CN104056270A - 用于制备多器官损伤救治药物的组蛋白去乙酰化酶抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备治疗和/或预防多器官损伤的药物中的应用，以及一种治疗和/或预防多器官损伤的药物制剂，所述制剂含有有效治疗剂量的组蛋白去乙酰化酶抑制剂和辅酶Q10。所述药物制剂对多器官损伤具有显著的治疗效果。

Description

用于制备多器官损伤救治药物的组蛋白去乙酰化酶抑制剂

技术领域

本发明涉及一种治疗和/或预防多器官损伤的药物，属于急救药物领域。

背景技术

心衰、急性肺损伤、失血、烧伤、心脑血管疾病、重创、淹溺、电击等疾病发生时，经常导致多器官损伤。损伤早期主要出现重要的生命脏器缺氧、氧化应激损伤以及能量代谢障碍。如果不积极有效地治疗，将会导致一系列严重后果，如缺血再灌注损伤、弥散性血管内凝血、急性呼吸窘迫综合征，造成后期死亡率极高。多器官损伤时保护细胞的存活和功能是阻止病程恶化、提高疾病治愈率的关键，广谱细胞保护药物如组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)则可以通过改善缺氧、清除自由基、调节代谢等途径降低器官损伤、维护器官功能，从而达到疾病的良性转归。目前多器官损伤的治疗一般以综合治疗为主，通过控制引起多器官衰竭的病因的继续恶化，遏制疾病进程。而己出现多器官器质性损伤的伤患，多数采用手术控制为主。在无法进行手术的紧急情况下，通常采用糖皮质激素类及免疫抑制剂类药物。广谱性的细胞保护药物用于治疗和/或预防多器官损伤则少见报道。

乙酰化是重要的蛋白质翻译后修饰之一，组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)控制着蛋白乙酰化水平，HDACi则通过抑制HDAC的去乙酰化活性参与蛋白的乙酰化调节。乙酰化发生在包括组蛋白在内的多种蛋白中，HDACi则通过乙酰化调节参与多种生命活动，并且在损伤发生时对多种细胞和脏器产生广泛的保护作用，包括缺氧以及自由基损伤时细胞的存活、能量代谢的调节、正常心律的维持等。

研究发现，缺氧、缺血再灌注以及氧化应激损伤时，HDACi能够明显提高心、脑、肝、肺等脏器细胞的存活。HDACi对细胞保护作用的分子机制可能包括：通过调节对细胞存活和凋亡起重要作用的蛋白表达(如：线粒体外膜Mcl-1、Akt、Bcl-2等)抑制细胞凋亡；通过线粒体内膜和基质Mcl-1蛋白调节能量代谢，提高细胞对损伤的耐受力。

HDACi与能量代谢途径的调节密切相关。乙酰化修饰普遍存在于人体的代谢酶之中，调节代谢通路及代谢酶的活性，HDACi所维持的蛋白质乙酰化是细胞中一种与磷酸化相对的调控机制。另一方面，HDACi通过组蛋白中赖氨酸的去乙酰化，改变细胞信号通路，尤其是通过多聚赖氨酸残基的超乙酰化，改变DNA连接蛋白的活性，从而减少机体应激反应的发生，减弱器官和组织损伤，能够有效提高严重创伤早期器官的存活。

此外，某些HDACi具有抗心律失常作用，其机制可能与抑制钠离子通道和L型的钙离子通道有关。HDACi通过对钠离子通道的阻滞作用，可提高心肌快反应细胞动作电位发生的阈值；通过对钙离子通道的阻滞，可提高慢反应细胞动作电位的发生阈值。从而改变心肌膜对钠、钾、钙离子的转换，影响膜的电生理特性，延长心肌不应期，降低心肌的自律性，从而发挥抗心律失常作用，在严重创伤时早期有利于恢复和维持正常窦性心律。

辅酶Q10在机体内与线粒体内膜结合，它从复合物I和复合物II接受氢，将质子释放至线粒体基质内，电子传递给细胞色素，促进氧化磷酸化及电子的主动转移。辅酶Q10是生物氧化过程中电子传递链限速反应的关键性物质，它具有消除自由基、提高机体免疫力等功能，是天然的抗氧化剂、细胞代谢激活剂。1972年，意大利Gian Paolo Littarru教授证明缺乏辅酶Q10是引发心脏病等疾病的原因之一。1978年，PeterMitchell教授用化学渗透理论解释了生物能量转移包括在能量转换系统中辅酶Q10起到重要的质子转移作用。辅酶Q10可以消除已经生成的过氧化物，还可以改善心肌线粒体电子传递系统活性，

