JP2021176315A - 神経系細胞の作製方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】細胞の遺伝子を傷つけることなく、短期間で効率よく神経系細胞を作製可能な、神経系細胞の作製方法を提供する。【解決手段】本発明の態様によれば、幹細胞を用意することと、幹細胞に誘導因子ＲＮＡを導入し、神経系細胞に分化させることと、を含む、神経系細胞の作製方法が提供される。また、本発明の態様によれば、細胞を用意することと、細胞に初期化因子ＲＮＡを導入することと、初期化因子ＲＮＡを導入された細胞に誘導因子ＲＮＡを導入し、神経系細胞に分化させることと、を含む、神経系細胞の作製方法が提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、細胞技術に関し、神経系細胞の作製方法に関する。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、体を構成するあらゆる細胞に変化することができる。そのため、様々な種類の体細胞や組織に変化することができるｉＰＳ細胞は、細胞移植治療や創薬研究に利用されることが期待されている。また、例えば、２０１４年にはｉＰＳ細胞から作製された網膜の細胞が移植治療に応用された。日本のみならず、世界各国でも、ｉＰＳ細胞から脳の細胞や、各種臓器の細胞を作製し、移植治療に用いるプロジェクトが進んでいる。
従来、ｉＰＳ細胞を分化細胞に変化させる方法は数多くある。しかし、ｉＰＳ細胞を移植治療に利用するためには、ｉＰＳ細胞の効率の良い分化誘導方法を確立することが重要である。具体的には、ｉＰＳ細胞を分化細胞へと誘導するときに用いる技術を確立し、分化誘導の効率及び精度を向上させ、作製した分化細胞の機能性などが移植治療に耐えうるものである必要がある。
従来、ｉＰＳ細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から分化細胞へ誘導する方法は、細胞の性質を決定するホルモンや成長因子、並びに低分子化合物を組み合わせ、それらの量比や濃度を経時的に変える事で、発生の過程を模倣して行なわれてきている。しかし、発生の過程を試験管内で完全に模倣することは難しく効率が悪い。また、マウスの体細胞分化誘導に比べてヒトの場合は非常に長い分化誘導期間が必要であり、例えば成熟した神経を作製するためには３ヶ月以上を要する。
さらに、ＥＳ／ｉＰＳ細胞株によって分化誘導の効率が大きく異なり、誘導された体細胞の性質が不均一である等の問題がある。実際に、複数のＥＳ細胞クローンに化学物質を添加し、様々な細胞を作製したところ、膵臓の細胞に分化しやすいクローンや、心臓の細胞に分化しやすいクローンなどが存在し、クローンによって分化能力の違いがあることが示された（例えば、非特許文献１参照。）。また、無血清凝集浮遊培養法（ＳＦＥＢｑ法）とよばれる、血清や神経細胞分化を阻害する化学物質を含まない培地でｉＰＳ細胞を培養することで、ｉＰＳ細胞／ＥＳ細胞から神経細胞を作製する方法を利用し、数十種類のｉＰＳ細胞から神経細胞を作製したところ、神経細胞に変化しにくいｉＰＳ／ＥＳ細胞クローンが存在することが証明された（例えば、非特許文献２参照。）。
具体的には、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞からホルモンや化学物質を利用する方法を用いて分化誘導された細胞は、初期の段階では胎児段階の体細胞であることが確認されている。ヒトの成熟した体細胞の分化誘導は極めて難しく、数か月にわたる長期の培養が必要である。しかし、発生が完了した個体を対象とする創薬や移植医療において、個体の成熟度に一致する体細胞を作製することは重要である。
また、神経細胞には、様々なサブタイプの細胞が存在するが、ホルモンや化学物質を利用する方法では、これらのサブタイプ神経を均一にＥＳ／ｉＰＳ細胞から分化誘導できない。そのため、特定の神経サブタイプ特異的な創薬スクリーニングができない。したがって、創薬スクリーニングの効率が低い。また、移植医療においても、疾患のある特定の細胞だけを濃縮して移植することができない。
これに対し、ウイルスを用いて特定の体細胞の性質を規定する遺伝子をＥＳ／ｉＰＳ細胞に直接を導入し、目的の体細胞を作製する方法が提案されている。ウイルスを用いる方法は、ホルモンや化学物質を利用する方法に比べて、例えば２週間のような非常に短い期間で成熟した神経細胞を特異的に作製可能である。また、特定の遺伝子導入により神経細胞を作製すると、例えば興奮性神経のみを均一に得ることができる。そのため、特定の神経サブタイプ特異的な創薬スクリーニングが可能であり、移植医療においても、疾患のある特定の細胞だけを濃縮して移植できると考えられている。
しかし、特定の遺伝子を発現させるためにウイルスを用いて幹細胞を体細胞に分化誘導する方法においては、ＥＳ／ｉＰＳ細胞のゲノム上に遺伝子が挿入され、内在性の遺伝子の傷を付けてしまう。その結果、創薬スクリーニングが正しく行なわれず、移植においては癌化のリスクが伴うという問題がある（例えば、非特許文献３、４参照。）。
Nature Biotechnol 26(3): 313-315, 2008. PNAS, 111:12426-12431, 2014 N Eng J Med, 346:1185-1193, 2002 Science 302: 415-419, 2003
本発明は、細胞の遺伝子を傷つけることなく、短期間で効率よく神経系細胞を作製可能な、神経系細胞の作製方法を提供することを課題とする。
本発明の態様によれば、幹細胞を用意することと、幹細胞に誘導因子ＲＮＡを導入し、神経系細胞に分化させることと、を含む、神経系細胞の作製方法が提供される。
上記の神経系細胞の作製方法において、幹細胞が人工多能性幹細胞であってもよい。神経系細胞が、神経細胞、神経幹細胞及び神経前駆細胞のいずれかであってもよい。神経細胞が、抑制性神経細胞、興奮性神経細胞及びドーパミン産生神経細胞のいずれかであってもよい。あるいは、神経系細胞は、運動神経細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、及びオリゴデンロドサイト等であってもよい。
上記の神経系細胞の作製方法において、リポフェクション法により、幹細胞に誘導因子ＲＮＡを導入してもよい。
上記の神経系細胞の作製方法において、誘導因子ＲＮＡが、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいてもよい。
上記の神経系細胞の作製方法において、幹細胞に誘導因子ＲＮＡを導入した後、薬剤耐性を示す細胞を選択することを含んでいてもよい。
また、本発明の態様によれば、細胞を用意することと、細胞に初期化因子ＲＮＡを導入することと、初期化因子ＲＮＡを導入された細胞に誘導因子ＲＮＡを導入し、神経系細胞に分化させることと、を含む、神経系細胞の作製方法が提供される。従来においては、幹細胞の樹立に２ヵ月、神経系細胞の誘導に３ヵ月を有していた。これに対し、本発明の態様に係る神経系細胞の作製方法によれば、細胞から神経系細胞を短期間に誘導することが可能である。
上記の神経系細胞の作製方法において、同じ培養器の中で、細胞に初期化因子ＲＮＡを導入し、初期化因子ＲＮＡを導入された細胞に誘導因子ＲＮＡを導入してもよい。
上記の神経系細胞の作製方法において、細胞に初期化因子ＲＮＡを導入した後、初期化因子ＲＮＡを導入された細胞を培養器から剥離することなく、初期化因子ＲＮＡを導入された細胞に誘導因子ＲＮＡを導入してもよい。
上記の神経系細胞の作製方法において、細胞に初期化因子ＲＮＡを導入した後、初期化因子ＲＮＡを導入された細胞を培養器から剥離し、初期化因子ＲＮＡを導入された細胞を別の培養器に播種した後、初期化因子ＲＮＡを導入された細胞に誘導因子ＲＮＡを導入してもよい。
上記の神経系細胞の作製方法において、初期化因子ＲＮＡを導入される細胞がヒト繊維芽細胞又は血液細胞等の体細胞であってもよい。
上記の神経系細胞の作製方法において、神経系細胞が、神経細胞、神経幹細胞及び神経前駆細胞のいずれかであってもよい。神経細胞が、抑制性神経細胞、興奮性神経細胞及びドーパミン産生神経細胞のいずれかであってもよい。
上記の神経系細胞の作製方法において、リポフェクション法により、幹細胞に誘導因子ＲＮＡを導入してもよい。
上記の神経系細胞の作製方法において、誘導因子ＲＮＡが、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいてもよい。
上記の神経系細胞の作製方法において、幹細胞に誘導因子ＲＮＡを導入した後、薬剤耐性を示す細胞を選択することを含んでいてもよい。
また、本発明の態様によれば、配列番号１から１０のいずれかのＤＮＡに対応するＲＮＡが提供される。
また、本発明の態様によれば、配列番号１から１０のいずれかのＤＮＡに対応するＲＮＡを備える誘導因子が提供される。
本発明によれば、細胞の遺伝子を傷つけることなく、短期間で効率よく神経系細胞を作製可能な、神経系細胞の作製方法を提供可能である。
第１実施形態の実施例１に係る神経細胞の写真である。 第１実施形態の実施例１に係る神経細胞の写真である。 第１実施形態の実施例１に係る神経細胞の写真である。 第１実施形態の実施例２から４に係る神経細胞の写真である。 第１実施形態の実施例３に係る神経細胞の写真である。 第１実施形態の実施例３に係る神経細胞の写真である。 第１実施形態の実施例５に係る神経細胞の写真である。 第１実施形態の実施例６に係る神経細胞の写真である。 第１実施形態の実施例７に係る神経細胞の写真である。 第１実施形態の実施例８に係る神経細胞の写真である。 第１実施形態の比較例に係る神経細胞の写真である。 第２実施形態の実施例１で用いた初期化因子ｍＲＮＡのマスターミックスの成分を示す表である。 第２実施形態の実施例１で用いたキットの内容物を示す表である。 第２実施形態の実施例１に係る神経細胞の写真である。 第２実施形態の実施例２に係る神経細胞の写真である。 第２実施形態の実施例２に係る神経細胞の写真である。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
（第１実施形態）
第１実施形態に係る神経系細胞の作製方法は、幹細胞を用意することと、幹細胞に誘導因子ＲＮＡを導入し、神経系細胞に分化させることと、を含む。
幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及び胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の両方が使用可能である。
誘導される神経系細胞の例としては、神経細胞、神経幹細胞及び神経前駆細胞が挙げられる。神経細胞の例としては、抑制性神経細胞、興奮性神経細胞及びドーパミン産生神経細胞が挙げられる。あるいは、神経系細胞は、運動神経細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、及びオリゴデンロドサイト等であってもよい。
幹細胞を培養する培養液には、Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、及びＴｅＳＲＥ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等を利用してもよい。
また、幹細胞を培養する培地はゲルを含んでいてもよい。ゲルは、脱アシルカジェランガム、ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、及びラムナン硫酸、並びに及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
ゲルは、温度感受性ゲルであってもよい。温度感受性ゲルは、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくとも１種であってもよい。
幹細胞を培養する培地は、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでいてもよい。
幹細胞に導入される誘導因子ＲＮＡは、例えば、ＡＳＣＬ１（Ａｃｈａｅｔｅ−Ｓｃｕｔｅ Ｈｏｍｏｌｏｇ １）のｍＲＮＡ、ＤＬＸ２（Ｄｉｓｔａｌ−Ｌｅｓｓ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２）のｍＲＮＡ、ＭＹＴ１Ｌ（Ｍｙｅｌｉｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １−Ｌｉｋｅ）のｍＲＮＡ、及びＮＧＮ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２）のｍＲＮＡの少なくともいずれかを含んでいてもよい。なお、ここでは遺伝子記号はヒトで記載しているが、大文字・小文字表記によって、種を制限することを意図するものではない。例えば、全て大文字表記していても、マウス又はラットの遺伝子を含むことを排除するものではない。ただし、実施例においては、実際に使用した生物種に則って、遺伝子記号を表記している。
誘導因子ＲＮＡは、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいてもよい。薬剤とは、例えばピューロマイシン、ネオマイシン、ブラストサイジン、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びゼオシン等の抗生物質である。誘導因子ＲＮＡが導入された細胞は、薬剤耐性を示す。
