。
因此可以推断，给定患者的癌细胞和外周血细胞的总体表观遗传组成在其对某些药理学试剂如HDAC抑制剂的影响的易感性方面是相当的，并且因此这两种细胞类型将经历相同或类似的基因表达调节。因此，在患者的外周血细胞中表观遗传学上诱导的某些特定基因的基因表达变化可以潜在地用于确定相同患者的肿瘤细胞的药物活性。
此外，在用HDAC抑制剂治疗患者的过程中基因表达谱的这些表观遗传学上诱导的变化的增加或减少可以指示对于患者的降低的或增加的治疗益处，并且因此可以与疾病预后相关联。
发明简要说明
在一个方面，本发明涉及癌细胞系和PBMC中以及癌症患者的外周血细胞中的特定选择的基因的基因表达的调节，所述基因在暴露于HDAC抑制剂后可再现地变化。
所预期的是这些基因表达调节(在此也称为生物标志物)具有各种效用。
它们可以充当所用HDAC抑制剂的药效动力学活性的标志物。
在参与HDAC抑制剂治疗之前它们可以充当预测性生物标志物(或用于分级)，从而允许预测患者是否应该用HDAC抑制剂治疗或在有待用HDAC抑制剂治疗的患者中是否可能出现或不出现临床益处。
在参与HDAC抑制剂治疗之前它们可以充当预后性生物标志物，从而允许预测对于给定患者疾病将如何进展，这无关治疗。
在HDAC抑制剂治疗过程中它们可以充当生物标志物，以便预测患者可以从所述HDAC抑制剂治疗中获益的时间，并且总体上监测所述HDAC抑制剂治疗的进展。
此外，这些生物标志物因此还可以参与疾病进展，并且由此本身可以表示治疗靶标结构。因此，可以利用各种手段使它们的活性经受治疗干扰，如通过例如siRNA干扰影响它们的mRNA表达图式；通过基因治疗来增加它们的存在；利用抗体技术来调节他们的蛋白质功能，或利用小分子结合物来改变此类生物标志物实体的功能效力。同样疫苗接种方法也是可能的。
因此本发明的主题是至少一个基因、所述至少一个基因的DNA序列、由所述至少一个基因或其长至少150(优选180)个核苷酸的片段编码的RNA序列、或由所述至少一个基因编码的至少一种蛋白质或所述蛋白质的结构域在涉及HDAC抑制剂治疗的诊断和预后方法中以及用于监测HDAC抑制剂治疗或用于对患者分级的用途，其中所述至少一个基因选自包含以下各项的组中的一个或多个成员：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1。本发明的另外的实施例是上述至少一个基因、DNA序列、RNA序列或蛋白质分别地作为治疗干扰的靶标的用途。
本发明涵盖根据本发明的生物标志物、核苷酸序列、蛋白质、试剂盒、方法和用途用于监测HDAC抑制剂治疗以及用于将潜在需要所述治疗的患者分级为反应者或非反应者的用途。
为本发明选择的基因的鉴定在表1中给出。
表1：本发明的生物标志物，通过NCBI号码、基因名称和EntrezID标示
实施方式详述
本发明的一个主题是测量根据本发明的基因中的一个或多个的基因表达，或是直接在患病组织或在外周血细胞中进行，或是在用HDAC抑制剂开始治疗之前或在治疗过程中进行。此外，本发明的另一个主题是比较治疗开始之前的基因表达和治疗过程中观察到的基因表达，测量本发明选择的基因中的一个或多个的这些表达谱中的变化。此外，本发明的另一个主题是比较接收治疗的患者的不同亚组之间的基因表达，测量本发明选择的基因中的一个或多个的这些表达谱中的差异。
本发明的某些实施例在以下列出。
1.一种测定HDAC抑制剂治疗的效果的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供接收所述HDAC抑制剂治疗的患者的样品，
b)测定所述样品中选自包含以下各项的组的至少一个基因的基因表达和/或基因表达变化：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1，
c)将所测定的所述至少一个基因的基因表达和/或基因表达变化与所述患者中所述HDAC抑制剂治疗的效果相关联。
在本发明的某些实施例中，所测定的所述至少一个基因的基因表达和/或基因表达变化与患者中HDAC抑制剂治疗的相关性可以通过将所述测定的基因表达和/或基因表达变化与从其他患者中获取的现有数据进行比较来测定，所述现有数据中所述至少一个基因的某些基因表达和/或基因表达变化已被寻址到所述HDAC抑制剂治疗的效果。这种数据可以例如以表格或机器可读数据库的形式提供。
2.一种监测HDAC抑制剂治疗的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供接收所述HDAC抑制剂治疗的患者的样品，
b)测定所述样品中选自包含以下各项的组的至少一个基因的基因表达和/或基因表达变化：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1，
c)重复以上步骤a和b至少一次，优选地多于一次，并且
d)使用步骤a)至c)中测定的所述基因表达来生成所述患者对所述HDAC抑制剂治疗的反应的时间谱。
根据本发明的监测HDAC抑制剂治疗的方法可以包括将所测定的所述至少一个基因的基因表达和/或基因表达变化与所述患者中所述HDAC抑制剂治疗的效果相关联。
3.根据以上项目1或2中任一项所述的方法，其中将所述至少一个基因的基因表达和/或基因表达变化另外与HDAC抑制剂治疗的阳性结果或阴性结果的概率相关联。
4.一种对潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者分级的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供所述患者的样品
b)测定所述样品中选自包含以下各项的组的至少一个基因的基因表达：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1
c)将所测定的所述至少一个基因的基因表达与HDAC抑制剂治疗对所述患者具有有益效果的概率相关联，并且
d)基于步骤c中测定的概率，将所述患者分类为对所述HDAC抑制剂治疗的反应者或非反应者。
5.根据以上项目4所述的方法，其中在将HDAC抑制剂给予所述患者之前提供步骤a)中提供的所述样品，
其中在步骤a)之后，将HDAC抑制剂活体外添加至所述样品中以抑制所述样品中的HDAC，并且
其中在步骤b)中，在包含所述HDAC抑制剂的所述样品中测定至少一个基因的基因表达。
具体地讲，在以上项目5中，表述“在将HDAC抑制剂给予所述患者之前提供步骤a)中提供的样品”意思是在第一次将HDAC抑制剂给予所述患者之前提供步骤a)中提供的所述样品。可替代地，在以上项目5中，表述“在将HDAC抑制剂给予所述患者之前提供步骤a)中提供的样品”意思是在第一次将特异性HDAC抑制剂(例如，瑞米司他(resminostat))给予所述患者之前提供步骤a)中提供的所述样品，所述特异性HDAC抑制剂预期给予所述患者以用于HDAC抑制剂治疗。
在一个实施例中，患者被分类为反应者，如果所述患者的样品中的CCDC43的基因表达与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比相差25％或更多，优选50％或更多，更优选75％或更多，甚至更优选100％或更多的话。在一个具体实施例中，与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达增加。在一个具体实施例中，与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达减少。
在一个实施例中，患者被分类为反应者，如果所述患者的样品中的DPP3的基因表达与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比相差25％或更多，优选50％或更多，更优选75％或更多，甚至更优选100％或更多的话。在一个具体实施例中，与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达增加。在一个具体实施例中，与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达减少。
在一个实施例中，患者被分类为反应者，如果所述患者的样品中的HIST2H4A/B的基因表达与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比相差25％或更多，优选50％或更多，更优选75％或更多，甚至更优选100％或更多的话。在一个具体实施例中，与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达增加。在一个具体实施例中，与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达减少。
在一个实施例中，患者被分类为反应者，如果所述患者的样品中的KDELC2的基因表达与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比相差25％或更多，优选50％或更多，更优选75％或更多，甚至更优选100％或更多的话。在一个具体实施例中，与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达增加。在一个具体实施例中，与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达减少。
在一个实施例中，患者被分类为反应者，如果所述患者的样品中的MICALL1的基因表达与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比相差25％或更多，优选50％或更多，更优选75％或更多，甚至更优选100％或更多的话。在一个具体实施例中，与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达增加。在一个具体实施例中，与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达减少。
在一个实施例中，患者被分类为反应者，如果所述患者的样品中的ZFP64的基因表达与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比相差25％或更多，优选50％或更多，更优选75％或更多，甚至更优选100％或更多的话。在一个具体实施例中，与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达增加。在一个具体实施例中，与健康受试者中所述基因的中值基因表达相比，所述差异为基因表达减少。
6.一种预测针对接收HDAC抑制剂治疗的患者的所述HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供所述患者的样品
b)测定所述样品中选自包含以下各项的组的至少一个基因的基因表达：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1，
c)将所述基因表达与在步骤a)之前从所述患者提供的样品中的所述至少一个基因的基因表达进行比较，并且
d)将在步骤a)中提供的所述样品中的所述至少一个基因的基因表达与在步骤a)之前提供的所述样品中的所述至少一个基因的基因表达的差异与针对所述患者的所述HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率相关联。
7.根据以上项目6所述的方法，其中在将HDAC抑制剂给予所述患者之前从所述患者提供在步骤a)之前提供的所述样品，并且
其中在将HDAC抑制剂给予所述患者之后，优选在第一次将HDAC抑制剂给予所述患者之后提供在步骤a)中提供的所述样品，其中优选地，“在给予HDAC抑制剂之前”意指在给予所述HDAC抑制剂之前1秒至一天，更优选一秒至一小时。
在一个实施例中，给定患者的HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率为75％或更大，优选85％或更大，更优选90％或更大，甚至更优选95％或更大，如果在给予HDAC抑制剂之后两小时测定的CCDC43的基因表达与在将HDAC抑制剂给予所述患者之前在所述患者的样品中测定的所述基因的基因表达相比变化25％或更多，优选50％或更多，更优选75％或更多，甚至更优选100％或更多，又甚至更优选150％或更多的话。在一个具体实施例中，所述变化为基因表达增加。在一个具体实施例中，所述变化为基因表达减少。
在一个实施例中，给定患者的HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率为75％或更大，优选85％或更大，更优选90％或更大，甚至更优选95％或更大，如果在给予HDAC抑制剂之后两小时测定的DPP3的基因表达与在将HDAC抑制剂给予所述患者之前在所述患者的样品中测定的所述基因的基因表达相比变化25％或更多，优选50％或更多，更优选75％或更多，甚至更优选100％或更多，又甚至更优选150％或更多的话。在一个具体实施例中，所述变化为基因表达增加。在一个具体实施例中，所述变化为基因表达减少。
在一个实施例中，给定患者的HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率为75％或更大，优选85％或更大，更优选90％或更大，甚至更优选95％或更大，如果在给予HDAC抑制剂之后两小时测定的HIST2H4A/B的基因表达与在将HDAC抑制剂给予所述患者之前在所述患者的样品中测定的所述基因的基因表达相比变化25％或更多，优选50％或更多，更优选75％或更多，甚至更优选100％或更多，又甚至更优选150％或更多的话。在一个具体实施例中，所述变化为基因表达增加。在一个具体实施例中，所述变化为基因表达减少。
在一个实施例中，给定患者的HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率为75％或更大，优选85％或更大，更优选90％或更大，甚至更优选95％或更大，如果在给予HDAC抑制剂之后两小时测定的KDELC2的基因表达与在将HDAC抑制剂给予所述患者之前在所述患者的样品中测定的所述基因的基因表达相比变化25％或更多，优选50％或更多，更优选75％或更多，甚至更优选100％或更多，又甚至更优选150％或更多的话。在一个具体实施例中，所述变化为基因表达增加。在一个具体实施例中，所述变化为基因表达减少。
在一个实施例中，给定患者的HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率为75％或更大，优选85％或更大，更优选90％或更大，甚至更优选95％或更大，如果在给予HDAC抑制剂之后两小时测定的MICALL1的基因表达与在将HDAC抑制剂给予所述患者之前在所述患者的样品中测定的所述基因的基因表达相比变化25％或更多，优选50％或更多，更优选75％或更多，甚至更优选100％或更多，又甚至更优选150％或更多的话。在一个具体实施例中，所述变化为基因表达增加。在一个具体实施例中，所述变化为基因表达减少。