补充外源性辅酶Q10可以增加ATP的合成，可作为自由基清除剂降低血管的过氧化状态，减少内皮细胞和血管平滑肌细胞的超氧化物，保护并减轻血管内皮细胞的损伤，降低胞浆NADH的水平，促进血管内皮细胞释放可以保持血管张力的活性物质NO、PGI2。Baggio对2664例心力衰竭患者进行临床实验，结果表明无论是对特发性扩张型心肌病或原因不明的心力衰竭，辅酶Q10的疗效和安全性都是显著的。治疗充血性心力衰竭机理是通过外源性辅酶Q10进入心肌线粒体内膜，参与线粒体呼吸作用，显著提高线粒体膜磷脂保护和损伤修复效应，提高射血分数和增加心输出量。

综上所述，HDACi通过乙酰化调节对多种细胞和脏器产生广泛的保护作用，包括提高氧化应激损伤时细胞的存活、调节能量代谢、维持窦性心律等；辅酶Q10则在抗自由损伤、改善能量代谢方面具有重要作用。二者联用将有助于预防和/或缓解多器官损伤，提高存活率。但是现有技术还缺乏HDACi或辅酶Q10在治疗和/或预防多器官损伤中的应用，以及具有协同功效的联合用药的药物制剂。因此，本发明旨在提供一种HDACi和辅酶Q10在制备多靶向性的治疗和/或预防多器官损伤的药物中的应用以及相应的药物制剂。

发明内容

本发明首先公开了组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备治疗和/或预防多器官损伤的药物中的应用。

在一个优选的技术方案中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括：西达本胺(Chidamide)、丙戊酸钠(sodium valproate)、丙戊酸镁(magnesiumvalproate)、曲古抑菌素A(trichostatin A)、伏立诺他(Vorinostat)、罗米地辛(Romidepsin)、恩替诺特(Entinostat)、阿沛西丁(Apicidin)、帕比司他(Panobinostat)、贝林司他(Belinostat)、达西司他(Dacinostat)、吉维司他(Givinostat)、阿贝司他(Abexinostat)、奎司司他(Quisinostat)、瑞米司他(Resminostat)、莫西司他(Mocetinostat)、卓西司他(Droxinostat)、Tubastatin A(C20H21N3O2，CAS号：1310693-92-5)、AGK-2(C23H13C12N3O2，CAS号：304896-28-4)、AR-42(C18H20N2O3，CAS号：935881-37-1)、MC1568(C17H15FN2O3，CAS号：852475-26-4)、CUDC-101(C24H26N4O4，CAS号：1012054-59-9)和PCI-34051(C17H16N2O3，CAS号：950762-95-5，1072027-64-5)。

优选地，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸钠，所述丙戊酸钠被作为能量代谢调节剂使用。

在另一个优选方案中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸钠，所述丙戊酸钠被作为抗心律失常剂使用。

在本发明的一个优选技术方案中，所述多器官损伤包括：心衰、急性肺损伤、失血、烧伤、心脑血管疾病、重创、淹溺、电击、缺血再灌注损伤、弥散性血管内凝血和急性呼吸窘迫综合征。

本发明还公开了一种治疗和/或预防多器官损伤的药物制剂，所述制剂含有有效治疗剂量的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。

在一个优选的技术方案中，所述制剂还含有有效治疗剂量的辅酶Q10。

优选地，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自：西达本胺(Chidamide)、丙戊酸钠(sodium valproate)、丙戊酸镁(magnesium valproate)、曲古抑菌素A(trichostatin A)、伏立诺他(Vorinostat)、罗米地辛(Romidepsin)、恩替诺特(Entinostat)、阿沛西丁(Apicidin)、帕比司他(Panobinostat)、贝林司他(Belinostat)、达西司他(Dacinostat)、吉维司他(Givinostat)、阿贝司他(Abexinostat)、奎司司他(Quisinostat)、瑞米司他(Resminostat)、莫西司他(Mocetinostat)、卓西司他(Droxinostat)、Tubastatin A(C20H21N3O2，CAS号：1310693-92-5)、AGK-2(C23H13C12N3O2，CAS号：304896-28-4)、AR-42(C18H20N2O3，CAS号：935881-37-1)、MC1568(C17H15FN2O3，CAS号：852475-26-4)、CUDC-101(C24H26N4O4，CAS号：1012054-59-9)和PCI-34051(C17H16N2O3，CAS号：950762-95-5，1072027-64-5)。

