WO2022163466A1 - オリゴデンドロサイトの作製方法 - Google Patents

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剛士 田邊
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    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to cell technology, and to methods for producing oligodendrocytes and their progenitor cells.
  • Oligodendrocytes which are myelin-forming cells in the central nervous system, may be useful for cell transplantation of hereditary and acquired leukodystrophies (see, for example, Patent Documents 1 and 2).
  • conventional methods for inducing oligodendrocytes from stem cells are problematic in that they are time consuming and inefficient.
  • One of the objects of the present invention is to provide an efficient method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells.
  • a method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells comprises introducing inducers including OLIG and SOX into iPS cells or ES cells.
  • methods for producing oligodendrocytes and their progenitor cells comprise introducing inducers including OLIG and NKX into iPS cells or ES cells.
  • a method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells which comprises introducing inducers including OLIG, NKX, and SOX into iPS cells or ES cells.
  • the inducer may further contain a factor that promotes cell proliferation.
  • the factor that promotes cell proliferation is at least one selected from the group consisting of p53 gene-repressing factors, Rb gene-repressing factors, and MYC.
  • MYC may be c-MYC.
  • the inducer may further contain ASCL.
  • a method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells which comprises introducing inducers including OLIG and factors that promote cell proliferation into iPS cells or ES cells.
  • the factor that promotes cell proliferation is at least one selected from the group consisting of p53 gene-repressing factors, Rb gene-repressing factors, and MYC.
  • MYC may be c-MYC.
  • the inducer may contain at least one selected from the group consisting of SOX, ASCL, and NKX.
  • an oligodendro oligodendro which includes producing iPS cells without cloning cells into which a reprogramming factor has been introduced, and introducing an inducer including OLIG into the iPS cells.
  • the steps include seeding cells into which a reprogramming factor has been introduced to produce iPS cells without cloning, and introducing an inducer including OLIG into the iPS cells.
  • an inducer including OLIG into the iPS cells.
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced are detached from the culture vessel, and at least a portion of the detached cells are mixed and seeded to produce iPS cells; Introducing an inducer comprising OLIG is provided.
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced are recovered from the culture vessel, and at least a portion of the recovered cells are mixed and seeded to produce iPS cells; Introducing an inducer comprising OLIG is provided.
  • iPS cells are produced without picking up each of a plurality of colonies formed by cells into which a reprogramming factor has been introduced, and an inducer containing OLIG is introduced into the iPS cells.
  • a method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells comprising:
  • iPS cells are prepared by seeding a mixture of cells into which a reprogramming factor has been introduced, which are derived from different single cells, and iPS cells containing OLIG. Introducing a factor is provided.
  • the cells do not have to be cloned in seeding.
  • cells into which reprogramming factors have been introduced may be mixed during seeding.
  • clones of cells into which reprogramming factors have been introduced may be mixed during seeding.
  • oligodendrocytes and their progenitor cells In the method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells described above, different clones of reprogramming factor-introduced cells may be mixed in seeding.
  • the above-described method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells may not include cloning a single colony formed by cells into which a reprogramming factor has been introduced.
  • the above method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells may not include picking up colonies formed by cells into which reprogramming factors have been introduced.
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced and which are attached to the culture vessel are collected, and at least part of the collected cells are seeded in a medium.
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced may be seeded without discrimination by gene expression state.
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced may be seeded without distinguishing the degree of reprogramming.
  • the inducer may contain at least one selected from the group consisting of SOX, ASCL, and NKX.
  • a method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells which comprises introducing inducers including OLIG, SOX, ASCL, and NKX into somatic cells.
  • the inducer may further contain a factor that promotes cell proliferation.
  • a method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells which comprises introducing inducers including OLIG and factors that promote cell proliferation into somatic cells.
  • the inducer may contain at least one selected from the group consisting of SOX, ASCL, and NKX.
  • the factor that promotes cell proliferation is at least one selected from the group consisting of p53 gene-repressing factors, Rb gene-repressing factors, and MYC.
  • MYC may be c-MYC.
  • the somatic cells need not be iPS cells or ES cells.
  • the somatic cells may be blood cells.
  • the somatic cells may be mononuclear cells.
  • the somatic cells may be fibroblasts.
  • FIG. 4 is a graph showing measurement results by a flow cytometer according to Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of PCR according to Example 1.
  • FIG. 1 is a photograph showing TRA1-60 positive cells according to Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing clonal efficiencies according to Examples 1 and 2.
  • FIG. 4 is a fluorescence micrograph of cells according to Example 3.
  • FIG. 4 is a fluorescence micrograph of cells according to Example 3.
  • FIG. 4 is a fluorescence micrograph of cells according to Example 4.
  • FIG. 10 is a fluorescence micrograph of cells according to Examples 5 to 9.
  • FIG. 10 is a fluorescence micrograph of cells according to Example 10.
  • FIG. 11 is a fluorescence micrograph of cells according to Example 11.
  • FIG. 12 is a fluorescence micrograph of cells according to Example 12.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Examples 13-18.
  • a method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells includes introducing inducers including OLIG, SOX, ASCL, and NKX into somatic cells.
  • the method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells includes introducing inducers including OLIG and SOX into iPS cells (induced pluripotent stem cells) or ES cells (embryonic stem cells).
  • inducers including OLIG and SOX into iPS cells (induced pluripotent stem cells) or ES cells (embryonic stem cells).
  • the method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells includes introducing inducers including OLIG and NKX into iPS cells or ES cells.
  • the method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells is to produce iPS cells without cloning cells into which a reprogramming factor has been introduced, and to introduce an inducer containing OLIG into the iPS cells.
  • the method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells includes producing iPS cells by seeding cells into which a reprogramming factor has been introduced without cloning, and iPS cells containing an inducer containing OLIG. and introducing
  • the cells into which the reprogramming factor has been introduced are detached from the culture vessel, and at least part of the detached cells are mixed and seeded to produce iPS cells. and introducing an inducer comprising an OLIG into iPS cells.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced are recovered from a culture vessel, and at least a portion of the recovered cells are mixed and seeded to produce iPS cells. and introducing an inducer comprising an OLIG into iPS cells.
  • the method for producing oligodendrocytes and their progenitor cells comprises producing iPS cells without picking up each of a plurality of colonies formed by cells into which a reprogramming factor has been introduced; introducing an inducer comprising
  • iPS cells are produced by seeding a mixture of cells into which a reprogramming factor has been introduced, which are derived from different single cells. and introducing an inducer comprising an OLIG into the iPS cells.
  • Inducers may include OLIG and ASCL. Inducers may include OLIG, ASCL, and SOX. Inducers may include OLIG, SOX, ASCL, and NKX.
  • OLIG is, for example, OLIG2.
  • SOX is, for example, SOX10.
  • ASCL is, for example, ASCL1.
  • NKX is, for example, NKX2.2 or NKX6.1.
  • the inducer may further contain a factor that promotes cell proliferation.
  • factors that promote cell proliferation include factors that repress the p53 gene, factors that repress the Rb gene, and MYC.
  • a factor that promotes cell proliferation can be a factor that promotes canceration, a factor that suppresses apoptosis, or a factor that induces chromatin to euchromatin.
  • p53 is a cancer suppressor protein.
  • Factors that repress the p53 gene are, for example, dominant-negative mutants of p53.
  • the dominant-negative mutant of p53 is not particularly limited as long as it can act competitively with the wild-type p53 protein endogenously present in somatic cells to inhibit the function of the wild-type p53 protein.
  • Examples of dominant-negative mutants of p53 include p53P275S, in which proline at position 275 (position 278 in humans) located in the DNA-binding region of mouse p53 is mutated to serine; p53DD in which amino acids at positions 11 to 304 in p53) are deleted, p53S58A in which serine at position 58 (position 61 in human) of mouse p53 is mutated to alanine, position 135 in human p53 (position 135 in mouse) p53C135Y with a point mutation of cysteine at position 132 in the case of mouse p53 to tyrosine, p53A135V with a point mutation of alanine at position 135 in mouse p53 (position 138 in the case of humans) to valine, and position 172 of mouse p53 (position 132 in the case of humans).
