CN104667295A

CN104667295A - miR-30家族抑制剂在制备防治急性心肌梗死药物中的用途

Info

Publication number: CN104667295A
Application number: CN201310631981.5A
Authority: CN
Inventors: 朱依谆; 沈亚琪
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2013-11-30
Filing date: 2013-11-30
Publication date: 2015-06-03

Abstract

本发明属小核酸药物制药领域，涉及miR-30家族抑制剂在制备预防和治疗急性心肌梗死药物中的应用。本发明通过体外缺血缺氧细胞模型和体内心肌梗死模型实验研究，结果显示所述的miR-30家族抑制剂通过增加胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）的表达，增加H₂S的生成，从而保护缺血缺氧引起的体外细胞损伤，保护冠状动脉结扎所导致的的小鼠急性心肌梗死性损伤，明确miR-30家族抑制剂对缺血缺氧引起的心肌损伤具有明显的保护作用，可作为保护急性心肌梗死损伤的新药物。

Description

miR-30家族抑制剂在制备防治急性心肌梗死药物中的用途

技术领域

本发明属制药领域，涉及小核酸药物，具体涉及小核酸药物miR-30家族抑制剂在制备防治急性心肌梗死药物中的用途。

背景技术

现有技术公开了心肌梗死是指冠状动脉的血流急剧减少或中断，使相应的心肌出现严重而持久地急性缺血，最终导致一系列病例变化。目前临床实践中对缺血性心脏病的最佳治疗方法是血运重建加药物治疗，但实践显示，经皮冠状动脉介入(PCI)有支架内再狭窄的风险，冠脉旁路移植术有移植物闭塞的可能。因此深入探索缺血性心脏病发生机制，发现新的作用靶点，寻找有效的防治措施是本领域目前研究的一个热点。

研究显示，微小RNA(miRNA)在心肌缺血的发生发展中起着重要作用。miRNA是一种微小的，内源性，保守的非编码RNA，它约含有大约22个核苷酸，可与靶基因mRNA的3′-非翻译区相互配对结合，通过降解mRNA或抑制翻译，在转录后水平负调控靶基因的表达。研究显示miRNA参与了心脏疾病的不同病理生理过程，包括心律失常，心衰，心肌梗死，心肌肥大，心肌纤维化等。

H₂S被认为是心血管功能调节的新型气体信号分子，对多种心脏疾病起到保护作用，包括抑制心肌缺血损伤、保护心肌病引起的心脏损伤、治疗冠心病、抗心脏氧化应激及负性调节心脏收缩等。内源性H₂S在机体内主要有三种酶催化生成，包括胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和巯基丙酮酸转硫酶(3-MST)。CBS主要分布于神经系统，CSE主要存在于心血管组织中。

虽然miRNAs和H₂S都参与心肌缺血的保护作用，但miRNAs与H₂S之间的关系目前尚不清楚。尤其是miRNA通过调节H₂S在急性心肌梗死中的作用未见有报道。

发明内容

本发明的目的是提供小核酸药物miR-30家族抑制剂在制备防治急性心肌梗死损伤的药物中的新的用途。

本发明进行了体外缺血缺氧细胞模型和体内心肌梗死模型实验研究，结果显示所述的miR-30家族抑制剂通过增加胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）的表达，增加H₂S的生成，从而保护缺血缺氧引起的体外细胞损伤，保护冠状动脉结扎所导致的的小鼠急性心肌梗死性损伤，结果证实miR-30家族抑制剂对缺血缺氧引起的心肌损伤具有明显的保护作用，

本发明所述的miR-30家族抑制剂是经过锁核酸（LNA）修饰的寡核苷酸（可市购），其碱基序列为：GGATGTTTAC，它可以和miR-30家族成员（包括miR-30a，miR-30b，miR-30c，miR-30d，miR-30e）5’端第2-11个碱基完全互补配对。

本发明中，通过real-timePCR和western blot方法检测转染miR-30家族抑制剂后对CSE表达的影响及对H₂S生成的影响，同时检测miR-30家族抑制剂对缺血缺氧引起的原代心肌细胞损伤的保护作用，结果表明，miR-30家族抑制剂可以剂量依赖性地增加CSE的表达和H₂S的生成，通过增加细胞活力，减少细胞凋亡，从而保护心肌细胞的缺血缺氧损伤。

