CN115612664A - 人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞、其制法及应用 - Google Patents

人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞、其制法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞、其制法及应用，属于生物医药技术领域，解决现有技术中分化的重复性差、分化效率低下、分化时间长的问题。本发明的制备方法包括：步骤1.原条分化；步骤2.前体节中胚层分化；步骤3.传代及巩板间质前体细胞分化。本发明设计科学，构思巧妙，起始细胞密度控制简单、具体、易实现。本发明分化流程简单，时间短。本发明分化而成的细胞表达巩板成骨/软骨间质前体细胞的相关分子标记，且具有体外软骨向及骨向分化能力。采用本发明方法分化效率高、重复性高。分化效率稳定控制99.2％0±0.7％。

Description

人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞、其制法及 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞、其制法及应用。
背景技术
哺乳动物骨骼系统的发育起源于胚胎发育时期三个不同胚层，其中头面部骨及软骨来源于神经嵴间质细胞；除胸骨外的中轴骨(如脊柱、肋骨、肋软骨等)来源于体节中特化的巩板间质细胞；而四肢骨及胸骨则来源于侧板中胚层及其特化产生的肢体芽间质细胞。另一方面，体细胞诱导生成多能干细胞(iPSCs)是生物和医学领域的革命性发现。诱导多能干细胞(iPSCs)不仅能保持自我更新，且具有多向分化潜能，以多能干细胞为材料，通过转基因或化学诱导手段，已经实现了多种人体细胞的体外制备，在适当的诱导条件下可以高效率分化为神经元、心肌细胞以及胰岛素分泌细胞等。
目前，人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞，皆经由四个不同的胚层谱系逐步诱导而成。例如，Matsuda等首先将人诱导多能干细胞以单细胞状态(8x104个细胞/100mm细胞培养皿)进行接种，扩增4-5天后，通过调控巩板成骨/软骨间质前体细胞形成过程中各胚层分化相关信号通路，经6天时间将人诱导多能干细胞逐步向原条(PS)、前体节中胚层(PSM)、体节(SM)、巩板成骨/软骨间质前体细胞(SCL)诱导，其中除SM至SCL的诱导需72h外，其余胚层诱导时间均为24h。此外，Loh等首先将聚合度为90％的人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞以1:12至1:20传代至培养皿，贴壁/扩增过夜后，通过调控相似通路，同样经6天时间将上述多能干细胞逐步向原条(PS)、前体节中胚层(PSM)、体节(SM)、巩板成骨/软骨间质前体细胞(SCL)诱导，其中除SM至SCL的诱导需72h外，其余胚层诱导时间均为24h。但是，上述两种方法目前皆存在明显的缺陷，包括：
(1)分化的重复性差且分化效率低下。在目前的制备方法中，从多能干细胞接种开始至分化完成，所有流程在同一个培养皿中进行，由此带来的细胞过度扩增问题会引起分化效率低下；同时，不同批次的分化效率会因为密度控制的适宜程度而发生变化。虽然Loh等在其文献中以“1:12至1:20传代至新培养皿，贴壁过夜后进行分化”来描述其对起始细胞密度的控制，但在实际操作过程中这样宽泛的密度范围难以保证各批次分化间的重复性。经测试，以传统方法分化得到的SOX9+巩板间质细胞比例仅在84.9％±9.2％(均值±标准差，以流式细胞仪分析SOX9阳性细胞比例计)。即在分化细胞中存在超过15％的杂质细胞的污染。
(2)分化时间长。在控制起始细胞密度上，虽然Matsuda等改进了Loh等的方法，将细胞以单细胞形式接种，限制了分化过程中由于细胞密度过高引起的分化效率低下，但是，人多能干细胞在单细胞状态下存活力较差，即使添加了凋亡抑制剂，也不可避免地会造成起始细胞的损失；另外，以其建议的细胞密度以单细胞形式接种后，需经4-5天的扩增时间才可进行分化，导致制备时间过长，即至少需要10天左右才能完成目标细胞的制备。
因此，提供一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞，能在短时间制备高纯度该前体细胞，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的制备方法，解决现有技术中分化的重复性差、分化效率低下、分化时间长的问题。