誘導因子ＲＮＡに含まれるｍＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）、５−メチルウリジン（５ｍｅＵ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍｅ１Ψ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５−ヒドロキシメチルウリジン（５ｈｍＵ）、５−フォーミルウリジン（５ｆＵ）、５−カルボキシメチルエステルウリジン（５ｃａｍＵ）、チエノグアノシン（ｔｈＧ）、Ｎ４−メチルシチジン（ｍｅ４Ｃ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５−メチオキシチジン（５ｍｏＣ）、５−ヒドロキシメチルシチジン（５ｈｍＣ）、５−ヒドロキシシチジン（５ｈｏＣ）、５−フォルムシチジン（５ｆＣ）、５−カルボキシシチジン（５ｃａＣ）、Ｎ６−メチル−２−アミノアデノシン（ｍ６ＤＡＰ）、ジアミノプリン（ＤＡＰ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍ又はｍ２’−ＯＵ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、及びＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つで修飾されていてもよい。
ｍＲＮＡは、ポリアデニル化されていてもよい。ｍＲＮＡは、インビトロで転写される（ＩＶＴ）ＲＮＡのポリアデニル化によって調製されてもよい。ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）末端をコードするＤＮＡテンプレートを用いることによって、ＩＶＴの間にポリアデニル化されてもよい。ｍＲＮＡがキャッピングされてもよい。細胞における発現の効率性を最大化するために、大部分のｍＲＮＡ分子がキャップを含有してもよい。
ｍＲＮＡは５’ｃａｐ［ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］構造を有していてもよい。当該配列はｍＲＮＡを安定化させ、転写を促進させる配列である。５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅをもつｍＲＮＡからは、脱リン酸化処理により５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを取り除いてもよい。ｍＲＮＡはＡｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）として［３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］を有していてもよい。ＡＲＣＡは転写開始点より前に挿入される配列であり、転写されるｍＲＮＡの効率は二倍となる。ｍＲＮＡはＰｏｌｙＡテールを有していてもよい。
誘導因子ＲＮＡは、例えば、ＮＧＮ２−Ｔ２Ａ−ＰＵＲＯ ｍＲＮＡ（ＴｒｉLｉｎｋ、配列番号１に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡ）を含む。ＮＧＮ２−Ｔ２Ａ−ＰＵＲＯ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）をトランスフェクトされた細胞は、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（ＮＧＮ２）を産生し、かつ、ピューロマイシン耐性を示す。ｍＲＮＡは、Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）でキャップされ、ポリアデニル化されており、５−メチルシチジン及びプソイドウリジンで置換されていてもよい。５−メチルシチジン及びプソイドウリジンは、抗体によるｍＲＮＡの認識力を低下させる。また、配列番号２に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡを用いてもよい。配列番号２に記載のＤＮＡは、配列番号１のＤＮＡからｘｂａ１制限部位を除去したＤＮＡである。
あるいは、誘導因子は、ＮＧＮ２−Ｔ２Ａ−ＰＵＲＯ ｍＲＮＡ（配列番号３に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡ）を含む。配列番号３に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡをトランスフェクトされた細胞は、ＮＧＮ２を産生し、かつ、ピューロマイシン耐性を示す。
あるいは、誘導因子は、ＡＳＣＬ１−Ｔ２Ａ−ＰＵＲＯ ｍＲＮＡ（配列番号４に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡ）を含む。配列番号４に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡをトランスフェクトされた細胞は、ＡＳＣＬ１を産生し、かつ、ピューロマイシン耐性を示す。
あるいは、誘導因子は、ＤＬＸ２−Ｔ２Ａ−ＰＵＲＯ ｍＲＮＡ（配列番号５に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡ）を含む。配列番号５に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡをトランスフェクトされた細胞は、ＤＬＸ２を産生し、かつ、ピューロマイシン耐性を示す。
あるいは、誘導因子は、ＤＬＸ２−Ｔ２Ａ−ＨＹＧＲＯ ｍＲＮＡ（配列番号６に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡ）を含む。配列番号６に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡをトランスフェクトされた細胞は、ＤＬＸ２を産生し、かつ、ハイグロマイシン耐性を示す。
あるいは、誘導因子は、ＤＬＸ２−Ｔ２Ａ−ＢＬＡＳＴ ｍＲＮＡ（配列番号７に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡ）を含む。配列番号７に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡをトランスフェクトされた細胞は、ＤＬＸ２を産生し、かつ、ブラストサイジン耐性を示す。
あるいは、誘導因子は、ＤＬＸ２−ＩＲＥＳ−ＨＹＧＲＯ ｍＲＮＡ（配列番号８に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡ）を含む。配列番号８に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡをトランスフェクトされた細胞は、ＤＬＸ２を産生し、かつ、ハイグロマイシン耐性を示す。
あるいは、誘導因子は、ＤＬＸ２−ＩＲＥＳ−ＢＬＡＳＴ ｍＲＮＡ（配列番号９に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡ）を含む。配列番号９に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡをトランスフェクトされた細胞は、ＤＬＸ２を産生し、かつ、ブラストサイジン耐性を示す。
あるいは、誘導因子は、ＡＳＣＬ１−Ｔ２Ａ−ＰＵＲＯ ｍＲＮＡ（配列番号１０に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡ）を含む。配列番号１０に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡをトランスフェクトされた細胞は、ＡＳＣＬ１を産生し、かつ、ピューロマイシン耐性を示す。
誘導因子ＲＮＡは、例えばリポフェクション法等のトランスフェクション法により幹細胞に導入される。リポフェクション法とは、陰性荷電物質である核酸と、陽性荷電脂質と、の複合体を、電気的な相互作用により形成し、複合体をエンドサイトーシスや膜融合により細胞内に取り込ませる方法である。リポフェクション法は、細胞へのダメージが少なく、導入効率に優れており、操作が簡便であり、時間がかからない等の利点を有する。
誘導因子ＲＮＡのトランスフェクションには、トランスフェクション試薬として、例えば、リポフェクタミン メッセンジャーマックス（登録商標）が用いられる。さらに、リポフェクション試薬としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）３０００、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｆｅｃｔ）、ｍＲＮＡ−Ｉｎ（登録商標、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｉｎｃ．）ＮｅｘｔＦｅｃｔ（登録商標）ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏｏＳｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ−１００２）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ−１００３）、及びＲｅｐｒｏＲＮＡ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等を利用してもよい。
誘導因子ＲＮＡのトランスフェクションは複数回行ってもよい。
誘導因子ＲＮＡのトランスフェクションの際に用いられる培地は、例えば、Ｐｌｕｒｉｔｏ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）やＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標、Ｇｉｂｃｏ）等の無血清又は低血清培地である。誘導因子ＲＮＡのトランスフェクションの際、及びその前後に用いられる培地は、Ｂ１８Ｒタンパク質を含んでいてもよい。Ｂ１８Ｒタンパク質は、細胞の先天性抗ウイルス反応を緩和する。Ｂ１８Ｒタンパク質は、細胞へのＲＮＡの挿入時に伴う免疫反応に伴う細胞死を抑制するために使用されることがある。ただし、培地はＢ１８Ｒタンパク質を含まなくともよく、あるいは、Ｂ１８Ｒタンパク質を０．０１％から１％のような薄い濃度で含有してもよい。
誘導因子ＲＮＡのトランスフェクションの後、あるいは誘導因子ＲＮＡのトランスフェクションを複数回行っている途中から、培地を神経系細胞に適した培地に交換する。
誘導因子ＲＮＡが、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいた場合、トランスフェクションの間又は後、薬剤耐性を示す細胞を選択してもよい。例えば、誘導因子ＲＮＡが、ピューロマイシン耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいた場合、トランスフェクションの後の細胞をピューロマイシンに曝すことにより、誘導因子ＲＮＡが導入された細胞以外を死滅させ、誘導因子ＲＮＡが導入された細胞を選別することが可能である。誘導因子ＲＮＡが、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡとして、ネオマイシン、ブラストサイジン、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びゼオシン等から選択されるいずれかを含んでいてもよい。
神経系細胞に分化したか否かは、ＮＧＮ２、β−ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、ｖＧＬＵＴ、ＧＡＤ６７、ＴＨ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＣＤ１３３、Ｎｅｓｔｉｎ、ＨＢ９、ＩＳＬ１、Ｏ４、ＰＬＰ１、ＭＯＧ、又はＭＢＰが陽性であるか否かによって確認される。ＮＧＮ２は、神経細胞分化に必要なスイッチタンパク質である。β−ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２、及びＰＳＡ−ＮＣＡＭは、神経細胞のマーカーである。ｖＧＬＵＴは、興奮性神経細胞のマーカーである。ＧＡＤ６７は、抑制性神経細胞のマーカーである。ＴＨは、ドーパミン産生神経細胞のマーカーである。ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＣＤ１３３、及びＮｅｓｔｉｎは、神経幹細胞のマーカーである。ＨＢ９及びＩＳＬ１は運動神経細胞のマーカーである。Ｏ４、ＰＬＰ１、ＭＯＧ、及びＭＢＰは、オリゴデンドロサイト前駆体のマーカーである。
また、アストロサイト前駆体及びアストロサイトのマーカーとして、ＧＦＡＰ及びＣＤ４４が利用可能である。さらに、コリナージックニューロンのマーカーとして、ＣｈＡＴが利用可能である。
以上説明した第１実施形態に係る方法によれば、幹細胞に特定の遺伝子をコードするＲＮＡを発現させることで、幹細胞の遺伝子に傷をつけることなく、神経系細胞を効率よく作製することが可能である。