在一个实施例中，给定患者的HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率为75％或更大，优选85％或更大，更优选90％或更大，甚至更优选95％或更大，如果在给予HDAC抑制剂之后两小时测定的ZFP64的基因表达与在将HDAC抑制剂给予所述患者之前在所述患者的样品中测定的所述基因的基因表达相比变化25％或更多，优选50％或更多，更优选75％或更多，甚至更优选100％或更多，又甚至更优选150％或更多的话。在一个具体实施例中，所述变化为基因表达增加。在一个具体实施例中，所述变化为基因表达减少。
8.一种测定需要HDAC抑制剂治疗的患者中作为药效动力学标志物的至少一个基因的基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供所述患者的样品，
b)测定所述样品中ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的基因表达和/或基因表达变化
c)将所测定的所述至少一个基因的基因表达和/或基因表达变化与HDAC抑制剂所致的相对HDAC抑制相关联。
9.根据以上项目1至8中任一项所述的方法，其中所述至少一个基因的基因表达是通过测量所述样品中由所述至少一个基因或其长至少150个核苷酸、优选长至少180个核苷酸的片段编码的至少一种mRNA的水平来测定。
10.根据以上项目1至8中任一项所述的方法，其中所述至少一个基因的基因表达是通过测量所述样品中由所述至少一个基因编码的至少一种蛋白质、或所述蛋白质的结构域的水平来测定。
11.根据以上项目10所述的方法，其中所述至少一种蛋白质或其结构域的水平和/或水平变化通过抗体或包含抗体的探针的结合来测定，其中所述抗体特异性结合所述至少一种蛋白质或其结构域。
12.根据以上项目4至11中任一项所述的方法，其中所述样品是在HDAC抑制剂治疗开始之前获取或在HDAC抑制剂治疗过程中获取。
13.根据以上项目1至12中任一项所述的方法，其中所述样品是体液样品，优选选自包含全血、血清或血浆的组的血液样品，更优选选自包含全血、血清或血浆的组的外周血样品。
14.根据以上项目1至12中任一项所述的方法，其中所述样品是组织样品，优选患病组织的样品，更优选来自癌组织的活检物。
15.根据以上项目1至14中任一项所述的方法，其中将步骤a至c或a至b重复至少一次，优选多于一次。
在本发明的方法中，其中典型地重复步骤a至c或a至b，所述步骤是在每次给予HCAD抑制剂之后或每次治疗周期之后重复。可替代地，步骤a至c或a至b可以按不太频繁的时间间隔，例如在每两次、每三次、每四次等给予HCAD抑制剂之后或每两个、每三个、每四个等治疗周期之后重复。以此方式，可以监测治疗的进程以及患者的健康状体。
16.根据以上项目1至15中任一项所述的方法，其中HDAC抑制剂选自包含以下各项的组：伏立诺他、罗米地辛、丙戊酸、帕比司他、恩替诺特、贝林司他、莫西司他、吉维司他以及瑞米司他或其药学上可接受的盐，优选游离形式的(E)-3-(1-(4-((二甲基氨基)甲基)苯磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-N-羟基丙烯酰胺或其盐酸盐或甲磺酸盐。
17.至少一个基因或由所述至少一个基因编码的蛋白质在针对需要HDAC抑制剂治疗的患者的所述HDAC抑制剂治疗中作为药效动力学标志物的用途，其中所述至少一个基因选自包含以下各项的组：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1。
18.至少一个基因或由所述至少一个基因编码的蛋白质用于预测针对需要HDAC抑制剂治疗的患者的所述HDAC抑制剂治疗的结果的用途，其中所述至少一个基因选自包含以下各项的组：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1。
19.至少一个基因或由所述至少一个基因编码的蛋白质作为用于测定HDAC活性的替代标志物的用途，其中所述至少一个基因选自包含以下各项的组：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1。
20.至少一个基因或由所述至少一个基因编码的蛋白质用于将潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者分级为反应者或非反应者的用途，其中所述至少一个基因选自包含以下各项的组：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1。
21.一种用于测定样品中选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的至少一个基因的基因表达的试剂盒，
其中所述试剂盒包含探针，所述探针特异性结合由所述至少一个基因或其长至少150个核苷酸、优选长至少180个核苷酸的片段编码的至少一种mRNA，并且
其中所述试剂盒任选地包含选自包含以下各项的组的一种或多种另外的组分：培养基、培养基组分、缓冲液、缓冲液组分、RNA纯化柱、DNA纯化柱、染料、包括dNTP混合物的核酸、包括聚合酶的酶、以及盐。
22.一种用于测定样品中由选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的基因编码的至少一种蛋白质的水平的试剂盒：
其中所述试剂盒包含探针，所述探针特异性结合由所述至少一个基因编码的至少一种蛋白质或所述蛋白质的结构域，并且
其中所述试剂盒任选地包含选自包含以下各项的组的一种或多种另外的组分：培养基、培养基组分、缓冲液、缓冲液组分、膜、ELISA板酶底物、染料、包括聚合酶的酶、以及盐。
23.根据以上项目21或22所述的试剂盒用于测定样品中选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的至少一个基因的基因表达的用途。
24.根据以上项目23所述的用途，其中将所述测定的基因表达与所述样品中的HDAC活性相关联。
25.根据以上项目23或24所述的用途，其中所述样品是从潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者中提供。
26.根据以上项目21或22所述的试剂盒在根据以上项目1至16中任一项所述的方法中的用途。
27.一种用于在潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者的治疗中使用的HDAC抑制剂，其中在所述治疗之前和/或期间，选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的至少一个基因、对应于所述至少一个基因的至少一种mRNA、或由所述至少一个基因编码的至少一种蛋白质是用于测定所述HDAC抑制剂治疗对所述患者的效果的概率，或用于测定所述患者是否是所述HDAC抑制剂治疗的反应者。
28.一种治疗潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者的方法，所述方法包括向所述患者给予HDAC抑制剂，其中在所述方法之前和/或期间，选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的至少一个基因、对应于所述至少一个基因的至少一种mRNA、或由所述至少一个基因编码的至少一种蛋白质是用于测定所述HDAC抑制剂治疗对所述患者的效果的概率，或用于测定所述患者是否是所述HDAC抑制剂治疗的反应者。
29.根据以上项目27所述的用于在潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者的治疗或根据以上项目28所述的方法中使用的HDAC抑制剂，其中所述HDAC抑制剂选自包含以下各项的组：伏立诺他、罗米地辛、丙戊酸、帕比司他、恩替诺特、贝林司他、莫西司他、吉维司他以及瑞米司他或其药学上可接受的盐，优选游离形式的(E)-3-(1-(4-((二甲基氨基)甲基)苯磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-N-羟基丙烯酰胺或其盐酸盐或甲磺酸盐。
本发明的特别优选的实施例涉及如上所述的对应方法、用途、试剂盒以及用于在潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者的治疗中使用的HDAC抑制剂，其中选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的基因是ZFP64。
更优选的实施例是如在此所述的用于预测针对接收HDAC抑制剂治疗的患者的HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率、测定所述HDAC抑制剂治疗的某些效果的概率、监测HDAC抑制剂治疗和/或对潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者分级的方法，其中选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的基因是选自包含ZFP64和DPP3的组。
甚至更优选的实施例是一种预测针对接收HDAC抑制剂治疗的患者的所述HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供所述患者的样品
b)测定所述样品中ZFP64的基因表达，
c)将所述基因表达与在步骤a)之前从所述患者提供的样品中的ZFP64的基因表达进行比较，并且
将在步骤a)中提供的所述样品中的ZFP64的基因表达与在步骤a)之前提供的所述样品中的ZFP64的基因表达的差异与针对所述患者的所述HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率相关联。本发明的甚至更特别优选的实施例涉及如上所述的预测针对接收HDAC抑制剂治疗的患者的所述HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率的优选方法，其中所述基因是ZFP64。
此外甚至更优选的实施例是一种预测针对接收HDAC抑制剂治疗的患者的所述HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率的方法，所述方法包括以下步骤：
d)提供所述患者的样品
e)测定所述样品中DPP3的基因表达，
f)将所述基因表达与在步骤a)之前从所述患者提供的样品中的DPP3的基因表达进行比较，并且
将在步骤a)中提供的所述样品中的DPP3的基因表达与在步骤a)之前提供的所述样品中的DPP3的基因表达的差异与针对所述患者的所述HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率相关联。本发明的甚至更特别优选的实施例涉及如上所述的预测针对接收HDAC抑制剂治疗的患者的所述HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率的优选方法，其中所述基因是DPP3。
在本发明的实施例(例如，根据本发明的用途、方法、试剂盒以及HDAC抑制剂)中，在适用情况下，患者优选为患癌症、具体患血液学癌症、更具体患霍奇金淋巴瘤的患者，并且在适用情况下，样品优选获自为患癌症、具体患血液学癌症、更具体患霍奇金淋巴瘤的患者。
在本发明的其他实施例(例如，根据本发明的用途、方法、试剂盒以及HDAC抑制剂)中，在适用情况下，患者优选为患CRC或HCC、更优选HCC的患者，并且在适用情况下，样品优选获自患CRC或HCC、更优选HCC的患者。
在本发明的一个具体实施例中，根据本发明的生物标志物中的一个或多个的基因表达是在向患者给予HDAC抑制剂之后的多个时间点测量的。以此方式，可以确定生物标志物的基因表达变化的时间谱，这可以增加生物标志物的有效性。一般来讲，根据本发明的生物标志物中的一个或多个是在向患者给予HDAC抑制剂之后的多个时间点测量的。优选地，根据本发明的生物标志物中的一个或多个是在向患者给予HDAC抑制剂之后的至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个时间点测量的。
在根据本发明的方法中，所述一个或多个基因的基因表达优选是HDAC抑制剂的HDAC抑制的指示。
在根据本发明的方法中，所述一个或多个基因的基因表达优选与HDAC抑制剂治疗的结果相关联。
在根据本发明的方法的某些实施例中，样品是在HDAC抑制剂治疗开始之前或在HDAC抑制剂治疗过程中获取的，这在对应方法中视情况而定。
优选地，根据本发明的试剂盒是用于测定需要HDAC抑制剂治疗的患者的样品中根据本发明的至少一个基因或根据本发明的由所述至少一个基因编码的至少一种蛋白质的水平。
如在此使用的，术语“HDAC”或组蛋白脱乙酰酶指促进组蛋白的脱乙酰作用，并且可以另外促进其他蛋白如转录因子、受体等的脱乙酰作用的酶。HDAC蛋白的家族包括从以下人基因(以它们的NCI基因ID来定义)，以及它们在其他哺乳动物物种中的对应物转录的蛋白质：HDAC1，ID:3065；HDAC2，ID:3066；HDAC3，ID:8841；HDAC4，ID:9759；HDAC5，ID:10014；HDAC6，ID:10013；HDAC7，ID:51564；HDAC8，ID:55869；HDAC9，ID:51564；HDAC10，ID:83933；HDAC11，ID:79885；SIRT1，ID:23411；SIRT2，ID:22933；SIRT3，ID:23410；SIRT4，ID:23409；SIRT5，ID:23408；SIRT6，ID:51548；SIRT7，ID:51547。
在此通过EntrezID和正式基因号码(Officialgenesymbol)(NCBI)指定的基因序列涉及人基因。然而，本发明还涵盖其他哺乳动物物种中的相应基因，以用于其中患者为非人哺乳动物的应用。
如在此使用的，术语“异羟肟酸型的HDAC抑制剂”指定包含能够螯合位于HDAC的活性位点的锌离子的异羟肟酸基团的HDAC抑制剂。
在本发明的所有实施例(包括所有方法、用途、供使用的化合物、试剂盒等)中，HDAC抑制剂具体为瑞米司他(例如，“HDAC抑制剂治疗”于是具体为“瑞米司他治疗”)。
在本发明的所有实施例(包括所有方法、用途、供使用的化合物、试剂盒等)中，选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的基因具体为ZFP64。
如在此使用的，术语“抑制”指待被抑制的实体的活性被减弱，例如就酶例如HDAC而言，所述酶进行的底物转化的周转率被减弱。
如在此使用的，在HDAC抑制剂的HDAC抑制的背景下的术语“相对抑制”意指相对于剂量前HDAC活性水平(即给予HDAC抑制剂之前)的HDAC活性的抑制。
如在此使用的，术语“HDAC的抑制的水平”或“HDAC抑制的水平”涉及在给予抑制剂之后HDAC活性被降低的比率。高的HDAC抑制水平将意味着HDAC活性被强烈降低，而低的HDAC抑制水平将意味着HDAC活性仅被稍稍降低，在各情况下都是相比给予抑制剂之前的HDAC活性而言。