本发明的目的之二在于，提供该方法制得的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞。
本发明的目的之三在于，提供人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的应用。
本发明的目的之四在于，提供包含人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的药物组合物。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞(简称巩板间质前体细胞)的制备方法，包括以下步骤：
步骤1.原条分化：将分化培养基I加入到人多能干细胞中，诱导培养；所述分化培养基I为含有activin A、CHIR99021、bFGF的CDMi基础培养基；
步骤2.前体节中胚层分化：将经步骤1培养后的细胞吸去分化培养基I，涮洗细胞后，加入分化培养基II，诱导培养；所述分化培养基II为含有SB431542、LDN193189、CHIR99021、bFGF的CDMi基础培养基；
步骤3.传代及巩板间质前体细胞分化：将经步骤2培养后的细胞吸去分化培养基II，再消化、中和、吹打细胞，制得单细胞混悬液，离心，重悬，将细胞重悬液接种于培养皿中，加入分化培养基Ⅲ，诱导培养一时间后，再将培养基更换为分化培养基Ⅳ；
所述分化培养基Ⅲ为含有SAG、LDN193189、XAV939、ROCKi的CDMi基础培养基；
所述分化培养基Ⅳ为含有SAG、LDN193189、XAV939的CDMi基础培养基。
本发明的部分实施方案中，步骤1中的诱导培养条件为37±1℃培养12-48小时；优选为24小时；
或/和步骤2中的诱导培养条件为37±1℃培养12-48小时；优选为24小时；
或/和步骤3中采用分化培养基Ⅲ的诱导培养条件为37±1℃培养12-48小时；优选为24小时；
或/和采用分化培养基Ⅳ的诱导培养条件为37±1℃培养12-48小时；优选为24小时。
本发明的部分实施方案中，所述分化培养基I中，各组分的含量为activin A 10-40ng/mL、CHIR99021 3-10μM、bFGF 10-30ng/mL；优选为activin A 30ng/mL、CHIR99021 7μM、bFGF 20ng/mL；
或/和所述分化培养基II中，各组分的含量为：SB431542 10～30μM、LDN193189100～200nM、CHIR99021 1～6μM、bFGF 20～80ng/mL；优选为SB431542 20μM、LDN193189125nM、CHIR99021 3μM、bFGF 40ng/mL；
或/和所述分化培养基Ⅲ中，各组分的含量为：SAG 100～300nM、LDN193189 400～800nM、XAV939 0.1～0.8μM、ROCKi 5～20μM；优选为SAG 200nM、LDN193189 600nM、XAV9390.5μM、ROCKi 10μM；
或/和所述分化培养基Ⅳ中，各组分的含量为：SAG 100～300nM、LDN193189 400～800nM、XAV939 0.1～0.8μM；优选为SAG 200nM、LDN193189 600nM、XAV939 0.5μM。
本发明的部分实施方案中，所述步骤3中，将细胞重悬液接种于培养皿中，其接种密度1×105～1.5×105，优选为1.18×105细胞/cm2。
本发明的部分实施方案中，在步骤1原条分化前，还包括有人多能干细胞的接种步骤，具体包括以下步骤：
S1.将人多能干细胞置于有Matrigel工作液的培养孔板中常规培养；
S2.在细胞密度达到70％-90％时，吸去培养基，于37℃消化细胞3-5min；
S3.吸弃消化液后，传代至另一个铺有Matrigel工作液的培养孔板中培养，优选地，按1:7-1:8接种。
本发明的部分实施方案中，所述Matrigel工作液为1mg Matrigel原液稀释于8～15mL DMEM/F12中制成，优选地，为1mg Matrigel原液稀释于12mL DMEM/F12中制成。
本发明提供的上述的制备方法制得的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞。
本发明提供的上述的制备方法制得的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞在制备修复关节软骨的药物中的应用。
本发明提供的上述的制备方法制得的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞在制备促进关节软骨组织再生的药物中的应用。