ホルモンや化学物質のみを利用して幹細胞から神経系細胞を作製する方法では、神経系細胞が作製されるまで非常に長い時間が必要である。これに対し、第１実施形態に係る方法によれば、非常に短い時間で神経系細胞を作製することが可能である。
また、ホルモンや化学物質を利用して幹細胞から神経系細胞を作製する方法においては、幹細胞のうちの一部のみが目的の神経系細胞になる。これに対し、第１実施形態に係る方法によれば、誘導因子ＲＮＡを導入する細胞の９０％以上が目的の神経系細胞となる。
さらに、ホルモンや化学物質を利用して幹細胞から神経系細胞を作製する方法においては、同じプロトコールに従っても、目的の神経系細胞になるクローンと、ならないクローンがあり、クローン間にばらつきが生じる。これに対し、第１実施形態に係る方法によれば、複数のクローンで高い分化誘導効率を得ることが可能である。
また、未分化な細胞集団からサイトカイン等を用いて分化誘導を行って移植用細胞を作製する場合、移植用細胞の中に未分化細胞が残存する可能性がある。この残存未分化細胞は移植位置で独自に細胞分裂、増殖をし、テラトーマ等を形成する危険性がある。これに対し、第１実施形態に係る方法によれば、薬剤耐性遺伝子も同時に発現させることができるため、誘導因子ＲＮＡが導入された細胞の薬剤選択が可能である。そのため未分化細胞の混入やテラトーマ形成などの危険性を回避することが可能であり、移植医療に適している。
（第１実施形態の実施例１）
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされたプレートを用意した。また、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２、Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含む１ｍＬのヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞維持用培地（ｍＴｅＳＲ１、ＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、１×１０５個、２×１０５個、又は４×１０５個のシングルセルのｉＰＳ細胞を懸濁させ、懸濁液をプレートに添加して、細胞を播種し、一日静置した。
培地を、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）に交換した。
さらに、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＡと、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＢと、を用意した。
チューブＡに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに１．８７５μＬのｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、よく混ぜて第１の反応液とした。
チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、７５０ｎｇのＡＳＣＬ１のｍＲＮＡ、２５０ｎｇのＤＬＸ２−Ｔ２Ａ−ＢＬＡＳＴのｍＲＮＡ、及び１００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。ＡＳＣＬ１は、ニューロン全般への分化を制御するタンパク質である。ＤＬＸ２は、抑制性神経細胞への分化を制御するタンパク質である。
第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で１０分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をプレートに加え、３７℃で６から８時間静置した。これにより、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ０）。次に、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ１）。次に、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２０ｎｇ／ｍＬの濃度で抗生物質であるブラストサイジンを含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ２）。その後、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２０ｎｇ／ｍＬの濃度でブラストサイジンを含む１ｍＬの神経細胞培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２５μｇ／ｍＬインシュリン、５０μｇ／ｍＬヒト・トランスフェリン、３０ｎｍｏｌ／Ｌ亜セレン酸ナトリウム、２０ｎｍｏｌ／Ｌプロゲステロン、及び１００ｎｍｏｌ／Ｌプトレシン、当該神経細胞培地を、Ｎ３培地という。）をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含む１ｍＬのＮ３培地をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ３）。その後、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２０μｇ／ｍＬの濃度でブラストサイジンを含む１ｍＬのＮ３培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含む１ｍＬのＮ３培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。その後、７日間細胞を培養した。ブラストサイジンによる選択はＤａｙ６まで行った。
その結果、図１に示すように、ｉＰＳ細胞から神経細胞が誘導されたことが、細胞の形態から確認された。
その後、プレートから培地を除き、ＰＢＳで細胞を洗った。次に、４％ＰＦＡをプレートに入れ、１５分４℃で反応させ、細胞を固定した。さらに、ＰＢＳで細胞を２回洗浄後、５％ＣＣＳ及び０．１％トライトンを含むＰＢＳ培地で一次抗体を希釈し、プレートに添加した。一次抗体としては、抑制性神経細胞のマーカーであるＧＡＤ６７のマウスモノクローナル抗体ＩｇＧ２ａ（ＭＡＢ５４０６、Ｍｉｌｌｅｐｏｒｅ）を使用した。
室温で一時間反応後、プレートにＰＢＳを添加し、プレートによくなじませた後、ＰＢＳを廃棄した。再度、ＰＢＳを添加、廃棄し、蛍光標識されたロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、登録商標、５５５、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ））を含む溶液をプレートに加えて、室温で３０分間反応させた。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図２（蛍光顕微鏡観察画像）及び図３（位相差顕微鏡観察画像と蛍光顕微鏡観察画像のマージ画像）に示すように、ｉＰＳ細胞から誘導された神経細胞は、抑制性神経細胞のマーカーであるＧＡＤ６７を発現していることが確認された。
（第１実施形態の実施例２）
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされたプレートを用意した。また、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞維持用培地（ｍＴｅＳＲ１、ＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、シングルセルに分解されたｉＰＳ細胞を懸濁させ、懸濁液をプレートに添加して、細胞を播種し、一日静置した。
培地を、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）に交換した。
さらに、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＡと、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＢと、を用意した。
チューブＡに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに１．８７５μＬのｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、よく混ぜて第１の反応液とした。
チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、５００ｎｇのＡＳＣＬ１−ＰＵＲＯのｍＲＮＡ、２５０ｎｇのＤＬＸ２−Ｔ２Ａ−ＢＬＡＳＴのｍＲＮＡ、及び１００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。
第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で１０分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をプレートに加え、３７℃で６から８時間静置した。これにより、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ０）。次に、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ１）。次に、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２０μｇ／ｍＬの濃度で抗生物質であるブラストサイジン、及び２μｇ／ｍＬの濃度のピューロマイシン及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ２）。その後、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２０μｇ／ｍＬの濃度でブラストサイジン、及び２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含む１ｍＬのＮ３培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含む１ｍＬのＮ３培地をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ３）。その後、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２０μｇ／ｍＬの濃度でブラストサイジン、及び２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含む１ｍＬのＮ３培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。これをＤａｙ６まで繰り返した。
プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含む１ｍＬのＮ３培地をプレートに入れた（Ｄａｙ７）。その後、Ｄａｙ９まで細胞を培養した。
顕微鏡で観察したところ、図４に示すように、ｉＰＳ細胞から神経細胞が誘導されたことが確認された。
（第１実施形態の実施例３）
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされたプレートを用意した。また、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞維持用培地（ｍＴｅＳＲ１、ＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、シングルセルに分解されたｉＰＳ細胞を懸濁させ、懸濁液をプレートに添加して、細胞を播種し、一日静置した。
培地を、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）に交換した。
さらに、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＡと、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＢと、を用意した。
チューブＡに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに１．８７５μＬのｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、よく混ぜて第１の反応液とした。
チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、５００ｎｇのＡＳＣＬ１−ＰＵＲＯのｍＲＮＡ、２５０ｎｇのＤＬＸ２−Ｔ２Ａ−ＢＬＡＳＴのｍＲＮＡ、２５０ｎｇのＭＹＴ１ＬのｍＲＮＡ、及び１００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。ＭＹＴ１Ｌは、ニューロンへの分化を制御するタンパク質である。
