CN105833291A - miR-125b 慢病毒在制备心肌细胞凋亡的保护药物中的应用 - Google Patents

miR-125b 慢病毒在制备心肌细胞凋亡的保护药物中的应用 Download PDF

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鞠少卿
申娴娟
储海丹
朱冰影
吴珊
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Abstract

本发明公开了一种miR‑125b 慢病毒在制备心肌细胞凋亡的保护药物中的应用。本发明具有明显的心肌细胞凋亡的保护作用，应用前景广阔。

Description

miR-125b慢病毒在制备心肌细胞凋亡的保护药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种miR-125b慢病毒在制备心肌细胞凋亡的保护药物中的应用。
背景技术
心肌细胞凋亡的保护药物的研发，一直是科研人员长期的研究课题，寻找一种有效的药物是广大科研人员的目标。
发明内容
本发明的目的在于提供一种miR-125b慢病毒在制备心肌细胞凋亡的保护药物中的应用。
本发明的技术解决方案是：
一种miR-125b慢病毒在制备心肌细胞凋亡的保护药物中的应用。
所述miR-125b慢病毒是miR-125b过表达慢病毒。
本发明具有明显的心肌细胞凋亡的保护作用，应用前景广阔。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是本发明慢病毒转染后miR-125b的表达情况示意图。
图2是Bcl-2表达水平示意图。
图3是bax表达水平示意图。
具体实施方式
一种miR-125b慢病毒在制备心肌细胞凋亡的保护药物中的应用。
所述miR-125b慢病毒是miR-125b过表达慢病毒。
材料与方法
2.1研究资料与仪器设备
2.1.1实验动物
出生2d的Sprague Dawley(SD)大鼠乳鼠，雌雄不拘，由南通大学医学院实验动物中心提供。
2.1.2慢病毒表达载体的构建
MiR-125b慢病毒表达载体及阴性对照载体的构建由上海吉凯基因化学有限公司完成。
2.1.3引物设计
MiR-125b引物包括反转录特异茎环(stem-loop)引物及实时荧光定量PCR上下游引物。由上海睿安生物科技有限公司合成。
2.1.4主要试剂
胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、DMEM培养基、Trypsin-EDTA(美国Corning公司)；RNA Master SYBR Green I(瑞士Roche公司)；Bax抗体、Bcl-2抗体、GAPDH抗体(德国SIGMA公司)；碘化丙啶(PI)、RNase A(南通碧云天生物技术研究所)；凋亡试剂盒(美国BD公司)；Trizol(美国Invitrogen公司)；Opti-MEMReduced Serum Medium(美国Gibco公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT)(Amresco公司)；二甲基亚砜(DMSO)(美国sigma公司)
2.1.5主要仪器
FastStart Universal SYBR Green Master(瑞士Roche公司)；高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)；紫外分光光度计(德国IimPlen公司)；7500 Real Time PCR仪(美国ABI公司)；逆转录试剂盒(美国Life Technologies公司)；PTC-2000核酸扩增仪、Light cycler定量PCR扩增仪、Allergra TM64R低温高速离心机(美国Backman-Coulter公司)；细胞培养设备(恒温培养箱、温控摇床、CO2培养箱)；核酸蛋白紫外测定仪、U-0080D核酸紫外检测仪、DolPhin-Doc凝胶成像系统(美国Wealtec公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；Bio-Rad Model 550酶标仪、THZ-C恒温振荡仪等；可控温水浴锅(上海电理仪器厂)；TDL80-2B型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；电子天平(TP200s，瑞士Mettler Toledo公司)；LX-100手掌型离心机(江苏海门麒麟医用仪器厂)；SZ-3自动三重纯水蒸馏仪(上海沪西分析仪器厂)；电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；DK电热恒温水槽(江苏海门市恒昌仪器厂)；5-2型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器厂)；Z-C恒温振荡器(江苏太仓实验设备厂)；生物分光光度计(德国Eppendorf公司)；各种型号的移液器(法国Gilson公司)。