本发明提供的一种药物组合物，包括按上述的制备方法制得的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞、以及药学上可接受的载体。
本发明所述药学上可接受的载体是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。
优选地，所述药学上可接受的载体包括透明质酸、胶原蛋白。
本发明所述的人多能干细胞为人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。
本发明的实施例中，所述人多能干细胞为SOX9-tdTomato荧光报告细胞系，系利用基因编辑技术，在SOX9基因位点的3’UTR区域插入了tdTomato表达元件，其转录受到SOX9启动子的控制，在完成转录后，利用自身表达元件中的IRES序列介导翻译。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明设计科学，构思巧妙。起始细胞密度控制简单、具体、易实现。对于常规培养的人多能干细胞，只需按“细胞聚合度达70％-80％时，1:7-1:8传代”即可在第二天开始分化。
本发明分化流程简单，时间短。从开始分化到完成制备，只需4天时间。
本发明分化而成的细胞表达巩板成骨/软骨间质前体细胞的相关分子标记，且具有体外软骨向及骨向分化能力。
采用本发明方法分化效率高、重复性高。分化效率(以流式细胞仪检测SOX9+％计)稳定控制99.2％0±0.7％。
附图说明
附图1为诱导多能干细胞向巩板成骨/软骨间质前体细胞分化过程中的形态变化图；
附图2为对本发明方法制得的巩板成骨/软骨间质前体细胞进行巩板成骨/软骨间质前体细胞标记分子SOX9、TWIST1进行免疫荧光染色检测结果图；
附图3为对本发明方法制得的巩板成骨/软骨间质前体细胞进行体外成软骨(COLII免疫组织化学染色、阿利新蓝染色、番红-固绿染色)/骨(茜素红染色)分化后的验证结果图；
附图4为该方法制备诱导多能干细胞向巩板成骨/软骨间质前体细胞的效率结果图；
附图5为实时荧光定量PCR对分化细胞的鉴定结果图；
附图6为流式细胞分析对分化细胞的鉴定结果图；
附图7为小鼠骨关节软骨修复流程图；
附图8巩板成骨/软骨间质前体细胞可高效率修复关节软骨损伤结果对比图。
具体实施方式
本发明的实施例所用的人多能干细胞为SOX9-tdTomato荧光报告细胞系，系利用基因编辑技术，在SOX9基因位点的3’UTR区域插入了tdTomato表达元件，其转录受到SOX9启动子的控制，在完成转录后，利用自身表达元件中的IRES序列介导翻译。
实施例1
本实施例公开了本发明的分化用人多能干细胞的接种传代方法，所用试剂为：
PGM1培养基：在500mL人多潜能干细胞培养基PGM1(中国赛贝公司)中加入5mLPen-strep(100X储存液，美国Gibco公司)后过滤除菌。
Matrigel工作液：将瓶装Matrigel溶液从-80℃冰箱中取出，将其瓶身完全浸没于冰上，将冰盒至于4℃冰箱过夜放置。次日，将吸取原液的枪头、EP管等置于-80℃冰箱遇冷10分钟以上。使用-20℃预冷的枪头取1mg Matrigel原液(美国Corning公司)加入到12mL冰上预冷的DMEM/F12(美国Gibco公司)中，该工作液可以在4度冰箱中存放两周。
本实施例的分化用人多能干细胞的接种传代方法，具体包括以下步骤：
1.将用六孔板培养的人多能干细胞从37℃培养箱中取出，在普通光学显微镜下观察细胞密度，细胞聚合度为70％-90％；
2.吸去PGM1培养基，加入0.5mM EDTA(2mL/60mm培养板)，于37℃消化细胞5分钟，然后取出在显微镜下观察，若细胞克隆团中开始出现裂隙，克隆团周围开始皱缩，即可吸弃消化液终止消化，否则应放入37℃培养箱继续消化；
3.吸弃消化液后，加入适量PGM1培养基，均匀、缓慢、轻柔地将细胞从板底吹下来，按传代前聚合度70％-90％对应比例1:8传代至另一个Matrigel工作液处理过的六孔板，左右晃动培养板，使细胞均匀分布在培养板的生长区域，过夜培养后，第二天观察细胞，如细胞以克隆形式贴壁于培养板，细胞克隆团之间不连成片，则可以用于分化。
实施例2
本实施例公开了本发明的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的制备方法。本实施例中所用的试剂为：
Holo-transferrin工作液：称取15mg Holo-transferrin(美国sigma公司)粉末，向其中加入1mL UP水(美国Invitrogen公司)；
Rh-insulin工作液：称取2mg rh-insulin(中国solarbio公司)粉末，向其中加入1mL 10mM HCL，过滤除菌；