第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で１０分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をプレートに加え、３７℃で６から８時間静置した。これにより、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ０）。次に、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ１）。次に、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２０μｇ／ｍＬの濃度で抗生物質であるブラストサイジン、及び２μｇ／ｍＬの濃度のピューロマイシン及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ２）。その後、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２０μｇ／ｍＬの濃度でブラストサイジン、及び２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含む１ｍＬのＮ３培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含む１ｍＬのＮ３培地をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ３）。その後、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２０μｇ／ｍＬの濃度でブラストサイジン、及び２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含む１ｍＬのＮ３培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。これをＤａｙ６まで繰り返した。
プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含む１ｍＬのＮ３培地をプレートに入れた（Ｄａｙ７）。その後、Ｄａｙ２１まで細胞を培養した。
Ｄａｙ９で、顕微鏡で観察したところ、図４に示すように、ｉＰＳ細胞から神経細胞が誘導されたことが確認された。また、Ｄａｙ２１で、第１実施形態の実施例１と同様に、抑制性神経細胞のマーカーであるＧＡＤ６７の抗体（ＭＡＢ５４０６、Ｍｉｌｌｅｐｏｒｅ）を使用して細胞を蛍光免疫染色したところ、図５及び図６に示すように、ｉＰＳ細胞から誘導された神経細胞は、抑制性神経細胞のマーカーであるＧＡＤ６７を発現していることが確認された。また、ｍＲＮＡが導入されなかった細胞を、ブラストサイジンとピューロマイシンで効率的に死滅させ、ｍＲＮＡが導入された細胞を、選択的に生存させることができた。さらに、ＭＹＴ１ＬのｍＲＮＡを細胞に導入することにより、神経細胞がより効率的に導入されることが示された。また、ブラストサイジンとピューロマイシンの両方で選択を行ったことにより、不完全に初期化されて増殖能をもった形質転換細胞が減少していた。
（第１実施形態の実施例４）
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされたプレートを用意した。また、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞維持用培地（ｍＴｅＳＲ１、ＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、シングルセルに分解されたｉＰＳ細胞を懸濁させ、懸濁液をプレートに添加して、細胞を播種し、一日静置した。
培地を、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）に交換した。
さらに、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＡと、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＢと、を用意した。
チューブＡに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに１．８７５μＬのｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、よく混ぜて第１の反応液とした。
チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、５００ｎｇのＡＳＣＬ１のｍＲＮＡ、２５０ｎｇのＤＬＸ２−Ｔ２Ａ−ＢＬＡＳＴのｍＲＮＡ、２５０ｎｇのＭＹＴ１ＬのｍＲＮＡ、及び１００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。
第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で１０分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をプレートに加え、３７℃で６から８時間静置した。これにより、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ０）。次に、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ１）。次に、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２０ｎｇ／ｍＬの濃度の抗生物質であるブラストサイジン及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ２）。その後、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２０ｎｇ／ｍＬの濃度でブラストサイジンを含む１ｍＬのＮ３培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含む１ｍＬのＮ３培地をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ３）。その後、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２０ｎｇ／ｍＬの濃度でブラストサイジンを含む１ｍＬのＮ３培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。これをＤａｙ６まで繰り返した。
プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含む１ｍＬのＮ３培地をプレートに入れた（Ｄａｙ７）。その後、Ｄａｙ２１まで細胞を培養した。
顕微鏡で観察したところ、図４に示すように、ｉＰＳ細胞から神経細胞が誘導されたことが確認された。
（第１実施形態の実施例５）
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされたプレートを用意した。また、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質及びＲＯＣＫ阻害剤を含む１ｍＬのヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞維持用培地（ｍＴｅＳＲ１、ＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、シングルセルに分解された２×１０５個のｉＰＳ細胞を懸濁させ、懸濁液をプレートに添加して、細胞を播種し、一日静置した。
培地を、２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質、ＲＯＣＫ阻害剤、ＡＬＫ５、ＡＬＫ４及びＡＬＫ７の選択的阻害物質である５００ｎｍｏｌ／ＬのＡ８３−１、２００ｎｇ／ｍＬの成長因子ＳＨＨ（ソニックヘッジホッグ）、１００ｎｍｏｌ／Ｌの成長因子ＬＤＮ、１００ｎｇ／ｍＬの成長因子ＦＧＦ８、ＧＳＫ−３β阻害物質である３μｍｏｌ／ＬのＣＨＩＲ９９０２１、及び分化促進試薬である２μｍｏｌ／Ｌのパルモルファミンを含む１ｍＬのゼノフリー培地な（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）に交換した。当該培地を、Ｐｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地と呼ぶ。
さらに、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＡと、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＢと、を用意した。
チューブＡに、６２．６μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに１．８７５μＬのｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、よく混ぜて第１の反応液とした。
チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、２００ｎｇのＮＧＮ２−Ｔ２Ａ−ＰＵＲＯのｍＲＮＡ、２００ｎｇのＡＳＣＬ１−Ｔ２Ａ−ＰＵＲＯのｍＲＮＡ、２００ｎｇのＮＵＲＲ１のｍＲＮＡ、２００ｎｇのＬＭＸ１ＡのｍＲＮＡ、２００ｎｇのＥＮ１（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−１）のｍＲＮＡ、２００ｎｇのＰＩＴＸ３のｍＲＮＡ、２００ｎｇのＦＯＸＡ２のｍＲＮＡ、及び１００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。
第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で１０分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をプレートに加え、３７℃で６から８時間静置した。これにより、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ０）。次に、プレートから全ての培地を除去し、Ｐｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ１）。次に、プレートから全ての培地を除去し、２μｇ／ｍＬの濃度のピューロマイシンを含むＰｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＢ１８Ｒ組み換えタンパク質、２００ｎｇ／ｍＬの成長因子ＳＨＨ、１００ｎｍｏｌ／Ｌの成長因子ＬＤＮ、１００ｎｇ／ｍＬの成長因子ＦＧＦ８、３μｍｏｌ／ＬのＣＨＩＲ、及び２μｍｏｌ／Ｌのパルモルファミンを含む１ｍＬのＮ３培地を用意した。当該培地を、Ｎ３−Ｃ培地と呼ぶ。プレートから全ての培地を除去し、Ｐｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ２）。その後、プレートから全ての培地を除去し、２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含む１ｍＬのＮ３−Ｃ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、新鮮なＮ３−Ｃ培地をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ３）。２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含む１ｍＬのＮ３−Ｃ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。同様に、Ｄａｙ４にも細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした。
プレートから全ての培地を除去し、ピューロマイシンを含まない１ｍＬのＮ３−Ｃ培地をプレートに入れた（Ｄａｙ５）。
細胞の免疫染色をＤａｙ７に行った。ウサギ抗ＴＵＪ１抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）を１：１０００で、ヒツジ抗ＴＨ抗体（Ｐｅｌ−Ｆｒｅｅｚ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を１：１０００で含むバッファをプレートに添加し、４℃で一晩静置した。その後、ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５複合体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａ−２１４２８）及びロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７複合体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａ３１５７３）をプレートに添加し、細胞の顕微鏡観察を行った。
その結果、図７に示すように、細胞において、ドーパミン産生神経細胞に特異的なマーカーであるＴＨと、神経細胞全般のマーカーであるＴＵＪ１と、が、陽性であることが確認された。一方、ＧＦＰはほとんど発現していなかった。このことは、外来ＲＮＡが分解された、安全なドーパミン産生神経細胞が得られたことを示している。
（第１実施形態の実施例６）
第１実施形態の実施例５と同様に、プレートに２×１０５個のｉＰＳ細胞を播種し、一日静置した。次に、培地を、Ｐｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地に交換した。第１実施形態の実施例５と同様に、第１の反応液を含むチューブＡを用意した。
チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、２００ｎｇのＡＳＣＬ１−Ｔ２Ａ−ＰＵＲＯのｍＲＮＡ、２００ｎｇのＮＵＲＲ１のｍＲＮＡ、２００ｎｇのＬＭＸ１ＡのｍＲＮＡ、２００ｎｇのＥＮ１のｍＲＮＡ、２００ｎｇのＰＩＴＸ３のｍＲＮＡ、２００ｎｇのＦＯＸＡ２のｍＲＮＡ、及び１００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。
第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で１０分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をプレートに加え、３７℃で６から８時間静置した。これにより、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ０）。次に、プレートから全ての培地を除去し、Ｐｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ１）。次に、プレートから全ての培地を除去し、２μｇ／ｍＬの濃度のピューロマイシンを含むＰｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、Ｐｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ２）。その後、プレートから全ての培地を除去し、２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含む１ｍＬのＮ３−Ｃ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、新鮮なＮ３−Ｃ培地をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ３）。２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含む１ｍＬのＮ３−Ｃ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。同様に、Ｄａｙ４にも細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした。
プレートから全ての培地を除去し、ピューロマイシンを含まない１ｍＬのＮ３−Ｃ培地をプレートに入れた（Ｄａｙ５）。
第１実施形態の実施例５と同様に、細胞の免疫染色をＤａｙ７に行った。その結果、図８に示すように、細胞において、ＴＨとＴＵＪ１が、陽性であることが確認された。一方、ＧＦＰはほとんど発現していなかった。
（第１実施形態の実施例７）
ｉＰＳ細胞の数が４×１０５個であった以外は第１実施形態の実施例５と同様に、プレートにｉＰＳ細胞を播種し、一日静置した。次に、培地を、Ｐｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地に交換した。第１実施形態の実施例５と同様に、第１の反応液を含むチューブＡを用意した。
チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、５００ｎｇのＡＳＣＬ１−Ｔ２Ａ−ＰＵＲＯのｍＲＮＡ、２００ｎｇのＮＵＲＲ１のｍＲＮＡ、２００ｎｇのＬＭＸ１ＡのｍＲＮＡ、２００ｎｇのＥＮ１のｍＲＮＡ、２００ｎｇのＰＩＴＸ３のｍＲＮＡ、２００ｎｇのＦＯＸＡ２のｍＲＮＡ、及び１００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。
第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で１０分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をプレートに加え、３７℃で６から８時間静置した。これにより、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ０）。次に、プレートから全ての培地を除去し、Ｐｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ１）。次に、プレートから全ての培地を除去し、２μｇ／ｍＬの濃度のピューロマイシンを含むＰｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、Ｐｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ２）。その後、プレートから全ての培地を除去し、２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含む１ｍＬのＮ３−Ｃ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、新鮮なＮ３−Ｃ培地をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ３）。２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含む１ｍＬのＮ３−Ｃ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。同様に、Ｄａｙ４及びＤａｙ５にも細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした。
プレートから全ての培地を除去し、ピューロマイシンを含まない１ｍＬのＮ３−Ｃ培地をプレートに入れた（Ｄａｙ６）。
第１実施形態の実施例５と同様に、細胞の免疫染色をＤａｙ７に行った。その結果、図９に示すように、細胞において、ＴＨとＴＵＪ１が陽性であることが確認された。一方、ＧＦＰはほとんど発現していなかった。
（第１実施形態の実施例８）
ｉＰＳ細胞の数が２×１０５個又は４×１０５個であった以外は第１実施形態の実施例５と同様に、プレートにｉＰＳ細胞を播種し、一日静置した。次に、培地を、Ｐｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地に交換した。第１実施形態の実施例５と同様に、第１の反応液を含むチューブＡを用意した。
チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、５００ｎｇのＮＧＮ２−Ｔ２Ａ−ＰＵＲＯのｍＲＮＡ及び１００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。
第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で１０分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をプレートに加え、３７℃で６から８時間静置した。これにより、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ０）。次に、プレートから全ての培地を除去し、Ｐｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ１）。次に、プレートから全ての培地を除去し、２μｇ／ｍＬの濃度のピューロマイシンを含むＰｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、Ｐｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地をプレートに入れた。次に、細胞に２００ｎｇのＮＧＮ２−Ｔ２Ａ−ＰＵＲＯのｍＲＮＡ、２００ｎｇのＡＳＣＬ１−Ｔ２Ａ−ＰＵＲＯのｍＲＮＡ、２００ｎｇのＮＵＲＲ１のｍＲＮＡ、２００ｎｇのＬＭＸ１ＡのｍＲＮＡ、２００ｎｇのＥＮ１のｍＲＮＡ、２００ｎｇのＰＩＴＸ３のｍＲＮＡ、２００ｎｇのＦＯＸＡ２、及び１００ｎｇのＧＦＰのｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ２）。その後、プレートから全ての培地を除去し、２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含む１ｍＬのＮ３−Ｃ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、新鮮なＮ３−Ｃ培地をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ３）。２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含む１ｍＬのＮ３−Ｃ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。同様に、Ｄａｙ４にも細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした。
プレートから全ての培地を除去し、新鮮なＮ３−Ｃ培地をプレートに入れた。次に、前日と同様に、細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ５）。２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含み、かつＢ１８Ｒ組み換えタンパク質（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含む１ｍＬのＮ３−Ｃ培地をプレートに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、ピューロマイシンを含まない１ｍＬのＮ３−Ｃ培地をプレートに入れた（Ｄａｙ６）。
第１実施形態の実施例５と同様に、細胞の免疫染色をＤａｙ７に行った。その結果、図１０に示すように、細胞において、ＴＨとＴＵＪ１が陽性であることが確認された。一方、ＧＦＰはほとんど発現していなかった。このことは、外来ＲＮＡが分解された、安全なドーパミン産生神経細胞が得られたことを示している。
（第１実施形態の比較例）
Ｐｌｕｒｉ−ＮＰＣ培地とＮ３−Ｃ培地は、ｉＰＳ細胞からホルモンのみでドーパミン産生神経細胞を誘導するときに使われている培地である。ここで、ｉＰＳ細胞に誘導因子ＲＮＡを導入しなかった以外は、第１実施形態の実施例５から８と同様に培地を交換して細胞を培養し、細胞の免疫染色をＤａｙ７に行った。その結果、図１１に示すように、細胞において、ＴＨとＴＵＪ１が陰性であることが確認された。また、形態も、神経細胞の形態ではなかった。
（第２実施形態）
第２実施形態に係る神経系細胞の作製方法は、細胞を用意することと、細胞に初期化因子ＲＮＡを導入することと、初期化因子ＲＮＡを導入された細胞に誘導因子ＲＮＡを導入し、神経系細胞に分化させることと、を含む。
第２実施形態に係る神経系細胞の作製方法において、同じ培養器の中で、細胞に初期化因子ＲＮＡを導入し、初期化因子ＲＮＡを導入された細胞に誘導因子ＲＮＡを導入してもよい。例えば、細胞に初期化因子ＲＮＡを導入した後、初期化因子ＲＮＡを導入された細胞を培養器から剥離することなく、初期化因子ＲＮＡを導入された細胞に誘導因子ＲＮＡを導入してもよい。また、細胞に初期化因子ＲＮＡを導入した翌日に、細胞に誘導因子ＲＮＡを導入してもよい。
あるいは、第２実施形態に係る神経系細胞の作製方法において、細胞に初期化因子ＲＮＡを導入した後、初期化因子ＲＮＡを導入された細胞を培養器から剥離し、初期化因子ＲＮＡを導入された細胞を別の培養器に播種した後、初期化因子ＲＮＡを導入された細胞に誘導因子ＲＮＡを導入してもよい。
初期化因子を導入される細胞の例としては、繊維芽細胞、血液細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、及び体性幹前駆細胞等の分化細胞（体細胞）が挙げられる。
血液細胞は、血液から分離される。血液は、例えば末梢血及び臍帯血であるが、これらに限定されない。血液は、成年から採取されてもよいし、未成年から採取されてもよい。採血の際には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及び生物学的製剤基準血液保存液Ａ液（ＡＣＤ−Ａ）液等の抗凝固剤を用いる。
血液細胞は、例えば、単核球細胞（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、好中球、好酸球、好塩基球、及びリンパ球等の有核細胞であり、赤血球、顆粒球、及び血小板を含まない。血液細胞は、例えば血管内皮前駆細胞、血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、例えばαβＴ細胞である。
単核球細胞は、血液細胞の分離用媒体、及び遠心分離装置等を用いて、血液から分離される。血液細胞の分離用媒体としてＦｉｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。