2.2实验流程与方法
2.2.1乳鼠心肌细胞原代培养
(1)消化酶溶液配制:0.06％胰酶25m1，另外加入0.5ml DNaseI溶液和0.5gBSA，颠倒混匀，并于水浴锅中使消化酶溶液预热至37％
(2)做两个冰台：将平皿装满冰后倒置即可，75％酒精擦拭平皿后放进操作台。取2个60-mm的一次性组织培养平皿，加入5ml预冷的Ads缓冲液，标记上1，2放进操作台的冰台上。
(3)取2日龄的SD乳鼠若干只，低温麻醉，75％酒精浸泡1min；
(4)无菌条件下开胸，暴露心脏，用眼科剪于心脏收缩期剪取心尖部，将取下的心脏组织放进标记为1的培养皿中，以去除残留血液；
(5)上述操作完成后，用两把镊子剔除心脏上结缔组织和血块再转入标记为2的平皿中，再洗一遍，用镊子将心脏组织移入一青霉素瓶。
(6)用准备好的无菌眼科剪把心脏切碎成0.5-1mm3大小，Ads缓冲液冲洗2次。
(7)向青霉素瓶中加入相当于组织块10倍体积预温的消化酶，把上述切碎的心脏及胰酶液转入加了搅拌子的锥形瓶中，加上塞子，放入37℃水浴中，消化5min，期间每隔1min轻轻震荡锥形瓶以使心脏组织块散开与消化酶充分接触。
(8)用粗口巴氏滴管轻柔缓慢吹打分离组织块，停止吹打待组织块沉降后，吸去上清液(因其含有残留血细胞和从组织边缘消化下来的坏死心肌细胞)。
(9)加入适量消化酶，37℃水浴在作用5min，如前法期间每隔1min轻轻震荡锥形瓶；
(10)5min后轻柔吹打分离组织块，待组织块沉降，收集上清液，上清液移至一支新的15ml离心管中，与含10％胎牛血清(FBS)的M199终止培养液1:1等体积混合以终止胰酶消化。
(11)重复(9)(10)步骤，直至只剩余少许组织块为止
(12)将上述收集的含培养基和细胞上清的细胞悬液，以1000r/min离心5分钟。轻轻弃去上清，加10ml含20％胎牛血清的M199培养基轻轻吹打以重新悬浮细胞团。
(13)将上述10ml悬液转移到100-mm规格的无菌组织培养平皿中，于5％CO2，高湿度的37℃温箱中差速贴壁90分钟，目的是减少成纤维细胞的污染(这些细胞比心脏细胞贴壁快)。
(14)孵育后，收集平皿中的培养液，培养液包含非贴壁细胞(经富集了的心脏细胞)，细胞计数板计数并调整细胞密度至5×105细胞/ml，向培养液中加入0.1mmol 5-Brdu以抑制成纤维细胞生长，将其接种于六孔板中。
(15)24h后倒置显微镜下观察可见大多数心脏细胞出现自律性搏动，当日首次换液以含10％胎牛血清的M199培养基继续培养数日后用于后续实验。
2.2.2原代培养心肌细胞纯度鉴定
(1)心肌细胞培养于12孔板中经0.1％明胶处理过的12mm×12mm盖玻片上，纯化培养4d后弃去培养基，用预温的PBS轻轻冲洗细胞爬片3次，每次5min；
(2)固定：加入适量4％多聚甲醛固定30min；
(3)清洗：加入适量PBS清洗3次，每次5min；
(4)透膜：加入适量0.5％TritonX-100透膜15min；
(5)清洗：加入适量PBS清洗3次，每次5min；
(6)封闭：封闭液(0.5％TritonX-100+BSA+羊血清)室温封闭2小时，以封闭非特异性背景；
(7)弃血清(不用洗，用滤纸吸去血清)；
(8)一抗孵育：加入稀释后的肌钙蛋白抗体Troponin I(1：100)于4℃冰箱孵育过夜；
(9)清洗：加入适量PBS清洗3次，每次5min；
(10)二抗孵育：FITC标记二抗(1∶100)避光孵育2小时；
(11)染核：加适量DAPI(100ng/mL)细胞核染色标记；
(12)激光共聚焦显微镜下观察并拍照(激发波长488nm)；用PBS代替一抗作为阴性对照。
(13)取6个视野拍照，计数troponin I阳性细胞数作为心肌细胞数，DAPI荧光阳性的为细胞总数，计算心肌细胞比例。
2.2.3细胞总RNA提取
(1)细胞Trizol混悬液取出后置于冰上溶化。
(2)将融化好的混合液瞬时离心。
(3)将液体吹打混匀，之后加入0.2ml氯仿(三氯甲烷，Trizol：氯仿＝1:0.2)。
(4)盖紧盖子，用力震荡(手动颠倒)混匀15s，之后置于冰上静置3min。
(5)离心，4℃ 12，000r/min，15min，样品分成三层(红色：有机相蛋白，中间层DNA，上层水相RNA)。(统筹安排：期间配步骤9中要用到的1ml乙醇，1ml 75％的乙醇＝750μl无水乙醇+250μlDEPC水)。