如在此使用的，术语“基因表达”指代细胞中基因的表达产物的量。表达产物包括基因的转录物，例如mRNA，以及相应的翻译产物即蛋白质。基因表达通常表示为相对表达水平，即一个靶基因在给定时间点的表达是相对于一个或多个持家基因的表达和/或相对于所述靶基因在不同指定时间点的表达而言的，所述时间点通常是在给予药物之前，例如在第一次给予药物之前，或在第一次在给定治疗周期给予药物之前的时间点。基因表达指定在某一样品中靶基因的相对丰度。“基因表达”因此还包括给定基因的表达的缺乏。基因表达的绝对值通常表示为“Ct”值(见下文)并且可以针对各基因发生改变，这取决于测定表达的具体方法，具体地取决于所使用的聚合酶。
如在此使用的，表述“选自包含(例如，项目x、项目y以及项目z)的组”以及类似物优选地等同于“选自(例如，项目x、项目y以及项目z)”(其中，术语“以及”并不意味着上述项目——例如项目x、项目y以及项目z——全部都被选择，而是所述组中的项目中的一个(或多个，取决于特定背景)待被选择)。在具体实施例中，这还包括“选自由(例如，项目x、项目y以及项目z)组成的组”。
在表2中呈现出定义了如上所述的根据本发明的基因的表达的分立表达范围的数据。在此，与HDAC抑制剂治疗的结果的相关性可以在范围2和3中以某一置信度建立，并且优选地，与HDAC抑制剂治疗的结果的相关性可以在范围1和4中以更高的置信度建立。
表2：以dCt值给出的基因表达水平的定义
在表2a中呈现出定义了如上所述的根据本发明的ZFP64基因的表达的分立表达范围的数据。在此，与HDAC抑制剂治疗的结果的相关性可以在范围2中以某一置信度建立，并且优选地，与HDAC抑制剂治疗的结果的相关性可以在范围1和3中以更高的置信度建立
表2a：以dCt值给出的ZFP64基因表达的具体水平
范围1 范围2 范围3
ZFP64 <10.02 10.02-11.15 >11.15
如在此使用的，术语“基线基因表达”指定对应于在个体群体中测定的中值或平均水平的基因、RNA或蛋白质的表达水平，其中所述个体不受HDAC抑制剂的影响。所述群体可以反映总群体、或特定亚群体的人口组成，其中亚群体包括基于一个或多个因素选择的个体，所述一个或多个因素选自包含以下各项的组：医学症状，包括个体是否患有特定疾病如癌症或某种癌症类型，是否具有一定程度的疾病严重度，或是否健康；性别；种族；身体质量指数；医学症状既往史；年龄；个体生活方式中的某些因素，如酒精或物质使用、吸烟、药物、营养等。
如在此使用的，术语“基因表达变化”涉及基因在给定时间点的表达相对于所述基因在不同时间点的基因表达，优选相对于所述基因在更早时间点的基因表达的变化。这可以例如指代相对于基线基因表达(以上比较)、剂量前基因表达(即，在给予HDAC抑制剂之前相同个体的基因表达)或在治疗之前、之后或过程中的时间点测量的基因表达的基因表达变化。在某些情况下，基因的基因表达变化可以为零(即，基因表达不变)或不能被检测到；然而，此类情况也涵盖在涉及基因表达变化的实施例中，其中测定基因表达变化的结果是基因表达保持不变。
例如，基因表达变化可以通过以下方式来测定：(i)将HDAC抑制剂治疗开始前给定基因的基因表达与HDAC抑制剂治疗过程中所述基因的基因表达进行比较；(ii)将在HDAC抑制剂治疗过程中一个时间点处给定基因的基因表达与在HDAC抑制剂治疗过程中另一个时间点处所述基因的基因表达进行比较；和/或(iii)将给定基因的基因表达与从健康、患病、未治疗和/或经治疗个体群体中测定的所述基因的基因表达进行比较。
所述基因表达变化可以涉及基因表达的增加或降低，即基因的上调或下调。另外，根据本发明的多个基因可以彼此独立地被上调或下调，例如，所述基因中的一个或多个可以被上调，而其他的可以被下调，而其他基因的基因表达可以保持不变。
如在此使用的，术语“生物标志物”指定分子物质，如多肽，例如蛋白质或多核酸，例如可以作为正常生物过程、发病过程、或对治疗性干预的药物反应的指示被检测和评估的mRNA。这样，生物标志物是反映生理、药理、或疾病过程或疾病状态的可测量特征。
除非另外说明，否则术语如“生物标志物”或“一种生物标志物”包括多于一种生物标志物的组合。这意味着在某些情况下针对多于一种生物标志物收集的组合数据可以指示HDAC抑制剂治疗的某种效果。另外，针对根据本发明的一种或多种生物标志物收集的数据的预测或预后值可以通过取更多的生物标志物，如基线HDAC活性或基线组蛋白或蛋白质乙酰化水平，或在医学方面常用的其他生物标志物如身体质量指数、疾病既往史、年龄等来强化。
如在此使用的，诊断性生物标志物是如上所述的用于鉴定特定疾病状态的严重度或缺乏的生物标志物。
如在此使用的，预后性生物标志物是如上所述的用于测定患者的存活概率的生物标志物。
如在此使用的，术语“药效动力学生物标志物”或“药效动力学标志物”指定如上所述的通过给予药物例如HDAC抑制剂之后其水平变化来指示在患者中所述药物的存在和/或效果的生物标志物。所述药物可以存在于患者的整个系统中或存在于患者的特定药理学隔室中，如存在于患者的血液、体液、肝、脂肪组织或其他组织中。药效动力学生物标志物可以在新型药物测试中用于确定所述药物是否在体内命中靶标，即在体内是否存在任何HDAC抑制。
此外，药效动力学生物标志物可以例如在临床前I期临床试验中用于药代动力学/药效动力学建模(PK/PD建模)，即用于关联药代动力学行为与药效学行为，这涉及所给予的HDAC抑制剂剂量与体内抑制水平的关联。此外，药效动力学生物标志物还可以用于例如在针对I期临床试验的临床前模型研究中进行体内剂量探索，或通过使用在I期临床试验中收集的数据用于在II期临床试验中进行剂量探索。
如在此使用的，预测性生物标志物是如上所述的用于鉴定哪位患者有可能或不可能受益于具体治疗，例如区别反应者和非反应者的生物标志物。预测性生物标志物可以在给予药物之前用于患者分级或在治疗监测过程中使用，其中监测数据是用于预测进一步的治疗结果。预测性生物标志物还可以充当替代端点，即，用于确定治疗是否应当继续。
如在此使用的，“分级”或“分级了”涉及使用根据本发明的生物标志物以便根据患者的剂量前生物标志物水平，即根据本发明的生物标志物中的一个或多个在HDAC抑制剂给予之前的水平来选择患者，从而测定某一患者将受益于HDAC抑制剂治疗的概率。
如在此使用的，术语“持家基因”典型地指定经所用技术测定显示出良好的可检测表达的一个或多个构成型基因，这些基因例如在本发明中在qPCR技术中Ct值<25，且总RNA量为至少100ng。当然类似的考虑适用于其中在蛋白质水平上测定表达的情况。此外，在接收相同治疗方案的特定患者组的所有样品中，在给予药物后持家基因未显示出或显示出极小的基因表达变化。一个或多个持家基因的表达是用于标准化所测结果的偏差，所述偏差是由例如对应样品中的个体差异如不同细胞数目和/或由技术层面例如移液误差导致的。
如在此使用的，术语“靶基因”指定在此试验系统中调查某一治疗引起的其表达和调控的有关基因。
如在此使用的，术语“HDAC抑制剂治疗”或意味着需要所述HDAC抑制剂治疗的患者接收包括给予一个或多个剂量的HDAC抑制剂的治疗方案以便治疗所述患者中的医学症状(例如，疾病)，如在本发明的说明中进一步详细描述的。如在此定义的HDAC抑制剂治疗可以包括这样的时间段：从诊断医学症状开始，并包括治疗方案，直至最后的随访检查，即其中患者不接收任何更多的药物，但患者的身体状况和治疗状态得到控制。在某些情况下，随访可以包括确定HDAC抑制剂给予对给定患者的长期效果，所述HDAC抑制剂可以在最后一次给予HDAC抑制剂之后存在甚至几个月或几年。
在此背景下，“治疗周期”是指这样的时间段：其中HDAC抑制剂以某些特定时间间隔给予至患者，并且可以包括不向患者给予HDAC抑制剂使得HDAC抑制剂从所述患者完全排出的某个时间段。例如，一个治疗周期可以包括14天，其中在第1至5天每天两次给予HDAC抑制剂，并且其中在第6至14天不给予HDAC抑制剂。在HDAC抑制剂治疗过程中，治疗周期通常重复至少一次，优选多于一次，然而这可以取决于多种因素，例如像患者对HDAC抑制剂给予的反应、HDAC抑制剂的不想要的副作用的出现、患者的总体健康状体等。
如在此使用的，在“HDAC抑制剂治疗的效果”或“所述HDAC抑制剂治疗的效果”的背景下的术语“效果”包括如下文定义的HDAC抑制剂治疗的药效动力学效果和/或阳性或阴性结果。此类效果的实例是a)药效动力学效果，即对分子水平的效果，包括选自包含以下各项的组的效果：HDAC活性的降低、组蛋白乙酰化或其他蛋白质(如转录因子或受体)乙酰化的诱发、基因转录的调节、蛋白质表达的调节以及信号传导途径的活性调节；b)对患病组织或细胞的效果，包括肿瘤尺寸变化、代谢活动、细胞活力、肿瘤的血供给(即血管生成)、肿瘤组成，例如组成肿瘤的细胞如肿瘤细胞、免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞的关系；以及c)对病人医疗状态的效果，包括临床状态变化、健康状态变化、疾病进展或稳定、无进展存活期的减少或增加、疾病治愈、总体存活期的增长或缩短、疾病进展的延迟以及症状的减轻或加重。在本发明的优选实施例中，所述效果是药效动力学效果。
如在此使用的，术语“HDAC抑制剂治疗的阳性结果”意思是所述HDAC抑制剂治疗产生了对患者有益的效果。这包括临床益处、健康改善、疾病稳定、无进展存活期的时间延长、疾病治愈、总体存活期增长以及疾病进展的延迟和症状的减轻。
如在此使用的，术语“HDAC抑制剂治疗的阴性结果”意思是所述HDAC抑制剂治疗不产生对患者有益的效果或者结果与上述阳性结果相反，例如健康下降。
如在此使用的，“反应者”是因如上定义的HDAC抑制剂治疗而显现出阳性结果的患者。
如在此使用的，“非反应者”是因如上定义的HDAC抑制剂治疗而显现出阴性结果的患者。
如在此使用的，术语“体液”指定源于患者身体的流体或流体部分，包括从患者身体排出或分泌的流体，包括但不限于血液，包括外周血、血清、血浆、尿液、组织液、碱液、房水和玻璃状液、胆汁、乳汁、脑脊液、内淋巴、外淋巴、精液、胃液、粘液、腹水、胸水、唾液、汗液、眼泪、以及阴道分泌物。在本发明的背景下优选的体液为外周血、血清、血浆以及尿液。所述体液本身可以或可以不包括患病的和/或非患病的细胞。
如在此使用的，术语“组织样品”指定源于患者身体的非流体物质或固体。组织样品包括但不限于骨材料、骨髓、皮肤、毛囊、粘膜、脑、软骨、肌肉、肺、肾脏、胃、肠、膀胱以及肝脏样品。所述组织样品本身可以或可以不包括患病细胞，并且可以例如是从患者身体的患病区域所取的样品，如肿瘤的活检物。优选地，组织样品选自皮肤、毛囊或口腔粘膜。
在本发明的实施例中，通过医学领域技术人员熟知的任何方法和/或手段从患者获得样品，例如优选地通过静脉穿刺采取血样。
如在此使用的，术语“外周血”指定从远离心脏的循环获得的血液，即体循环中的血液，例如像来自肢体末端区域的血液。
如在此使用的，术语“全血”指定包含细胞和流体的未修饰血液，如从所述血液的供体例如患者获得的。
如在此使用的，术语“患者”指定预期接收HDAC抑制剂治疗的受试者。患者是潜在地患病的，并且可以在I期临床试验中包括患病受试者和健康受试者，例如健康志愿者以确定HDAC抑制剂的安全性、毒性以及药效动力学行为。优选地，患者是哺乳动物，更优选地是人。在进一步优选的实施例中，患者患有癌症。
如在此使用的，术语“潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者”指定疑似患有疾病或病症，优选地患有疾病，对于其而言HDAC抑制剂治疗预期是有益的和/或其响应于HDAC抑制剂治疗的受试者。在此背景下，“患者潜在需要”还包括并且在具体实施例中意指“患者需要”。
根据本发明的基因的表达可以使用根据现有技术的用于定量来源于这些基因的转录过程的mRNA的检测方法，如实时定量PCR(qPCR)方法来测量。此外，这些基因表达可以通过分析由所讨论的基因编码的蛋白质的表达来测量。所有这些测量都可以活体外或在体外进行。
用于检测或测量RNA的方法不受具体限制，并且RNA的检测或测量可以通过技术人员已知的任何合适的方法来进行。此类方法的实例是定量PCR(也称为实时PCR)、mRNA的定量测序(也称为深度测序)、RNA印迹技术或斑点印迹技术。以上方法可能需要使用某些包含引物对和/或包含DNA分子的特异性探针。此类引物对通常是一对短的、非互补的单链DNA分子，例如长约20个碱基，其特异性结合有关相同多核酸分子的不同区域(典型地，某些mRNA分子的cDNA拷贝)，并且可以用于所述多核酸的扩增。上述包含DNA分子的分子探针是包含单链DNA分子的分子构建体，所述单链DNA分子特异性结合有关多核酸分子以及一个或多个标记(也称为“标签”)以方便检测。任选地，所述探针可以进一步包含一个或多个接头分子。上述标记可以例如选自在结合单链DNA分子时显示颜色强度变化的颜色标记、荧光标记(如荧光蛋白质或荧光染料)、酶标记(如辣根过氧化物酶)、放射性标记或分子生物学中常用的允许检测单链DNA分子的结合的其他标记。
在本发明的背景下，“包含抗体的探针”是包含用于结合表位以及一个或多个标记(也称为“标签”)以促进检测的特异性抗体的分子构建体。任选地，所述探针可以进一步包含一个或多个接头分子。上述标记可以例如选自基因颜色强度和/或变化指示抗体结合的颜色标记、荧光标记(如荧光蛋白质或荧光染料)、酶标记(如辣根过氧化物酶)、放射性标记或分子生物学中常用的允许检测抗体结合的其他标记。检测特异性抗体与其靶表位的结合的其他可能性包括间接技术，其中为了检测特异性抗体使用第二抗体，其中第二抗体携带标记，所述标记如上所定义，并且其中第二抗体特异性结合上述特异性抗体。此类间接的技术包括分子生物学领域中通常已知的方法，如ELISA、用于检测蛋白质的HPLC法、蛋白质印迹技术、反相蛋白质检测技术或斑点印迹技术。上述“间接技术”还可以以直接设置进行，其中上述探针结合靶表位并且被直接检测。在某些实施例中，特异性抗体可以被固定在例如片材、珠粒、条带等上。在一个实施例中，在溶液中或在珠粒悬浮在溶液中的情况下有助于检测，所述珠粒包含如在此提及的固定的探针。
如在此使用的，术语“多个探针”还指代“一个探针”，即单个探针。
在另一个实施例中，可以通过质谱法或LC-质谱联用法协助蛋白质的检测和/或定量。
用于本发明的示例性方法详细描述在“分子生物学中的短方案(ShortProtocolsinMolecularBiology)”,第5版,第2卷组；弗雷德里克M.奥苏贝尔(FrederickM.Ausubel)(编辑)、罗杰布伦特(RogerBrent)(编辑)、罗伯特E.金斯敦(RobertE.Kingston)(编辑)、大卫D.摩尔(DavidD.Moore)(编辑)、J.G.塞德曼(J.G.Seidman)(编辑)、约翰A.史密斯(JohnA.Smith)(编辑)、凯文斯特鲁尔(KevinStruhl)(编辑)；Wiley；ISBN:978-0-471-25092-0中。
如在此定义的，特异性结合抗体、引物对或DNA分子优选地具有相对于其他结构对其靶结构的至少1000倍的结合亲和力。“结构”在此涉及分子实体，包括蛋白质表位和多核酸序列。在此，“表位”是蛋白质的由抗体识别的部分。