本发明的实验中，首先建立小鼠心肌梗死模型，通过检测心梗面积，心梗标志物，心功能和心肌细胞的凋亡情况观察尾静脉注射miR-30家族抑制剂后对心肌梗死的保护作用，结果表明，尾静脉注射miR-30家族抑制剂可以剂量依赖性地增加小鼠心脏中CSE的表达和血浆中H₂S的含量，从而通过减少心梗面积，改善心功能（增加射血分数EF和缩短分数FS），减少心脏梗死边缘区的细胞凋亡数量，保护急性心肌梗死损伤；更具体的，所述的miR-30家族抑制剂通过调控胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）mRNA和蛋白的表达发挥保护急性心肌梗死损伤的作用；所述的miR-30家族抑制剂通过调控硫化氢（H₂S）的产生发挥保护急性心肌梗死损伤的作用；所述的miR-30家族抑制剂通过增加细胞存活率和减少细胞凋亡发挥保护急性心肌梗死损伤的作用；所述的miR-30家族抑制剂通过减少梗死面积，减少梗死边缘区心肌细胞的凋亡和改善心脏功能发挥保护急性心肌梗死损伤的作用。

本发明通过体外缺血缺氧细胞模型和体内小鼠心肌梗死模型实验，证实miR-30家族抑制剂对心肌梗死具有保护作用，尤其是miR-30家族抑制剂通过调节H₂S生成，预防以及治疗急性心肌梗死损伤，本发明所述的的miR-30家族抑制剂，可进一步制备防、治急性心肌梗死损伤的新药物。

附图说明

图1显示了用Real-time PCR和western方法检测转染不同浓度的miR-30家族抑制剂后对CSE mRNA和蛋白表达的影响，同时用亚甲基蓝法检测细胞上清中H₂S的含量，

其中，数据用目的基因和内参GAPDH相比，H₂S含量用μM表示。LNA-miR-NC：miRNA阴性对照；LNA-miR-30FI：miR-30家族抑制剂；^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001：miR-30家族抑制剂组和阴性对照组相比。

图2显示了用MTT，TUNE法检测缺血缺氧处理后细胞活力和细胞凋亡的情况，

其中，Normoxia：正常氧供培养组；Hypoxia：缺氧培养组；lipo NC：转染试剂阴性对照组；LNA-miR-NC：miRNA阴性对照组；LNA-miR-30FI：miR-30家族抑制剂组；MTT和LDH数据正常组用100%表示，其余各组和正常组的相对值表示；红色为凋亡细胞，蓝色为细胞核，细胞凋亡率用凋亡细胞数占总细胞的百分比表示；^*p＜0.05，和正常氧供培养组细胞相比；#p＜0.05，miR-30家族抑制剂组和miRNA阴性对照组相比。

图3显示了用Real-time PCR和western方法检测尾静脉注射miR-30家族抑制剂后对小鼠心脏CSEmRNA和蛋白表达的影响，

其中，数据用目的基因和内参GAPDH相比，Scrambled-NC：miRNA阴性对照组；LNA-miR-30FI：miR-30家族抑制剂组；^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001：miR-30家族抑制剂组和阴性对照组相比。

图4显示了用TTC和Evans bule双染检测心肌梗死面积，

其中，白色为梗死区，红色为梗死边缘区，黑色为非梗死区，梗死面积用梗死区（白色）和危险区（红色+白色）相比表示，Saline：生理盐水对照组；Scrambled-NC：miRNA阴性对照组；LNA-miR-30FI：miR-30家族抑制剂组；^*p＜0.05，：miR-30家族抑制剂组和阴性对照组相比。

图5显示了用显色法和ELASA法检测血浆中心梗标志物乳酸脱氢酶LDH，肌酸激酶CK和肌钙蛋白cTnI的含量，

其中，假手术组（sham）数据用100%表示，其余各组用和假手术组的相对值表示，Saline：生理盐水对照组；Scrambled-NC：miRNA阴性对照组；LNA-miR-30FI：miR-30家族抑制剂组；#p＜0.05,##p＜0.01,###p＜0.001,生理盐水对照组、阴性对照组和假手术组相比；^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001：miR-30家族抑制剂组和阴性对照组相比。

图6显示了用心超检测心肌梗死后的心脏功能，

其中，EF为射血分数，FS为缩短分数，数据用百分比表示；LVIDd为左室舒张期内径，LVIDs为左室收缩期内径，数据用mm表示；LVEDV为左室舒张末期容积，LVESV为左室收缩末期容积，数据用μl表示；Saline：生理盐水对照组；Scrambled-NC：miRNA阴性对照组；LNA-miR-30FI：miR-30家族抑制剂组；#p＜0.05,##p＜0.01,###p＜0.001,生理盐水对照组、阴性对照组和假手术组相比；^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001：miR-30家族抑制剂组和阴性对照组相比。