低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから１０μＬから５０ｍＬの血液を採血し、血液が固まらないように血液にＥＤＴＡを含むキレート剤を加えて優しく混ぜる。また、ヒトリンパ球分離用の媒体（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ、ＧＥヘルスケアジャパン）を５ｍＬずつ２本の１５ｍＬチューブに分注する。５ｍＬの血液に対して５ｍＬのＰＢＳを加えて希釈し、チューブ中のヒトリンパ球分離用の媒体の上に５ｍＬずつ重層する。この時、界面を乱さないように、希釈血液をチューブの管壁を伝わらせてゆっくりと媒体上に加える。
チューブ中の溶液を、１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは４００×ｇで、４℃から４２℃好ましくは１８℃で５分から２時間、好ましくは３０分間遠心する。遠心後、チューブ中に白く濁った中間層が現れる。この白く濁った中間層は、単核球細胞を含んでいる。チューブ中の白く濁った中間層をピペットマンでゆっくりと回収し、新しい１５ｍＬチューブに移す。この際、下層は吸い取らないようにする。白く濁った中間層は、１本のチューブより１ｍＬ程度回収できる。２本分の中間層をまとめて１本のチューブに移す。
回収した単核球細胞に対し、１ｍＬから４８ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、溶液をさらに１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは２００×ｇ、４℃から４２℃、好ましくは１８℃で１分から６０分、好ましくは１０分間遠心する。その後、アスピレータを用いて溶液の上清を吸引して除去し、１ｍＬから１２ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
採血管としてバキュテイナ（登録商標、ＢＤ）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。
低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃、好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから、採血管（バキュテイナ（登録商標）、ＢＤ）を用いて８ｍＬ採血し、転倒混和して抗凝固剤と混和する。その後、バランスを調整し、溶液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは１５００×ｇから１８００×ｇでスイングロータで１分から６０分、好ましくは２０分間遠心する。遠心後、血漿層である上層を取り除き、ピペッティングして単核球層とゲルに張り付いている血球を懸濁して懸濁液を得る。得られた懸濁液を、別の１５ｍＬチューブに移す。
１５ｍＬチューブの懸濁液に１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、懸濁液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで１分から６０分、好ましくは５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除去する。また、溶血剤（ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（登録商標）、１０倍濃度、ＢＤ）を滅菌水で１倍濃度に希釈する。１５ｍＬチューブ中のペレットをタッピングでほぐし、１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１ｍＬの溶血剤を加える。その後、室温で遮光し、１分間から６０分間、好ましくは１分間溶液を静置する。
次に、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、４℃から４２℃、好ましくは室温で、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで１分から６０分、５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除去し、１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
血液から単核球細胞を分離する方法は、上記の方法に限られず、例えば、透析膜を使用して、血液から単核球を分離してもよい。また、全血単核球濃縮用ピュアセルセレクトシステム（登録商標、ＰＡＬＬ）、血球細胞除去用浄化器（セルソーバＥ、登録商標、旭化成）、及び血小板製剤用白血球除去フィルター（セパセルＰＬ、登録商標、ＰＬＸ−５Ｂ−ＳＣＤ、旭化成）等のフィルターも使用可能である。
単核球細胞は、赤血球を重力沈降又は遠心分離することにより有核細胞を分離することが可能な赤血球分離剤を用いて分離されてもよい。赤血球分離剤の例としては、ＨｅｔａＳｅｐ（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＨＥＳ４０（ＮＩＰＲＯ）が挙げられる。
また、単核球細胞としては、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社から販売されているＣＴＬ−ＵＰ１や、Ｓａｎｇｕｉｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＰＢＭＣ−００１等を使用してもよい。
あるいは、血液細胞としては、セルバンカー１、ステムセルバンカー ＧＭＰグレード、及びステムセルバンカー ＤＭＳＯフリー ＧＭＰグレード（ゼノアック）等の細胞凍結保存液を用いて凍結保存された血液細胞を解凍して用いてもよい。
単核球細胞を解凍する際には、まず、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは８ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を入れておき、凍結した単核球細胞の入ったチューブを４℃から４２℃、好ましくは３７℃の温浴槽にいれて、単核球細胞を溶かし始める。その後、少し氷が残っている状態で、単核球細胞の入ったチューブを温浴槽から引きあげ、単核球細胞を既知組成無血清造血細胞培地の入ったチューブに移す。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
血液細胞は、細胞表面マーカーに基づいて分離されてもよい。血液幹・前駆細胞は、ＣＤ３４が陽性である。Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８のいずれかが陽性である。Ｂ細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０のいずれかが陽性である。血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞は、例えば、自動磁気細胞分離装置及び免疫磁気ビーズを用いて、血液細胞から分離される。あるいは、予め分離された単核球細胞を用意してもよい。ただし、細胞表面マーカーに基づいて分離されていない血液細胞を用いてもよい。
ＣＤ３４陽性細胞は、幹・前駆細胞であり、リプログラミングされやすい傾向にある。また、ＣＤ３陽性細胞であるＴ細胞を用いてｉＰＳ細胞を作製すると、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞はＴＣＲリコンビネーションの型を保持しているので、Ｔ細胞に効率的に分化誘導できる傾向にある。
ＣＤ３４陽性細胞の分離方法は、以下のとおりである。
１０ｍＬの無血清培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００、ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、１０μＬのＩＬ−６（１００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＳＣＦ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＴＰＯ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＦＬＴ３リガンド（３００μｇ／ｍＬ）、及び１０μＬのＩＬ−３（１０μｇ／ｍＬ）を加えて血球培地（血液幹・前駆細胞培地）を調製する。
６ウェルプレートの１ウェルに１ｍＬから６ｍＬ、好ましくは２ｍＬの血球培地を入れる。また、培地の蒸発を防ぐために、他の５ウェルのそれぞれに１ｍＬから６ｍＬ、２ｍＬのＰＢＳを入れる。その後、６ウェルプレートを４℃から４２℃、好ましくは３７℃のインキュベーターに入れて温める。
２０ｍＬのＰＢＳに対し、１０μＬから１ｍＬ、好ましくは８０μＬのＥＤＴＡ（５００ｍｍｏｌ／Ｌ）及び１０μＬから１ｍＬ、好ましくは２００μＬのＦＢＳを加えたカラムバッファを用意する。１×１０４から１×１０９個、好ましくは２×１０７個の単核球細胞を含有する単核球細胞懸濁液を１５ｍＬチューブに分注し、単核球細胞懸濁液を、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１０分間遠心する。遠心後、上清を除き、単核球細胞を１００μＬから１ｍＬ、好ましくは３００μＬのカラムバッファで懸濁する。
１５ｍＬチューブ中の単核球細胞懸濁液に、１０μＬから１ｍＬ、好ましくは１００μＬのＦｃＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及び１０μＬから１ｍＬ、好ましくは１００μＬのＣＤ３４マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を加える。ＦｃＲブロッキング試薬は、マイクロビーズ標識の特異性を高めるために用いられる。その後、単核球細胞懸濁液を混和して、４℃から４２℃、好ましくは４℃で１分から２時間、好ましくは３０分間静置する。
次に、１５ｍＬチューブ中の単核球細胞懸濁液に１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは１０ｍＬのカラムバッファを加えて希釈し、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから１０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１分から２時間、好ましくは１０分間遠心する。遠心後、１５ｍＬチューブ中の上清をアスピレータで除き、１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを加えて再懸濁する。
自動磁気細胞分離装置用のカラム（ＭＳカラム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を自動磁気細胞分離装置（ＭｉｎｉＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に取り付け、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを入れて洗浄する。次に、単核球細胞をカラムに入れる。さらに、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを入れて、カラムを１回から１０回、好ましくは３回洗浄する。その後、カラムを自動磁気細胞分離装置から外し、１５ｍＬチューブに入れる。次に、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは１０００μＬのカラムバッファを入れ、速やかにシリンジを押してＣＤ３４陽性細胞を１５ｍＬチューブに流出させる。
１０μＬのＣＤ３４陽性細胞懸濁液をトリパンブルーで染めて、細胞数を血球計算版でカウントする。また、１５ｍＬチューブ中のＣＤ３４陽性細胞懸濁液を、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから１０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１分から２時間、好ましくは１０分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除く。さらに、温めておいた血球培地でＣＤ３４陽性細胞を再懸濁し、ＣＤ３４陽性細胞を培養プレートにまく。その後、４℃から４２℃、好ましくは３７℃、１％から２０％、好ましくは５％ＣＯ２でＣＤ３４陽性細胞を６日間培養する。この間、培地交換はしなくてもよい。
ＣＤ３４以外のマーカーで細胞を単離する方法は、ＣＤ３４陽性細胞を単離する方法と同様である。
細胞に導入される初期化因子ＲＮＡは、例えば、ＯＣＴ３／４のｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、及びｃ−ＭＹＣのｍＲＮＡを含む。初期化因子ＲＮＡとして、ＯＣＴ３／４を改良したＭ３Ｏを使用してもよい。また、初期化因子ＲＮＡは、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ｐ５３−ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３−Ｐ２７５Ｓ、Ｌ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ−２、Ｅ−ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、及びＴＨ２Ｂからなる群から選択される少なくとも一つの因子のｍＲＮＡをさらに含んでいてもよい。これらのｍＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋから入手可能である。
ｍＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）、５−メチルウリジン（５ｍｅＵ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍｅ１Ψ）、５−メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５−ヒドロキシメチルウリジン（５ｈｍＵ）、５−フォーミルウリジン（５ｆＵ）、５−カルボキシメチルエステルウリジン（５ｃａｍＵ）、チエノグアノシン（ｔｈＧ）、Ｎ４−メチルシチジン（ｍｅ４Ｃ）、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５−メチオキシチジン（５ｍｏＣ）、５−ヒドロキシメチルシチジン（５ｈｍＣ）、５−ヒドロキシシチジン（５ｈｏＣ）、５−フォルムシチジン（５ｆＣ）、５−カルボキシシチジン（５ｃａＣ）、Ｎ６−メチル−２−アミノアデノシン（ｍ６ＤＡＰ）、ジアミノプリン（ＤＡＰ）、５−メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’−Ｏ−メチルウリジン（Ｕｍまたはｍ２’−ＯＵ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、及びＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つで修飾されていてもよい。
ｍＲＮＡは、ポリアデニル化されていてもよい。
ｍＲＮＡは、インビトロで転写される（ＩＶＴ）ＲＮＡのポリアデニル化によって調製されてもよい。ｍＲＮＡは、ポリ（Ａ）末端をコードするＤＮＡテンプレートを用いることによって、ＩＶＴの間にポリアデニル化されてもよい。ｍＲＮＡがキャッピングされてもよい。細胞における発現の効率性を最大化するために、大部分のｍＲＮＡ分子がキャップを含有することが好ましい。ｍＲＮＡは５’ｃａｐ［ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］構造を有していてもよい。当該配列はｍＲＮＡを安定化させ、転写を促進させる配列である。５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅをもつｍＲＮＡからは、脱リン酸化処理により５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを取り除いてもよい。ｍＲＮＡはＡｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）として［３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］を有していてもよい。ＡＲＣＡは転写開始点より前に挿入される配列であり、転写されるｍＲＮＡの効率は二倍となる。ｍＲＮＡはＰｏｌｙＡテールを有していてもよい。
また、ｍＲＮＡは、自己増殖能を持つリプリケイティブＲＮＡであってもよい。リプリケイティブＲＮＡとは、自己増殖能を持つＲＮＡであり、通常のＲＮＡと異なり、ＲＮＡの複製に必要なタンパク質を発現させる能力を併せ持っている。リプリケイティブＲＮＡはアルファウイルスの一種であるベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルス由来である。リプリケイティブＲＮＡを細胞にトランスフェクションすると、リプログラミング因子を作り続けるＲＮＡを細胞に発現させることができるため、初期化因子ＲＮＡを細胞に複数回導入することを省くことが可能となる。
リプリケイティブＲＮＡの配列は、アルファウイルスレプリコンＲＮＡ、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、エバーグレーズ（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ）ウイルス、ムカンボ（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス、ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス、及び西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）からなる群から選択されるアルファウイルスから得られる配列を含んでいてよい。
また、リプリケイティブＲＮＡは、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス、セムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、ミデルブルグ（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ）ウイルス、チクングニア（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス、オニョンニョン（Ｏ’ｎｙｏｎｇ−ｎｙｏｎｇ）ウイルス、ロスリバー（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ）ウイルス、バーマフォレスト（Ｂａｒｍａｈ Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、ゲタ（Ｇｅｔａｈ）ウイルス、サギヤマ（Ｓａｇｉｙａｍａ）ウイルス、ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス、マヤロ（Ｍａｙａｒｏ）ウイルス、ウナ（Ｕｎａ）ウイルス、アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス、ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルス、ババンキ（Ｂａｂａｎｋｉ）ウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、ハイランドＪ（Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ Ｊ）ウイルス、フォートモーガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス、ヌドゥム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス、及びバギークリーク（Ｂｕｇｇｙ Ｃｒｅｅｋ）ウイルスからなる群から選択されるアルファウイルスから得られる配列を含んでいてよい。
リプリケイティブＲＮＡは、例えば、５’から３’に向かって、（ＶＥＥ ＲＮＡレプリカーゼ）−（プロモーター）−（ＲＦ１）−（自己切断型ペプチド）−（ＲＦ２）−（自己切断型ペプチド）−（ＲＦ３）−（ＩＲＥＳもしくはコアプロモーター）−（ＲＦ４）−（ＩＲＥＳもしくは任意のプロモーター）−（任意に選択可能なマーカー）−（ＶＥＥ ３’ＵＴＲ及びポリＡテール）−（任意に選択可能なマーカー）−プロモーターを含んでいる。上記のＲＦ１−４は、多能性細胞への細胞の脱分化を誘導する因子である。上記のＲＦ２−３、ＲＦ３−４、ＲＦ４は任意である。上記のＲＦ１−４は、ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ−２、ｃ−ＭＹＣ、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＦＯＸＨ１、ｐ５３−ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３−Ｐ２７５Ｓ、Ｌ−ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ−２、Ｅ−ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、及びＴＨ２Ｂからなる群から選択されてもよい。
初期化因子ＲＮＡを導入される細胞が培養される培地としては、例えば、ＰｌｕｒｉＱ（ＭＴＩ−ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）、及びＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ)等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地等の幹細胞培地を使用可能である。
ただし、幹細胞培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＥＳ／ｉＰＳ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ （登録商標）ＸＦ／ＦＦ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ａｎｄ ＥＳ Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ−Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｆｅｅｄｅｒ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、及びＬ７（登録商標）ｈＰＳＣ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＬＯＮＺＡ）等を利用してもよい。幹細胞培地は、例えば、ディッシュ、ウェル、又はチューブ等に入れられる。
初期化因子ＲＮＡは、ＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて細胞に導入される。ＲＮＡトランスフェクション試薬としては、ｍＲＮＡ−Ｉｎ（登録商標、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｉｎｃ．）が使用可能である。
あるいは、初期化因子ＲＮＡのトランスフェクションには、リポフェクション試薬として、例えば、リポフェクタミン メッセンジャーマックス（登録商標）が用いられる。さらに、リポフェクション試薬としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）３０００、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｆｅｃｔ）、ＮｅｘｔＦｅｃｔ（登録商標）ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏｏＳｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ−１００２）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ−１００３）、及びＲｅｐｒｏＲＮＡ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等を利用してもよい。
細胞への初期化因子ＲＮＡの導入は、複数回行ってもよい。細胞への初期化因子ＲＮＡの導入は、例えば、２日に１回、あるいは１日に１回、５日間以上１５日間以内、７日間以上１３日間以内、あるいは１０日間繰り返して行う。ただし、ｍＲＮＡがリプリケイティブＲＮＡである場合、細胞への初期化因子ＲＮＡの導入は１回でもよい。
その後、第１実施形態と同様の方法により、初期化因子ＲＮＡを導入した細胞に誘導因子ＲＮＡを導入する。
第２実施形態に係る方法によれば、分化細胞から神経系細胞を短期間で作製することが可能である。
（第２実施形態の実施例１）
ウェルプレートの各ウェルに、１．５ｍＬのＰＢＳに対し、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ｎｉｐｐｉ）を０．５μｇ／ｃｍ２となるように希釈した基底膜マトリックスの希釈液を入れた。その後、ウェルプレートを３７℃のインキュベーターに１時間以上入れた。次に、ウェルプレートの各ウェルから基底膜マトリックスの希釈液を取り除き、ウェルプレートの各ウェルに１０％ＦＢＳ培地に懸濁した繊維芽細胞を約１×１０５個播種し、繊維芽細胞を接着培養した。
図１２に示す初期化因子ｍＲＮＡのマスターミックスを用意した。また、ウェルプレートの各ウェル中の培地を２ｍＬのＰｌｕｒｉＱ（登録商標、ＭＴＩ−ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）に交換した。さらに、図１３に示す内容物をいれたチューブＡとチューブＢを用意した。次に、チューブＡとチューブＢの内容物を混合し、ＲＮＡトランスフェクション試薬であるｍＲＮＡ−Ｉｎ（登録商標、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｉｎｃ．）と、ｍＲＮＡマスターミックスと、の混合物を作製し、１０分間静置した。その後、ＲＮＡ−ＩｎとｍＲＮＡマスターミックスの混合物を各ウェルに加え、ウェルプレートを揺らして、培地中にＲＮＡ−ＩｎとｍＲＮＡマスターミックスの混合物を拡散させた。次に、繊維芽細胞を３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートして初期化因子ＲＮＡを細胞にトランスフェクトした（Ｄａｙ０）。