用于本发明的抗体可以通过本领域技术人员已知的任何方法来获得。所述抗体的类型不受具体限制，并且原则上，可以应用适合用于检测基因的表达产物的任何抗体类型，包括分子抗体和多克隆抗体。
根据本发明的方法、用途以及试剂盒适用于响应于HDAC抑制的疾病或病症的HDAC抑制剂治疗，包括其准备和随访。此类疾病和病症包括细胞瘤形成，它定义为细胞显示异常细胞增殖和/或存活和/或分化阻断。术语瘤形成包括“良性瘤形成”，它涉及细胞的过度增殖、不能在体内形成侵袭性转移性肿瘤；以及“恶性瘤形成”，它涉及具有多细胞和生化异常的细胞、能够形成全身性疾病，例如在远器官中形成肿瘤转移。恶性瘤形成的实例包括实体瘤和血液肿瘤。实体瘤示例为乳腺、膀胱、骨、脑、中枢和外周神经系统、结肠、内分泌腺(例如，甲状腺和肾上腺皮质)、食道、子宫内膜、生殖细胞、头颈部、肾脏、肝脏、肺、喉及咽下部、间皮瘤、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、肾脏、小肠、软组织、睾丸、胃、皮肤、输尿管、阴道和外阴。恶性瘤形成包括遗传癌症，示例为视网膜母细胞瘤和维耳姆斯瘤。此外，恶性瘤形成所述器官中的原发性肿瘤以及远器官中相应的继发性肿瘤(“肿瘤转移”)。血液肿瘤示例为侵袭性和无痛形式的白血病和淋巴瘤，即非霍奇金病、慢性和急性髓细胞性白血病(CML/AML)、慢性和急性成淋巴细胞性白血病(CLL/ALL)、霍奇金病、多发性骨髓瘤以及T细胞淋巴瘤。还包括骨髓增生异常综合征、浆细胞瘤形成、副肿瘤综合征、未知原发部位的癌症以及AIDS相关的恶性肿瘤。
本发明的特别优选的实施例涉及选自由以下各项组成的组的癌症：肝脏癌(包括HCC和肝癌转移)、胰腺癌、胃肠道癌(包括结肠癌和结直肠癌(CRC))、甲状腺癌、肾脏癌(即肾癌)、皮肤癌、睾丸癌以及淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤)。在此类特别优选的实施例中，根据本发明的患者优选是癌症患者，更优选患有选自由以下各项组成的组的癌症的患者：肝脏癌(包括HCC和肝癌转移)、胰腺癌、胃肠道癌(包括结肠癌和结直肠癌(CRC))、甲状腺癌、肾脏癌(即肾癌)、以及淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤)。
此外，响应于HDAC抑制的疾病或病症包括选自包含以下各项的非恶性疾病：
(i)关节病和骨病理学病状，如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风、多关节炎和银屑病关节炎；
(ii)系统性红斑狼疮；
(iii)平滑肌细胞增殖，包括血管增殖性病症、动脉粥样硬化和再狭窄；
(iv)炎性病状和皮肤病状，如溃疡性结肠炎、克隆氏病、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、囊性纤维化、慢性支气管炎和哮喘；
(v)子宫内膜组织异位、子宫肌瘤、子宫内膜增生和良性前列腺增生；
(vi)心功能障碍；
(vii)抑制免疫抑制性病状，如HIV感染；
(viii)神经病理性病症，如帕金森病、阿尔茨海默病或聚谷氨酰胺相关病症；以及
(ix)适合于在基因治疗中通过增强内源基因表达以及提高转基因表达来治疗的病理状况。
在本发明的测定基因表达的具体实施例中，这是通过由所述基因转录的mRNA的cDNA拷贝的qPCR执行的，其中所述cDNA可以是由所述基因转录的mRNA的完全或部分拷贝，其中就ZFP64而言所述mRNA典型地包含所述基因的多于一个外显子，如在此对于ZFP64的转录变体详细描述的。在所述qPCR中，可以产生所述cDNA的完全或部分拷贝(这取决于qPCR引物的对应结合位点)，其中典型地此类拷贝包含50至90，具体60至80，更具体65至75，甚至更具体73个碱基对。在某些情况下，基于所述基因的不同外显子组合，在样品中可以存在所述基因的多于一种转录变体(即，不同的mRNA)；在此情况下，可以产生一种或多种所述转录变体的cDNA拷贝，其中的一种或多种然后可以通过qPCR处理(产生一种或多种扩增产物)；确定基因表达的读数于是还可以基于所述扩增产物中的一种或多种。
在本发明的测定ZFP64的基因表达的其他具体实施例中，这是通过AssayIDHs00217022_m1或通过寡核苷酸对执行的，所述寡核苷酸对特异性结合由ZFP64转录的mRNA(ZFP64mRNA内含子被排除在外)的cDNA拷贝内的靶序列，所述靶序列具有序列(SeqID1)5’CACCTCGGAGACCCAGACAATCACAGTTTCAGCTCCAGAATTTGTTTTTGAACATGGCTATCAAACTTACCTG3’。可以使用的寡核苷酸对包含以下或以下的组合：对1正向引物与对2反应引物或对2反应引物与对1正向引物，或此类引物可以比这些引物更短或更长，具体长17至26个碱基：
对1：正向引物(SeqID2)5’CACCTCGGAGACCCAGACAA3’(20个碱基)，反向引物(SeqID3)5’CAGGTAAGTTTGATAGCCATGTTCA3’(25个碱基)
对2：正向引物(SeqID4)5’CACCTCGGAGACCCAGACA3’(19个碱基)，反向引物(SeqID5)5’CAGGTAAGTTTGATAGCCATGTTC3’(24个碱基)
除上述用于通过qPCR测定ZFP64的基因表达的引物之外，可以使用特异性扩增ZFP64的cDNA序列的引物。一般而言，这些探针/引物是短的DNA序列，特异性结合ZFP64的一种或多种转录变体。这些引物对的长度可以包括17–25，具体19-23，更具体20-22个核苷酸碱基，并且应当内含子跨越地设计(即，结合两个单独外显子的引物对的正向引物和反向引物由至少一个内含子分隔)，以避免扩增可能存在于RNA样品中的基因组DNA。由此方法获得PCR产物的长度可以为50-400，具体70-300，更具体80-200，更具体123或198个碱基对。源于RNA样品中剩余的基因组DNA的PCR产物理论上可以与扩增的cDNA一起产生。然而，基因组DNA的此类拷贝比扩增的cDNA要长得多，并且此外，用于聚合酶介导的PCR过程的延伸步骤的限定时间段阻止长产物延伸(注意，对于1000个碱基，即使是高速聚合酶也需要15秒)。因此，熟练人员可以容易地确定扩增步骤的适当持续时间以便避免基因组DNA的过度拷贝形成。
在本发明中用于扩增由ZFP64转录的mRNA的cDNA拷贝的具体引物对的实例为：
以上引物全部具有58℃的退火温度。
以NCBI数据库中参考号示出的ZFP64的转录变体(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/55734)
NM_199427.2；转录变体4，mRNA
NM_018197.2，转录变体1，mRNA
NM_199426.1，转录变体3，mRNA
NM_022088.4，转录变体2，mRNA
另外，ZFP64mRNA水平也可以通过RNA测序来测定。这可以通过至少两种不同方法来进行：mRNA的直接测序以及反向转录的mRNA即cDNA的测序。用于这些测序技术的方法是本领域中众所周知的。
在本发明的测定基因表达的具体实施例中，这是通过RNA测序来进行的。RNA测序又称为“全转录组鸟枪法测序”(“WTSS”)(RD.莫兰(RD.Morin)等人(2008),生物技术(BioTechniques)45(1):81–94)，允许揭露在给定时刻来自基因组的特定RNA的存在和量(ChuY、科里博士(CoreyDR)(2012).核酸治疗学(NucleicAcidTher)22(4):271–4)。基于测序的RNA分析记录样品中给定序列的数字频率。根据本发明的基因(具体地ZFP64)的mRNA/cDNA的水平通过利用跨越细胞的全转录组的引物池测序细胞的全cDNA来检测(除其他基因以外)。
在本发明的测定基因表达的具体实施例中，这是(在蛋白质水平上)通过蛋白质印迹法来进行的。蛋白质印迹法(有时称作蛋白质免疫印迹)是广泛使用的用来检测样品中的特定蛋白质的分析技术。所述技术使用凝胶电泳来根据3-D结构分离天然蛋白质或可替代地根据多肽的长度分离变性蛋白质。然后将蛋白质转移到膜(典型地硝化纤维或PVDF)上，在那里用特异于靶蛋白的抗体染色。把凝胶电泳步骤包括在蛋白质印迹分析中是为了解决抗体的交叉反应性的问题。一种改善的免疫印迹方法，即西式印迹分析(Zesternanalysis)(张建棣(Zhang,Jiandi)；Wang,Dan.，美国专利号8,293,487)能够在无电泳步骤的情况下解决此问题，因此显著改善蛋白质分析的有效性。相比蛋白质印迹分析，西式印迹分析在检测步骤之前加入洗脱步骤。膜上形成的免疫复合物允许触及含有过量竞争分子的溶液。竞争分子可以是合成抗原或部分抗原，或一个分子内抗原或部分抗原的多个重复。竞争发生是因为抗原-抗体相互作用的可逆性。抗体由竞争分子从膜释放到洗脱溶液中。通过报告基因测定实现的洗脱溶液中抗体量的定量提供了关于蛋白质样品中抗原量的可靠指示。因此，可以通过添加竞争抗原来定量标记抗体与表位的特异性结合。其他相关技术包括斑点印迹分析、使用抗体通过免疫染色检测组织和细胞中的蛋白质的免疫组织化学、以及酶联免疫吸附测定(ELISA)。用于ZFP64的具体特异性抗体是例如：Abcamab66658；ZFP64的兔多克隆抗体；免疫原：合成肽DGGQNIAVATTAPPVFSSSSQQELPKQTYSIIQGAAHPALLCPADSIPD(SeqID10)内的区域，对应于人ZFP64的C端氨基酸633-682；SigmaHPA035112；兔多克隆抗体；免疫原序列SFDTKQPSNLSKHMKKFHGDMVKTEALERKDTGRQSSRQVAKLDAKKSFHCDICDASFMREDSLRSHKRQHSEYSESKNSDVTVLQFQIEPS(SeqID11)；ThermoScientificPA5-28546，兔多克隆抗体；免疫原：对应于人ZFP64的氨基酸394和681内的区域的重组片段
在本发明的测定基因表达的具体实施例中，这是(在蛋白质水平上)通过Luminex技术来进行的。Luminex技术是以抗体依赖性方式测定不同基质中给定蛋白质的表达的基于珠粒的技术。因此，捕获抗体和检测抗体的组合，这两种抗体都特异性结合有关蛋白但不一定结合不同的不重叠的表位。将捕获抗体包被到珠粒上，并且直接地(藻红蛋白(PE)偶联的)或间接地(生物素化的—通过后续链霉亲和素-PE结合检测此抗体)标记(例如，利用如在此所述的标记)检测抗体，或者可以通过标记的物种特异性抗体(例如，针对Zfp64表位特异性兔抗体的标记的抗兔抗体)来标记。
在本发明的测定基因表达的具体实施例中，这是(在蛋白质水平上)通过ELISA来进行的。酶联免疫吸附测定(ELISA)和酶免疫测定是以抗体依赖性方式测定不同样品类型(例如，血浆、血清、细胞裂解物等)中给定蛋白质的表达的技术。因此，需要包含捕获抗体和检测抗体的组合，这两种抗体都特异性结合有关蛋白但不一定结合不同的不重叠的表位。将捕获抗体固定在固相例如塑料表面上，并且直接地(例如，利用将底物转化成可检测信号的酶，如转化显色底物像TMB、DAB、ABTS的辣根过氧化物酶)或间接地(生物素化的—通过后续链霉亲和素-PE或链霉亲和素-荧光性标记结合检测此抗体)标记(例如，利用如在此所述的标记)检测抗体，或者可以通过标记的物种特异性抗体(例如，针对Zfp64表位特异性兔抗体的标记的抗兔抗体)来标记。
在本发明的测定基因表达的具体实施例中，这是在一个或多个特定时间点进行的，例如就在向患者给予HDAC抑制剂之前的一个或多个时间点(也称作0h)，以及在向患者给予HDAC抑制剂之后的1至10小时，具体地1至6，更具体地2至5小时进行。在本发明的测定ZFP64基因表达的具体实施例中，这是在如在此在临床试验描述(SAPHIRE、SHELTER、SHORE)的背景中描述的一个或多个特定时间点进行的，即就在向患者给予HDAC抑制剂之前、在向患者给予HDAC抑制剂之后约2和/或5小时进行。
典型地，如果测量基因表达以确定HDAC抑制剂治疗的效果、监测HDAC抑制剂治疗、对患者分级或预测阳性结果的概率，在某些实施例中这就在向患者给予HDAC抑制剂之前进行。为了对患者分级或预测阳性结果的概率，基因表达测量典型地在HDAC抑制剂治疗开始之前(即，向所述患者给予第一个HDAC抑制剂剂量之前)进行，所述测量可以伴随有在稍后时间点进行的另外的测量，具体地就在治疗周期开始前的一个或多个时间，例如如在此在临床试验描述的背景中描述的。为了确定HDAC抑制剂治疗的效果或监测HDAC抑制剂治疗，这可以在HDAC抑制剂治疗开始之前进行并且典型地就在治疗周期开始前的一个或多个时间进行，例如如在此在临床试验描述的背景中描述的。
在本发明的测定ZFP64基因表达的具体实施例中，这是通过使样品与抗体，具体地选自Abcamab66658；SigmaHPA035112以及ThermoScientificPA5-28546(在此另外描述)的抗体接触并且测量由ZFP64表达的蛋白质与所述抗体之间的结合来进行的。具体地，使用如在此所述的方法例如ELISA、Luminex等来测量所述结合。
本发明的具体实施例涉及一种利用HDAC抑制剂治疗有需要的患者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供所述患者的样品，其中所述患者已经接收HDAC抑制剂治疗，
b)测定所述样品中选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的至少一个基因，具体地ZFP64的基因表达和/或基因表达变化，
c)将所测定的所述至少一个基因的基因表达和/或基因表达变化与所述患者中步骤a)中的所述HDAC抑制剂治疗的效果相关联，并且
d)使用基于步骤c)的关联性确定的HDAC抑制剂剂量和/或给药计划向所述患者给予HDAC抑制剂。
本发明的另外的具体实施例涉及一种利用HDAC抑制剂治疗有需要的患者的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供所述患者的样品，
b)测定所述样品中选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的至少一个基因，具体地ZFP64的基因表达，
c)将所测定的所述至少一个基因的基因表达与HDAC抑制剂治疗对所述患者具有有益效果的概率相关联，
d)基于步骤c)测定的概率，将所述患者分类为对所述HDAC抑制剂治疗的反应者，并且
e)基于将所述患者分类为反应者的分类，向所述患者给予HDAC抑制剂。
本发明的另外的具体实施例涉及一种对潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者分级的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供所述患者的样品，其中所述患者被诊断患有癌症，具体地肝细胞癌(HCC)、霍奇金淋巴瘤(HL)或结肠直肠癌(CRC)，更具体地，肝细胞癌(HCC)，
b)通过从对于ZFP64测定的Ct值中减去一个或多个持家基因的Ct值均值，获得ZFP64的基因表达水平的dCt值，并且
c)将所述患者分类为反应者，如果在步骤b)中对于ZFP64获得的dCt值低于11.15，具体地低于10.02的话。
