CN106282238A - 细胞的转分化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细胞的转分化方法，包括如下步骤：采用慢病毒表达载体制备慢病毒，慢病毒表达载体的序列中包括转录因子etv2；以及采用慢病毒感染目的细胞株并且培养5天～7天后，完成目的细胞株的转分化。这种细胞的转分化方法通过采用慢病毒为载体，将转录因子etv2转染到目的细胞株中接着培养5天～7天，完成目的细胞株的转分化。通过对上述完成转分化的目的细胞株的进行FACS鉴定，发现约有70％的细胞表达内皮细胞分子标记物CD144，通过对上述完成转分化的目的细胞株的进行QPCR鉴定，发现转分化的细胞中血管相关的基因有不同程度的提高。这种细胞的转分化方法可以实现目的细胞株的转分化，使得不同来源的细胞转分化为血管相关的细胞，从而可以用于细胞治疗。

Description

细胞的转分化方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种细胞的转分化方法。

背景技术

细胞治疗的首要问题便是细胞来源的问题。目前应用于心血管疾病的多能干细胞种类繁多，例如骨骼肌成肌细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞、肝脏干细胞、造血干细胞等。1996年，人类胚胎干细胞(hESC)被科研工作者成功分离并体外培养。此后Amit等通过长期培养及诱导分化实验证实，hESC不仅具有分化为内、中、外三个胚层的多能性，而且具有持续分裂的自我复制能力，其分裂能力与全能性要远远高于已经部分分化的多能干细胞，这给移植医学带来极大的希望和曙光。可是如何克服人类胚胎干细胞面临的伦理和免疫排斥问题，从而应用于临床一直困扰着生命科学工作者。2006年，Takahashi和Yamanaka首次报道通过逆转录病毒将Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4等4个因子导入小鼠成纤维细胞，经培养得到一种具有类似ESC的具有分化为内、中、外三个胚层潜能的类干细胞，命名为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS细胞)。iPS细胞，尤其是患者特异性iPS细胞的出现，完全克服了伦理和免疫排斥两大难题，大大拓宽了多能干细胞种子的来源，将干细胞研究和再生医学推向了一个全新的境地。

iPS细胞问世后，科学家们立刻对iPS细胞的定向分化进行了广泛的探索。2008年，Narazaki等首先将原始iPS细胞置于涂有DM(differentiation mediμm，基本细胞培养液加上10％胎牛血清及5×10-5mol/L 2-巯基乙醇)的IV号胶原蛋白培养基上诱导出中胚层细胞，并筛选出表达Flk1(内皮细胞和血细胞最早的分化标志)的干细胞。之后通过将Flk1+细胞培养于含有100ng/mL人类VEGF165及0.5mmol/L的8-bromo-cAMP的DM培养基中培养出了血管内皮干细胞，通过将Flk1+与OP9基质细胞共同培养的方法得到了淋巴管内皮细胞以及心肌细胞。Narazaki等发现由此分化而来的血管内皮细胞能形成类血管，可以正常表达CD31或SMA，而且CD31+和SMA+细胞还能相互连接，同时证明这些细胞能进一步分化为微动脉与微静脉。这样分化来的淋巴管内皮细胞也能表现出和ESC分化而来的淋巴管内皮细胞相似的特性。2014年，Slukvin小组采用转染不同组合的转录因子的方法成功的将包括iPS细胞在内的多种人类多能干细胞成功诱导分化为血管细胞以及相应的血液细胞，使得这些细胞又向应用于临床迈了一大步。