更为优选地，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸钠。

在本发明的一个优选技术方案中，所述丙戊酸钠的有效治疗剂量为15mg/kg-500mg/kg，所述辅酶Q10的有效治疗剂量为50mg/kg-500mg/kg。

优选地，所述丙戊酸钠的有效治疗剂量为60-180mg/kg。

更为优选地，所述辅酶Q10的有效治疗剂量为100mg/kg

在本发明的一个优选技术方案中，所述制剂剂型可以为口服制剂、静脉注射制剂、肌肉注射制剂、皮下注射制剂或腹腔注射制剂。

本发明所公开的组蛋白去乙酰化酶抑制剂能够提高损伤后细胞(心肌、肝、肺和神经细胞等)存活率，组蛋白去乙酰化酶抑制剂和辅酶Q10联合使用，具有更好的治疗效果。细胞给予应激创伤后立即使用该药物，调节细胞能量代谢方式，提高器官受损时代谢提供能量的效率，增加在极端情况下的能量供应，细胞存活大大提高，并抑制凋亡，从而大大减弱机体组织损伤，达到提高患者治愈率的目的。该药物可有效保护临床病人的脏器组织，并有利于重大灾难以及战场上伤员展开自救和互救。

附图说明

图1.丙戊酸钠对H9C2细胞增殖的影响；

图2.丙戊酸钠对HL-7702细胞增殖的影响；

图3.丙戊酸钠对MRC-5细胞增殖的影响；

图4.丙戊酸钠对连二亚硫酸钠损伤的H9C2细胞增殖的影响；

图5.丙戊酸钠对连二亚硫酸钠损伤的HL-7702细胞增殖的影响；

图6.丙戊酸钠对连二亚硫酸钠损伤的MRC-5细胞增殖的影响；

图7.丙戊酸钠对物理缺氧损伤的H9C2细胞增殖的影响；

图8.丙戊酸钠对物理缺氧损伤的HL-7702细胞增殖的影响；

图9.丙戊酸钠对物理缺氧损伤的MRC-5细胞增殖的影响；

图10.丙戊酸钠对氧化应激损伤的H9C2细胞增殖的影响；

图11.丙戊酸钠对氧化应激损伤的HL-7702细胞增殖的影响；

图12.丙戊酸钠对氧化应激损伤的MRC-5细胞增殖的影响；

图13.西达本胺对氧化应激损伤的H9C2细胞增殖的影响；

图14.伏立诺他对氧化应激损伤的H9C2细胞增殖的影响；

图15.丙戊酸钠对氯化钴损伤的H9C2细胞增殖的影响；

图16.伏立诺他对氯化钴损伤的H9C2细胞增殖的影响；

图17.丙戊酸钠对损伤细胞有氧呼吸代谢的影响；

图18.单用丙戊酸钠治疗多器官损伤大鼠的4小时存活曲线；

图19.单用丙戊酸钠治疗多器官损伤大鼠的平均动脉压变化曲线；

图20.联合用药治疗多器官损伤大鼠的4小时存活曲线；

图21.Western blot检测药物对多器官损伤大鼠蛋白表达影响；

图22.空白组大鼠心肌线粒体透射电镜图；

图23.多器官损伤大鼠心肌线粒体透射电镜图；

图24.多器官损伤大鼠治疗后心肌线粒体透射电镜图；

图25大鼠实验前正常心电图；

图26多器官损伤大鼠心电图；

图27多器官损伤大鼠治疗后心电图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明权利要求所限定的范围构成进一步的限定。