本发明的另外的具体实施例涉及一种对潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者分级的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供所述患者的样品，其中所述患者被诊断患有癌症，具体地肝细胞癌(HCC)、霍奇金淋巴瘤(HL)或结肠直肠癌(CRC)，更具体地，肝细胞癌(HCC)，
b)通过从对于ZFP64测定的Ct值中减去一个或多个持家基因的Ct值均值，获得ZFP64的基因表达水平的dCt值，并且
c)将所述患者分类为对HDAC抑制剂治疗合格，如果在步骤b)中对于ZFP64获得的dCt值低于11.15，具体地低于10.02的话。
在本发明的方法的具体实施例中，ZFP64基因表达的所述dCT值可以通过从对于ZFP64测定的Ct值中减去持家基因18sRNA、TBP以及GAPDH的Ct值均值来获得。
在本发明的方法的具体实施例中，Ct值可以通过由所述基因，具体地由ZFP64表达的mRNA的cDNA拷贝的qPCR扩增来测得。
本发明的具体实施例是一种用于测定样品中选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的至少一个基因，具体地ZFP64的基因表达的试剂盒，其中所述试剂盒包含核酸探针，所述核酸探针(例如，PCR引物对)结合由所述基因表达的mRNA的cDNA拷贝并且是两个外显子部分的互补物，具体是选自在此对于在由所述基因，更具体地由ZFP64转录的mRNA的cDNA拷贝的qPCR中使用而描述的引物对的引物对，并且
其中所述试剂盒任选地包含选自包含以下各项的组的一种或多种另外的组分：培养基、培养基组分、缓冲液、缓冲液组分、RNA纯化柱、DNA纯化柱、染料、包括dNTP混合物的核酸、包括聚合酶的酶、以及盐。
本发明的另一个具体实施例是一种用于测定样品中由选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的基因具体地ZFP64编码的至少一种蛋白质的水平的试剂盒，
其中所述试剂盒包含特异性结合由所述基因编码的至少一种蛋白质或所述蛋白质的结构域的探针，其中所述探针具体包括如在此所述的标记，和/或其中所述探针是如在此所述的作为对于ZFP64的特定特异性抗体的抗体，和/或其中所述探针被如在此在ELISA或Luminex的背景中描述的那样固定，并且其中所述试剂盒任选地包含选自包含以下各项的组的一种或多种另外的组分：培养基、培养基组分、缓冲液、缓冲液组分、膜、ELISA板酶底物、染料、包括聚合酶的酶、以及盐。
在本发明的应用特异性结合由ZFP64表达的蛋白质的抗体或探针的实施例中，所述探针或抗体具体地选自如上文所述的对于ZFP64的特定特异性抗体。
附图简要说明：
图1示出在600mg剂量组相比800mg剂量组的SAPHIRE临床试验中发现的瑞米司他依赖性的中值HDAC酶抑制。Y轴涉及相对于在HDAC抑制剂治疗的第1天0小时时间点的值的酶活性(％)，X轴涉及治疗周期，在各自对应的治疗周期开始后细分为天和小时。
图2示出在HDAC抑制剂治疗后根据本发明的基因的基因表达变化之间的比较，测得为表达水平(Y轴)，如在给予HDAC抑制剂之后的时间点0、2和5处在外周血(活体外)和选择人癌细胞系(体外)的样品中测定的(时间点在X轴上示出)。打阴影柱涉及血液，黑色柱涉及HepG2细胞，白色条涉及HT29细胞。值被标准化为0h时的值。
图3示出在HDAC抑制剂治疗后持家基因的基因表达变化之间的比较──测得为表达水平(Y轴)，如在给予HDAC抑制剂之后的时间点0、2和5处在外周血(活体外)和选择人癌细胞系(体外)的样品中测定的(时间点在X轴上示出)。打阴影柱涉及血液，黑色柱涉及HepG2细胞，白色条涉及HT29细胞。值被标准化为0h时的值。
图4示出第1、5、8和33天的CCDC43基因表达模式的药效动力学行为，这与图1中所示的HDAC酶抑制一致。值测得为表达水平(Y轴)，X轴涉及治疗周期，在各自对应的治疗周期开始后细分为天和小时。
图4b示出在HCC和HL患者的血细胞中瑞米司他所引起的ZFP64下调。粗线涉及瑞米司他600mg(n＝14HCC+16HL)的每日剂量，间断线涉及瑞米司他600mg+索拉非尼400mg(n＝19HCC)的每日剂量，并且虚线涉及瑞米司他800mg(n＝15HL)的每日剂量。数据是针对第1天(左图)和第5天(右图)给药时的相对ZFP64表达示出。
图4c示出在瑞米司他(10μM)治疗后在治疗0、2、5、和24小时后的不同癌细胞系中的ZFP64基因表达数据。
图4d示出使用瑞米司他(5μM)(“R”)或瑞米司他(5μM)和索拉非尼(5μM)的组合(“R/S”)对肝癌细胞系HepG2、以及来自相同健康供体的全血和PBMC的治疗，示出角度为在给予所述药物或药物组合后4h和2h的ZFP64表达的倍数变化。出于比较原因，示出对HepG2细胞的siRNA实验(ZFP64敲低)。将样品与DMSO对照比较并且测定倍数变化，例外的是siRNA样品与瑞米司他样品比较。
图5示出对于ZFP64而言在周期1，第1天，0小时的来自SAPHIRE临床研究的霍奇金淋巴瘤中的血细胞中的dCt值的盒形图，具有中值(Y轴)11.08(渐进性疾病患者：PD)和10.67(稳定疾病患者：SD)，以及各自的p值0.03(基于曼-惠特尼检验(Mann-Whitney-test))。
图6示出对于ZFP64而言在周期1，第1天，0小时的来自SHELTER临床研究的HCC中的血细胞中的ZFP64基线表达。患者以临床结果分离(PD对SD)。
图7示出来自SHORE临床研究的CRC患者(经历PD对SD)中的生物标志物ZFP64表达。样品在周期1，第1天，0小时(剂量前)采取。
图8示出比较4SC临床试验(SAPHIRE、SHORE、SHELTER)和健康志愿者的临床益处对基线ZFP64dCt的盒式图；单独示出每个临床试验的数据，将患者分为SD组和PD组。
图9示出比较4SC临床试验数据和健康志愿者的临床益处对基线ZFP64dCt的盒式图；整理所有临床试验(SAPHIRE、SHORE、SHELTER)的数据，将患者分为SD组和PD组。
图10示出对于ZFP64预后区域的百分位排列和分割—上三分之一指示“无临床益处(PD)”组的预测率＝0.78，下三分之一示出“临床益处组(SD)”的预测率＝0.69。Y轴涉及百分位，X轴涉及dCt。在所有情况下，X标记PD患者，点标记SD患者。
图11示出来自SHELTER临床研究的HCC中的血细胞中的ZFP64基线表达。就总体存活期长度将患者分为第40百分位和第60百分位组。
图11b示出来自SHELTER临床研究的HCC中的血细胞中的ZFP64基线表达。就无进展存活期长度将患者分为第40百分位和第60百分位组。
图12(XXX为13b)示出来自HCC患者的SHELTER临床试验数据，基线ZFP64表达对总体存活期(OS)；对于在第60百分位(60％高/40％低)的ZFP64相对表达分割—基线ZFP64表达分割的总体存活期(OS)的Kaplan-Meier估计量。粗线涉及低的基线相对ZFP64表达，间断线涉及高的基线相对ZFP64表达。开口圆涉及在数据收集点时活着的患者。
图12b示出来自接收瑞米司他(600mg)或瑞米司他(600mg)和索拉非尼(400mg)组合的HCC患者的SHELTER临床试验数据。基线ZFP64表达对总体存活期(OS)；对于在第75百分位(75％高/25％低)的ZFP64相对表达分割的总体存活期(OS)的Kaplan-Meier估计量。粗线涉及高的基线相对ZFP64表达，虚线涉及低的基线相对ZFP64表达。开口圆涉及在数据收集点时活着的患者，实心圆涉及失访的患者。
图13示出SHELTER临床试验数据—接收瑞米司他(600mg)的HCC患者；基线ZFP64表达对总体存活期(OS)。分割是通过在此所述的方法计算，并且仅基于接收瑞米司他(600mg)的患者的特定亚组。粗线涉及高的基线相对ZFP64表达，虚线涉及低的基线相对ZFP64表达，间断线涉及总体Kaplan-Meier曲线。开口圆涉及在数据收集点时活着的患者，实心圆涉及失访的患者。
图14示出SHELTER临床试验数据—接收瑞米司他(600mg)和索拉非尼(400mg)的HCC患者—基线ZFP64表达对总体存活期(OS)。分割是通过在此所述的方法计算，并且仅基于接收瑞米司他(600mg)的患者的特定亚组。粗线涉及高的基线相对ZFP64表达，虚线涉及低的基线相对ZFP64表达，间断线涉及总体Kaplan-Meier曲线。开口圆涉及在数据收集点时活着的患者。
图15示出来自HCC患者的SHELTER数据；基线ZFP64表达对总体存活期(OS)。短划线涉及高的基线相对ZFP64表达，粗黑线涉及低的基线相对ZFP64表达，短划虚线涉及总体Kaplan-Meier曲线。开口圆涉及在数据收集点时活着的患者。左图示出瑞米司他单一疗法分支，右图示出瑞米司他/索拉非尼组合分支。分割值取自全部研究群组(可评估患者：瑞米司他6高/8低，组合分支12高/6低)。图16示出来自SAPHIRE临床研究的霍奇金淋巴瘤中的血细胞中的ZFP64基线表达。就总体存活期长度将患者分为第35百分位和第65百分位组。
图17示出来自霍奇金淋巴瘤患者的SAPHIRE数据；基线ZFP64表达对总体存活期(OS)—在第65百分位(65％高/35％低)的基线ZFP64表达分割。粗线涉及低的基线相对ZFP64表达，间断线涉及高的基线相对ZFP64表达。开口圆涉及在数据收集点时活着的患者。
图18示出与OS关联的CRC患者中ZFP64基线表达(SHORE临床研究)。粗线涉及高的相对ZFP64表达，间断线涉及低的相对ZFP64表达。
图19示出对于DPP3而言在周期1，第1天，0小时的dCt值的盒形图，具有中值9.15(PD)和8.67(SD)，以及各自的p值0.03(基于曼-惠特尼检验(Mann-Whitney-test))。
图20示出对于DPP3预后区域的百分位排列和分割。上三分之一指示“无临床益处(PD)”组的预测率＝0.69，下三分之一示出“临床益处组(SD)”的预测率＝0.64。Y轴涉及百分位，X轴涉及dCt。在所有情况下，X标记PD患者，点标记SD患者。
图21示出用0.1％DMSO(媒介物对照)或5μM瑞米司他处理24h的HepG2细胞中的ZFP64核蛋白水平。在分离核级分后，通过蛋白质印迹分析检测ZFP64蛋白质水平。组蛋白H3充当核加载对照。添加瑞米司他后ZFP64蛋白质水平减弱，而组蛋白H3水平保持基本不变。
实例
(E)-3-(1-(4-((二甲氨基)甲基)苯磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-N-羟基丙烯酰胺(INN：瑞米司他)是最近开发的异羟肟酸类HDAC抑制剂。调查了对人受试者的瑞米司他口服给药，并且利用根据本发明的生物标志物组测定了其药理学行为和功效。
实例1：HDAC抑制
获得样品并且利用如下文所述的方法测定基因表达。全血用荧光HDAC底物Boc-K(Ac)-AMC在37℃下孵育2h。在红细胞裂解之后，将剩余的细胞储存在-80℃下。通过荧光分析使用FLUOstarOPTIMA读板仪测定HDAC活性，其中将细胞与限定的显色试剂(含胰蛋白酶和裂解缓冲液)一起孵育，这使得细胞裂解并且从脱去乙酰基的底物中生成荧光团。最后计算相比剂量前水平HDAC活性的抑制。结果示于图1中。
HDAC酶活性的抑制是瞬时的并且时间依赖性的，其中剂量后2h的最大抑制对应于1.0h与1.5h之间瑞米司他的中值峰值血浆水平。在两个剂量组中HDAC酶活性都被抑制达93％剂量后2h中值。
实例2：外周血细胞与癌细胞中基因表达之间的相关性
获得样品并且利用如下文所述的方法测定基因表达。结果示于下表3和图2和图3中。
图2和图3中汇总的结果显示，生物标志物在健康供体的血细胞和用瑞米司他治疗的癌细胞系中以相同方式调控。以上值表示基于2次生物学重复测定的平均值，对于所述2次生物学重复各准备3次技术重复。这些结果显示是可再现的。这指示，在外周血中所述基因的基因表达对应于患病组织中的基因表达。可例如通过应用适当的换算因数或换算表将外周血样品中测定的基因表达水平与患病细胞中的HDAC活性的某一水平相关联，所述换算因数或换算表可以针对各特定疾病和/或患者组确定。
图4b示出，HDAC抑制剂瑞米司他在癌症患者中下调ZFP64表达，而另外给予索拉非尼不影响ZFP64表达。
对于若干细胞系在图4c中可以看到对ZFP64的相同下调作用，其中示出了在给予瑞米司他之后0、2、5和24小时的ZFP64的表达水平。另外，在图4d中，以倍数变化形式显示了ZFP64的调控，其中对癌细胞系、来自相同健康供体的全血和PBMC互相比较并且进一步与HepG2细胞系中ZFP64的siRNA敲低比较。对于所有样品可以看到相同的下调趋势。siRNA样品的过渡性上调是因为siRNA的表达与给予瑞米司他的样品比较。典型地，相比小分子抑制剂，显示siRNA对靶基因的下调。
实例3：在获自癌症患者的样品中的基因表达分析
在剂量组100mg、200mg、400mg、600mg以及800mg中测量基因组的HDAC酶活性、H4组蛋白乙酰化以及基因表达。各组由3位患有不同类型的肿瘤的患者组成。最高剂量组由6位患者组成，由于此组中头三位患者中一位患者的剂量限制性毒性[DLT](疲劳和恶心等级3)。治疗循环如对于下文所述的SAPHIRE、SHELTER以及SHORE临床试验详细描述的。
将血药水平(PK数据)与药物剂量递增过程中HDAC酶抑制关联。所述分析示出从200mg剂量组开始的延长的药物效应。由于这些结果，在SAPHIRE试验的第8天，对于800mg剂量组修改另外的时间点。显示在此剂量组中HDAC酶活性被抑制达41％，但具有宽范围的单独抑制值。
对应于ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的mRNA通过由54.675探针组利用HumanChipU133v2.0(美国圣克拉拉的艾菲矩阵公司(AffymetrixInc.,SantaClara,USA))进行的基因芯片微阵列分析以及随后的qPCR来提取。这些实验的目标是鉴定mRNA生物标志物以便监测HDAC抑制剂对可能有关临床反应的人PBMC的转录的效果。另外的选择标准是有关基因高幅度的上调和下调以及HDAC抑制剂的稳定表达信号。
选择这些基因作为持家基因用于标准化，即18sRNA、TBP以及GAPDH(Entrez基因ID在下文详细描述)。
临床研究说明
在此的临床数据在利用(E)-3-(1-(4-((二甲氨基)甲基)苯磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-N-羟基丙烯酰胺(INN：瑞米司他)甲磺酸盐的临床试验过程中获取，这些临床试验即德国4SCAG的SAPHIRE临床试验(更多参考，见：http://clinicaltrials.gov/show/NCT01037478)、德国4SCAG的SHELTER临床试验(更多参考，见：http://clinicaltrials.gov/show/NCT00943449)、以及德国4SCAG的SHORE临床试验(更多参考，见：http://clinicaltrials.gov/show/NCT01277406)。对应研究方案的简短说明在下文详细描述。