虽然iPS细胞已经被各个实验室在体外利用不同的方法将其诱导分化为各类细胞，但是长期观察发现，借助反转录病毒向细胞导入Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc等因子诱导的iPS细胞导入小鼠体内后极易生长肿瘤，其可能的原因是诱导因子中含有的致癌基因c-myc。这些都极大的限制了iPS细胞走向临床。国际上很多实验室都在尝试着改进诱导的方法，并取得了巨大的成功。Stadtfeld等和Okita等先后利用不容易整合到宿主基因的腺病毒及质粒为载体向目的细胞导入上述4个因子诱导iPS细胞产生；Zhou等将Yamanaka因子的蛋白质产物导入细胞诱导iPS细胞。Honggang Li等仅使用四个小分子化合物的组合对体细胞进行处理就可以成功地得到iPS细胞。尽管科学家们已经可以利用各种“无致癌性”的方法获得iPS细胞，但是考虑iPS细胞本身的制备是借助于外源物质的介入得来的，在还没有完全阐明iPS细胞产生机制之前，我们仍然不能说iPS细胞应用于临床是绝对安全的，iPS细胞的安全性以及潜在危险性都需要通过长期的观察和实验加以证明。因此，寻求一种来源充足、免疫原性低的非诱导方法得来的干细胞作为实验对象，仍然显得十分有意义。

间充质干细胞(MSCs)是干细胞的一种，其来源于发育早期中胚层的多能干细胞。体外实验证明在不同诱导条件下，MSCs不仅可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和肌肉细胞等中胚层细胞，而且还可以跨胚层分化为外胚层的神经元、神经胶质细胞以及内胚层的肝细胞等。MSCs还对造血干细胞具有扩增作用，共移植MSCs可以促进造血干细胞的植入。因此，MSCs具有广泛的临床应用价值。目前间充质干细胞的来源很丰富，由最初的骨髓来源已经发展到脂肪、皮肤、脐带血等。目前实验和临床研究的主要集中在骨髓来源的MSCs，但骨髓来源的MSCs有着自身的局限性：如随着供着年龄的增大，其骨髓源的MSCs的细胞数量及增殖分化潜能大大下降；细胞病毒感染率高以及供者MSCs的采集必须进行骨髓穿刺，这对供者带来了极大的痛苦等。这些因素极大的限制了骨髓源MSCs的应用。虽然脐血MSCs来源充足但是其低下的分离效率也限制了其广泛应用。细胞治疗的首要问题便是细胞来源的问题，因此寻找一种来源丰富，且取材分离简单的MSCs来源，将会让间充质干细胞真正成为细胞治疗的一大利器。

近年来，细胞转分化由于其效率高，速度快、安全性高等特点成为了细胞治疗当中的一种新生力量。已有研究表明，在体外通过向细胞中转染特定的转录因子可以使终末分化的细胞转分化为有功能的血管、神经等细胞。

发明内容

基于此，有必要提供一种可以用于细胞治疗的细胞的转分化方法。

一种细胞的转分化方法，包括如下步骤：

采用慢病毒表达载体制备慢病毒，所述慢病毒表达载体的序列中包括转录因子etv2；以及

采用所述慢病毒感染目的细胞株并且培养5天～7天后，完成所述目的细胞株的转分化。

在一个实施例中，所述采用慢病毒表达载体制备慢病毒的操作为：

将细胞代数小于10的293T细胞在完全培养基中培养，待所述293T细胞达到80％的生长密度后更换完全培养基；

将转染试剂加入到无血清培养基中混匀，接着加入所述慢病毒表达载体溶液并混匀，充分静止得到转染混合物，其中，所述慢病毒表达载体溶液的溶质包括packaging plasmid pCMV-dR8.2dvpr、envelope plasmid pCMV-VSV-G和pCCL-ETV2；

将所述转染混合物加入到更换了完全培养基的所述293T细胞中，混合10s～30s后置于细胞培养箱内培养48h～60h，收集第一上清液并更换完全培养基，将所述293T细胞继续培养24h～48h后收集第二上清液；

将所述第一上清液和所述第二上清液混合得到总上清液，对所述总上清液进行低速离心以沉降细胞和细胞碎片，接着采用0.45μm的过滤器进行过滤并保留滤液；以及

将所述滤液在20000rpm～25000rpm的转速下离心90min～120min，收集沉淀，所述沉淀即为所述慢病毒。

在一个实施例中，所述慢病毒表达载体溶液中，packaging plasmidpCMV-dR8.2dvpr、envelope plasmid pCMV-VSV-G和pCCL-ETV2的质量比为1：2.5：2.5。