  • the agent that suppresses the p53 gene can be an RNA such as short hairpin RNA (shRNA) and siRNA that interferes with the p53 gene.
  • Rb is a cancer suppressor protein.
  • Agents that suppress the Rb gene can be RNAs such as, for example, short hairpin RNAs (shRNAs) and siRNAs that interfere with the Rb gene.
  • shRNAs short hairpin RNAs
  • siRNAs that interfere with the Rb gene.
  • MYC loses the function of cell cycle control and induces canceration.
  • MYC may be c-MYC.
  • the inducer may be DNA or RNA.
  • RNA may be mRNA.
  • human gene symbols are used here, capital letters and small letters are not intended to limit species. For example, all capital letters do not exclude the inclusion of mouse or rat genes. However, in the examples, gene symbols are indicated according to the species actually used.
  • Somatic cells are, for example, cells that are not stem cells. Somatic cells are, for example, cells other than iPS cells and ES cells. Examples of somatic cells include fibroblasts, blood cells, dental pulp stem cells, keratinocytes, dermal papilla cells, oral epithelial cells, and somatic stem progenitor cells. Examples of blood cells include T cells and blood cells other than T cells (non-T cells) such as macrophages, monocytes, monocytes, B cells, and non-rosette forming cells. The somatic cells may be cells contained in urine. Examples of cells contained in urine include bladder epithelial cells.
  • Somatic cells may be human-derived or non-human animal-derived.
  • a somatic cell may be derived from one human, or may be derived from multiple humans.
  • a somatic cell may be derived from one non-human animal or may be derived from multiple non-human animals.
  • Somatic cells may be of fetal origin.
  • iPS cells and ES cells may be human-derived or non-human animal-derived.
  • the iPS cells and ES cells may be derived from one human, or may be derived from multiple humans.
  • iPS cells and ES cells may be derived from one non-human animal, or may be derived from multiple non-human animals.
  • iPS cells may be of fetal origin.
  • culturing cells introduced with a reprogramming factor, collecting the cells introduced with the reprogramming factor, seeding at least a part of the collected cells in a medium and subculturing may be induced by a culture method, including
  • Cells into which reprogramming factors are introduced are not particularly limited, but examples include fibroblasts, blood cells, dental pulp stem cells, keratinocytes, dermal papilla cells, oral epithelial cells, and somatic stem progenitor cells.
  • Cells into which reprogramming factors are introduced may be cells contained in urine. Examples of cells contained in urine include bladder epithelial cells.
  • Cells into which reprogramming factors are introduced may be derived from humans or non-human animals.
  • a cell into which a reprogramming factor is introduced may be derived from one human, or may be derived from multiple humans.
  • the cells into which the reprogramming factor is introduced may be derived from one non-human animal or multiple non-human animals.
  • a reprogramming factor introduced into a cell is, for example, RNA.
  • RNA is, for example, mRNA.
  • Reprogramming factors introduced into cells include, for example, OCT RNA such as OCT3/4, SOX RNA such as SOX2, KLF RNA such as KLF4, and MYC RNA such as c-MYC.
  • OCT3/4-modified M 3 O may be used as a reprogramming factor RNA.
  • reprogramming factor RNA is LIN28A, FOXH1, LIN28B, GLIS1, p53-dominant negative, p53-P275S, L-MYC, NANOG, DPPA2, DPPA4, DPPA5, ZIC3, BCL-2, E-RAS, TPT1, SALL2 , NAC1, DAX1, TERT, ZNF206, FOXD3, REX1, UTF1, KLF2, KLF5, ESRRB, miR-291-3p, miR-294, miR-295, NR5A1, NR5A2, TBX3, MBD3sh, TH2A, TH2B, and P53DD It may further contain RNA of at least one factor selected from the group consisting of. These RNAs are available from TriLink.
  • p53 is a cancer suppressor protein.
  • the dominant-negative mutant of p53 is not particularly limited as long as it can act competitively with the wild-type p53 protein endogenously present in somatic cells to inhibit the function of the wild-type p53 protein.
  • Examples of dominant-negative mutants of p53 include p53P275S, in which proline at position 275 (position 278 in humans) located in the DNA-binding region of mouse p53 is mutated to serine; p53DD in which amino acids at positions 11 to 304 in p53) are deleted, p53S58A in which serine at position 58 (position 61 in human) of mouse p53 is mutated to alanine, position 135 in human p53 (position 135 in mouse) p53C135Y with a point mutation of cysteine at position 132 in the case of mouse p53 to tyrosine, p53A135V with a point mutation of alanine at position 135 in mouse
  • p53R172H with a point mutation of arginine to histidine at position 175) of mouse p53
  • p53R270H with a point mutation of arginine to histidine at position 270 (position 273 in humans) of mouse p53
  • position 278 position 281 in humans of mouse p53.
  • p53D278N in which the aspartic acid at position ) is mutated to asparagine.
  • RNA may be modified with pseudouridine ( ⁇ ) or 5-methyluridine (5meU). RNA may be polyadenylated.
  • the RNA introduced into the cell is, for example, single-stranded RNA, and double-stranded RNA may be substantially removed. Moreover, it is preferable that impurities such as short-chain RNA and contaminants are substantially removed from the RNA to be introduced into the cells.
  • Single-stranded RNA introduced into cells may be purified and/or concentrated to substantially remove double-stranded RNA. Methods for purifying single-stranded RNA to be introduced into cells include a purification method using high performance liquid chromatography (HPLC). For example, HPLC removes 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, or 90% or more of double-stranded RNA.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the RNA introduced into the cells may be treated with a ribonuclease that degrades double-stranded RNA to substantially remove double-stranded RNA.
  • the RNA to be introduced into the cell may further comprise MYOD transcriptional activation domain (TAD) RNA directly connected to the full-length OCT3/4 RNA.
  • TAD MYOD transcriptional activation domain
  • the lipofection method is a method in which a complex of a nucleic acid, which is a negatively charged substance, and a positively charged lipid is formed through electrical interaction, and the complex is taken up into cells by endocytosis or membrane fusion. .
  • the lipofection method has advantages such as little damage to cells, excellent transfection efficiency, simple operation, and short time.
  • a reprogramming factor is introduced into cultured cells using, for example, an RNA transfection reagent.
  • an RNA transfection reagent for example, if the cells are mononuclear cells, the RNA may be introduced into the mononuclear cells immediately after their isolation from the blood.
  • a viral vector may be an RNA viral vector.
  • the RNA virus vector may be a Sendai virus vector.
  • the Sendai virus vector may be a temperature-sensitive Sendai virus vector in which the stability of the viral nucleic acid is reduced above a predetermined temperature.
  • the viral nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector is stable below a certain temperature.
  • the viral nucleic acid may be viral DNA or viral RNA.
  • a viral nucleic acid may be a viral genome. The reduction in viral nucleic acid stability may be at least one of degradation of the viral nucleic acid and inhibition of replication or proliferation of the viral nucleic acid.
  • the predetermined temperature is, for example, 36.5° C. or higher and 37.5° C. or lower.
  • the stability of the viral nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector ie at least one of the growth, replication rate and gene expression level, is high below a predetermined temperature and low above a predetermined temperature.
  • the temperature-sensitive Sendai virus vector has a growth rate or gene expression level in cells cultured at 37°C that is half or less than the growth rate or gene expression level in cells cultured at 32°C. is.
  • the Sendai virus encodes the N gene, P gene, M gene, F/HN gene, and L gene.
  • the HN protein recognizes sialic acid on the cell surface and tethers the virus particles to the cell when the Sendai virus attaches to the cell.
  • the F protein is cleaved and activated by an extracellular protease to catalyze the fusion of the tethered Sendai virus envelope and the plasma membrane of the target cell, thereby establishing infection.
  • the L protein, together with its modification protein, the P protein catalyzes replication of viral nucleic acids and transcription from the replicated multi-copy nucleic acids in the cytoplasm after infection.
  • the Sendai virus vector By deleting the F gene in the Sendai virus vector, it is possible to suppress the production of infectious virus particles from transfected cells.