实施例1.HDACi对细胞损伤的保护作用

本实施例采用二亚硫酸钠化学缺氧、氯化钴化学缺氧损伤、物理缺氧损伤和氧化应激损伤四种细胞模型来证明丙戊酸钠、西达本胺、伏立诺他等HDACi对多种受损伤器官组织(包括心肌、肝脏和肺脏)的保护作用，进而探索HDACi用于制备多器官损伤救治药物的可能性。

1.1实验方法

1.1.1细胞系：大鼠心肌细胞H9C2，人正常肝细胞HL-7702和人正常胚肺成纤维细胞MRC-5。

1.1.2丙戊酸钠对细胞增殖的影响：在96孔培养板中用含10％胎牛血清的Hyclone高糖血清培养基培养H9C2、HL-7702和MRC-5细胞，培养24h后在96孔中加入不同浓度的丙戊酸钠低糖DMEM溶液，浓度分别为：80μM、40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM，分别于24、48、72、96h用MTT检测，对照组采用低糖DMEM溶液。MTT检测方法是：每孔加入5mg/mL的MTT10uL，37℃继续孵育4h，然后每孔加入100uL10％SDS，孵育2h后，在570nm处检测并记录。

1.1.3连二亚硫酸钠化学缺氧损伤实验：将含有连二亚硫酸钠的Hyclone低糖无血清培养基加入96孔培养板的H9C2、HL-7702和MRC-5细胞中，建立细胞培养的化学缺氧环境，期间用倒置显微镜观察细胞形态变化。化学缺氧损伤形成后，细胞加入含有丙戊酸钠或西达本胺的完全培养基，对照组给予不含丙戊酸钠的完全培养基，培养24h后采用MTT方法进行测定。

1.1.4物理缺氧损伤实验：将H9C2、HL-7702和MRC-5细胞接种于96孔板中，放置在含有94.7％N2、0.3％O2、5％CO2混合气体的低氧培养箱中孵育1h后，加入含丙戊酸钠的DMEM液体100ul，对照组给予同等体积的DMEM。继续放入缺氧培养箱中培养2h后，用MTT检测细胞增殖效果。

1.1.5氧化应激损伤实验：将含有0.03％过氧化氢的GIBCO无血清培养基加入96孔培养板的H9C2、HL-7702和MRC-5细胞中，用倒置显微镜观察细胞形态变化，细胞氧化应激损伤后去除损伤液，加入含有丙戊酸钠、西达本胺或伏立诺他的完全培养基，正常对照组和损伤对照组用不含药物的完全培养基，培养24h后采用MTT方法进行测定。

1.1.6氯化钴化学缺氧损伤实验：将含有氯化钴的GIBCO完全培养基加入96孔培养板的H9C2细胞中建立细胞培养的化学缺氧环境，用倒置显微镜观察细胞形态变化。细胞低氧损伤后去除损伤液，加入含有丙戊酸钠或伏立诺他的完全培养基，正常对照组和损伤对照组给予不含丙戊酸钠的完全培养基，培养24h后采用MTT方法进行测定。

1.2实验结果

在H9C2、HL-7702和MRC-5三种细胞正常培养体系中加入一系列浓度的丙戊酸钠，MTT法细胞增殖实验发现加入丙戊酸钠后对细胞生长略有影响，但统计学分析没有显著性差异，结果见图1-3。

通过连二亚硫酸建立化学缺氧损伤细胞模型，图4-6显示加入丙戊酸钠药物后，H9C2、HL-7702和MRC-5三种细胞生存率较损伤对照组(零剂量组)均有显著提高，说明丙戊酸钠能够保护心、肝、肺等细胞拮抗化学缺氧损伤。

图7-9显示在物理缺氧损伤细胞模型中，加入丙戊酸钠药物后低氧培养的H9C2、HL-7702和MRC-5三种细胞的生存率较损伤对照组均有显著提高，说明丙戊酸钠能够保护心、肝、肺等细胞拮抗物理缺氧损伤。

图10-12显示在氧化应激损伤细胞模型中，加入丙戊酸钠药物后H9C2、HL-7702和MRC-5三种细胞的生存率较损伤对照组均有显著提高；另外两种HDACi西达本胺和伏立诺他也得到了近似的实验结果(图13-14)。说明丙戊酸钠、西达本胺和伏立诺他等HDACi能够保护心、肝、肺等细胞拮抗氧化应激损伤。