在一个实施例中，所述慢病毒表达载体溶液的质粒总浓度为1ng/μL；

所述慢病毒表达载体溶液的溶质和无血清培养基的比例为10ng：1mL。

在一个实施例中，所述转染试剂和无血清培养基的体积比为2.5：100。

在一个实施例中，采用所述慢病毒感染目的细胞株并且培养5天～7天的操作具体为：

在感染前一天将所述目的细胞株铺板；

在感染第一天将所述慢病毒加入到温度为37℃的含有聚凝胺的完全培养基中得到感染培养基，将所述感染培养基与感染前一天铺板的所述目的细胞株混合；以及

将所述目的细胞株与所述感染培养基的混合物在细胞培养箱内37℃培养2h后，移除所述慢病毒培养基并且加入37℃的完全培养基继续培养至第三天，移除所述完全培养基并且加入内皮细胞生长培养基继续培养至第五天到第七天。

在一个实施例中，所述目的细胞株为人源肌母细胞、成纤维细胞、脐带来源的间充质干细胞、脂肪干细胞或神经胶质瘤细胞。

在一个实施例中，在感染前一天将所述目的细胞株铺板的操作中，所述目的细胞铺板在12孔细胞培养板内的密度为2×10⁴cells/well，或者所述目的细胞铺板在100mm细胞培养皿内的密度为2.5×10⁵cells/well。

在一个实施例中，所述含有聚凝胺的完全培养基中，所述聚凝胺的浓度为8μg/mL。

在一个实施例中，将所述感染培养基与感染前一天铺板的所述目的细胞株混合的操作中，所述慢病毒与所述目的细胞株的数量的比值为2TU/cell。

这种细胞的转分化方法通过采用慢病毒为载体，将转录因子etv2转染到目的细胞株中接着培养5天～7天，完成目的细胞株的转分化。通过对上述完成转分化的目的细胞株的进行FACS鉴定，发现约有70％的细胞表达内皮细胞分子标记物CD144，通过对上述完成转分化的目的细胞株的进行QPCR鉴定，发现转分化的细胞中血管相关的基因有不同程度的提高。因此，这种细胞的转分化方法可以实现目的细胞株的转分化，使得不同来源的细胞转分化为血管相关的细胞，从而可以用于细胞治疗。

附图说明

图1为一实施方式的细胞的转分化方法的流程图；

图2为96孔细胞培养板中293T感染不同梯度体积的慢病毒96小时后荧光对比照片；

图3为HSKMM(人源肌母细胞)在感染ETV2慢病毒后3dpi(感染三天后)细胞形态向上皮样细胞状转变对比照片，对照组为mcherry慢病毒感染；

图4为HSKMM细胞感染ETV2慢病毒7天后，孵育CD144抗体进行流式分析得到的结果图，横坐标表示HSKMM细胞被慢病毒感染并表达ETV2的细胞个数，纵坐标表示HSKMM感染慢病毒7天后转分化成类内皮细胞的个数；

图5为HSKMM细胞感染ETV2慢病毒7天后转分化成类内皮血管细胞QPCR分析各内皮基因的表达水平示意图。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对细胞的转分化方法作进一步详细的说明。

如图1所示的一实施方式的细胞的转分化方法，包括如下步骤：

S10、采用慢病毒表达载体制备慢病毒。

慢病毒表达载体的序列中包括转录因子etv2。转录因子etv2是一种包含ETS结构域的转录因子。ETV-2的编码区序列可以从ENSEMBL网站获得，序列号为ENST00000402764。

制备慢病毒的操作具体可以为：

将细胞代数小于10的293T细胞在完全培养基中培养，待所述293T细胞达到80％的生长密度后更换完全培养基；

将转染试剂加入到无血清培养基中混匀，接着加入慢病毒表达载体溶液并混匀，充分静止得到转染混合物，其中，慢病毒表达载体溶液的溶质包括packaging plasmid pCMV-dR8.2dvpr、envelope plasmid pCMV-VSV-G和pCCL-ETV2，充分静止的时间可以为5min～15min；