  • the Sendai virus vector can be made temperature-sensitive by introducing a mutation into at least one of the L gene and the P gene.
  • TS7 Y942H/L1361C/L1558I mutation of L protein
  • TS12 D433A/R434A/K437A mutation of P protein
  • TS13 D433A/R434A/K437A of P protein mutation and L1558I mutation of L protein
  • TS14 D433A/R434A/K437A mutation of P protein and L1361C mutation of L protein
  • TS15 D433A/R434A/K437A mutation of P protein and L1361C/L1558I mutation of L protein
  • the Sendai virus vector has, for example, G69E, T116A, and A183S mutations in the M protein, A262T, G264R, and K461G mutations in the HN protein, L511F mutation in the P protein, and N1197S in the L protein. and an F gene-deleted ( ⁇ F) Sendai virus vector having the K1795E mutation, which is a Sendai virus vector into which the above-mentioned TS7, TS12, TS13, TS14, or TS15 mutation has been introduced.
  • temperature-sensitive mutations of Sendai virus vectors are not limited to these.
  • the Sendai virus vector is, for example, SeV(PM)/TS ⁇ F, SeV18+/TS ⁇ F, or SeV(HNL)/TS ⁇ F, and is a Sendai virus vector introduced with the above TS7, TS12, TS13, TS14, or TS15 mutation. be.
  • temperature-sensitive mutations of Sendai virus vectors are not limited to these.
  • the Sendai virus vector to be introduced into cells may be a combination of a temperature-sensitive Sendai virus vector and a temperature-insensitive Sendai virus vector.
  • the Sendai virus vector to be introduced into the cell may be only the temperature-sensitive Sendai virus vector and may not contain the temperature-insensitive Sendai virus vector.
  • the Sendai virus vector to be introduced into cells may be only a temperature-sensitive Sendai virus vector introduced with the TS7, TS12, TS13, TS14, or TS15 mutation, and may not contain a temperature-insensitive Sendai virus vector.
  • the Sendai virus vector to be introduced into cells is only a Sendai virus vector that has the same or higher temperature sensitivity than the temperature-sensitive Sendai virus vector into which the TS7, TS12, TS13, TS14, or TS15 mutation is introduced. It does not have to contain a viral vector.
  • the Sendai virus vector to be introduced into cells is only a Sendai virus vector having temperature sensitivity equal to or higher than that of the temperature-sensitive Sendai virus vector introduced with the TS7, TS12, TS13, TS14, or TS15 mutation.
  • the Sendai virus vector which is less temperature sensitive than the temperature-sensitive Sendai virus vector into which the TS13, TS14, or TS15 mutation is introduced, may not be included.
  • the Sendai virus vector introduced into cells carries any reprogramming factor.
  • the Sendai virus vector to be introduced into the cell contains, for example, KLF RNA, OCT RNA, and SOX RNA in this order, a temperature-sensitive Sendai virus vector that does not contain MYC RNA, and a temperature-sensitive Sendai virus vector that contains MYC RNA and KLF.
  • RNA, OCT RNA, and a temperature-sensitive Sendai virus vector that does not contain SOX RNA are arbitrary and are not particularly limited.
  • the Sendai virus vector to be introduced into the cell may contain a Sendai virus vector that contains KLF RNA and does not contain OCT RNA and SOX RNA.
  • the Sendai virus vector containing KLF RNA and not containing OCT RNA and SOX RNA may be a temperature-sensitive Sendai virus vector or a temperature-insensitive Sendai virus vector.
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector containing KLF RNA, OCT RNA, and SOX RNA has, for example, G69E, T116A, and A183S mutations in the M protein and A262T, G264R, and K461G mutations in the HN protein.
  • Temperature-sensitive mutations are, for example, TS7 or TS12, or TS12.
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector comprising KLF RNA, OCT RNA, and SOX RNA is, for example, SeV(PM)KOS/TS7 ⁇ F or SeV(PM)KOS/TS12 ⁇ F, or SeV(PM)KOS/TS12 ⁇ F. be.
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector containing MYC RNA has, for example, G69E, T116A, and A183S mutations in the M protein, A262T, G264R, and K461G mutations in the HN protein, and L511F mutation in the P protein. and the F gene-deleted Sendai virus vector having the N1197S and K1795E mutations in the L protein, which is a Sendai virus vector having the above mutations of TS7, TS12, TS13, TS14, or TS15.
  • a temperature sensitive mutation is for example TS15.
  • a temperature-sensitive Sendai virus vector containing MYC RNA is, for example, SeV(HNL)MYC/TS12 ⁇ F, SeV(HNL)MYC/TS13 ⁇ F, or SeV(HNL)MYC/TS15 ⁇ F, or SeV(HNL)MYC/TS15 ⁇ F. be.
  • a Sendai virus vector containing KLF RNA and not containing OCT RNA and SOX RNA has, for example, G69E, T116A, and A183S mutations in the M protein and A262T, G264R, and K461G mutations in the HN protein. It is an F gene-deleted Sendai virus vector having an L511F mutation in the P protein and N1197S and K1795E mutations in the L protein.
  • a Sendai virus vector containing KLF RNA and not containing OCT RNA and SOX RNA is, for example, weaker in temperature sensitivity than the Sendai virus vector introduced with the above-mentioned TS7, TS12, TS13, TS14, or TS15 mutation,
  • the KLF gene can be expressed even at temperatures above .
  • a Sendai virus vector containing KLF RNA and not containing OCT RNA and SOX RNA is, for example, SeV18+KLF4/TS ⁇ F.
  • Sendai virus vectors When introducing multiple types of Sendai virus vectors into cells, for example, multiple types of Sendai virus vectors are simultaneously introduced into cells. Alternatively, it is preferable to introduce all types of Sendai virus vectors into cells within 48 hours after the introduction of one type of Sendai virus vector into cells.
  • the multiplicity of infection (MOI) of the Sendai virus vector when infecting cells is, for example, 0.1 or more. Moreover, MOI is 100 or less, for example.
  • the temperature at which the cells are infected with the Sendai virus vector should be below a predetermined temperature at which the stability of the viral nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector decreases, that is, the temperature at which the viral nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector is stable. or above a predetermined temperature.
  • the temperature at which cells are infected with the Sendai virus vector reduces the stability of the viral nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector.
  • the temperature is preferably lower than the predetermined temperature, that is, the temperature at which the viral nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector is stable.
  • Cells into which reprogramming factors are introduced may be adherent or suspension cultured.
  • Somatic cells introduced with reprogramming factors are feeder-free using basement membrane matrices such as Matrigel (Corning), CELLstart®, Laminin 511 (iMatrix-511, nippi), fibronectin, and vitrotin. It may be cultured.
  • basement membrane matrices such as Matrigel (Corning), CELLstart®, Laminin 511 (iMatrix-511, nippi), fibronectin, and vitrotin. It may be cultured.
  • Examples of media in which cells into which reprogramming factors are introduced are cultured include human ES/iPS media such as Primate ES Cell Medium (ReproCELL), Stemfit AK02N, Stemfit AK03 (Ajinomoto), and TeSR-E8 (STEMCELL Technologies).
  • Stem cell culture medium such as can be used.
  • Stem cell culture medium is placed in an incubator such as, for example, a dish, well, or tube.
  • At least 2 days, or 2 to 10 days after infecting the cells with the Sendai virus vector, at a temperature lower than a predetermined temperature at which the stability of the viral nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector decreases, that is, the temperature-sensitive Sendai virus Cells may be cultured at a temperature at which the viral nucleic acid of the vector is stable. After that, the cells may be cultured at a predetermined temperature or higher. While culturing the cells at a predetermined temperature or higher, the medium may be changed, for example, once every two days.
  • the cells After infecting the cells with the Sendai virus vector, the cells may be cultured at a temperature of at least 2 days, or 2 to 10 days, for example, at a temperature of 4.0°C or higher and lower than 37.0°C. Thereafter, the temperature is raised, and the cells may be cultured at a temperature of 36.5°C or higher and 40.0°C or lower. The temperature may be raised once or may be raised stepwise. After raising the temperature, the medium may be changed while culturing the cells, eg every two days.