开放标记单分支SAPHIRE试验包括在先前治疗后疾病继续进展或对治疗难治的霍奇金淋巴瘤患者。以600mg或800mg每天一次给予瑞米司他。以连续5天接着9天无治疗期(5+9计划)的周期治疗患者，这组成了一个14天的周期。患者经受通过PET/CT对他们疾病状态的评定。研究的主要终点是整体客观反应率(ORR)，并且次要终点包括功效、安全性和耐受性，以及在第一和第三治疗周期过程中剂量后6h的两个剂量的药代动力学的分析。在相同时间点，在外周血细胞中测定不同剂量的瑞米司他对药效动力学标志物如HDAC酶抑制和所选靶基因的基因表达变化的影响。
SHELTER试验被设计来在对索拉非尼对瑞米司他治疗难治的肝细胞癌(HCC)患者中评估安全性、PK以及功效。瑞米司他作为单一疗法并且与索拉非尼组合研究。在多中心两分支试验中包括患晚期HCC(BCLC分期B/C)的患者。在研究开始之前，必须通过中心评价(RECIST)确认索拉非尼一线治疗下的放射学进展。执行瑞米司他(范围为200至600mg)与索拉非尼(400或800mg)组合的剂量递增。分支A调查联合用药(瑞米司他+索拉非尼)，分支B调查瑞米司他(600mg)单一疗法。主要目的是12周(w)后的无进展存活率(PFSR)。次要目的包括安全性、耐受性、肿瘤反应、PFS、TTP、OS以及PK和生物标志物(BM)的分析，包括外周血中的HDAC酶抑制、组蛋白乙酰化和基因表达。
SHORE临床研究(4SC-201-3-2010)被设计作为I/II期研究以评估瑞米司他与已确定的二线化疗方案(FOLFIRI)组合对于具有k-ras突变的晚期结肠癌(CRC)的患者的安全性、耐受性、药代动力学以及功效。
主要纳入标准包括：年龄≥18岁，组织学或细胞学确认的晚期或转移性k-ras突变的结肠癌。患者之前必须已接收5-FU治疗并且合格于FOLFIRI二线治疗。对于I期部分，也允许k-ras野生型态和后续治疗线纳入。
I期部分的主要目的是通过调查瑞米司他与FOLFIRI的组合的安全性、耐受性以及药代动力学来确定所述组合的MTD。次要目的是评定8周(4个周期)后、随后每个8周后的PFSR、PFS、TTP、客观反应数目、OS以及DOR。此外，调查生物标志物，包括HDAC酶抑制、组蛋白乙酰化、基因表达分析、蛋白质生物标志物以及肿瘤标志物如CA19-9和CEA。在本申请的交发日期，在I期后未募集患者，并且所述研究在http://clinicaltrials.gov.上被标示为“启动，未募集”。
在I期部分期间，具有3-6位患者的群组接收每天从200-800mg递增剂量的瑞米司他与标准FOLFIRI治疗方案的组合，直至测定所述组合的MTD。在每14天的治疗周期中，连续5天(第1-5天)对患者给予瑞米司他，接着9天休息期(第6-14天)。在第3和4天，给予FOLFIRI方案的化合物。
在本专利申请的交发日期时，在I期部分登记17位患者：剂量水平200mg、400mg和600mg瑞米司他加FOLFIRI各3位患者，剂量水平400mg瑞米司他BID加FOLFIRI8位患者。
材料和方法
样品
将来自患者的2.5ml全血收集在含化学品的PAXgeneTM管(BD生物科学公司(BDBiosciences))中，以便使红细胞裂解，稳定来自RNA酶降解的RNA，并且活体外最小化基因表达变化。将样品在20℃至25℃下孵育2小时并且然后在-20℃下冷冻直至总RNA的纯化。
用于样品收集的优选方案在下文描述：
所有工序在冰上进行。执行以下步骤：
将静脉血样品(2ml)收集在标记的K-EDTA真空管(例如，)中。时间点“0h”是指恰在给药前的时间(剂量前样品)。
周期1，第1天：0h(剂量前)；2h；5h
周期1，第5天：0h(剂量前)；2h；5h
周期1，第8天：0h(剂量前)
周期3，第5天：0h(剂量前)；2h；5h
除非另有说明，否则接受的时间偏差为：+/-10min。
PBMC分离：
所需材料
标记的LeucosepTM管(莱娜第一生化有限公司(Greinerbio-one))(有待储存在+4-+8℃下和黑暗中直至使用，使用前待加温至室温)
标记的15ml管(例如，PP管，例如管)
标记的2ml管(例如，PP管)
红细胞裂解缓冲液(Qiagen79217)(有待储存在室温下直至使用)
PBS(有待储存在室温下直至使用)
RIPA缓冲液(ThermoScientific89900)(有待储存在4℃下直至使用)
蛋白酶抑制剂混合物储备液，作为10μL等分试样提供(ThermoScientific87785)(有待储存在-80℃下直至使用)
样品处理
1)将处理的7ml柠檬酸盐血液(通过众所周知的工序用柠檬酸盐处理以抑制凝固的血液样品)转移到可立即使用的LeucosepTM管中。
2)在室温下以800g不停地离心15min。
3)去除大约2ml血浆上清液(含红细胞)，在PBMC中间相上留下5mm。
4)孔膜隔板上余下的全部上清液通过移液至适于离心的标记的15mlPP(例如，)管来转移。
5)添加10mlPBS(室温)并且混合。
6)在室温下以400g间歇地离心7min。
7)去除上清液，剩下剩余体积的大约0.5mlPBS和重悬浮细胞。
8)添加1.5mlErylysis(红细胞裂解)-缓冲液(Qiagen79217)并且在室温下孵育4min用于裂解。
9)添加10mlPBS以停止Erylysis(红细胞裂解)。
10)在室温下以400g离心7min。
11)去除上清液并且将细胞重悬浮于14mlPBS中。
12)在室温下以400g离心7min。
13)去除上清液并且将细胞重悬浮于4.5mlPBS中。
14)将三个相同等分试样(3×1.5ml)从细胞悬浮液转移至标记的2ml管中。
15)在室温下以400g离心7min。
16)根据以下工序完全去除上清液：将管倾斜至45度角，使细胞沉淀面向上，并且使用凝胶装料器尖端去除与细胞沉淀相对的液体。置于冰上。
17)将1000μL冷的RIPA-缓冲液转移至蛋白酶抑制剂混合物储备液的一个管中并混合。
18)将50μL此蛋白酶抑制剂混合物溶液转移至三个等分细胞沉淀的每个中并简单混合。
19)将沉淀立即储存在-80℃下。
细胞HDAC酶活性测定方案
所需材料
标记的15ml管(例如，PP管，例如管)
标记的2ml管(例如，PP管)
红细胞裂解缓冲液(Qiagen79217)(储存在室温下直至使用)
含40mMBoc-K(Ac)AMC储备液的DMSO(Bachem:I-1875)(储存在–80℃下直至使用)
样品处理
1)添加1ml柠檬酸盐血液到15ml标记的管中。
2)添加5μl40mMBoc-K(Ac)AMC到1ml柠檬酸盐血液中(最终浓度：200μMBoc-K(Ac)AMC)。
3)在孵育器中孵育2h(37℃)。
4)添加5倍体积(5ml)的4℃冷红细胞裂解缓冲液(EL缓冲液，Qiagen79217)。
5)在振动器上简单混合。
6)在冰上孵育至少15min；期间在平板振动器上混合两次。
7)添加7ml的4℃EL缓冲液。
8)在4℃下以400g离心10min，并且去除上清液。
9)添加2倍体积(2ml)4℃EL缓冲液并简单混合。
10)在4℃下以400g离心10min，并且去除上清液。
11)添加2倍体积(2ml)4℃EL缓冲液并简单混合。
12)取标记有样品的正确时间点的2ml管。
13)在管标记上写上患者编号。
14)制备两个1ml等分试样(在等分前再次用移液管混合)。
15)在+4℃下以400g离心10min，并且根据以下工序完全去除上清液：将管倾斜至45度角，使细胞沉淀面向上，并且使用凝胶装料器尖端去除与细胞沉淀相对的液体。
16)在-80℃下冷冻样品。
从细胞系和PBMC中分离RNA
例如机械地(例如，声处理)或化学地(例如，使用洗涤剂，如十二烷基磺酸钠、异硫氰酸胍)破坏样品，例如细胞，以获得RNA。为了从含RNA、DNA、蛋白质以及其他实体的细胞裂解物中提取RNA，可以使用不同方法，例如使用有机物(例如，酚/氯仿)的提取方法、基于过滤器的转蓝型式(例如，核酸所结合的玻璃纤维、衍生的二氧化硅、或离子交换膜)、磁性粒子方法(被修饰来结合核酸的具有顺磁芯和周围外壳的粒子，如二氧化硅)、以及直接裂解方法(例如，使用破坏样品并且使核酸稳定的裂解缓冲液配制品)。
为了测定不同癌细胞系和PBMC中ZFP64的RNA表达水平，用含异硫氰酸胍的缓冲液化学地破坏细胞膜，所述缓冲液使细胞裂解并且支持RNA与二氧化硅膜的结合，并且通过基于过滤器的旋转柱提取RNA。
PaxGene方案
1)每个时间点和患者取2个标记的管(Qiagen79217)(有待储存在室温下直至使用)。
2)添加2ml血液混合物之后，通过倒置管10次混合这些管。
3)在室温下孵育装有血液的管2小时
4)将这些管转移至-20℃冷冻器。
5)在运送前将含血液的管储存在-20℃下至少24h。
如在此使用的，RT意指室温，典型地在21℃-25℃范围内。
生物标志物测量的优选方法描述于欧洲专利申请号12179187.5中。
从全血样品分离RNA
根据制造商的说明，使用适于全血样品的基于旋转柱的技术(如来自Qiagen的PAXgeneTM血液miRNA试剂盒或PAXgeneTM血液RNA试剂盒)从在PAXgeneTM缓冲液中稳定的全血样品中分离总RNA。纯化以离心步骤开始以将核酸沉淀在(PAXgeneTM血液RNA)管中。将重悬浮的沉淀在缓冲液中孵育、优化以便维持RNA稳定性以及蛋白酶K，从而引起蛋白质消化。通过PAXgeneTM撕碎机旋转柱进行额外的离心以使细胞裂解物均匀化并去除残留的细胞碎片，并且将流通级分转移至新鲜的微量离心管。添加乙醇以调整结合条件，并且将裂解物施于PAXgeneTMRNA旋转柱上。在简单离心过程中，使RNA选择性地结合PAXgeneTM二氧化硅膜同时污染物通过。在若干有效的洗涤步骤中去除剩余的污染物。在第一次洗涤步骤和第二次洗涤步骤之间，如下文在1.3中描述的用DNA酶I处理膜，以去除痕量的结合DNA。洗涤布置之后，RNA在无核酸酶水中洗脱并热变性。
额外的DNA酶消化和清理
为了提高RNA的纯度，使用无RNA酶的DNA酶套件(Qiagen)实施额外的溶液中RNA酶消化。简言之，将洗脱的RNA与6.81孔尼茨单位的无RNA酶的DNA酶I在室温下孵育10分钟。孔尼茨单位孔尼兹单位是用于测量DNA酶I的常用单位，定位为在25℃，pH5.0，以高度聚合的DNA作为底物的情况下，每毫升每分钟引起0.001的A260增加的DNA酶I的量(孔尼茨M.[1950]基因生理学杂志(J.Gen.Physiol.)33、349和363)。然后使用基于旋转柱的技术(来自Qiagen的微量试剂盒)纯化样品。
RNA浓度和纯度的测定
使用各总RNA样品的等分试样在分光光度计(ND-1000分光光度计(peqlab))上测定RNA浓度和纯度。
RNA完整性控制
测试RNA完整性但不是必要的，因为对于给定样品，样品中所有测量的RNA的RNA质量是相当的，从而调平了任何潜在异常。在2100Bioanalyzer(安捷伦科技公司(AgilentTechnologies))上使用RNA6000Nano或RNA6000PicoLabChip试剂盒(安捷伦科技公司)分析所有样品，这取决于总RNA浓度。
2100Bioanalyzer允许通过毛细管电泳分析总RNA样品。根据片段大小分离RNA，并且结果以电泳图和虚拟凝胶图像的形式返回。
RNA质量指数，即所谓的RIN(RNA完整性数)衍生自电泳图谱。RIN标度范围为1至10。为10的RIN指示绝佳的RNA质量，而为1的RIN指示大量降解。对于RIN计算，算法不单单依赖于28S/18S-rRNA比率，而且考虑整个电泳图谱(例如，如长约20个核碱基的短的降解的RNA物种的分数)(施罗德(Schroeder)等人,2006,BMC分子生物学(BMCMolecularBiology)7:3)。
逆转录
根据制造商的说明在随机六聚体引物的帮助下使用高通量cDNA逆转录试剂盒(High-CapacitycDNAReverseTranscriptionKit)(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))用于总RNA到单链cDNA的逆转录。简言之，对于反应混合，使总RNA与过量随机引物、4mMdNTP混合物、2.5U/反应液、逆转录酶以及无核酸酶水混合。在以下条件下在热循环仪中发生逆转录：25℃持续10min，37℃持续120min，85℃持续5min，接着4℃用于冷却反应。原则上逆转录可以利用其他逆转录酶、引物以及温度方案来进行。只要有可能，逆转录250ng总RNA，如果不可利用，则使用更低的量。
Custom阵列上的实时定量PCR
型式16的Custom阵列(应用生物系统公司)被设计用于本发明的生物标志物和持家基因的基因表达分析，如表4中列出的。这些阵列允许每个卡片8个样品的qPCR分析。当然，所有的反应同样可以使用特异性引物通过常规qPCR分析进行。
表4：Custom阵列上含有的靶基因和持家基因测定
向微流体性卡片每端口上样基因表达主液混合物(应用生物系统公司)和200ngcDNA，或更少量的如果不可利用的话。
通过在330g和4℃下离心两次，每次持续1分钟来将反应混合物转移到反应室中。密封后，在AB7900HT仪器(应用生物系统公司)上运行微流体性卡片。采用软件SDS2.4(应用生物系统公司)用于仪器控制、数据采集和原始数据分析。平板以相对定量(ΔΔCt)模式运行，并且使用以下温度轮廓：
50℃/2:00min–94.5℃/10:00min–[97℃/0:30min–59.7℃/1:00min]，持续40个循环。
核蛋白提取和蛋白质印迹分析
HepG2肝细胞癌细胞
75cm2细胞培养烧瓶莱娜第一生化有限公司，目录658170
核提取试剂盒亚诺法公司(Abnova)，目录KA1346，批号0448735
NP-40替代物(10％)蛋白质等级洗涤剂，Calbiochem，目录492018
CriterionTM预制凝胶12％Bis-Tris，18WellComb，30μl，伯乐生命医学产品有限公司(Bio-RADLaboratories)，目录345-0118
两性离子样品缓冲液伯乐生命医学产品有限公司，目录161-0739(使用前，添加5μlβ-巯基乙醇至250μl样品缓冲液中)PrecisionPlusProteinTM双色标准品伯乐生命医学产品有限公司，目录161-0374
生物素酰化的蛋白梯细胞信号传导公司(CellSignaling)，目录7727
XTMOPS(20x)缓冲液伯乐生命医学产品有限公司，目录1161-0788
Tris/CAPS缓冲液(10x)伯乐生命医学产品有限公司，目录161-0778
Immun-BlotPVDF膜(0,2μm)伯乐生命医学产品有限公司，目录162-0177
滤纸标准大小(FilterPaperCriterionSize)伯乐生命医学产品有限公司，目录1703967
SuperBlockT20(PBS)封闭缓冲液赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)，目录37516