将转染混合物加入到更换了完全培养基的293T细胞中，混合10s～30s后置于细胞培养箱内培养48h～60h，收集第一上清液并更换完全培养基，将所述293T细胞继续培养24h～48h后收集第二上清液，完全培养基为含有10％(体积百分数)的胎牛血清(FBS)的DMEM培养基；

将第一上清液和第二上清液混合得到总上清液，对总上清液进行低速离心(800rpm～1000rpm)以沉降细胞和细胞碎片，接着采用0.45μm的过滤器进行过滤并保留滤液；

将滤液在20000rpm～25000rpm的转速下离心90min～120min，收集沉淀，沉淀即为慢病毒。

packaging plasmid pCMV-dR8.2dvpr、envelope plasmid pCMV-VSV-G为病毒包装系统，购买于addgene Plasmid#8455，Plasmid#8454。

pCCL-ETV2为含有转录因子etv2的编码区序列的骨架载体pCCL。ETV-2的编码区序列可以从ENSEMBL网站获得，序列号为ENST00000402764。pCCL-ETV2的具体构建过程为：在ETV-2的编码区序列两端分别引入BamHI和SalI酶切位点后，通过酶切连接可将目的片段连入骨架载体pCCL中，获得pCCL-ETV2。骨架载体pCCL购买于addgene#10881。

慢病毒表达载体溶液中，packaging plasmid pCMV-dR8.2dvpr、envelopeplasmid pCMV-VSV-G和pCCL-ETV2的质量比为1：2.5：2.5。

本实施方式中，慢病毒表达载体溶液的质粒总浓度为1μg/mL，慢病毒表达载体溶液的溶质和无血清培养基的比例为1μg：1mL。

本实施方式中，转染试剂和无血清培养基的体积比为6：100。

packaging plasmid pCMV-dR8.2dvpr、envelope plasmid pCMV-VSV-G和pCCL-ETV2可以分别先在感受态细胞中扩增，接着用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒得到。

制得的慢病毒可以通过荧光计数法测定滴度。

S20、采用S10得到的慢病毒感染目的细胞株并且培养5天～7天后，完成目的细胞株的转分化。

采用慢病毒感染目的细胞株并且培养5天～7天的操作具体可以为：

在感染前一天将目的细胞株铺板；

在感染第一天将慢病毒加入到温度为37℃的含有聚凝胺的完全培养基中得到感染培养基，将感染培养基与感染前一天铺板的目的细胞株混合；以及

将目的细胞株与感染培养基的混合物在细胞培养箱内37℃培养2h后，移除慢病毒培养基并且加入37℃的完全培养基继续培养至第三天，移除完全培养基并且加入内皮细胞生长培养基继续培养至第五天到第七天。

本实施方式中，目的细胞株为人源肌母细胞、成纤维细胞、脐带来源的间充质干细胞、脂肪干细胞或神经胶质瘤细胞。在其他的实施方式中，目的细胞株为还可以为其他来源的人源细胞。

在感染前一天将目的细胞株铺板的操作中，目的细胞铺板在12孔细胞培养板内的密度为2×10⁴cells/well，或者目的细胞铺板在100mm细胞培养皿内的密度为2.5×10⁵cells/well。

含有聚凝胺的完全培养基中，所述聚凝胺的浓度为8μg/mL。

将感染培养基与感染前一天铺板的目的细胞株混合的操作中，慢病毒与目的细胞株的数量的比值为2TU/cell。

内皮细胞生长培养基(ECM，Cat.No.1001，sciencell，)包括500mL基础培养基，25mL胎牛血清(FBS,Cat.No.0025)，5mL内皮细胞生长因子(ECGS,Cat.No.1052)和5mL青霉素、链霉素混合溶液(P/S,Cat.No.0503)。