  • the viral nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector is below a predetermined temperature at which the stability of the viral nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector decreases until stem cell-like colonies begin to appear.
  • Cells may be cultured at a temperature that is stable. After stem cell-like colonies begin to appear, the cells may be cultured at a predetermined temperature or higher. While culturing the cells at a predetermined temperature or higher, the medium may be changed, for example, once every two days.
  • the cells may be cultured at a temperature of, for example, 4.0°C or higher and lower than 37.0°C until stem cell-like colonies begin to appear. After stem cell-like colonies begin to appear, the temperature is increased and the cells may be cultured at temperatures above 36.5°C and below 40.0°C. The temperature may be raised once or may be raised stepwise. After raising the temperature, the medium may be changed while culturing the cells, eg every two days.
  • the cells introduced with the reprogramming factor are recovered, and at least a part of the recovered and mixed cells is seeded in a medium for at least one passage.
  • the reprogramming factor-introduced cells may be collected, and at least a portion of the collected mixed cells may be seeded in culture medium and passaged until stem cells are established. In addition, all of the collected mixed cells may be seeded in the medium.
  • collecting the reprogramming factor-introduced cells and seeding at least a part of the collected and mixed cells in a culture medium for passage means, for example, reprogramming factor-introduced cells, gene It refers to passaging without distinguishing between expression states.
  • cells introduced with reprogramming factors may be seeded in the same culture vessel without being differentiated by gene expression state.
  • recovering the cells introduced with the reprogramming factor, seeding at least a part of the recovered and mixed cells in a medium for passage means, for example, reprogramming the cells introduced with the reprogramming factor. It means to pass without distinguishing at the degree of.
  • cells into which reprogramming factors have been introduced may be seeded in the same culture vessel without being differentiated by the degree of reprogramming.
  • recovering the reprogramming factor-introduced cells and seeding at least a portion of the recovered and mixed cells in a medium for passaging means, for example, that the reprogramming factor-introduced cells are morphologically Passage without discrimination.
  • cells into which reprogramming factors have been introduced may be seeded in the same culture vessel without being differentiated by morphology.
  • recovering the reprogramming factor-introduced cells and seeding at least a portion of the recovered and mixed cells in a medium for passaging means, for example, reprogramming factor-introduced cells to a size It means to pass without distinction.
  • cells into which reprogramming factors have been introduced may be seeded in the same culture vessel without size discrimination.
  • recovering the reprogramming factor-introduced cells and seeding at least a portion of the recovered and mixed cells in a medium for passage means without cloning the reprogramming factor-introduced cells. It means to pass. For example, when passage without cloning, it is not necessary to pick up colonies formed by cells into which a reprogramming factor has been introduced. For example, when passaging without cloning, multiple colonies formed by cells into which a reprogramming factor has been introduced may not be separated from each other. For example, during passaging, cells forming different colonies may be mixed and seeded in the same culture vessel.
  • a single colony formed by cells into which a reprogramming factor has been introduced may not be cloned.
  • colonies may be mixed together and seeded in the same culture vessel during passaging.
  • the adherently cultured cells may be collected, and at least a portion of the collected and mixed cells may be seeded in a medium for passage. good.
  • cells may be detached from a culture vessel and at least a portion of the detached and mixed cells may be seeded into the same culture vessel.
  • the cells may be detached from the incubator with a detachment solution, and the detached and mixed whole cells may be passaged.
  • non-colony forming cells may be passaged.
  • the whole cells in suspension culture may be subcultured.
  • the cells When subculturing cells into which a reprogramming factor has been introduced, the cells may be seeded in a medium or incubator at a low concentration.
  • the low concentration is, for example, 1 cell/cm 2 or more, 0.25 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less, 1.25 ⁇ 10 3 cells/cm 2 or less, or 0.25 ⁇ 10 3 cells/cm 2 or less. cm 2 or less, 0.25 ⁇ 10 2 cells/cm 2 or less, or 0.25 ⁇ 10 1 cells/cm 2 or less.
  • low concentration means that 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, or 2 or less cells can contact each other.
  • the concentration at which 11 or more cells do not come into contact with each other is a concentration at which 11 or more cells do not come into contact with each other.
  • the state where the entire bottom surface of the cell container is covered with cells is 100% confluent, and low concentration means 5% or less confluent, 4% or less confluent, 3% or less confluent, 2% or less confluent, 1% or less confluent, 0 0.5% confluent, 0.1% confluent, 0.05% confluent, or 0.01% confluent.
  • the low concentration is, for example, a concentration at which single cells do not contact each other in seeded cells.
  • wells of a well plate may be seeded with single cells.
  • a well plate may be a 12-well plate or a 96-well plate.
  • the cells may be cultured at a predetermined temperature or higher at which the stability of the viral nucleic acid of the temperature-sensitive Sendai virus vector decreases after passage. After passage, the cells are cultured at a temperature of, for example, 36.5°C or higher and lower than 38.0°C. After passage, for example, the cells are cultured at a temperature of 36.5 ° C. or higher and less than 38.0 ° C. until intercellular adhesion starts, and after intercellular adhesion starts, a higher temperature until intercellular adhesion starts, For example, cells may be cultured at a temperature of 37.5°C or higher and 42.0°C or lower. After subculturing, the cells may be cultured at a temperature of 37.5° C. or higher and 42.0° C. or lower before cell-cell adhesion starts.
  • Cells introduced with reprogramming factors may be cultured and passaged in a closed incubator.
  • a closed incubator does not exchange, for example, gases, viruses, microorganisms and impurities with the outside.
  • cells into which a reprogramming factor has been introduced may be expanded by two-dimensional culture, or expanded by three-dimensional culture.
  • the whole adherent cultured cells may be cryopreserved as pluripotent stem cells.
  • whole cells detached from the incubator with a detachment solution may be cryopreserved as pluripotent stem cells.
  • the whole cells in suspension culture may be cryopreserved as pluripotent stem cells.
  • Induced pluripotent stem cells can form flat-shouldered colonies similar to ES cells and express alkaline phosphatase. Induced pluripotent stem cells can express undifferentiated cell markers such as Nanog, OCT4, and SOX2. Induced pluripotent stem cells can express TERT. Induced pluripotent stem cells may exhibit temoutherase activity.
  • a cytoflow meter which are cell surface markers indicating undifferentiated TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-1, and It may be done by analyzing whether at least one surface marker selected from SSEA5 is positive.
  • TRA-1-60 is an antigen specific to iPS/ES cells. Since iPS cells can be generated only from the TRA-1-60 positive fraction, TRA-1-60 positive cells are considered to be iPS cell seeds.
  • the method of introducing an inducer to oligodendrocytes into cells is not particularly limited.
  • Inducers are introduced into cells, for example, by electroporation.
  • inducers are introduced into cells by, for example, the lipofection method.
  • the inducer is introduced into the cell using, for example, a viral vector.
  • the inducer may be introduced into the cell integration-free.
  • the cells into which the oligodendrocyte inducer is introduced may be adherent or suspension cultured.
  • Somatic cells introduced with an inducer to oligodendrocytes are treated with basement membrane matrices such as Matrigel (Corning), CELLstart (registered trademark, ThermoFisher), Laminin511 (iMatrix-511, nippi), fibronectin, and vitrotin. , may be cultured feeder-free.
  • basement membrane matrices such as Matrigel (Corning), CELLstart (registered trademark, ThermoFisher), Laminin511 (iMatrix-511, nippi), fibronectin, and vitrotin.
  • stem cell medium such as Stemfit (Ajinomoto) and mTeSR (Stem Cell Technologies) can be used.
  • a gel medium for example, is used when cells into which an inducer has been introduced are cultured in suspension or three-dimensionally.
  • a gel medium is prepared, for example, by adding gellan gum to a stem cell medium.