通过氯化钴建立的另外一种化学缺氧损伤细胞模型中，加入丙戊酸钠或伏立诺他可以显著提高H9C2细胞的生存率，见图15-16。说明丙戊酸钠和伏立诺他等HDACi均能保护心肌细胞拮抗氯化钴化学缺氧损伤。

该实施例从体外实验证明了在多种缺氧以及氧化应激损伤的情况下，HDACi对于心脏、肺脏和肝脏等重要脏器细胞具有显著的保护作用。机体在遭受心衰、急性肺损伤、失血、烧伤、心脑血管疾病、重创、淹溺、电击、缺血再灌注损伤、弥散性血管内凝血、急性呼吸窘迫综合征等疾病时，HDACi作为多器官损伤救治药物能保护重要生命脏器免受缺氧和氧化应激损伤，利于重要脏器存活，提高患者的存活率。

实施例2.HDACi提高线粒体呼吸能量代谢的检测

本实施例采用细胞生物能量测定仪检测HDACi对心肌细胞基础代谢、ATP生成以及细胞极限呼吸能力的影响，探索细胞受损时HDACi通过调节线粒体能量代谢保护细胞的机制。

2.1实验方法：

在XF细胞生物能量测定仪专用培养盘中每孔接种10000个H9C2大鼠心肌细胞，测量细胞的耗氧率(OCR)。每个24孔微孔盘中保留A1、B4、C3、D6四个位置，置入等体积的培养基作为背景校正之用。待细胞贴附之后，再给每个孔中加入适量的培养基，然后将细胞培养盘置于二氧化碳培养箱隔夜培养，进行过氧化氢损伤，损伤后加入含有丙戊酸钠的完全培养基。

分析用培养基成分以不含血清和碳酸氢盐的细胞培养基为基准培养基，加入丙氨酸二肽、丙酮酸钠和25mM葡萄糖。自探针上方的药物注射槽依次注入三种氧化磷酸化抑制剂OLIGOMYCLN(寡霉素)、FCCP(碳酰氰4-(三氟甲氧基)苯腙)、Rotenone/A.(鱼藤酮/A)，体积依次为75、83和93μl，注意保持每个孔所注入的药物体积相同，采用XF细胞生物能量测定仪检测并记录结果。

2.2实验结果：

图17显示XF细胞生物能量测定仪测定结果，表明丙戊酸钠明显提高心肌细胞线粒体有氧代谢，增加耗氧率和ATP的生成，提高细胞极限呼吸能力并具有明显的剂量效应。图例自上而下为：IC：正常细胞对照组；C：加入氧化磷酸化抑制剂的细胞对照组；H₂O₂：过氧化氢损伤对照组；12.5：丙戊酸钠12.5μM治疗组；25：丙戊酸钠25μM治疗组；50：丙戊酸钠50μM治疗组；100：丙戊酸钠100μM治疗组；200：丙戊酸钠200μM治疗组；Back.Corr.：培养基对照组。

线粒体作为细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，是控制和调节能量代谢的重要细胞器。心脏中存在着丰富的线粒体，线粒体的正常功能对于维持心脏功能具有至关重要的作用。本实施例说明HDACi在极端情况下能够调节心肌细胞线粒体有氧代谢，保证心脏自身供能，进而通过维持重要生命脏器的血供，拮抗多器官损伤，提高机体的存活率。

实施例3.HDACi和辅酶Q10对多器官损伤动物的预防和治疗作用

本实施例采用急性重度失血所致的多器官损伤大鼠模型来观测单用HDACi以及HDACi和辅酶Q10联用对多器官损伤的预防和治疗作用，进而确证HDACi和辅酶Q10用于制备多器官损伤预防和救治药物的可能性。

3.1实验方法

3.1.1实验动物：雄性Wistar大鼠，每个试验组12只，平均体重为250g，由北京维通利华实验动物有限公司提供。

3.1.2实验器材及物品：多导生理仪、恒流泵BT00-50M、异氟烷、引流管、生理盐水、丙戊酸钠等。

3.1.3实验过程：

利用Wistar大鼠建立急性重度失血所致的多器官损伤动物模型。大鼠按3％的异氟烷麻醉，仰卧固定。单侧股动、静脉切开留置导管，动脉导管通过压力换能器与多导生理仪系统连接，持续监测心率(P)、平均动脉压(MAP)等指标。术间采用1％的异氟烷麻醉。大鼠分两次放血，至总血量的60％。药物治疗实验先从留置的一侧动脉导管10分钟内快速放血40％，给药，然后模拟慢性失血和渗血自静脉导管50分钟内放血20％。药物预防实验在动物放血前24小时提前给药，然后依次自动脉快速放血40％，自静脉慢速放血20％。放血期间维持MAP不低于30mmHg，麻醉维持0.7％的异氟烷浓度。观察药物对动物多器官损伤的治疗作用。