Polyvinyl alcohol工作液：称取500mg Polyvinyl alcohol粉末，向其中加入18mL UP水(美国Invitrogen公司)，搅拌至形成颗粒状悬浮物后，于85℃水浴加热溶解20分钟左右，定容至20mL，过滤除菌；
Monothioglycerol工作液：吸取450μmol当量monothioglycerol母液(美国sigma公司)，加入至UP水中，使溶液总体积为1mL，涡旋振荡混匀，过滤除菌；
CDMi基础培养基：IMDM(美国Gibco公司)234.384mL，Ham’s F12(美国Gibco公司)234.384mL，Chemically Defined Lipid Concentrate(美国Gibco公司)5mL，Holo-transferrin工作液500μL，rh-insulin工作液234μL，Polyvinyl alcohol工作液20mL，Pen-strep(美国Gibco公司)5mL，monothioglycerol工作液500μL；
分化培养基I：添加activin A(中国solarbio公司，30ng/mL)、CHIR99021(美国MCE公司，7μM)、bFGF(20ng/mL，美国peprotech公司)的CDMi基础培养基；
分化培养基II：添加SB431542(美国MCE公司，20μM)、LDN193189(美国MCE公司，125nM)、CHIR99021(美国MCE公司，3μM)、bFGF(美国peprotech公司，40ng/mL)的CDMi基础培养基；
分化培养基III：添加SAG(美国MCE公司，200nM)、LDN193189(美国MCE公司，600nM)、XAV939(美国MCE公司，0.5μM)、ROCKi(美国MCE公司，10μM)的CDMi基础培养基；
分化培养基IV：添加SAG(美国MCE公司，200nM)、LDN193189(美国MCE公司，600nM)、XAV939(美国MCE公司，0.5μM)的CDMi培养基；
Wash buffer：称取1.5g牛血清白蛋白(BSA，美国sigma公司)加入至500mL DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)中，混匀后过滤除菌；
本实施例的制备方法具体为：
1.原条(PS)分化
传代第二天，从37℃培养箱取出细胞，吸弃PGM1培养基。向孔中加入2mL Washbuffer洗去死细胞及残存的PGM1培养基，吸弃Wash buffer，向其中加入2mL分化培养基I，然后于37℃培养箱培养；
2.前体节中胚层(PSM)分化
24h后，从37℃培养箱取出细胞，吸弃分化培养基I。向孔中加入2mL Wash buffer洗去死细胞及残存的分化培养基I，吸弃Wash buffer，向其中加入2mL分化培养基II，然后于37℃培养箱培养；
3.传代及巩板间质前体细胞(SCL)分化
3.1消化：24h后，从37℃培养箱取出细胞，吸弃分化培养基II。向孔中加入500μLTrypLE Express消化液，将细胞置于37℃培养箱中消化3分钟；
3.2中和、重悬：消化完成后，向孔中加入4倍体积(2mL)的Wash buffer进行中和，均匀吹打使之成为单细胞悬液。将细胞吸入一个15mL离心管中，300g离心3分钟，离心完成后用适量Wash buffer重悬细胞；
3.3用血球计数板进行计数；
3.4取1.18x105细胞/cm2当量细胞于15mL离心管中，300g离心3分钟；吸弃上清，向其中加入4mL分化培养基III并吹打混匀，将细胞吸入一个60mm培养板中，然后于37℃培养箱培养；
3.5 24h后，从37℃培养箱取出细胞，吸弃分化培养基III。向孔中加入2mL Washbuffer洗去死细胞及残存的分化培养基III，吸弃Wash buffer，向其中加入2mL分化培养基IV，然后于37℃培养箱培养；
24h后，即可收集巩板成骨/软骨间质前体细胞。
试验例1
1.取实施例2的原条(PS)分化后的细胞、前体节中胚层(PSM)分化后的细胞、传代及巩板间质前体细胞(SCL)分化后的细胞于光学显微镜下观察，结果如附图1所示。
其中左图为PS(原条)，中间为PSM(前体节中胚层)，右图为SCL(巩板成骨/软骨间质前体细胞)，由附图1可知，本发明方法成功实现了人多能干细胞的原条分化、前体节中胚层分化、及SCL分化。
2.对分化细胞进行巩板成骨/软骨间质前体细胞标记分子SOX9、TWIST1进行免疫荧光染色检测，结果如附图2所示，其中左图为SOX9染色结果右图为TWIST1染色结果，由附图2可知，由人多能干细胞分化得到的前体细胞表达巩板细胞的相关分子标记，均一性好。
免疫荧光染色检测的具体步骤为：