  • the gel medium contains gellan gum, hyaluronic acid, rhamsan gum, diutan gum, xanthan gum, carrageenan, fucoidan, pectin, pectic acid, pectinic acid, heparan sulfate, heparin, heparitin sulfate, keratosulfate, chondroitin sulfate, deltaman sulfate, rhamnan sulfate, and It may contain at least one polymer compound selected from the group consisting of salts thereof. Moreover, the gel medium may contain methylcellulose. Containing methylcellulose further suppresses aggregation between cells.
  • the gel medium contains poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA), poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA), Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM), amine terminated, carboxylic acid terminated, maleimide terminated, N-hydroxysuccinimide ( NHS) ester terminated, triethoxysilane terminated, Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide), Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid), Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate), Poly (N-isopropylacrylamide-co- methacrylic acid), Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate), and N-isopropylacrylamide.
  • PGMA poly(glycerol monomethacrylate)
  • PPMA poly(2-hydroxypropyl methacrylate)
  • the gel medium may or may not contain growth factors such as basic fibroblast growth factor (bFGF).
  • the gel medium may contain growth factors such as bFGF at low concentrations of 400 ⁇ g/L or less, 40 ⁇ g/L or less, or 10 ⁇ g/L or less.
  • the gel medium may contain TGF- ⁇ , may not contain TGF- ⁇ , or may contain TGF- ⁇ at a low concentration of 600 ⁇ g/L or less, 300 ⁇ g/L or less, or 100 ⁇ g/L or less.
  • the gel medium does not have to be stirred. Also, the gel medium may not contain feeder cells.
  • the gel medium may contain at least one substance selected from the group consisting of cadherin, laminin, fibronectin, and vitronectin.
  • the cells are produced within, for example, 30 days, 20 days, 10 days, or 7 days after the introduction of the inducer into the cells. It can be directed to oligodendrocytes.
  • Immature oligodendrocytes such as oligodendrocyte progenitor cells and mature oligodendrocytes express at least one selected from O4 and PLP (Myelin Proteolipid Protein) 1 .
  • Mature oligodendrocytes express MOG (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein) and PDGFR ⁇ (platelet-derived growth factor receptor ⁇ ).
  • Example 1 A dish coated with laminin 511 was used as a dish for inducing pluripotent stem cells.
  • human peripheral blood mononuclear cells were suspended in a blood medium, and the number of mononuclear cells was measured using a hemocytometer to adjust the number of mononuclear cells in the blood medium. After that, the mononuclear cells were two-dimensionally cultured on a dish for pluripotent stem cell induction at 37° C. for 1 to 7 days.
  • SeV(PM) hKOS/TS12 ⁇ F and SeV(HNL) hC-Myc/TS15 ⁇ F were added to two-dimensionally cultured mononuclear cells at an MOI of 5, and a dish for inducing pluripotent stem cells was prepared. was placed in an incubator at 34° C. to culture the cells. Two days after infection, the blood medium was replaced with iPS cell medium. After that, the medium was changed once every two days using the iPS cell medium. On the way, the temperature was raised stepwise to 37°C and 38°C.
  • stem cell-like cell clusters were generated. Almost all the cells became TRA1-60-positive cells on the 14th day after the infection, and exhibited an iPS cell-like morphology. 14 days after the infection, a cell detachment agent, Triple Select, was added to the dish, allowed to stand at room temperature for 1 minute, then the cell-containing solution was aspirated, and the cell-containing solution was incubated at 37°C for 5 to 10 minutes. . Thereafter, an iPS cell medium was added, and the iPS cell medium containing the cells was collected in a 15 mL tube.
  • a cell detachment agent Triple Select
  • Example 2 The number of cells was measured using a hemocytometer, the concentration of the cell-containing solution was adjusted, and the cells were seeded in a well plate so that the concentration was 0.25 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less. took over.
  • Example 1 during the first passage, all cells were detached from the well plate and the detached and mixed cells were indiscriminately seeded in the next well plate.
  • Example 2 colonies were picked and cloned during the first passage. In both Examples 1 and 2, the cells were seeded so that 11 or more cells did not come into contact with each other during passage.
  • the well dish was placed in a 37° C. incubator to two-dimensionally culture the cells. After the cells began to divide, the culture temperature was raised to 38°C. After that, in both Examples 1 and 2, all the cells were collected every time the cells became 60% to 80% confluent, and at least a part of the collected and mixed cells was seeded in the medium and subcultured. . Cells were seeded in well plates at a concentration of 0.25 ⁇ 10 4 cells/cm 2 or less for the second and subsequent passages. Also in this case, 11 or more cells did not contact each other.
  • the number of colonies formed 5 days after the Sendai virus disappeared in the cells was counted.
  • clonal efficiency was calculated by dividing the number of colonies by the number of cells plated. The results of three tests are shown in FIG. When all cells are harvested at the first passage using mTeSR Plus as the medium, and some of the harvested and mixed cells are plated in the medium and passaged, the clonal efficiency ranges from about 5%. It was about 8%, and the variation was small. When using mTeSR Plus as the medium and cloning by colony picking at the first passage, the clonal efficiency is sometimes less than 1% and sometimes about 6%. There was variability.
  • Clonal efficiency is about 10% to about 10% when all cells are harvested at the first passage using StemFit in the medium and some of the harvested mixed cells are plated in the medium and passaged. 15%, and the variation was small.
  • the clonal efficiency is sometimes less than 1% and sometimes about 16%, and the clonal efficiency varies. was there.
  • Example 3 A well dish coated with a solubilized basement membrane preparation (Matrigel, Corning) was prepared, and ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase) inhibitor (Selleck) was added to each well at a concentration of 10 nmol/mL.
  • ROCK Rho-associated coiled-coil forming kinase inhibitor
  • Human iPS cells were dispersed with a tissue/culture cell detachment/separation/dispersion solution (Accutase, Innovative Cell Technologies) and seeded in a well dish. After that, the iPS cells were cultured for 24 hours in a feeder-free medium under gaseous conditions of 5% carbon dioxide concentration and 20% oxygen concentration.
  • a single-cell suspension was prepared by detaching the iPS cells from the wells using a detachment agent.
  • OLIG2, SOX10, ASCL1, and NKX2.2 as inducers were introduced into iPS cells by electroporation using a Human Stem Cell Nucleofector Kit (registered trademark, LONZA) and an episomal plasmid. After that, the inducer-introduced cells were seeded in a well dish and cultured in mTeSR.
  • Oligodendrocyte medium contains DMEM/F12, N2 (1X), B27 (1X), penicillin-streptomycin (1X), NEAA (1X), insulin (25 ⁇ g/mL, Sigma), PDGF-AA (10 ng/ml, PeproTech), IGF (10 ng/mL, PeproTech), NT3 (1 ng/mL, PeproTech), biotin (100 ng/mL, Sigma), and cAMP (1 ⁇ mol/L, Sigma).
  • the wells were also supplemented with oligodendrocyte medium.
  • the inducer-introduced cells were seeded on human fibroblasts or human glial cells, and the inducer-introduced cells were cultured until 21 days.
  • Cells on day 7 after introduction of the inducer were stained with an anti-O4 antibody.
  • the cells 21 days after introduction of the inducer were stained with anti-O4 antibody, anti-PLP1 antibody, and anti-MOG antibody.
  • the cells 7 days after the introduction of the inducer expressed O4, a marker for oligodendrocytes and their progenitor cells.
  • O4, PLP1, and MOG were expressed in the cells 21 days after introduction of the inducer. Whether the iPS cells to be introduced with the inducer are the iPS cells prepared in Example 1 or the iPS cells prepared in Example 2, the expression of markers for oligodendrocytes and their progenitor cells is confirmed.
  • Example 4 Inducing factors were introduced into iPS cells in the same manner as in Example 3, except that OLIG2, SOX10, ASCL1 and NKX6.1 were used as inducers. As shown in FIG. 7, the inducer-introduced cells expressed O4.
  • Example 5 Inducing factors were introduced into iPS cells in the same manner as in Example 3, except that OLIG2, SOX10, and ASCL1 were used as inducers. As shown in FIG. 8(a), the inducer-introduced cells expressed O4.
  • Example 6 Inducing factors were introduced into iPS cells in the same manner as in Example 3, except that OLIG2 and SOX10 were used as inducers. As shown in FIG. 8(b), the inducer-introduced cells expressed O4.