这种细胞的转分化方法通过采用慢病毒为载体，将转录因子etv2转染到目的细胞株中接着培养5天～7天，完成目的细胞株的转分化。通过对上述完成转分化的目的细胞株的进行FACS鉴定，发现约有70％的细胞表达内皮细胞分子标记物CD144，通过对上述完成转分化的目的细胞株的进行QPCR鉴定，发现转分化的细胞中血管相关的基因有不同程度的提高。因此，这种细胞的转分化方法可以实现目的细胞株的转分化，使得不同来源的细胞转分化为血管相关的细胞，从而可以用于细胞治疗。

下面为具体实施例。

DMEM培养基(DMEM，Cat.No.C11995500BT，Gibco)主要成分包括4.5g/L D-葡萄糖，4.0mM L-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸钠。

完全培养基为DMEM培养基+10％胎牛血清(FBS，Cat.No.SH30084.03，HyClone)。

无血清培养基(Opti-MEM，Cat.No.31985，Gibco)。

内皮细胞生长培养基(ECM，Cat.No.1001，sciencell)成分包括500mL基础培养基，25mL胎牛血清(FBS,Cat.No.0025)，5mL内皮细胞生长因子(ECGS,Cat.No.1052)和5mL青霉素、链霉素混合溶液(P/S,Cat.No.0503)。

实施例1、慢病毒Lentivirus-ETV2的制备。

将packaging plasmid pCMV-dR8.2dvpr、envelope plasmid pCMV-VSV-G、pCCL-ETV2分别在Stbl3感受态细胞(TransStbl3Chemically Competent Cell，Cat.No.CD521，TRANS)中扩增，并使用无内毒素质粒大提试剂盒(Cat.No.DP118-02，TIANGEN)提取质粒，各自得到1mg的总量。

使用细胞代数小于10的293T细胞(Cat.No.CRL-3216，ATCC)，在完全培养基，100mm的细胞培养皿内进行培养，待细胞80％的生长密度后就可以准备进行质粒转染。

将pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2和pCCL-ETV2三种质粒按照1:2.5:2.5的质量比例(或摩尔比1：1：1)加入到1mL的常温无血清培养基Opti-MEM中，轻轻混合配置成慢病毒表达载体溶液(每个100mm细胞培养皿中转染的质粒浓度为1μg/mL，总质量不超过15μg)。

用10mL室温的完全培养基更换已经生长80％的密度的293T培养皿(100mm)内的旧培养基。

吸取25μL的FuGen6转染试剂(cat.No.E2691,Promega)，到1mL的常温无血清培养基(Opti-MEM)，轻混，并静止5min。

接着缓慢加入1mL含12μg质粒质量的慢病毒表达载体溶液，，边加边轻混，并室温静止15min，得到2mL转染混合液。

加入2mL转染混合液到100mm的80％的生长密度的含有新鲜DMEM的完全培养基的293T培养皿内。使用振荡器或移液器轻轻混匀10s～30s后，在细胞培养箱内培养48h。

48h后收集培养皿内的上清液，放在4℃内保存。

加入新鲜的完全培养基10mL继续培养24h～36h，收集上清液。

将两次收集的上清液混合，1000rpm低速离心10min，沉降细胞和细胞碎片。

离心后上清液使用0.45μm的过滤器进行过滤处理。

过滤后的液体通过4℃，90min，20200rpm的高速离心，收集沉淀，沉淀即为慢病毒。

将慢病毒用100μL受感染细胞培养基或PBS重悬，分装成小管，-80℃保存。

实施例2、荧光计数法测定Lentivirus-ETV2的滴度

测定前一天，为测定滴度所需的293T细胞铺板，96孔细胞培养板，每个孔加5000个细胞，体积为100μL。

感染前，对待检测的慢病毒样品进行10倍的梯度稀释。操作方法为：准备8个无菌的1.5mL的离心管，离心管子中加入DMEM完全培养基90μL，取待测定的病毒样品11μL加入到第一个管中，混匀，取11μL加入到第二个管中，继续相同的操作直到最后一管。