检测试剂1过氧化物溶液赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)，目录1859701
检测试剂2鲁米诺增强剂溶液赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific)，目录1859698
印迹缓冲液50ml10xTris/Caps缓冲液+2,5ml20％SDS，加水H2O补充到500ml
洗涤缓冲液(PBS+0,05％Tween20)25mlPBS+25ml0,1％Tween20的PBS溶液
GelDoc2000伯乐生命医学产品有限公司
第一抗体：
第二抗体：
接种后4h，HepG2细胞用0,1％DMSO或5μM瑞米司他处理。
瑞米司他处理后24h，用PBS洗涤细胞一次，之后刮除并收获在冷PBS中并将细胞转移至预冷的15mlfalcon管中。
对于制备细胞质提取物和核提取物，通过重悬于低渗缓冲液中实现第一次细胞溶胀。之后添加洗涤剂(如NonidentP-40)，这打破细胞膜并且从而允许获得细胞质级分。通过离心执行细胞分级分离并且去除细胞质提取物。随后，使用核提取缓冲液裂解核。
细胞质提取缓冲液：10mMHEPES、60mMKCl、1mMEDTA、1mMDTT、1mMPMSF，调整至pH7.6；洗涤剂：0.075％(v/v)NP-40；核提取缓冲液：20mMTrisCl、420mMNaCl、1.5mMMgCl2、0.2mMEDTA、1mMPSMF、25％(v/v)甘油，调整至pH8.0
使用Abnova核提取试剂盒制备缓冲液：
PBS/磷酸酶抑制剂溶液(1X)
反应器 60mm细胞培养平板
核提取PBS(10X) 0.6ml
蒸馏水 5.28ml
核提取磷酸酶抑制剂(50X) 0.12ml
总体积 6ml
低渗缓冲液(1X)
反应器 60mm细胞培养平板
核提取低渗缓冲液(10X) 25μl
核提取磷酸酶抑制剂(50X) 5μl
核提取蛋白酶抑制剂(100X) 2.5μl
蒸馏水 217.5μl
总体积 250μl
提取缓冲液(1X)
反应器 60mm细胞培养平板
核提取缓冲液(2X) 25μl
核提取蛋白酶抑制剂(100X) 0.5μl
核提取磷酸酶抑制剂(50X) 1μl
DTT(10mM) 5μl
蒸馏水 18.5μl
总体积 50μl
如下如制造商(亚诺法公司，目录号KA1346)所述的执行核提取：
-以300xg，5min，4℃离心悬浮细胞
-放弃上清液，将沉淀重悬浮于3ml冰冷的PBS/磷酸酶抑制剂溶液中
-以300xg，5min，4℃离心
-放弃上清液，将沉淀重悬浮于3ml冰冷的PBS/磷酸酶抑制剂溶液中
-以300xg，5min，4℃离心
-放弃上清液，添加250μl冰冷的低渗缓冲液，混合并将重悬浮沉淀转移到预冷的1,5ml管中
-在冰上孵育15min
-添加50μl10％NonidentP-40，通过移液轻轻混合
-以30秒，4℃离心
-将上清液(含细胞质级分)转移到新的管中
-将沉淀重悬浮于50μl冰冷的核提取缓冲液中，涡旋15秒，在冰上摇摆15min，涡旋30秒，在冰上摇摆15min
-以14000xg，10min，4℃离心
-将上清液(含核级分)转移到新的管中
-将细胞质样品和核样品储存在-80℃下
对于每个核样品，将4,4μg蛋白质(经BCA蛋白测定测量)添加至相同量的两性离子缓冲液(补充有β-巯基乙醇)中，在95℃下加热5min，然后置于冰上。将样品—两性离子缓冲液混合物施于预制12％Bis-Tris凝胶的孔中。凝胶在80-110V下运行。
将印迹纸和PVDF膜(在甲醇中立刻激活)浸泡在印迹缓冲液中并且堆积在印迹机件上。在恒定180mA下持续45min将凝胶印迹在膜上。之后将膜置于含有SuperBlockT20(PBS)封闭缓冲液的塑料盒中并且在振动下室温孵育2h。在将膜切成适当大小后，将这些膜片在4℃下在10ml1/10稀释的SuperBlockT20封闭缓冲液中孵育过夜，所述封闭缓冲液含有对应的第一抗体，如抗体表中所述稀释。
次日，在用洗涤缓冲液洗涤四次之后，将膜与相应的辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG第二抗体以1/50.000稀释度且与抗生物素以1/1.000稀释度(在10ml1/10稀释的SuperBlockT20封闭缓冲液中稀释)一起孵育1h。在用洗涤缓冲液洗涤四次之后，使用增强的化学发光检测HRP信号并将其暴露于X线胶片。随后，使用GelDoc2000扫描胶片，并且利用“QuantityOne”软件(伯乐公司)定量相应信号。
数据分析
分析设置
对于下游分析，将384孔微流体性卡片的实时PCR轮次加载到软件RQManager1.2.1(应用生物系统公司)中。对于每位测试患者生成单独研究(*.sdm文件)。
对于每个孔，在软件RQManager1.2.1中计算Ct值(循环阈值)，即其中扩增曲线明显超出背景并且指数曲线处于线性相位的循环数。只要有可能，就使用仪器的设置“自动Ct”,并且基于对扩增曲线的检验定义所有手动设置。然后在每个样品/测定组合的三重测量值中求所得Ct值的平均值，以生成Ct平均值。使用软件RQManager1.2.1的算法计算相联偏差(CtSD，其等于Ct平均值的平均标准误差)。
质量过滤(技术一致性)
密切检验每个孔的原始信号，即6-FAM(6-羧基荧光素)信号和ROX(6-羧基-X-罗丹明)信号(主液混合物中含有的被动参比染料)。无论何时观察到不规则性(如曲线中意想不到的波浪和位移)，检查对处理信号和所得扩增虚线的影响。必要的话，从下游分析中省去具有不规则原始信号的孔。
此外，基于CtSD值评估每个样品/测定组合的三重测量值的一致性。应用质量过滤器CtSD≤0.25，这意味着无论何时发现CtSD值>0.25，就密切检验三重孔的扩增曲线。无论何时发现超偏孔，即相比其他重复dCt>1，就将其从进一步的分析中除去。这种超偏可能起因于反应室的填充不足、PCR期间的不规则处理，例如微小气泡的爆裂或由制造商造成的生产误差。
如果靶基因表达是低的(例如，Ct>32)并且起始分子数非常有限(介于1,000–10,000个拷贝之间，取决于分子和测定)，随机效应对PCR扩增过程产生主要影响，引起可变的Ct值。尤其对于Ct值>32，观察到技术重复测量的低可再现性。由于这个原因，具有高Ct值且CtSD>0.25的三重孔未从分析中排除。然而，必须谨慎地解读这些结果。
在Ct值<32，但CtSD值>0.25并且未鉴定到明显的超偏值的情况中，所有三个数据点都用于下游计算。
相对表达水平的计算
应用ΔΔCt方法计算靶(生物标志物)转录物的相对表达水平。此方法将靶基因的基因表达标准化为一个或多个持家基因的表达，并且接着将其与校准(参比)样品或组中的靶基因和持家基因的基因表达关联。
ΔΔCt方法的基本概念：
第一步，对样品A中基因的三重测量的Ct值求平均值以产生平均Ct值。计算靶基因的平均Ct值与持家基因的平均Ct值之间的差异(ΔCt值)。随后，计算样品A的ΔCt值与校准样品的ΔCt值的差异(ΔΔCt值)。
基于等式2-ΔΔCt，确定RQ值(相对量)，所述RQ值指示相比校准样品，样品A中靶基因的相对表达。对于所有靶基因，校准样品获得1.000的RQ值。RQ值等于X倍变化值。
使用RQManager软件执行基础ΔΔCt计算。使用18S作为持家基因并且每位患者的第一样品(周期1，第一天，0小时)作为校准样品计算不同相对定量研究的结果。
修改ΔΔCt方法以实行若干持家基因：
执行R/Bioconductor软件包ddCt(v1.5.0，http://www.bioconductor.org/packages/bioc/html/ddCt.html；作者：JitaoDavidZhang、RudolfBiczok和MarkusRuschhaupt)用于相对表达水平的先进计算。此工具提供了组合若干持家基因(而且如果需要的话，整合若干样品到校准(参比)组)的方法。
通过ddCt脚本实施以下计算步骤：
计算每个基因-样品组合的技术重复的均值，并且称为均值Ct。(在ddCt的最初输出表中，此列简单地称为“Ct”。为了更好地将其与单个技术重复的Ct值辨别开，在ddCt分析后将其更名为“均值Ct”)。
对于每个样品计算所有持家基因的均值Ct值的均值。
从基因Gene1的相应均值Ct值中减去所有持家基因的均值Ct值的均值。所得值称为dCt。
对于基因Gene1，计算所有参比样品的dCt值的均值(如果适用的话)。
从样品A中基因Gene1的相应dCt值中减去所有参比样品的所得均值dCt值。所得值称为ddCt。
对于每个ddCt值应用变换x→2-x。所得值称为exprs。此值等于相对表达水平或X倍变化。
对于每个值计算误差，这是基于平均标准误差。
对于每位患者单独地实施此分析。使用第一样品(周期1，第一天，0小时)作为参比样品。“exprs”值指示单独样品的相对表达水平(倍数变化值)。
基因表达中值/平均值
取决于数据分布，优选的使用中值或平均值。在患者中表达水平分布为非正态的情况中(如在此实例中)，中值通常优于平均值，因此考虑可能的偏斜数据分布。为了证明基因表达的重复行为，提供实例以显示治疗期内的表达水平。[图4]
以下示出表5，其含有600mg或800mg瑞米司他甲磺酸盐每日剂量下治疗第5天(周期1，第5天，小时0、2和5)的中值表达水平。
表5：周期1，第5天时的中值表达水平。头3个基因(18S、GAPDH、TBP)表示持家基因
实例3a：与SD/PD关联的ZFP64基因表达
ZFP64作为预后性标志物
使用统计软件R(R_Core_Team,2012.R：用于统计计算的语言和环境(R:Alanguageandenvironmentforstatisticalcomputing).[在线]可用：http://www.R-project.org)。
基因ZFP64的基线表达(周期1，第一天，0小时)的统计分析揭露，基于ZFP64基线基因表达，患者可以被分成两个组，即a)预期显现如在此所述的HDAC抑制剂治疗的阳性结果的患者；以及b)预期不显现如在此所述的HDAC抑制剂治疗的阳性结果的患者。ZFP64基线基因表达的差异可通过使用dCt值，而不是表达水平来检测(对于这两者之间的数学联系，参考“ΔΔCt方法的基本概念”，见上文)。图5示出来自SAPHIRE临床研究的两个患者组的盒形图，其中有它们各自的中值、四分位数的间距(第25至75百分位)以及数据范围。根据Welch双样品t检验，两组之间的差异的p值(双侧)为0.03。
因此，在图6和图7中示出SHELTER(p值＝0.04)和SHORE(p值＝0.06)临床研究各自的图，指示在瑞米司他治疗下作为标志物的ZFP64的适用性。另外，取来自健康供体的血液样品，并且如上所述测量mRNA表达以用于临床研究。来自健康供体的dCt值在临床样品的表达范围之内，其中患稳定疾病(SD)的患者的对应中值接近健康供体的中值。这在图8中对于单独研究作为盒形图示出，并且在图9中作为所有研究的组合示出。
考虑到作为生物标志物的ZFP64的预后值，基于dCt值的百分位排序，将预后能分成三组是可能的(见图10)。在包括第71百分位及以上的范围内的dCt值指示，以0.78(9分之7)的精度，HDAC抑制剂治疗未引起阳性结果。在包括第51百分位及以下的范围内的dCt值指示，具有0.69(16分之11)精度的HDAC抑制剂治疗的阳性结果。在第51百分位和第71百分位之间(但不包括第51百分位和第71百分位)的dCt值不提供明确的预后指示。如上所述的dCt值百分位范围涉及接收HDAC抑制剂治疗的所有患者中基因表达的整体分布。
实例3b：与OS/PFS关联的ZFP64基因表达
分割方法学
基于在实例3a中见到的结果和指示，用此处描述的方法处理基线时ZFP64的dCt值以便测定基因表达组之间的分割。如下处理数据：将有关基因的基因表达数据收集为相对于特定时间点，例如治疗开始前的基线时持家基因的表达的实时PCRdCt值。以有关基因的dCt值的限定百分比(以5百分位为一级，总计从第25百分位到第85百分位)逐步地将患者群组分成两个组：低值和高值，相对彼此而言。然后针对OS、PFS在Kaplan-Meier分析中比较所述两个组，以便鉴定分离患者的OS、PFS概率的统计显著差异。
基于图10中的数据和百分位排列以及如上所述的分割方法学，如在图11和图11b中所示并对其详细描述的那样定义低组和和高组。
将所述分割应用于盒式图，对来自SHELTER研究的数据示例，在图11中示出总体存活期(OS)并在图11b中示出无进展存活期(PFS)。此分析示出高组与低组之间的统计差异，其中与OS的相关性的p值为0.06，并且与PFS的相关性的p值为0.03。
如在图12和图12b中见到的Kaplan-Meier分析反映了来自图11和图11b的结果。在图12中，来自SHELTER试验的所有可用患者都包括在关于OS的分析中。所述分割与图11中的分割相当，其中60％患者在高表达组中且40％患者在低表达组中，使用时序检验统计学上测定的p值为0.04。中值OS(高ZFP64表达)为8个月(95％C.I.：5.6–NA)，而中值OS(低ZFP64表达)为3.9个月(95％C.I.：2.6–9.9)。
在图12b中，仅来自SHELTER研究的那些患者被包括在分析中，所述患者用瑞米司他(600mg)或瑞米司他(600mg)和索拉非尼(400mg)的组合治疗。分割百分位不同于图12，对应组的中值也不同。中值OS(高ZFP64表达)为：9.4个月(95％C.I.：7.0–20.6)，而中值OS(低ZFP64表达)为5.1个月(95％C.I.：3.3–NA)，通过时序检验测定的p值为0.02。
与图10一起，图12和12b指示相同的趋势。图10中介于51％与71％之间的中间部分是处于与用于图12和图12b中的分割的两个百分位(分别为第60百分位和第75百分位)的相同的范围内。记着更高的dCtZFP64基线值意味着更低的ZFP64mRNA表达并且指示在瑞米司他治疗后在HCC患者中发展渐进性疾病(PD)，而更低的dCtZFP64基线值(更高的ZFP64mRNA表达)指示发展稳定疾病(SD)。
在图13中，分析了接收瑞米司他(600mg)的来自SHELTER研究的可评估患者(参与临床研究的一些患者由于缺失数据或低质量样品而不能被包括在此分析中)的基线表达。所示分割在第75百分位处，使得低ZFP64表达的中值OS为.9个月(95％C.I.：1.9–NA)，并且高ZFP64表达的中值OS为7.0个月(95％C.I.：3.3–NA)，时序检验测定的p值为0.05。两个组的总体中值OS为3.7个月，由间断线表示。
在图14中，分析了接收瑞米司他(600mg)和索拉非尼(400mg)组合的来自SHELTER研究的可评估患者(见上文)的基线表达。所示分割在第75百分位处，使得低ZFP64表达的中值OS为6.1个月(95％C.I.：0.6–NA)，并且高ZFP64表达的中值OS为11.1个月(95％C.I.：8.0–NA)，时序检验测定的p值为0.07。两个组的总体中值OS为8.3个月，由间断线表示。