将培养的巩板成骨/软骨间质前体细胞(接种于爬片)从37℃培养箱中取出，吸去上清。用PBS洗去悬浮的死细胞，弃去上清后立即加入适量4％多聚甲醛溶液，将细胞于常温固定8-10分钟；
吸去固定液，向孔中加入适量PBS，洗去残留固定液；
用0.3％ PBST(用PBS配制的体积分数为0.3％的Triton溶液)于室温处理10分钟；
吸去PBST，向孔中加入5％牛血清白蛋白溶液(PBS配制)，于室温封闭1小时；
吸去封闭液，向孔中加入适量一抗(稀释比为1:200，用封闭液稀释)，于4℃冰箱过夜染色；
吸去一抗，用PBS洗3次，每次3分钟；
吸去PBS，向孔中加入适量二抗(稀释比为1:400，用封闭液稀释)，于常温染色1小时；
吸去二抗，用PBS洗3次，每次3分钟；
吸去PBS，用含DAPI的封片剂进行染核、封片，拍照。
3.对分化细胞进行体外成软骨(COLII免疫组织化学染色、阿利新蓝染色、番红-固绿染色)/骨(茜素红染色)分化后的验证，结果如附图3所示，其中左上图为COLII免疫组织化学染色结果图，右上图为阿利新蓝染色结果图，左下图为番红-固绿染色结果图，右下图为茜素红染色结果图。由附图3可知，巩板成骨/软骨前体细胞具有体外软骨向分化的能力，经诱导分化后能够形成表达各种软骨特质分子标记的组织。
3.1体外成软骨分化的染色
3.1.1COLII免疫组织化学染色
将经成软骨诱导分化后的样品从37℃培养箱中取出，吸去培养基，将软骨球直接置于OCT胶中，并将其立即放入-80℃冰箱中包埋，待胶水凝固后用冰冻切片机切片，切片厚度为6μm；
切片完成后，将切片至于适量4％多聚甲醛溶液中固定8-10分钟即可进行染色；
弃去固定液，于适量PBS中洗去残留固定液；
用免疫组化笔在样品所在位置周围画圈；
用胃蛋白酶(美国sigma公司)对其进行抗原修复，于37℃孵箱中处理30分钟；
吸去复性液，将切片在PBS中浸洗两次，每次5-10秒钟；
封闭。5％牛血清白蛋白溶液(PBS配制)，于室温封闭1小时；
吸去封闭液，加入适量一抗(稀释比为1:200，用封闭液稀释)，于4℃冰箱过夜染色；
吸去一抗，用PBS洗3次，每次3分钟；
擦干PSB，加入适量二抗(稀释比为1:400，用封闭液稀释)，于常温染色1小时；
吸去二抗，用PBS洗3次，每次3分钟；
擦干PBS，用含DAPI的封片剂进行染核、封片；
3.1.2阿利新蓝染色
取上述固定后的切片一张，用0.1N HCl处理复水后的切片2分钟；
直接用1％阿利新蓝溶液染色30分钟；
将切片于蒸馏水中浸洗两次，每次5-10秒，将0.1NN HCl滴加在样品区域，处理2分钟以去除非特异性染色；
用蒸馏水洗去残留的盐酸，滴加苏木精(商品化H&E染色试剂盒)显核，染色4分钟；
将切片于自来水下冲洗4分钟促进苏木精返蓝；
95％乙醇脱水1分钟，100％乙醇脱水1分钟，二甲苯透明，中性树脂封片。
3.1.3番红-固绿染色
取上述固定后的切片一张，用苏木精(商品化H&E染色试剂盒)染色2分钟；
将切片于自来水下冲洗4分钟促进苏木精返蓝；
用1％固绿溶液(美国Sigma公司)染色1分30s；
用1％冰醋酸溶液分化15秒，洗去固绿的非特异性染色；
用移液枪吸去冰醋酸，用5％番红(美国sigma公司)染色1分钟；
用95％乙醇浸洗15s，切片入100％乙醇中脱水1分钟，二甲苯透明，中性树脂封片。
3.2体外成骨分化的染色
将成骨诱导分化的细胞从37℃培养箱中取出，用4％的多聚甲醛溶液于室温固定8-10分钟；
吸去固定液，PBS涮洗孔板以去除残余固定液；
吸弃PBS，直接加入茜素红染色液于室温染色2分钟；
吸去染色液，用PBS涮洗细胞3次，每次5分钟以去除非特异性染色。
4.实施例2的方法制备诱导多能干细胞向巩板成骨/软骨间质前体细胞的效率测试，具体步骤为：
将培养的巩板成骨/软骨间质前体细胞从37℃培养箱中取出，吸去上清。用PBS洗去悬浮的死细胞，弃去上清后用TryPLE消化液于37℃消化3分钟；
用4倍体积的Wash buffer终止消化，收集细胞悬液，300g于2-8℃离心3分钟；
吸弃上清，用预冷的PBS重悬细胞；
用70μm的细胞筛去掉细胞团块即可进行流式细胞仪分析。
结果以流式细胞仪分析SOX9表达细胞比例计，如附图4所示。由附图4可知，流式细胞仪分析不同批次分化得到的巩板间质前体细胞中SOX9表达细胞比例均在99％以上，均一性好。
试验例2
本试验例公开了对实施例2制得的巩板成软骨/骨前体细胞的荧光定量PCR鉴定，具体为：
1.RNA提取
吸去分化培养基，向培养皿/孔中加入适量TRI试剂，不断吹打，使细胞从培养皿/孔上解离；
将匀质化的细胞吸入一个1.5mL EP管中，于常温下静置5-10分钟，待细胞充分裂解；
相分离。按氯仿：TRI试剂＝1:5的比例向管中加入氯仿，剧烈摇晃15秒后于常温精置4-10分钟；
12000g离心15分钟(2-8℃环境)。离心完成后可见三相分层，最上层(无色透明)即含RNA；