(6)小心吸取上层水相液体(约500μl，即加入Trizol量的60％)，移入1.5ml离心管。
(7)加入500μl的异丙醇沉淀RNA(与吸取的水相液体比＝1:1)，颠倒混匀，之后冰上孵育15min。
(8)离心，4℃ 12，000r/min，10min，可见到管底有胶状沉淀。
(9)弃上清，留胶状沉淀，加1ml 75％的乙醇洗涤(步骤5中，配置的75％的乙醇，Trizol和乙醇的体积比为1:1)，温和震荡，颠倒混匀。
(10)离心，4℃ 7，500r/min 10min(统筹普安排：期间打开烘箱预热加温至50℃)。
(11)直接倒掉上清，尽量吸弃残留液体但保留沉淀，盖好盖子准备烘干。
(12)将离心管盖子打开，置于50℃烘箱中，5～10min，至沉淀变透明。
(13)盖好盖子取出，后依次加入30μl的DEPC水(具体所需溶解体积按实验经验、浓度及用量而定)，枪头吹打充分混合，盖好盖子后置于60℃烘箱中，孵育5～10min，得到RNA原液。
(14)配制测浓度的样品：取2μl提取好的原液，10倍比例稀释(即2μl原液+18μl DEPC水)，置于200μl的离心管内，于细胞室分光光度仪上测浓度。
(15)将RNA原液按下一步实验要求分装冻存于-80℃。
2.2.4逆转录反应
逆转录反应体系(miR-125b)
混匀，瞬时离心。反应条件如下：
42℃ 60min，
70℃ 5min，
4℃ ∞。
经过一个循环反应后，收集逆转录产物，将其置于冰箱-20℃保存。
2.2.5实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
实时荧光定量PCR反应体系(miR-125b)
混匀，瞬时离心。反应条件如下：
95℃ 10min，
95℃ 15s，
58℃ 31s，
经过40个循环后收集荧光，绘制溶解曲线，通过溶解曲线验证产物的特异性。每个样本做三个复孔，结果取其均值。
2.2.6细胞总蛋白提取
(1)冰上配制裂解混合液，按六孔板每孔200μl混合液配制，配制比例为RIPA∶PMSF＝100∶1。
(2)将细胞培养板(六孔板)上生长良好的新生乳鼠心肌细胞弃去上层培养基。用1×PBS冲洗3遍，吸净残留PBS，使细胞培养板尽量干燥。
(3)将裂解混合液按量加入，均匀摇晃，使混合液迅速铺满板后，冰上静置10min，至有胶状物附着即可进行下一步。
(4)取特制干净的细胞刮子，均匀刮取细胞胶状物于1.5ml EP管。
(5)离心，4℃ 12，000r/min，15min。
(6)离心完毕，吸取上清液于新的1.5ml EP管。
(7)在紫外分光度计上测蛋白浓度。
(8)按测得浓度，吸取50μl蛋白原液加入5μl的5×loadingbuffer(蛋白上样缓冲液)，吹打混匀。
(9)沸水煮蛋白8min，完毕取出后-80℃冻存。
2.2.7蛋白免疫印迹(Western Blot)
(1)细胞总蛋白提取(方法见2.2.5)
(2)配聚丙烯酰胺凝胶
(3)根据蛋白分子量大小及所需样本孔数，选择配胶浓度及所需体积，具体配方：
聚丙烯酰胺凝胶配方(分离胶)
聚丙酰胺凝胶配方(浓缩胶)
清洗玻璃板，倾斜晾干。将每组玻璃板对齐卡紧垂直卡在架子上，加去离子水测漏，完成后先加分离胶，加至距上端1.5cm处时，立即加水液封，静置30min后弃上层液封水，加浓缩胶至溢出，立即插入梳子，室温放置2h。
(4)电泳
安装电泳仪，按定量逐一加样至各加样孔，接通电源，按恒压调节80V-40min/100V-1h，电泳结束，根据Maker的位置切取目的蛋白。
(5)转膜
在一平皿中加入少量100％甲醇，将一定大小的PVDF膜剪下并置于甲醇中极化，约5min，极化结束，夹于转膜液中水洗平衡10min。安装转膜装置，“三明治”装置叠放次序：阴极碳板(黑色面)+海绵+三滤+胶-膜+三滤+海绵+阳极碳板(白色面)，将PVDF膜盖于胶上，夹好各层滤纸，调整装置，恒流转膜(2h，300mA或4℃ 12V转膜过夜)，此过程均需冰袋降温。
(6)封闭，
加一抗、二抗孵育将转膜完成的PVDF膜浸入封闭液(将5g脱脂奶粉溶于100ml 1×TBST)中，以60r/min转速封闭2h。封闭结束，按转速80r/min，用1×TBST洗5min。按RAGE一抗稀释比例(1:1000)配一抗稀释液，4℃过夜。第二天按转速80r/min，用1×TBST洗膜3次，每次10min。洗膜结束，孵上相应种属的二抗，室温孵育1.5h，结束后，按80r/min，用1×TBST洗膜4次，每次4min。
(7)显影
将洗涤完毕的PVDF膜用滤纸吸干残夜，平铺于显影仪相应位置，将配好的ECL的A、B发光液等比例混合(即用即配)后，均匀滴加于膜上，凝胶成像系统拍照、保存。显影所得条带用Image J软件进行灰度值扫描分析。