选取所需的细胞孔，吸去90μL培养基。加入90μL稀释好的病毒溶液。放入培养箱培养，小心操作，不要吹起细胞。培养过程中适当更换培养基以维持细胞正常生长。

37℃，5％CO₂培养48小时后，加入新鲜培养基100μL，再经过24h，更换新鲜培养基150μL。

96h后，观察荧光表达情况，拍摄相应病毒浓度孔的照片得到图2，并根据图2统计荧光细胞个数。

滴度的计算：

根据相应病毒浓度孔的荧光图片中GFP(绿色荧光蛋白)或是其他荧光蛋白的表达情况，比如在加入10^-6μL病毒原液的孔中观察到5个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有5个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本实施例中就是5/(10^-6)＝2×10⁶，单位为TU/μL，也就等于2×10⁹TU/mL。

实施例3、Lentivirus-ETV2感染目的细胞株

本实施例中采用的目的细胞株为人源肌母细胞(HSKMM，Cat.No.3520，Lot.No.2152，ScienCell)。

感染前一天，将人源肌母细胞在12孔细胞培养板内铺板，铺板密度为2×10⁴cells/well。

感染第一天，将相似处理过的细胞培养孔或皿重新消化细胞，计算细胞数。

将完全培养基(DMEM培养基+10％FBS)入37℃水浴加热。

按照最终为浓度8μg/μL将polybrene(Hexadimethrine bromide，Cat.No.H9268，Sigma)加入37℃的完全培养基内，接着加入慢病毒，得到感染培养基。

将12孔细胞培养板内的培养基移除，按照慢病毒与目的细胞株的数量的比值为2TU/cell，加入400μL感染培养基。其中，小体积的感染体系有助于提高感染效率。

在细胞培养箱内，37℃培养2h。移除慢病毒感染培养基，加入37℃完全培养基10mL，继续培养。

在感染后第一天，将完全培养基更换为内皮细胞生长培养基。在感染后第三天可以在荧光显微镜下观察得到图3。有图3可以看出，细胞形态发生转变，有成纤维细胞状向上皮样细胞状变化。

在感染后第5天，细胞形态的基本转变完成，继续培养至第7天，完成人源肌母细胞的转分化。

实施例4、转分化后的人源肌母细胞的血管内皮细胞分子标记物的FACS鉴定

1.在人源肌母细胞感染Lentivirus-ETV2后第7天，移除培养基，PBS缓冲液漂洗2次。

2.用0.25％Trypsin(EDTA0.02％)消化细胞5min。

3.用完全培养基终止消化，300g的离心速度收集细胞。

4.重新悬浮细胞于500μL的4℃预冷的Flow buffer(PBS+1％BSA)，300g的离心速度收集细胞。

5.重新悬浮细胞于200μL的4℃预冷的Flow buffer。

6.分别在两个1.5mL的离心管中，各加入100μL细胞悬液，一管用于孵育内皮细胞抗体，一管用于对照组实验。

7.在实验组中，每个1.5mL的离心管中，加入标记内皮细胞的荧光抗体anti-CD144(VE-CADHERIN，Alexafluor 647)1μL。对照组离心管中加入1μL PBS。

8.将孵育抗体的细胞放在冰上，避光孵育20min。

9.加入500μL的4℃预冷的Flow buffer，300g的离心速度收集细胞。

10.再次加入500μL的4℃预冷的Flow buffer，冰上静止5min。

11.300g的离心速度收集细胞，500μL的4℃预冷的Flow buffer重悬。

12.将细胞悬液移到流式管中，准备流式分析。

通过流式分析得到图4，由图4可以看出，约有50-60％的细胞表达CD144这个分子标记物。

实施例5、转分化后的人源肌母细胞的类血管内皮细胞的QPCR鉴定

1.在人源肌母细胞感染Lentivirus-ETV2后第7天，移除培养基，PBS缓冲液漂洗2次。

2.用0.25％Trypsin(EDTA0.02％)消化细胞5min。

3.用完全培养基终止消化，300g的离心速度收集细胞。

4.使用DNA-free TM RNA■Isolation for RT-PCR试剂盒(life，AM1914)提取样品RNA。

5.按照TAKALA逆转录试剂盒(RR047A)，反转录成cDNA。

6.按照TAKALA荧光实时定量PCR试剂盒(RR420A)的说明方法进行定量分析检测(共11对检测marker，如CDH5、Tal1、Kdr、Erg1、LMO2、Fli1、CD31、CD34、CD43、ETV2、FOXC2)，得到图5。