  • Example 7 Inducing factors were introduced into iPS cells in the same manner as in Example 3, except that OLIG2 and ASCL1 were used as inducers. As shown in FIG. 8(c), the inducer-introduced cells expressed O4.
  • Example 8 An inducer was introduced into iPS cells in the same manner as in Example 3, except that OLIG2 was used as the inducer. As shown in FIG. 8(d), the inducer-introduced cells expressed O4.
  • Example 9 Inducing factors were introduced into iPS cells in the same manner as in Example 3, except that OLIG2 and NKX2.2 were used as inducers. As shown in FIG. 8(e), the inducer-introduced cells expressed O4, a marker for oligodendrocytes and their progenitor cells.
  • Example 10 A well dish coated with a solubilized basement membrane preparation (Matrigel, Corning) was prepared and media was added to each well. In addition, Ficoll (GE)-separated human adult peripheral blood mononuclear cells were seeded in well dishes. Mononuclear cells were then cultured in blood medium (StemSpan®, SFEM II, STEMCELL TECHNOLOGIES) at 37° C. for 1 to 7 days. Medium contained 20 ng/mL FLT3, 10 ng/mL TPO, 50 ng/mL IL6, 10 ng/mL GCSF, 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL IL3, 10 ng/mL GM-CSF. . It was cultured on a dish under gaseous conditions of 5% carbon dioxide concentration and 20% oxygen concentration.
  • the mononuclear cells were collected from the wells and a single cell suspension was prepared. Next, OLIG2, SOX10, ASCL1 and NKX2.2 as inducers were introduced into mononuclear cells by electroporation using a Nucleofector kit for CD34+ cells (registered trademark, LONZA) and an episomal plasmid. After that, the inducer-introduced cells were seeded in a well dish and cultured in blood medium.
  • OLIG2, SOX10, ASCL1 and NKX2.2 as inducers were introduced into mononuclear cells by electroporation using a Nucleofector kit for CD34+ cells (registered trademark, LONZA) and an episomal plasmid. After that, the inducer-introduced cells were seeded in a well dish and cultured in blood medium.
  • oligodendrocyte medium was added to the wells.
  • the wells were also supplemented with oligodendrocyte medium.
  • all medium in the wells was replaced with fresh oligodendrocyte medium.
  • the inducer-introduced cells were seeded on human fibroblasts, and the inducer-introduced cells were cultured until 28 days.
  • Cells 28 days after introduction of the inducer were stained with anti-O4 antibody, anti-PLP1 antibody and anti-MOG antibody, respectively. As shown in FIG. 9, cells 28 days after introduction of the inducer expressed O4, PLP1 and MOG.
  • Example 11 A well dish coated with a solubilized basement membrane preparation (Matrigel, Corning) was prepared and medium (DMEM containing 10% FBS) was added to each well. In addition, human neonatal fibroblasts were seeded in well dishes. The fibroblasts were then cultured on the dish at 37° C. for 1 to 7 days under gaseous conditions of 5% carbon dioxide concentration and 20% oxygen concentration.
  • Fibroblasts were detached from the wells using a detachment agent to prepare a single-cell suspension.
  • OLIG2, SOX10, ASCL1, and NKX2.2 as inducers were introduced into fibroblasts by electroporation using a Human Dermal Fibroblast Nucleofector Kit (registered trademark, LONZA) and an episomal plasmid.
  • LONZA Human Dermal Fibroblast Nucleofector Kit
  • the inducer-introduced cells were seeded in a well dish and cultured in a 10% FBS DMEM medium.
  • oligodendrocyte medium was added to the wells.
  • the wells were also supplemented with oligodendrocyte medium.
  • all medium in the wells was replaced with fresh oligodendrocyte medium.
  • the inducer-introduced cells were seeded on human fibroblasts, and the inducer-introduced cells were cultured until 28 days.
  • Cells 28 days after introduction of the inducer were stained with anti-O4 antibody, anti-PLP1 antibody and anti-MOG antibody, respectively. As shown in FIG. 10, cells 28 days after introduction of the inducer expressed O4, PLP1 and MOG.
  • Example 12 A well dish coated with a solubilized basement membrane preparation (Matrigel, Corning) was prepared and media was added to each well. In addition, human adult peripheral blood-derived T cells were seeded in well dishes. After that, the T cells were expanded on a dish at 37° C. for 1 to 7 days under gaseous conditions of 5% carbon dioxide concentration and 20% oxygen concentration. Note that the expansion culture does not necessarily have to be performed.
  • a serum-free medium (X-VIVO10, Lonza) supplemented with 30 U/mL interleukin-2 and beads for human T cell proliferation stimulation (Dynabeas CD3/CD28, BD) was used.
  • T cells were collected from the wells and a single cell suspension was prepared.
  • OLIG2, SOX10, ASCL1 and NKX2.2 as inducers were introduced into mononuclear cells by electroporation using a Tcell electroporation kit (registered trademark, LONZA) and an episomal plasmid. After that, the inducer-introduced cells were seeded in a well dish, and serum-free medium (X-VIVO10 , Lonza).
  • oligodendrocyte medium was added to the wells.
  • the wells were also supplemented with oligodendrocyte medium.
  • all medium in the wells was replaced with fresh oligodendrocyte medium.
  • the inducer-introduced cells were seeded on human fibroblasts, and the inducer-introduced cells were cultured until 28 days.
  • Cells 28 days after introduction of the inducer were stained with anti-O4 antibody, anti-PLP1 antibody and anti-MOG antibody, respectively. As shown in FIG. 11, cells 28 days after introduction of the inducer expressed O4, PLP1 and MOG.
  • Example 13 Oligodendrocytes were induced from human iPS cells in the same manner as in Example 3, except that p53DD was added as an inducer. The results are shown in FIG. Addition of p53DD increased the percentage of cells showing O4 positivity.
  • Example 14 Oligodendrocytes were induced from human iPS cells in the same manner as in Example 3, except that RB gene shRNA was added to the inducer. The results are shown in FIG. Addition of Rb Sh increased the percentage of cells showing O4 positivity.
  • Example 15 Oligodendrocytes were induced from human iPS cells in the same manner as in Example 3, except that c-MYC was added as an inducer. The results are shown in FIG. Addition of c-MYC increased the percentage of cells showing O4 positivity.
  • Example 16 Oligodendrocytes were induced from human adult peripheral blood-derived mononuclear cells in the same manner as in Example 10, except that p53DD was added as an inducer. The results are shown in FIG. Addition of p53DD increased the percentage of cells showing O4 positivity.
  • Example 17 Oligodendrocytes were induced from human adult peripheral blood-derived mononuclear cells in the same manner as in Example 10, except that RB Sh was added as an inducer. The results are shown in FIG. Addition of Rb Sh increased the percentage of cells showing O4 positivity.
  • Example 18 Oligodendrocytes were induced from human adult peripheral blood-derived mononuclear cells in the same manner as in Example 10, except that c-MYC was added as an inducer. The results are shown in FIG. Addition of c-MYC increased the percentage of cells showing O4 positivity.