3.1.4实验分组

丙戊酸钠单一用药治疗实验中，实验组给予低(60mg/kg)、中(120mg/kg)、高(180mg/kg)3个剂量的丙戊酸钠治疗；丙戊酸钠单一用药预防实验中，在动物放血前24小时皮下注射给予丙戊酸钠180mg/kg；丙戊酸钠和辅酶Q10联合用药实验中，实验组给予180mg/kg丙戊酸钠和100mg/kg辅酶Q10治疗。VHE对照组给予同等体积的生理盐水，空白对照组不采用任何治疗。

3.2实验结果：

图18为丙戊酸钠单药治疗和预防急性失血所致的多器官损伤大鼠的存活曲线。结果表明在给予药物丙戊酸钠治疗时，高、中、低3个剂量治疗组的存活率分别为75％、58.3％、44％，药物预防组(pretreatment)的存活率为50％，而对照组(control)的存活率为16.7％，VHE组存活率为25％。本申请中丙戊酸钠3个治疗剂量组以及预防组的生存率显著性高于空白对照和生理盐水对照组。图18生存曲线中生存率从高到低依次表示为：丙戊酸钠治疗组，浓度180mg/kg；丙戊酸钠治疗组，浓度120mg/kg；丙戊酸钠预防给药组，浓度180mg/kg；丙戊酸钠治疗组，浓度60mg/kg；生理盐水组是给予同等体积生理盐水治疗；6.空白对照组是指失血后不给予任何治疗。在整个实验过程中对动物的MAP进行监测，结果见图19，图19的图标与图18一致。从图19可以看出，与空白对照和生理盐水对照组相比，丙戊酸钠给药10分钟后即可显著提升多器官损伤动物的MAP，并在此后约2个小时维持在相对较高水平，预防给药对防止血压过低也起到了一定作用。维持一定水平的MAP有利于机体在应激状态下保证心、脑等重要脏器的血液供应。

联合用药治疗多器官损伤大鼠的存活曲线见图20。V组为丙戊酸钠组，V+C组为丙戊酸钠和辅酶Q10联合用药组，对照为生理盐水对照组。可以看出丙戊酸钠和辅酶Q10联合用药组大鼠的存活率达到77.8％，而单独使用丙戊酸钠组的大鼠存活率为70％。联合使用辅酶Q10和丙戊酸钠两种药物，对于大鼠的存活率有显著性的提高，因此认为联合两种药物的使用效果优于单独使用的药效。

本实施例中，通过急性重度失血造成大鼠全身多脏器缺血缺氧，建立多器官损伤动物模型。丙戊酸钠则通过调节能量代谢保护心、脑、肝、肺等多个生命重要脏器(参见实施例4-6)抵抗缺血缺氧引起的多器官损伤，显著延长动物的生存时间。联合应用辅酶Q10取得了更好的治疗效果，动物的生存率得到进一步提高。说明丙戊酸钠和辅酶Q10联用可用于制备治疗和/或预防多器官损伤的药物。

实施例4.HDACi对多器官损伤动物组织蛋白表达的影响

本实施例采用Western blot的方法检测HDACi治疗前后多器官损伤动物脑、心、肝、肺等重要脏器中与细胞存活和能量代谢相关的多种蛋白表达的变化，探索HDACi对多器官损伤动物保护的分子机制。