由图5可以看出，在转分化的细胞当中，血管相关的基因有不同程度的提高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种细胞的转分化方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用慢病毒表达载体制备慢病毒，所述慢病毒表达载体的序列中包括转录因子etv2；以及

采用所述慢病毒感染目的细胞株并且培养5天～7天后，完成所述目的细胞株的转分化。

2.如权利要求1所述的细胞的转分化方法，其特征在于，所述采用慢病毒表达载体制备慢病毒的操作为：

将细胞代数小于10的293T细胞在完全培养基中培养，待所述293T细胞达到80％的生长密度后更换完全培养基；

将转染试剂加入到无血清培养基中混匀，接着加入所述慢病毒表达载体溶液并混匀，充分静止得到转染混合物，其中，所述慢病毒表达载体溶液的溶质包括packaging plasmid pCMV-dR8.2dvpr、envelope plasmid pCMV-VSV-G和pCCL-ETV2；

将所述转染混合物加入到更换了完全培养基的所述293T细胞中，混合10s～30s后置于细胞培养箱内培养48h～60h，收集第一上清液并更换完全培养基，将所述293T细胞继续培养24h～48h后收集第二上清液；

将所述第一上清液和所述第二上清液混合得到总上清液，对所述总上清液进行低速离心以沉降细胞和细胞碎片，接着采用0.45μm的过滤器进行过滤并保留滤液；以及

将所述滤液在20000rpm～25000rpm的转速下离心90min～120min，收集沉淀，所述沉淀即为所述慢病毒。

3.如权利要求2所述的细胞的转分化方法，其特征在于，所述慢病毒表达载体溶液中，packaging plasmid pCMV-dR8.2dvpr、envelope plasmidpCMV-VSV-G和pCCL-ETV2的质量比为1：2.5：2.5。

4.如权利要求2所述的细胞的转分化方法，其特征在于，所述慢病毒表达载体溶液的质粒总浓度为1ng/μL；

所述慢病毒表达载体溶液的溶质和无血清培养基的比例为10ng：1mL。

5.如权利要求2所述的细胞的转分化方法，其特征在于，所述转染试剂和无血清培养基的体积比为2.5：100。

6.如权利要求1所述的细胞的转分化方法，其特征在于，采用所述慢病毒感染目的细胞株并且培养5天～7天的操作具体为：

在感染前一天将所述目的细胞株铺板；

在感染第一天将所述慢病毒加入到温度为37℃的含有聚凝胺的完全培养基中得到感染培养基，将所述感染培养基与感染前一天铺板的所述目的细胞株混合；以及

将所述目的细胞株与所述感染培养基的混合物在细胞培养箱内37℃培养2h后，移除所述慢病毒培养基并且加入37℃的完全培养基继续培养至第三天，移除所述完全培养基并且加入内皮细胞生长培养基继续培养至第五天到第七天。

7.如权利要求1或6所述的细胞的转分化方法，其特征在于，所述目的细胞株为人源肌母细胞、成纤维细胞、脐带来源的间充质干细胞、脂肪干细胞或神经胶质瘤细胞。

8.如权利要求6所述的细胞的转分化方法，其特征在于，在感染前一天将所述目的细胞株铺板的操作中，所述目的细胞铺板在12孔细胞培养板内的密度为2×10⁴cells/well，或者所述目的细胞铺板在100mm细胞培养皿内的密度为2.5×10⁵cells/well。

9.如权利要求6所述的细胞的转分化方法，其特征在于，所述含有聚凝胺的完全培养基中，所述聚凝胺的浓度为8μg/mL。

10.如权利要求6所述的细胞的转分化方法，其特征在于，将所述感染培养基与感染前一天铺板的所述目的细胞株混合的操作中，所述慢病毒与所述目的细胞株的数量的比值为2TU/cell。