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Abstract

本開示によれば、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞にＯＬＩＧ及びＳＯＸの組み合わせ、又はＯＬＩＧ及びＮＫＸの組み合わせを含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。また、本開示によれば、体細胞にＯＬＩＧ、ＳＯＸ、ＡＳＣＬ、ＮＫＸを含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。

Description

オリゴデンドロサイトの作製方法
　本発明は、細胞技術に関し、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法に関する。
　中枢神経系のミエリン形成細胞であるオリゴデンドロサイトは、遺伝性及び後天性白質ジストロフィーの細胞移植に有用である可能性がある（例えば、特許文献１、２参照。）。しかし、従来の幹細胞からオリゴデンドロサイトを誘導する方法は、時間がかかり、効率的でないという問題がある。
特許第６５４１５７７号公報 国際公開第２０１１／０９１０４８号
　本発明は、効率的なオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法を提供することを目的の一つとする。
　本発明の態様によれば、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞にＯＬＩＧ及びＳＯＸを含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。
　本発明の態様によれば、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞にＯＬＩＧ及びＮＫＸを含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。
　本発明の態様によれば、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞にＯＬＩＧ、ＮＫＸ、及びＳＯＸを含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、誘導因子が、細胞増殖を促進する因子をさらに含んでいてもよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣからなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。ＭＹＣは、ｃ－ＭＹＣであってもよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、誘導因子がＡＳＣＬをさらに含んでいてもよい。
　また、本発明の態様によれば、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞にＯＬＩＧ及び細胞増殖を促進する因子を含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣからなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。ＭＹＣは、ｃ－ＭＹＣであってもよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、誘導因子がＳＯＸ、ＡＳＣＬ、及びＮＫＸからなる群から選択される少なくともいずれかを含んでいてもよい。
　また、本発明の態様によれば、リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングせずにｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。
　また、本発明の態様によれば、リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングせずに播種してｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。
　また、本発明の態様によれば、リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から剥離し、剥離した細胞の少なくとも一部を混合して播種し、ｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。
　また、本発明の態様によれば、リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から回収し、回収した細胞の少なくとも一部を混合して播種し、ｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。
　また、本発明の態様によれば、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーそれぞれをピックアップせずにｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。
　また、本発明の態様によれば、リプログラミング因子を導入された細胞であって、異なるシングルセル由来の細胞同士混合して播種してｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、播種することにおいて、細胞をクローニングしなくともよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、播種することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞同士を混合してもよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、播種することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞のクローン同士を混合してもよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、播種することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞の異なるクローン同士を混合してもよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、播種する前に、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに分離することを含まなくともよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、播種する前に、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーのそれぞれをピックアップしなくともよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、播種することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに混合してもよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する単一のコロニーをクローニングすることを含まなくともよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、リプログラミン因子を導入された細胞が形成するコロニーをピックアップすることを含まなくともよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入された細胞であって、培養器に付着している細胞を回収し、回収した細胞の少なくとも一部を培地に播種してもよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入された細胞を遺伝子発現状態で区別することなく播種してもよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、リプログラミング因子を導入された細胞をリプログラミングの程度で区別することなく播種してもよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、誘導因子がＳＯＸ、ＡＳＣＬ、及びＮＫＸからなる群から選択される少なくともいずれかを含んでいてもよい。
　また、本発明の態様によれば、体細胞にＯＬＩＧ、ＳＯＸ、ＡＳＣＬ、ＮＫＸを含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、誘導因子が、細胞増殖を促進する因子をさらに含んでいてもよい。
　また、本発明の態様によれば、体細胞にＯＬＩＧ及び細胞増殖を促進する因子を含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法が提供される。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、誘導因子がＳＯＸ、ＡＳＣＬ、及びＮＫＸからなる群から選択される少なくともいずれかを含んでいてもよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、細胞増殖を促進する因子が、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣからなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。ＭＹＣは、ｃ－ＭＹＣであってもよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、体細胞がｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞でなくともよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、体細胞が血液細胞であってもよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、体細胞が単核球であってもよい。
　上記のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法において、体細胞が線維芽細胞であってもよい。
　本発明によれば、効率的なオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法を提供可能である。
実施例１に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 実施例１に係るＰＣＲの結果を示すグラフである。 実施例１に係るＴＲＡ１－６０陽性細胞を示す写真である。 実施例１及び実施例２に係るクローナルエフィシエンシーを示すグラフである。 実施例３に係る細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例３に係る細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例４に係る細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例５から９に係る細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例１０に係る細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例１１に係る細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例１２に係る細胞の蛍光顕微鏡写真である。 実施例１３から１８の結果を示すグラフである。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための材料、物質、薬品、及び方法等を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
　実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、体細胞にＯＬＩＧ、ＳＯＸ、ＡＳＣＬ、ＮＫＸを含む誘導因子を導入することを含む。
　また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、ｉＰＳ細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）又はＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）にＯＬＩＧ及びＳＯＸを含む誘導因子を導入することを含む。
　また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞にＯＬＩＧ及びＮＫＸを含む誘導因子を導入することを含む。
　また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングせずにｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む。
　また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングせずに播種してｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む。