图7显示了用western检测心梗模型心脏左心室CSE的表达和用比色法检测心梗模型血浆中H₂S的含量，

其中，western数据用目的基因和内参GAPDH相比，H₂S含量用μM表示，Saline：生理盐水对照组；Scrambled-NC：miRNA阴性对照组；LNA-miR-30FI：miR-30家族抑制剂组；^*p＜0.05，^***p＜0.001,生理盐水对照组、阴性对照组和假手术组相比；#p＜0.05,##p＜0.01,：miR-30家族抑制剂组和阴性对照组相比。

图8显示了用TUNEL检测梗死周边去心肌细胞凋亡的情况，并用western检测凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达，

其中，红色为凋亡细胞，蓝色为细胞核，细胞凋亡率用凋亡细胞数占总细胞的百分比表示，Western数据用目的基因和内参GAPDH相比。Saline：生理盐水对照组；Scrambled-NC：miRNA阴性对照组；LNA-miR-30FI：miR-30家族抑制剂组；^*p＜0.05，^**p＜0.01,生理盐水对照组、阴性对照组和假手术组相比；#p＜0.05,##p＜0.01,：miR-30家族抑制剂组和阴性对照组相比。

具体实施方式

实施例1

miR-30家族抑制剂对缺血缺氧引起的原代心肌细胞损伤的保护作用

分离原代乳鼠细胞，以5×10⁵cell/ml的密度接种于6孔板内，使细胞达到70％～80％的汇合率，用X-tremeGENE siRNA转染试剂进行转染，48小时后，realtime RT-PCR和Western blot测定CSE mRNA和蛋白的表达水平，同时检测细胞上清中H₂S的含量。此外，转染48小时后，用缺氧培养箱进行8小时缺氧处理，MTT和TUNEL检测细胞活力和细胞凋亡情况。实验数据进行单因素方差分析，p＜0.05，结果显示miR-30家族抑制剂可以剂量依赖性地增加CSE的表达，增加H₂S的生成，此外miR-30家族抑制剂可以增加缺血缺氧后的细胞活力，减少缺血缺氧引起的细胞凋亡。

实验结果证明，miR-30家族抑制剂对缺血缺氧引起的细胞损伤具有保护作用，该作用是通过增加CSE的表达，增加H₂S的生成而发挥的。

实施例2miR-30家族抑制剂对小鼠心梗模型的保护作用

采用尾静脉注射的方法，将miR-30家族抑制剂注入小鼠体内，连续注射3天，在最后一次注射2小时后，采用结扎冠状动脉左前降支的方法建立小鼠心梗模型，手术48小时后，检测心脏中CSE的表达和血浆中H₂S的变化，检测心梗标志物LDH，CK和cTnI的浓度，TTC和Evans blue双染计算梗死面积，TUNEL检测梗死边缘区细胞凋亡情况和相关凋亡蛋白的表达，此外手术5天后，心超检测心脏功能。结果显示，与心梗模型组相比，miR-30家族抑制剂可以明显地增加心脏中CSE的表达，增加血浆中H₂S的含量，从而减少心肌梗死面积，减少心梗标志物LDH，CK和cTn I的浓度，减少梗死边缘区心肌细胞的凋亡，同时通过增加EF和FS改善心梗之后的心脏功能。

实验结果证明，miR-30家族抑制剂通过增加内体H₂S的浓度保护小鼠急性心肌梗死性损伤。

Claims

1.miR-30家族抑制剂在制备防治急性心肌梗死损伤的药物中的用途。

2.按权利要求1的用途，其特征是所述的miR-30家族抑制剂是经过锁核酸（LNA）修饰的寡核苷酸，其序列为：GGATGTTTAC；其和miR-30家族成员，包括miR-30a，miR-30b，miR-30c，miR-30d，miR-30e，5’端第2-11个碱基完全互补配对。

3.按权利要求1的用途，其特征是所述的miR-30家族抑制剂通过调控胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）mRNA和蛋白的表达发挥保护急性心肌梗死损伤的作用。

4.按权利要求1的用途，特征是所述的miR-30家族抑制剂通过调控硫化氢（H₂S）的产生发挥保护急性心肌梗死损伤的作用。

5.按权利要求1的用途，特征是所述的miR-30家族抑制剂通过增加细胞存活率和减少细胞凋亡发挥保护急性心肌梗死损伤的作用。

6.按权利要求1的用途，特征是所述的miR-30家族抑制剂通过减少梗死面积，减少梗死边缘区心肌细胞的凋亡和改善心脏功能发挥保护急性心肌梗死损伤的作用。