沉淀RNA。按异丙醇：TRI试剂＝1:2的比例向一个新的EP管中加入异丙醇，加入等量含RNA的透明上清；于涡旋振荡器上振荡10秒后常温静置10分钟；12000g离心10分钟(2-8℃环境)，弃去上清；
乙醇洗涤。用无酶水配置75％乙醇。按75％乙醇：TRI试剂＝1.5:1的比例加入无水乙醇，轻轻上下颠倒EP管，12000g离心4分钟(2-8℃环境)，弃上清；
重复步骤8；
将EP管至于常温下晾干，向其中加入适量56℃的无酶水溶解RNA
用Nanodrop等定量设备进行RNA浓度测定；
2.反转录及实时荧光定量PCR
取100-1000ng的RNA，利用商品化的反转录试剂将其反转录为cDNA；
将cDNA用无酶水进行1:4-1:10稀释；
以day0未分化的多能干细胞为阴性对照，以ACTB(编码β-actin)为内参基因，利用商品化的qPCR试剂盒(中国Vazyme公司)对巩板间质前体细胞相关特征标志物的表达进行定量，其中必须定量的基因包括：SOX9、PAX1、TWIST1；
结果如附图5所示，巩板成软骨/骨前体细胞的特征分子标记SOX9、PAX1、TWIST1的表达与未分化多能干细胞相比有明显上调。
试验例3
本试验例公开了采用本发明的人多能干细胞诱导的巩板成软骨/骨前体细胞修复小鼠股骨关节软骨的试验，具体为：
1.移植体制备
移植流程如图7所示。移植前须进行分化细胞的鉴定。在RNA水平上，通过实时荧光定量PCR鉴定巩板成软骨/骨前体细胞的特征分子标记，其中SOX9、PAX1、TWIST1的表达与未分化多能干细胞相比应有明显上调，如图5所示；在蛋白水平上，通过流式细胞仪检测分化细胞中SOX9阳性细胞的比例，其比例应在99.0％以上，如图6所示(左为未分化多能干细胞，右为分化得到的巩板成软骨/骨间质前体细胞)。
将实施例2诱导完成后的细胞，吸弃培养基，向孔中加入500μL TrypLE消化液，于37℃培养箱中消化3分钟；取出，加入2mL Wash buffer吹打中和；300g常温离心3分钟，离心完毕后用Wash buffer重悬细胞。
用血球计数板进行细胞计数；
以每15万细胞/3μL密度将细胞用胶原蛋白I溶液重悬，点种在60mm细菌培养板上，于37℃培养箱放置30分钟待胶原凝胶凝固；
30分钟后，将细胞培养板从培养箱中取出，在培养板中加入4mLPBS并轻轻摇晃培养板，使含有细胞的胶原凝集物从板底解离，将培养板放回37℃细胞培养箱，用分化培养基III过夜培养，得到待移植细胞。
2.小鼠股骨关节软骨造损与细胞移植
试剂：阿佛丁储备液：称取25g 2，2，2-三溴乙醇(美国sigma公司)于滤瓶中，向其中加入15.5mL叔戊醇(美国sigma公司)配制成80x储备液。使用时用0.9％氯化钠稀释至1x(即0.5mL储备液加入39.5mL生理盐水)。
2.1小鼠股骨关节软骨缺损模型构建
用阿佛丁工作液对非肥胖性糖尿病/重度免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠进行腹腔注射麻醉，注射剂量为20μL/g体重；将小鼠仰卧位置于超净工作台上，用润滑液避免其眼球干燥；用剃毛机剃除手术部位附近的毛发；用尖头镊夹起起膝关节部位的皮肤，并用剪刀沿夹起部位向下腹位置作1cm切口；暴露切口皮下组织，用剪刀伸入其皮下部位并不断水平开合，对其皮肤及皮下组织间作钝性分离；用手术刀在其髌骨右侧的肌肉切一小口，用刀背沿该小口向上将肌肉划开，使得髌骨易于暴露；用手术刀的刀背拨动向其左侧拨动髌骨，使其向左侧脱位，暴露出股骨关节面；用18G针头在股骨关节面上钻孔，此时钻孔的目的为制造洞口，钻孔应轻柔、缓慢，并尽量避免向软骨下骨方向用力；不断用PBS吸去脱落的关节软骨组织，待产生0.5mm缺口时，停钻孔。用26G针头深入洞口后继续钻孔，此时钻孔的目的为暴露软骨下骨的血管，为移植细胞提供营养。直至产生宽为0.5mm左右，深为1mm左右的洞口时，停止钻孔，此时应有软骨下骨中的血液向上涌出；用PBS清洗洞口并用干燥的面前擦拭掉PBS方便移植。
将制备好的胶原凝胶移植体置于疏水性半透膜上方便移植体的转移。用镊子夹起半透膜并将其转移至缺损部位并将其移入洞口。
移植结束后，左手持尖头镊夹住缺损部位的肌肉向右拉动，同时右手持棉签向左推动股骨，使髌骨复位；用8-0带针可吸收缝合线缝合肌肉，后用4-0带针可吸收缝合线缝合皮肤。
试验例4移植体的鉴定
试剂：4％ PFA固定液：称取4g多聚甲醛粉末(美国sigma公司)于滤瓶中，加入90mL超纯水，于37℃摇床中过夜振荡溶解。溶解后用超纯水定容至100mL，于4℃避光保存；
19％EDTA脱钙液：称取19gEDTA粉末于滤瓶中，向其中加入90mL超纯水，在磁力搅拌器上搅拌溶解。当溶液变为白色时逐渐向其中加入NaOH粉末，继续搅拌至溶解。用精密pH试纸检测溶液的pH值，并用浓盐酸调pH至7.0，最后用超纯水定容至100mL；