4.1实验方法：

采用实施例3的急性重度失血所致的多器官损伤大鼠模型，HDACi治疗4h后取Wistar大鼠组织(脑、心、肝、肺)保存在液氮中。进行Western blot检测时将动物组织从液氮中取出，立即称重和研磨，细胞裂解液中加入PMSF(苯甲基磺酰氟)防止蛋白降解；蛋白提取液在冰上放置30min、离心，取上清进行蛋白质定量测定；根据定量结果用细胞裂解液将浓度调至完全一致后，加入上样缓冲液将蛋白质煮沸变性，EP管分装后冻存于-70℃中保存备用；Western blotting检测10孔/1.0mm板上样20ul，电泳、转膜、封闭、免疫反应后，用Odyssey仪器进行扫描、图像分析。实验主要检测了Akt(蛋白激酶B)、pAkt(磷酸化蛋白激酶)、bim(Bcl-2家族中仅含有一个BH3结构域的蛋白)、Bcl-2(B细胞淋巴瘤/白血病-2)以及Mcl-1在药物治疗前后的表达差异。

4.2实验结果：

Akt在细胞存活和凋亡中起重要作用，它的活化形式有利于细胞存活，活化后即pAkt，可增强细胞组织存活，拮抗凋亡，增强Bcl-2基因表达。Mcl-1是Bcl-2家族蛋白，长链(Mcl-1_L)定位于线粒体外膜，具有抗凋亡的作用；短链(Mcl-1_s)定位在线粒体基质，发挥能量调节作用。图21中可以看出丙戊酸钠治疗组脑、肝、肺组织活化形式的pAkt增多，心肌、脑、肝、肺组织中Bcl-2和Mcl-1_L表达增多，提示细胞拮抗凋亡的能力显著增强；心肌、脑、肝、肺组织中Bim短链(Bim s)表达下降，表明细胞促凋亡能力下降；脑、心、肝、肺组织中Mcl-1_s表达量明显增加，提示能量生成增强。

本实施例检测了多器官损伤动物的脑、心、肝、肺等重要脏器中蛋白表达的变化。该部分实验结果提示HDACi对器官保护作用的分子机制是通过抑制细胞凋亡(pAkt、Bcl-2和Mcl-1_L表达升高、Bim s表达下降)和提高能量代谢(Mcl-1_s表达增加)实现的。

实施例5.动物组织酶学检测及心肌透射电镜观察：

本实施例检测HDACi治疗前后多器官损伤动物脑、心、肝等重要脏器中酶学变化以及心肌组织线粒体的完整性，探索HDACi对多器官损伤动物保护的酶学和物理学基础。

5.1动物组织酶学检测

采用Wistar大鼠主要器官组织，经过如实施例3所述建模后，动物40％失血后随机分组。分3个实验组，空白组，药物组，损伤组。药物组为给予丙戊酸钠治疗，治疗剂量为300mg/Kg。各组动物均在放血1h后将组织取出，称重并加入预冷的生理盐水，用组织匀浆机研磨后，离心取上清，测定上清液中重要代谢关键酶的活性变化，测定方法使用相对应的酶活测定试剂盒。下表1-3将蛋白酶活性及代谢关键物质中有显著性变化列出，其中空白组：假手术组；药物组：失血损伤后给药治疗组；损伤组：失血损伤后未给予治疗。

表1 大鼠血清中乳酸的变化

^*与空白组相比有显著性变化，p＜0.05。

^**与损伤组相比有显著性变化，p＜0.05。

表2 大鼠组织中乳酸脱氢酶的变化

^*与空白组相比有显著性变化，p＜0.05。

^**与损伤组相比有显著性变化，p＜0.05。

表3 心肌组织中ATP酶活性的变化

^*与空白组相比有显著性变化，p＜0.05。

^**与损伤组相比有显著性变化，p＜0.05。

从表1中可以看出组织中乳酸含量的变化趋势：心肌组织失血损伤后乳酸含量较空白组显著增加，给药组乳酸含量较损伤组显著减少；脑组织损伤后，失血损伤组乳酸含量较空白组显著增加，药物组乳酸含量较损伤组显著减少。

表2显示组织中乳酸脱氢酶的变化趋势：心肌组织、脑组织和肝脏组织失血损伤后乳酸脱氢酶活性较空白组LDH显著增加，心肌组织、脑组织和肝脏组织给药组治疗后乳酸脱氢酶活性较损伤组明显减少。

表3显示组织中ATP酶的变化，心肌组织损伤后钠钾ATP酶、钙镁ATP酶和总ATP酶活性均较空白组显著减少；给药组钠钾ATP酶、钙镁ATP酶和总ATP酶活性均较损伤组显著增加。