图15示出了分别接收瑞米司他或瑞米司他和索拉非尼并列组合的来自SHELTER研究的可评估患者(见上文)。分割是通过在此所述的方法计算，并且是基于总体研究群体(如图11中所见)。这两个图实质上对应地反映了图13和图14中所见的趋势，仅示出由于用于分割成两个组的值不同而引起的差异。因为百分位(图13和图14的第75百分位以及图15的第60百分位)与图10中所见的那些相当，其中具有明确结果可预测性的区域以及未给出可靠可预测性的区域是确定的，所以ZFP64作为标志物的适用性得到确认。
图16和图17表示基于如在此部分对于SAPHIRE数据分析所述的相同方法，对SAPHIRE数据进行的分析。图16中的盒式图示出关于在第65百分位处至高ZFP64表达和低ZFP64表达的分割的总体存活期(OS)，显示出两个组之间的统计差异，通过时序检验测定的p值为0.04。图17示出在第65百分位处ZFP64表达分割情况下的对OS的Kaplan-Meier分析。通过时序检验测定的p值为0.04。
图18是对SHORE研究数据的代表性Kaplan-Meier分析。在最终研究报告前收集数据，并且一些经审查患者(圆圈)在存活线的0.5比例之上，因此在最终评估所有患者数据时对应组中的OS中值可能略微不同。尽管如此，在CRC中仍然见到与在HCC和HL中类似的趋势，其中相对低的ZFP64表达组显示出更短的OS而相对高的ZFP64表达组显示出更长的OS。
DPP3作为预后性标志物
基因DPP3的基线表达(周期1，第一天，0小时)的统计分析揭露，基于DPP3基线基因表达，患者可以被分成两个组，即a)预期显现如在此所述的HDAC抑制剂治疗的阳性结果的患者；以及b)预期不显现如在此所述的HDAC抑制剂治疗的阳性结果的患者。DPP3基线基因表达的差异可通过使用dCt值，而不是表达水平来检测图19示出两个患者组的盒形图，其中有它们各自的中值、四分位数的间距(第25至75百分位)以及数据范围。根据Welch双样品t检验，差异的双侧p值为0.03。考虑到作为生物标志物的DPP3的预后值，基于dCt值的百分位排序，将预后能分成三组(见图20)。
在包括第59百分位及以上的范围内的dCt值指示，以0.69(13分之9)的精度，HDAC抑制剂治疗未引起阳性结果。在包括第52百分位及以下的范围内的dCt值指示，具有0.64(17分之11)精度的HDAC抑制剂治疗的阳性结果。在第52百分位和第59百分位之间(但不包括第52百分位和第59百分位)的dCt值不提供明确的预后指示。如上所述的dCt值百分位范围涉及接收HDAC抑制剂治疗的所有患者中基因表达的整体分布。
已显示瑞米司他给药引起癌细胞、健康供体PBMC和全血细胞以及取自临床试验SHELTER、SAPHIRE和SHORE的患者的全血细胞中的ZFP64基因表达下调。临床试验中基线(周期1，第1天，0小时)相对基因表达指示经受瑞米司他治疗的患者的临床结果，即渐进性疾病(PD)或至少稳定疾病或甚至反应性疾病(SD)的评估。在癌症患者中基线(治疗开始前)时测量的更高的ZFP64表达水平指示瑞米司他治疗后更大的临床益处(PD对SD，PFS和OS时间的增加)。另外并且更加相关的，所述基线相对基因表达还指示经受瑞米司他治疗的患者的无进展存活期(PFS)和/或总体存活期(OS)时间，显示出确定的相对高表达组和相对低表达组之间的统计相关差异。
细胞和全血实验证明，瑞米司他的基因调节效应不受索拉非尼影响。相比单独瑞米司他实现的下调，瑞米司他和索拉非尼组合确实显示出ZFP64基因表达下调的相当的价值。
ZFP64是瑞米司他活性的药效动力学标志物。
ZFP64指示为瑞米司他反应的预后性以及预测性生物标志物。此外，ZFP64提供了发展用于患者分级的伴随诊断的可能性。
图的原始数据(表号等于对应的图号)：
表F2/F3：HDAC抑制剂给予后基因表达变化之间的比较，如在外周血(活体外)和选择人癌细胞系(体外)的样品中测定的。
表F5表F6
表F7.
表F8

Claims (29)

1.一种测定HDAC抑制剂治疗的效果的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供接收所述HDAC抑制剂治疗的患者的样品，
b)测定所述样品中选自包含以下各项的组的至少一个基因的基因表达和/或基因表达变化：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1，
c)将所测定的所述至少一个基因的基因表达和/或基因表达变化与所述患者中所述HDAC抑制剂治疗的效果相关联。
2.一种监测HDAC抑制剂治疗的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供接收所述HDAC抑制剂治疗的患者的样品，
b)测定所述样品中选自包含以下各项的组的至少一个基因的基因表达和/或基因表达变化：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1，
c)重复以上步骤a和b至少一次，优选地多于一次，并且
d)使用步骤a)至c)中测定的所述基因表达来生成所述患者对所述HDAC抑制剂治疗的反应的时间谱。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中将所述至少一个基因的基因表达和/或基因表达变化另外与所述HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率或阴性结果的概率相关联。
4.一种对潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者分级的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供所述患者的样品
b)测定所述样品中选自包含以下各项的组的至少一个基因的基因表达：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1
c)将所测定的所述至少一个基因的基因表达与HDAC抑制剂治疗对所述患者具有有益效果的概率相关联，并且
d)基于步骤c中测定的概率，将所述患者分类为对所述HDAC抑制剂治疗的反应者或非反应者。
5.根据权利要求4所述的方法，其中在将HDAC抑制剂给予所述患者之前提供步骤a)中提供的所述样品，
其中在步骤a)之后，将HDAC抑制剂活体外添加至所述样品中以抑制所述样品中的HDAC，并且
其中在步骤b)中，在包含所述HDAC抑制剂的所述样品中测定至少一个基因的基因表达。
6.一种预测针对接收HDAC抑制剂治疗的患者的所述HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供所述患者的样品
b)测定所述样品中选自包含以下各项的组的至少一个基因的基因表达：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1，
c)将所述基因表达与在步骤a)之前从所述患者提供的样品中的所述至少一个基因的基因表达进行比较，并且
d)将在步骤a)中提供的所述样品中的所述至少一个基因的基因表达与在步骤a)之前提供的所述样品中的所述至少一个基因的基因表达的差异与针对所述患者的所述HDAC抑制剂治疗的阳性结果的概率相关联。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在将HDAC抑制剂给予所述患者之前从所述患者提供在步骤a)之前提供的所述样品，并且
其中在将HDAC抑制剂给予所述患者之后，优选在第一次将HDAC抑制剂给予所述患者之后提供在步骤a)中提供的所述样品。
8.一种测定需要HDAC抑制剂治疗的患者中作为药效动力学标志物的至少一个基因的基因表达的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供所述患者的样品，
b)测定所述样品中ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的基因表达和/或基因表达变化
c)将所测定的所述至少一个基因的基因表达和/或基因表达变化与所述HDAC抑制剂所致的相对HDAC抑制相关联。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述至少一个基因的基因表达是通过测量所述样品中由所述至少一个基因或其长至少150个核苷酸、优选长至少180个核苷酸的片段编码的至少一种mRNA的水平来测定。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述至少一个基因的基因表达是通过测量所述样品中由所述至少一个基因编码的至少一种蛋白质、或所述蛋白质的结构域的水平来测定。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少一种蛋白质或其结构域的水平和/或水平变化是通过抗体或包含抗体的探针的结合来测定，其中所述抗体特异性结合所述至少一种蛋白质或其结构域。
12.根据权利要求4至11中任一项所述的方法，其中所述样品是在所述HDAC抑制剂治疗开始之前或在HDAC抑制剂治疗过程中获取。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述样品是体液样品，优选选自包含全血、血清或血浆的组的血液样品，更优选选自包含全血、血清或血浆的组的外周血样品。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述样品是组织样品，优选患病组织的样品，更优选来自癌组织的活检物。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中将步骤a至c或a至b重复至少一次，优选多于一次。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述HDAC抑制剂选自包含以下各项的组：伏立诺他、罗米地辛、丙戊酸、帕比司他、恩替诺特、贝林司他、莫西司他、吉维司他以及瑞米司他或其药学上可接受的盐，优选游离形式的(E)-3-(1-(4-((二甲基氨基)甲基)苯磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-N-羟基丙烯酰胺或其盐酸盐或甲磺酸盐。
17.至少一个基因或由所述至少一个基因编码的蛋白质在针对需要HDAC抑制剂治疗的患者的所述HDAC抑制剂治疗中作为药效动力学标志物的用途，其中所述至少一个基因选自包含以下各项的组：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1。
18.至少一个基因或由所述至少一个基因编码的蛋白质用于预测针对需要HDAC抑制剂治疗的患者的所述HDAC抑制剂治疗的结果的用途，其中所述至少一个基因选自包含以下各项的组：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1。
19.至少一个基因或由所述至少一个基因编码的蛋白质作为用于测定HDAC活性的替代标志物的用途，其中所述至少一个基因选自包含以下各项的组：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1。
20.至少一个基因或由所述至少一个基因编码的蛋白质用于将潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者分级为反应者或非反应者的用途，其中所述至少一个基因选自包含以下各项的组：ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1。
21.一种用于测定样品中选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的至少一个基因的基因表达的试剂盒，
其中所述试剂盒包含探针，所述探针特异性结合由所述至少一个基因或其长至少150个核苷酸、优选长至少180个核苷酸的片段编码的至少一种mRNA，并且
其中所述试剂盒任选地包含选自包含以下各项的组的一种或多种另外的组分：培养基、培养基组分、缓冲液、缓冲液组分、RNA纯化柱、DNA纯化柱、染料、包括dNTP混合物的核酸、包括聚合酶的酶、以及盐。
22.一种用于测定样品中由选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的基因编码的至少一种蛋白质的水平的试剂盒：
其中所述试剂盒包含探针，所述探针特异性结合由所述至少一个基因编码的至少一种蛋白质或所述蛋白质的结构域，并且
其中所述试剂盒任选地包含选自包含以下各项的组的一种或多种另外的组分：培养基、培养基组分、缓冲液、缓冲液组分、膜、ELISA板酶底物、染料、包括聚合酶的酶、以及盐。
23.根据权利要求21或22所述的试剂盒用于测定样品中选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的至少一个基因的基因表达的用途。
24.根据权利要求23所述的用途，其中将所述测定的基因表达与所述样品中的HDAC活性相关联。
25.根据权利要求23或24所述的用途，其中所述样品是从潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者中提供。
26.根据权利要求21或22所述的试剂盒在根据权利要求1至16中任一项所述的方法中的用途。
27.一种用于在潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者的治疗中使用的HDAC抑制剂，其中在所述治疗之前和/或期间，选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的至少一个基因、对应于所述至少一个基因的至少一种mRNA、或由所述至少一个基因编码的至少一种蛋白质是用于测定所述HDAC抑制剂治疗对所述患者的效果的概率，或用于测定所述患者是否是所述HDAC抑制剂治疗的反应者。
28.一种治疗潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者的方法，所述方法包括向所述患者给予HDAC抑制剂，其中在所述方法之前和/或期间，选自包含ZFP64、DPP3、CCDC43、HIST2H4A/B、KDELC2以及MICALL1的组的至少一个基因、对应于所述至少一个基因的至少一种mRNA、或由所述至少一个基因编码的至少一种蛋白质是用于测定所述HDAC抑制剂治疗对所述患者的效果的概率，或用于测定所述患者是否是所述HDAC抑制剂治疗的反应者。
29.根据权利要求27所述的用于在潜在需要HDAC抑制剂治疗的患者的治疗或根据权利要求28所述的方法中使用的HDAC抑制剂，其中所述HDAC抑制剂选自包含以下各项的组：伏立诺他、罗米地辛、丙戊酸、帕比司他、恩替诺特、贝林司他、莫西司他、吉维司他以及瑞米司他或其药学上可接受的盐，优选游离形式的(E)-3-(1-(4-((二甲基氨基)甲基)苯磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-N-羟基丙烯酰胺或其盐酸盐或甲磺酸盐。
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