15％蔗糖溶液：称取15g蔗糖晶体颗粒于滤瓶中，向其中加入90mL超纯水，常温溶解后用超纯水定容至100mL；
30％蔗糖溶液：称取15g蔗糖晶体颗粒于滤瓶中，向其中加入90mL超纯水，常温溶解后用超纯水定容至100mL；
0.1N HCl溶液：取95mL浓盐酸于滤瓶中，用超纯水定容至100mL；
1％阿利新蓝染色液：先配置5％阿利新蓝溶液。称取5g阿利新蓝粉末于滤瓶中，加入90mL超纯水混匀，用超纯水定容至100mL。用0.1N HCl将5％阿利新蓝溶液稀释至1％。
1.组织取材与包埋
1)移植后4-8周取材。用脱颈法将小鼠处死；
2)用尖头镊夹起起膝关节部位的皮肤，并用剪刀沿夹起部位向下腹位置作1cm切口；
3)暴露切口皮下组织，用剪刀伸入其皮下部位并不断水平开合，对其皮肤及皮下组织间作钝性分离；
4)用手术刀在其髌骨右侧的肌肉切一小口，用刀背沿该小口向上将肌肉划开，使得髌骨易于暴露；
5)用手术刀的刀背拨动向其左侧拨动髌骨，使其向左侧脱位，暴露出股骨关节面；
6)用手术刀向下切割膝关节连接部位使股骨游离，用剪刀剪去股骨关节面两侧的肌肉，用剪刀于远端股骨关节上游5mm处将其剪下，立即浸泡于固定液中，于4℃固定过夜；
7)倒掉固定液，用PBS将洗去残留固定液；
8)将组织浸没于脱钙液中，于摇床上常温脱钙2天，脱钙液每天更换；
9)倒掉脱钙液，将组织浸没于15％蔗糖溶液中，于4℃常温脱水，待组织沉底后更换为30％蔗糖溶液，待组织沉底后脱水完成；
10)将组织浸没于OCT包埋胶中，此时可直接进行组织冰冻切片，若不立即切片，可将包埋组织于-80℃冷冻保存；
2.化学染色鉴定与分析
切片可于常温保存在切片盒内，染色时，取切片浸泡于PBS中进行复水，脱去组织表面的OCT胶；按商品化试剂盒说明书所示的方法对冰冻切片进行染色。染色鉴定项目包括：H&E、番红-固绿染色、马松染色、阿利新蓝染色。
1)阿利新蓝染色
用0.1N HCl处理复水后的切片2分钟；用1％阿利新蓝溶液染色30分钟；
先用蒸馏水洗涤载玻片，再用0.1N HCl洗去非特异性结合；用蒸馏水洗去残留的盐酸，滴加苏木精(H&E染色试剂盒)显核，染色4分钟；于自来水下冲洗4分钟返蓝；95％乙醇脱水1分钟，100％乙醇脱水1分钟，二甲苯透明，中性树脂封片。
2)番红-固绿染色
冰冻切片常规复水。用苏木精(商品化H&E染色试剂盒)染色2分钟；将切片于自来水下冲洗4分钟促进苏木精返蓝；用1％固绿溶液(美国sigma公司)染色1分30s；用1％冰醋酸溶液分化15秒，洗去固绿的非特异性染色；用移液枪吸去冰醋酸，用5％番红(美国sigma公司)染色1分钟；
用95％乙醇浸洗15s，切片入100％乙醇中脱水1分钟，二甲苯透明，中性树脂封片。
3)马松染色及H&E染色
冰冻切片常规复水。用改良Masson三色染色液(中国索莱宝公司)，及H&E染色剂试剂盒(中国索莱宝公司)进行染色，方法遵照试剂盒说明书进行。
结果如附图8所示，由染色结果分析：H&E图显示受损部位被明显的软骨样组织充填，马松染色(Masson)的显示充填部位存在大量的胶原组织(深蓝染色)，同时阿利新蓝(Alcian blue)及番红-固绿(Safranin O)染色显示该区域除了有丰富胶原外，还产生了大量的多糖(软骨部分被阿利新蓝染成蓝色，被番红-固绿染成红色)，与正常关节软骨的染色情况相符并且与未移植细胞组产生极大的对比。表明采用本发明的人多能干细胞诱导的巩板成软骨/骨前体细胞，能修复小鼠股骨关节软骨，促进关节软骨的再生。
最后应说明的是：以上各实施例仅仅为本发明的较优实施例用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，当然更不是限制本发明的专利范围；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；也就是说，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内；另外，将本发明的技术方案直接或间接的运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.原条分化：将分化培养基I加入到人多能干细胞中，诱导培养；所述分化培养基为含有activin A、CHIR99021、bFGF的CDMi基础培养基；
步骤2.前体节中胚层分化：将经步骤1培养后的细胞吸去分化培养基I，涮洗细胞后，加入分化培养基II，诱导培养；所述分化培养基II为含有SB431542、LDN193189、CHIR99021、bFGF的CDMi基础培养基；