2.2.8流式细胞仪检测细胞凋亡
(1)取对数生长期目的细胞，0.25％胰酶消化，细胞密度为1×105个/ml接种于6孔板中，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，次日进行瞬时转染。
(2)干预24h后，消化制备细胞悬液，调整待测细胞浓度约为1×106个/ml。
(3)1，000r/pm，4℃离心5min，弃上清。加入195μl AnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞。
(4)加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。室温避光孵育10min，使用铝箔进行避光。
(5)1，000r/pm离心5min，弃上清，加入190μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。
(6)加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。
(7)随即进行流式细胞仪检测。
2.2.9 miR-125b慢病毒及阴性对照慢病毒的构建和转染
miR-125b过表达慢病毒(LV-miR-125b-GFP)及对照慢病毒(LV-GFP)的构建由上海吉凯基因化学公司完成，其制作过程包括病毒包装辅助质粒的构成，高质量病毒载体的准备，获得目的基因片段，载体与目的基因共转染于293T细胞系，然后进行病毒颗粒的包装、生存、收获和浓缩工作，并标记GFP。最后进行病毒滴度测定。参照慢病毒转染操作手册，首先进行预实验测定新生乳鼠心肌细胞感染复数值，正式实验时，每孔中加入5μg/mL polybrene增强感染效率，转染72h后在荧光显微镜下观察GFP绿色荧光，估算细胞转染效率，选择转染效率达80％以上的细胞进行后续试验
2.2.10细胞凋亡模型制作
将细胞接种于96孔板中，每孔100ul，37℃、5％CO2培养箱中培养至80％-90％细胞融合。阴性对照组加入PBS 100uL，测定组分别加入终浓度50、100、200及400μmol/L的H2O2100ul，37℃，5％CO2培养箱中处理6h，每组设6个复孔。
2.2.10 MTT法检测不同浓度H2O2对新生乳鼠心肌细胞增殖活性的影响
(1)不同终浓度的H2O2(50、100、200、400umol/L)损伤新生乳鼠心肌细胞6h后每孔加入20u1(5mg/ml)MTT试剂，37℃培养箱孵育4h终止培养。
(2)用移液枪吸弃上层培养液，每孔加入150u1DMSO，振荡l0min充分融解结晶物。
(3)选择490nm波长，在酶标仪上测定每个孔的光吸收度，记录结果，实验结果以细胞增殖抑制率表示。细胞增殖抑制率＝1-处理组平均OD值/对照组平均OD值×100％。
2.2.11统计学方法
所有数据均采用SPASS18.0进行统计学处理，用Graphpad Prism5软件进行绘图。计数资料的比较采用X2检验；计量资料结果以均数±标准差((X±S)表示；两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。
结果
3.1慢病毒转染后miR-125b的表达情况
LV-miR-125b-GFP及LV-GFP慢病毒表达载体转染新生乳鼠心肌细胞第48小时后，采用实时定量PCR的方法检测细胞内miR-125b的表达情况。细胞内miR-24表达量显著升高，与转染LV-CON-GFP及对照组细胞相比差异有统计学意义。详见图1；
慢病毒转染后细胞内miR-125b表达情况与LV-GFP组比较，*P＜0.05；与control组比较，**P＜0.05。
3.2新生乳鼠心肌细胞凋亡模型的建立
采用50、100、200、400μmol/L H2O2分别处理新生乳鼠心肌细胞6h后结果显示如表。按下列公式计算抑制率:抑制率(IR％)＝(1-处理组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100％，结果见表。
不同浓度H2O2对新生乳鼠心肌细胞OD值和增殖的抑制率(x±S)
200μmol/L H2O2处理新生乳鼠心肌细胞6h，抑制率为50.21％±10.21％，与正常对照组0％相比，两者有显著性统计学差异(p<0.01)。应用50μmol/L H2O2和100μmol/L H2O2预处理差异不显著。应用400μmol/L H2O2预处理细胞基本全部死亡。所以选择200μmol/L H2O2制作新生乳鼠心肌细胞凋亡模型。
3.3 miR-125b可增加由H2O2诱导的细胞存活率