翌日以降、９日間連続で、上記と同様に、初期化因子ＲＮＡを細胞にトランスフェクトした。したがって、合計１０回、初期化因子ＲＮＡを細胞にトランスフェクトした。
１．２５ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、０．５μＬのＰｌｕｒｉｔｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、２μＬの濃度が１００ｎｇ／μＬのＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、を混合し、トランスフェクション培地を用意した。誘導因子ＲＮＡのトランスフェクションの前に各ウェルの培地をトランスフェクション培地に交換し、３７℃で２時間、初期化因子ＲＮＡをトランスフェクトされた細胞を培養した。
誘導因子ＲＮＡとしてのＮＧＮ２−Ｔ２Ａ−ＰＵＲＯ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と、を用意した。ｍＲＮＡは、Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）でキャップされ、ポリアデニル化されており、５−メチルシチジン及びプソイドウリジンで置換されていた。また、ｍＲＮＡは、シリカ膜で精製されており、ｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、ｐＨ６の１ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムを溶媒とする溶液によってされる。さらに、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＡと、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＢと、を、それぞれウェルの数だけ用意した。
チューブＡに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに１．８７５μＬのｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、よく混ぜて第１の反応液とした。その後、室温で１０分間、第１の反応液が混合するよう、チューブＡを軽くたたいた。
チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに５００ｎｇのＮＧＮ２−Ｔ２Ａ−ＰＵＲＯ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と１００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。
第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で５分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をそれぞれのウェルに加えて、３７℃で６から８時間静置した。これにより、それぞれのウェルに、５００ｎｇのＮＧＮ２ｍＲＮＡと、１００ｎｇのＧＦＰｍＲＮＡが加えられ、初期化因子ＲＮＡをトランスフェクトされた細胞に誘導因子ＲＮＡが導入された（Ｄａｙ１０）。なお、誘導因子ＲＮＡを細胞に最初にトランスフェクト日は、初期化因子ＲＮＡを細胞に最後にトランスフェクトした日の翌日であった。その後、各ウェルから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含むゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）を各ウェルに入れ、３７℃で一晩静置した。
各ウェルから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含むゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）を各ウェルに入れた。次に、前日と同様に、細胞に誘導因子ｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ１１）。その後、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含むゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）を各ウェルに入れ、３７℃で一晩静置した。
各ウェルから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含むゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）を各ウェルに入れた。次に、前日と同様に、細胞に誘導因子ｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ１２）。その後、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含むＮ３培地を各ウェルに入れ、３７℃で一晩静置した。
各ウェルから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含むＮ３培地を各ウェルに入れた。次に、前日と同様に、細胞に誘導因子ｍＲＮＡをトランスフェクトした（Ｄａｙ１３）。その後、プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含むＮ３培地を各ウェルに入れ、３７℃で一晩静置した。
プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、かつ２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含むＮ３培地を各ウェルに入れ、３７℃で一晩静置した（Ｄａｙ１４）。
プレートから全ての培地を除去し、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質を含み、ピューロマイシンを含まないＮ３培地を各ウェルに入れ、３７℃でＤａｙ２０まで細胞を培養した。
その後、プレートから培地を除き、ＰＢＳで細胞を洗った。次に、４％ＰＦＡをプレートに入れ、１５分４℃で反応させ、細胞を固定した。さらに、ＰＢＳで細胞を２回洗浄後、５％ＣＣＳ及び０．１％トライトンを含むＰＢＳ培地で一次抗体を希釈し、プレートに添加した。一次抗体としては、神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２のマウスモノクローナル抗体（シグマ）と、興奮性神経細胞のマーカーであるｖＧＬＵＴのウサギポリクローナル抗体（Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
室温で一時間反応後、プレートにＰＢＳを添加し、プレートによくなじませた後、ＰＢＳを廃棄した。再度、ＰＢＳを添加、廃棄し、蛍光標識されたロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、登録商標、５５５、ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、登録商標、６４７、ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む溶液をプレートに加えて、室温で３０分間反応させた。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、図１４に示すように、誘導された神経細胞は、神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２と、興奮性神経細胞のマーカーであるｖＧＬＵＴと、を発現していることが確認された。
（第２実施形態の実施例２）
第２実施形態の実施例１と同様に繊維芽細胞を用意し、合計１０回、初期化因子ＲＮＡを細胞にトランスフェクトした。その後、５日間、２ｎｇ／ｍＬの濃度でＴＧＦ−βを含有するＰｌｕｒｉＱ（登録商標、ＭＴＩ−ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）で細胞を培養した。
細胞をウェルプレートから剥離し、細胞をゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）に懸濁して、新しいウェルプレートの各ウェルに細胞を播種した。その後、第２実施形態の実施例１と同様に誘導因子ＲＮＡを細胞にトランスフェクトした。
その結果、図１５に示すように、神経細胞が誘導されたことが確認された。また、第２実施形態の実施例１と同様に細胞を免疫染色したところ、図１６に示すように、誘導された神経細胞は、神経細胞のマーカーであるＭＡＰ２と、興奮性神経細胞のマーカーであるｖＧＬＵＴと、を発現していることが確認された。

Claims (23)

  1. 幹細胞を用意することと、
    前記幹細胞に誘導因子ＲＮＡを導入し、神経系細胞に分化させることと、
    を含む、神経系細胞の作製方法。
  2. 前記幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１に記載の神経系細胞の作製方法。
  3. 前記神経系細胞が神経細胞である、請求項１又は２に記載の神経系細胞の作製方法。
  4. 前記神経系細胞が抑制性神経細胞である、請求項１又は２に記載の神経系細胞の作製方法。
  5. 前記神経系細胞が興奮性神経細胞である、請求項１又は２に記載の神経系細胞の作製方法。
  6. 前記神経系細胞がドーパミン産生神経細胞である、請求項１又は２に記載の神経系細胞の作製方法。
  7. リポフェクション法により、前記幹細胞に前記誘導因子ＲＮＡを導入する、請求項１から６のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  8. 前記誘導因子ＲＮＡが、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  9. 前記幹細胞に前記誘導因子ＲＮＡを導入した後、前記薬剤耐性を示す細胞を選択することを含む、請求項８に記載の神経系細胞の作製方法。
  10. 細胞を用意することと、
    前記細胞に初期化因子ＲＮＡを導入することと、
    前記初期化因子ＲＮＡを導入された細胞に誘導因子ＲＮＡを導入し、神経系細胞に分化させることと、
    を含む、神経系細胞の作製方法。
  11. 同じ培養器の中で、前記細胞に前記初期化因子ＲＮＡを導入し、前記初期化因子ＲＮＡを導入された細胞に前記誘導因子ＲＮＡを導入する、請求項１０に記載の神経系細胞の作製方法。
  12. 前記細胞に初期化因子ＲＮＡを導入した後、前記初期化因子ＲＮＡを導入された細胞を培養器から剥離することなく、前記初期化因子ＲＮＡを導入された細胞に前記誘導因子ＲＮＡを導入する、請求項１１に記載の神経系細胞の作製方法。
  13. 前記細胞に初期化因子ＲＮＡを導入した後、前記初期化因子ＲＮＡを導入された細胞を培養器から剥離し、前記初期化因子ＲＮＡを導入された細胞を別の培養器に播種した後、前記初期化因子ＲＮＡを導入された細胞に前記誘導因子ＲＮＡを導入する、請求項１１に記載の神経系細胞の作製方法。
  14. 前記細胞がヒト繊維芽細胞である、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  15. 前記細胞が血液細胞である、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  16. 前記神経系細胞が抑制性神経細胞である、請求項１０から１５のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  17. 前記神経系細胞が興奮性神経細胞である、請求項１０から１５のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  18. 前記神経系細胞がドーパミン産生神経細胞である、請求項１０から１５のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  19. リポフェクション法により、前記細胞に前記誘導因子ＲＮＡを導入する、請求項１０から１８のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  20. 前記誘導因子ＲＮＡが、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含む、請求項１０から１９のいずれか１項に記載の神経系細胞の作製方法。
  21. 前記細胞に前記誘導因子ＲＮＡを導入した後、前記薬剤耐性を示す細胞を選択することを含む、請求項２０に記載の神経系細胞の作製方法。
  22. 配列番号１から１０のいずれかのＤＮＡに対応するＲＮＡ。
  23. 配列番号１から１０のいずれかのＤＮＡに対応するＲＮＡを備える誘導因子。
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