步骤3.传代及巩板间质前体细胞分化：将经步骤2培养后的细胞吸去分化培养基II，再消化、中和、吹打细胞，制得单细胞混悬液，离心，重悬，将细胞重悬液接种于培养皿中，加入分化培养基Ⅲ，诱导培养一时间后，再将培养基更换为分化培养基Ⅳ；
所述分化培养基Ⅲ为含有SAG、LDN193189、XAV939、ROCKi的CDMi基础培养基；
所述分化培养基Ⅳ为含有SAG、LDN193189、XAV939的CDMi基础培养基。
2.根据权利要求1所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的制备方法，其特征在于，步骤1中的诱导培养条件为37±1℃培养12-48小时；优选为24小时；
或/和步骤2中的诱导培养条件为37±1℃培养12-48小时；优选为24小时；
或/和步骤3中采用分化培养基Ⅲ的诱导培养条件为37±1℃培养12-48小时；优选为24小时；
或/和采用分化培养基Ⅳ的诱导培养条件为37±1℃培养12-48小时；优选为24小时。
3.根据权利要求1或2所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的制备方法，其特征在于，所述分化培养基I中，各组分的含量为activin A 10-40ng/mL、CHIR99021 3-10μM、bFGF 10-30ng/mL；优选为activin A30ng/mL、CHIR99021 7μM、bFGF20ng/mL；
或/和所述分化培养基II中，各组分的含量为：SB431542 10～30μM、LDN193189 100～200nM、CHIR99021 1～6μM、bFGF 20～80ng/mL；优选为SB431542 20μM、LDN193189 125nM、CHIR99021 3μM、bFGF 40ng/mL；
或/和所述分化培养基Ⅲ中，各组分的含量为：SAG 100～300nM、LDN193189 400～800nM、XAV939 0.1～0.8μM、ROCKi 5～20μM；优选为SAG 200nM、LDN193189 600nM、XAV9390.5μM、ROCKi 10μM；
或/和所述分化培养基Ⅳ中，各组分的含量为：SAG 100～300nM、LDN193189400～800nM、XAV939 0.1～0.8μM；优选为SAG 200nM、LDN193189 600nM、XAV939 0.5μM。
4.根据权利要求1或2所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，将细胞重悬液接种于培养皿中，其接种密度1×105～1.5×105，优选为1.18×105细胞/cm2。
5.根据权利要求1或2所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的制备方法，其特征在于，在步骤1原条分化前，还包括有人多能干细胞的接种步骤，具体包括以下步骤：
S1.将人多能干细胞置于有Matrigel工作液的培养孔板中常规培养；
S2.在细胞密度达到70％-90％时，吸去培养基，于37℃消化细胞3-5min；
S3.吸弃消化液后，传代至另一个铺有Matrigel工作液的培养孔板中培养，优选地，按1:7-1:8接种。
6.根据权利要求5所述的一种人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞的制备方法，其特征在于，所述Matrigel工作液为1mg Matrigel原液稀释于8～15mL DMEM/F12中制成，优选地，为1mg Matrigel原液稀释于12mL DMEM/F12中制成。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的制备方法制得的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞。
8.根据权利要求1-6任意一项所述的制备方法制得的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞在制备修复关节软骨的药物中的应用。
9.根据权利要求1-6任意一项所述的制备方法制得的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞在制备促进关节软骨组织再生的药物中的应用。
10.一种药物组合物，其特征在于，包括按权利要求1-6任意一项所述的制备方法制得的人多能干细胞来源的巩板成骨/软骨间质前体细胞、以及药学上可接受的载体；
优选地，所述药学上可接受的载体包括透明质酸、胶原蛋白。
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