LV-GFP-miR-125b+H2O2组、LV-GFP+H2O2组、H2O2组及NC组新生乳鼠心肌细胞分别用200μmol/L H2O2处理6h。与NC组相比，H2O2组新生乳鼠心肌细胞抑制率显著增加(P<0.05)。LV-GFP-miR-125b+H2O2组与LV-GFP+H2O2组及H2O2组相比，细胞抑制率明显减少，但仍较NC组高(P<0.05)。LV-GFP+H2O2组及H2O2组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。结果如表。
各组新生乳鼠心肌细胞OD值和抑制率
3.4 miR-125b对H2O2诱导的新生乳鼠心肌细胞的抗凋亡作用
LV-GFP-miR-125b+H2O2组、LV-GFP+H2O2组、H2O2组及NC组新生乳鼠心肌细胞分别用200μmol/L H2O2处理6h。流式细胞术结果显示:LV-GFP-miR-125b+H2O2组、LV-GFP+H2O2组、H2O2组及NC组凋亡率分别为(26.83±6.67 44.67±9.98 46.35±10.78 11.23±5.33)。与NC组相比，H2O2组新生乳鼠心肌细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。
LV-GFP-miR-125b+H2O2组与LV-GFP+H2O2组及H2O2组相比，细胞抑制率明显减少，但仍较NC组高(P<0.05)。LV-GFP+H2O2组及H2O2组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。
各组新生乳鼠心肌细胞凋亡率
3.5 miRNA-125b对新生乳鼠心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响
抗凋亡蛋白Bc1-2和促凋亡蛋白Bax是凋亡信号通路的主要相关蛋白，在正常状态下定位于线粒体膜上的Bc1-2与Bax相结合，当触发凋亡信号时，下游级联反应裂解Bcl-2与Bax分离，Bax行使凋亡功能，并触发caspase，最终诱导细胞凋亡。
LV-GFP-miR-125b+H2O2组、LV-GFP+H2O2组、H2O2组及NC组新生乳鼠心肌细胞分别用200μmol/L H2O2处理6h。westrern blot结果显示:
1.与NC组相比，H2O2组新生乳鼠心肌细胞Bcl-2表达降低(P<0.05)。
LV-GFP-miR-125b+H2O2组与LV-GFP+H2O2组及H2O2组相比，Bcl-2表达增加，但仍低于NC组(P<0.05)。LV-GFP+H2O2组及H2O2组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。
与NC组相比，H2O2组新生乳鼠心肌细胞BAX表达增加(P<0.05)LV-GFP-miR-125b+H2O2组与LV-GFP+H2O2组及H2O2组相比，Bax表达降低，但仍高于NC组(P<0.05)。LV-GFP+H2O2组及H2O2组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。

Claims (2)

1.一种miR-125b 慢病毒在制备心肌细胞凋亡的保护药物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的miR-125b 慢病毒在制备心肌细胞凋亡的保护药物中的应用，其特征是：所述miR-125b 慢病毒是miR-125b过表达慢病毒。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN104667295A (zh) * 2013-11-30 2015-06-03 复旦大学 miR-30家族抑制剂在制备防治急性心肌梗死药物中的用途

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CN104667295A (zh) * 2013-11-30 2015-06-03 复旦大学 miR-30家族抑制剂在制备防治急性心肌梗死药物中的用途

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VARUN NAGPAL, ET AL: "MiR-125b is Critical for Fibroblast-to-Myofibroblast Transition and Cardiac Fibrosis", 《CIRCULATION》 *

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