从以上结果综合分析，大鼠急性重度失血后全身多脏器缺血缺氧，糖酵解活动增强，乳酸堆积；丙戊酸钠药物治疗后，通过降低乳酸脱氢酶的活性抑制糖酵解，同时提高ATP酶活性增强有氧代谢，保证脑、心、肝等多个重要脏器的能量供应，从而显著延长动物的生存时间。

5.2心肌透射电镜观察结果

同5.1例所示动物，同时取动物心肌组织用戊二醛固定后，透射电镜观察线粒体变化，结果如图22-24所示。

从图22与图23的比较中看出，失血损伤后，心肌细胞的线粒体周围的糖原明显堆积，线粒体内外膜模糊甚至消失，并且线粒体嵴明显减少，而图22与图24的比较可以看出，在给药之后心肌组织内线粒体组织周围糖原减少，同时线粒体内外膜较为完整，有可辨的内外膜间隙。线粒体嵴明显清晰。说明丙戊酸钠用于多器官损伤治疗可以有效提高线粒体的稳定性，减少线粒体凋亡。

实施例6.HDACi改善多器官损伤动物的心电

经过如实施例3所述多器官损伤后，丙戊酸钠静脉推注治疗，在60-180mg/Kg治疗剂量中，进行全程的心电图检测，均出现较好的治疗效果。以180mg/Kg治疗剂量为例，如图25-27所示，图中每个大格显示为0.5S，每个小格显示为0.1S。图25显示失血前正常的窦性心律心电图；急性失血后，潜在的异位起搏点自律性增高，心电活动活跃，异位心电波形与窦性心律叠加，同时ST段明显抬高，显示急性心肌受损，如图26所示；在给药治疗后，图27显示药物有效抑制或消除了心脏异位起搏点的兴奋活动，对恢复和维持正常窦性心律起到了重要作用，同时失血后抬高的ST段明显回落，提示药物对心肌细胞的保护作用。

Claims (14)

1.组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备治疗和/或预防多器官损伤的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括：西达本胺、丙戊酸钠、丙戊酸镁、曲古抑菌素A、伏立诺他、罗米地辛、恩替诺特、阿沛西丁、帕比司他、贝林司他、达西司他、吉维司他、阿贝司他、奎司司他、瑞米司他、莫西司他、卓西司他、Tubastatin A、AR-42、MC1568、CUDC-101、AGK-2和PCI-34051。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸钠，所述丙戊酸钠被作为能量代谢调节剂使用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸钠，所述丙戊酸钠被作为抗心律失常剂使用。

5.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于，所述多器官损伤包括：心衰、急性肺损伤、失血、烧伤、心脑血管疾病、重创、淹溺、电击、缺血再灌注损伤、弥散性血管内凝血和急性呼吸窘迫综合征。

6.一种用于治疗和/或预防多器官损伤的药物制剂，其特征在于，所述制剂含有有效治疗剂量的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。

7.根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述制剂还含有有效治疗剂量的辅酶Q10。

8.根据权利要求7所述的药物制剂，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自：西达本胺、丙戊酸钠、丙戊酸镁、曲古抑菌素A、伏立诺他、罗米地辛、恩替诺特、阿沛西丁、帕比司他、贝林司他、达西司他、吉维司他、阿贝司他、奎司司他、瑞米司他、莫西司他、卓西司他、TubastatinA、AR-42、MC1568、CUDC-101、AGK-2和PCI-34051。

9.根据权利要求8所述的药物制剂，其特征在于，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸钠。

10.根据权利要求9所述的药物制剂，其特征在于，所述丙戊酸钠的有效治疗剂量为15mg/kg-500mg/kg。

11.根据权利要求10所述的药物制剂，其特征在于，所述丙戊酸钠的有效治疗剂量为60-180mg/kg。

12.根据权利要求或10所述的药物制剂，其特征在于，所述辅酶Q10的有效治疗剂量为50-500mg/kg

13.根据权利要求12所述的药物制剂，其特征在于，所述辅酶Q10的有效治疗剂量为100mg/kg

14.根据权利要求6-13任一所述的药物制剂，其特征在于，所述制剂剂型为口服制剂、静脉注射制剂、肌肉注射制剂、皮下注射制剂或腹腔注射制剂。