　また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から剥離し、剥離した細胞の少なくとも一部を混合して播種し、ｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む。
　また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から回収し、回収した細胞の少なくとも一部を混合して播種し、ｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む。
　また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーそれぞれをピックアップせずにｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む。
　また、実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法は、リプログラミング因子を導入された細胞であって、異なるシングルセル由来の細胞同士混合して播種してｉＰＳ細胞を作製することと、ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、を含む。
　誘導因子は、ＯＬＩＧとＡＳＣＬを含んでいてもよい。誘導因子は、ＯＬＩＧ、ＡＳＣＬ、及びＳＯＸを含んでいてもよい。誘導因子は、ＯＬＩＧ、ＳＯＸ、ＡＳＣＬ、及びＮＫＸを含んでいてもよい。
　ＯＬＩＧは、例えば、ＯＬＩＧ２である。ＳＯＸは、例えば、ＳＯＸ１０である。ＡＳＣＬは、例えば、ＡＳＣＬ１である。ＮＫＸは、例えば、ＮＫＸ２．２又はＮＫＸ６．１である。
　誘導因子が、細胞増殖を促進する因子をさらに含んでいてもよい。細胞増殖を促進する因子の例としては、ｐ５３遺伝子を抑制する因子、Ｒｂ遺伝子を抑制する因子、及びＭＹＣが挙げられる。細胞増殖を促進する因子は、ガン化を促進する因子、アポトーシスを抑制する因子、あるいはクロマチンをユークロマチンに誘導する因子であり得る。
　ｐ５３は、ガン抑制タンパク質である。ｐ５３遺伝子を抑制する因子は、例えば、ｐ５３のドミナントネガティブ変異体である。ｐ５３のドミナントネガティブ変異体は、体細胞に内在する野生型ｐ５３タンパク質と競合的に作用して、野生型ｐ５３タンパク質の機能を阻害し得る限り特に限定されない。ｐ５３のドミナントネガティブ変異体の例としては、マウスｐ５３のＤＮＡ結合領域に位置する２７５位（ヒトの場合は２７８位）のプロリンをセリンに点変異させたｐ５３Ｐ２７５Ｓ、マウスｐ５３の１４－３０１位（ヒトｐ５３では１１－３０４位に対応）のアミノ酸を欠失させたｐ５３ＤＤ、マウスｐ５３の５８位（ヒトの場合は６１位）のセリンをアラニンに点変異させたｐ５３Ｓ５８Ａ、ヒトｐ５３の１３５位（マウスの場合は１３２位）のシステインをチロシンに点変異させたｐ５３Ｃ１３５Ｙ、マウスｐ５３の１３５位（ヒトの場合は１３８位）のアラニンをバリンに点変異させたｐ５３Ａ１３５Ｖ、マウスｐ５３の１７２位（ヒトの場合は１７５位）のアルギニンをヒスチジンに点変異させたｐ５３Ｒ１７２Ｈ、マウスｐ５３の２７０位（ヒトの場合は２７３位）のアルギニンをヒスチジンに点変異させたｐ５３Ｒ２７０Ｈ、及びマウスｐ５３の２７８位（ヒトの場合は２８１位）のアスパラギン酸をアスパラギンに点変異させたｐ５３Ｄ２７８Ｎが挙げられる。あるいは、ｐ５３遺伝子を抑制する因子は、ｐ５３遺伝子に干渉する短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びｓｉＲＮＡのようなＲＮＡであってもよい。
　Ｒｂは、ガン抑制タンパク質である。Ｒｂ遺伝子を抑制する因子は、例えば、Ｒｂ遺伝子に干渉する短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びｓｉＲＮＡのようなＲＮＡであってもよい。
　ＭＹＣは、細胞周期制御の機能を喪失させ、ガン化を誘導する。ＭＹＣは、ｃ－ＭＹＣであってもよい。
　誘導因子はＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡは、ｍＲＮＡであってもよい。なお、ここでは遺伝子記号はヒトで記載しているが、大文字・小文字表記によって、種を制限することを意図するものではない。例えば、全て大文字表記していても、マウス又はラットの遺伝子を含むことを排除するものではない。ただし、実施例においては、実際に使用した生物種に則って、遺伝子記号を表記している。
　体細胞は、例えば、幹細胞ではない細胞である。体細胞は、例えば、ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞ではない細胞である。体細胞の例としては、線維芽細胞、血液細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、及び体性幹前駆細胞等が挙げられる。血液細胞の例としては、Ｔ細胞、並びにマクロファージ、モノサイト、単核球、Ｂ細胞、及びロゼット非形成細胞のようなＴ細胞以外の血液細胞（ｎｏｎ－Ｔ細胞）が挙げられる。体細胞は、尿に含まれる細胞であってもよい。尿に含まれる細胞の例としては、膀胱上皮細胞が挙げられる。
　体細胞は、ヒト由来であってもよいし、非ヒト動物由来であってもよい。体細胞は、一人のヒト由来であってもよいし、複数人のヒト由来であってもよい。体細胞は、一匹の非ヒト動物由来であってもよいし、複数匹の非ヒト動物由来であってもよい。体細胞は、胎児由来であってもよい。
　ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞は、ヒト由来であってもよいし、非ヒト動物由来であってもよい。ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞は、一人のヒト由来であってもよいし、複数人のヒト由来であってもよい。ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞は、一匹の非ヒト動物由来であってもよいし、複数匹の非ヒト動物由来であってもよい。ｉＰＳ細胞は、胎児由来であってもよい。
　ｉＰＳ細胞は、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を培養することと、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収した細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することと、を含む、培養方法によって誘導されてもよい。
　リプログラミング因子を導入される細胞は特に限定されないが、例としては、線維芽細胞、血液細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、及び体性幹前駆細胞等が挙げられる。リプログラミング因子を導入される細胞は、尿に含まれる細胞であってもよい。尿に含まれる細胞の例としては、膀胱上皮細胞が挙げられる。リプログラミング因子を導入される細胞は、ヒト由来であってもよいし、非ヒト動物由来であってもよい。リプログラミング因子を導入される細胞は、一人のヒト由来であってもよいし、複数人のヒト由来であってもよい。リプログラミング因子を導入される細胞は、一匹の非ヒト動物由来であってもよいし、複数匹の非ヒト動物由来であってもよい。
　細胞に導入されるリプログラミング因子は、例えば、ＲＮＡである。ＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡである。細胞に導入されるリプログラミング因子は、例えば、ＯＣＴ３／４等のＯＣＴのＲＮＡ、ＳＯＸ２等のＳＯＸのＲＮＡ、ＫＬＦ４等のＫＬＦのＲＮＡ、及びｃ－ＭＹＣ等のＭＹＣのＲＮＡを含む。リプログラミング因子ＲＮＡとして、ＯＣＴ３／４を改良したＭ３Ｏを使用してもよい。また、リプログラミング因子ＲＮＡは、ＬＩＮ２８Ａ、ＦＯＸＨ１、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ｐ５３－ｄｏｍｉｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３－Ｐ２７５Ｓ、Ｌ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ－２、Ｅ－ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、ＴＨ２Ｂ、及びＰ５３ＤＤからなる群から選択される少なくとも一つの因子のＲＮＡをさらに含んでいてもよい。これらのＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋから入手可能である。
　ｐ５３は、ガン抑制タンパク質である。ｐ５３のドミナントネガティブ変異体は、体細胞に内在する野生型ｐ５３タンパク質と競合的に作用して、野生型ｐ５３タンパク質の機能を阻害し得る限り特に限定されない。ｐ５３のドミナントネガティブ変異体の例としては、マウスｐ５３のＤＮＡ結合領域に位置する２７５位（ヒトの場合は２７８位）のプロリンをセリンに点変異させたｐ５３Ｐ２７５Ｓ、マウスｐ５３の１４－３０１位（ヒトｐ５３では１１－３０４位に対応）のアミノ酸を欠失させたｐ５３ＤＤ、マウスｐ５３の５８位（ヒトの場合は６１位）のセリンをアラニンに点変異させたｐ５３Ｓ５８Ａ、ヒトｐ５３の１３５位（マウスの場合は１３２位）のシステインをチロシンに点変異させたｐ５３Ｃ１３５Ｙ、マウスｐ５３の１３５位（ヒトの場合は１３８位）のアラニンをバリンに点変異させたｐ５３Ａ１３５Ｖ、マウスｐ５３の１７２位（ヒトの場合は１７５位）のアルギニンをヒスチジンに点変異させたｐ５３Ｒ１７２Ｈ、マウスｐ５３の２７０位（ヒトの場合は２７３位）のアルギニンをヒスチジンに点変異させたｐ５３Ｒ２７０Ｈ、及びマウスｐ５３の２７８位（ヒトの場合は２８１位）のアスパラギン酸をアスパラギンに点変異させたｐ５３Ｄ２７８Ｎが挙げられる。
　ＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）又は５－メチルウリジン（５ｍｅＵ）で修飾されていてもよい。ＲＮＡは、ポリアデニル化されていてもよい。
　細胞に導入されるＲＮＡは、例えば、１本鎖ＲＮＡであり、２本鎖ＲＮＡが実質的に除去されていてもよい。また、細胞に導入されるＲＮＡは、短鎖ＲＮＡ及び夾雑物等の不純物が実質的に除去されていることが好ましい。２本鎖ＲＮＡを実質的に除去するために、細胞に導入する１本鎖ＲＮＡを、精製及び／又は濃縮してもよい。細胞に導入する１本鎖ＲＮＡを精製する方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる精製方法が挙げられる。例えば、ＨＰＬＣによって、２本鎖ＲＮＡが、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、あるいは９０％以上除去される。あるいは、２本鎖ＲＮＡを実質的に除去するために、細胞に導入するＲＮＡを、２本鎖ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼで処理してもよい。
　細胞に導入されるＲＮＡは、ＯＣＴ３／４のＲＮＡの完全長に直接接続されたＭＹＯＤの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）のＲＮＡをさらに含んでいてもよい。
　リプログラミング因子は、例えば、リポフェクション法により細胞に導入される。リポフェクション法とは、陰性荷電物質である核酸と、陽性荷電脂質と、の複合体を、電気的な相互作用により形成し、複合体をエンドサイトーシスや膜融合により細胞内に取り込ませる方法である。リポフェクション法は、細胞へのダメージが少なく、導入効率に優れており、操作が簡便であり、時間がかからない等の利点を有する。
　リプログラミング因子は、例えば、ＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて培養されている細胞に導入される。例えば、細胞が単核球である場合、血液から単核球を分離した直後に、単核球にＲＮＡを導入してもよい。
　あるいは、細胞には、例えば、ウイルスベクターを用いてリプログラミング因子を導入する。ウイルスベクターは、ＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターは、センダイウイルスベクターであってもよい。センダイウイルスベクターは、所定の温度以上でウイルス核酸の安定性が低下する温度感受性センダイウイルスベクターであってもよい。温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸は、所定の温度未満で安定である。ウイルス核酸は、ウイルスＤＮＡであってもよいし、ウイルスＲＮＡであってもよい。ウイルス核酸はウイルスゲノムであってもよい。ウイルス核酸の安定性の低下とは、ウイルス核酸が分解すること、及びウイルス核酸の複製又は増殖が抑制されることと、の少なくとも一方であってもよい。ウイルス核酸の安定性が低下すると、ウイルス核酸の増殖、ウイルス核酸の複製速度及び遺伝子発現レベルの少なくとも一方が低下する。所定の温度とは、例えば、３６．５℃以上３７．５℃以下である。温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性、すなわち、増殖、複製速度及び遺伝子発現レベルの少なくとも一方は、所定の温度未満で高く、所定の温度以上で低くなる。例えば、温度感受性センダイウイルスベクターは、３２℃で培養されている細胞における増殖速度又は遺伝子発現レベルと比較して、３７℃で培養されている細胞における増殖速度又は遺伝子発現レベルが、１／２以下である。
　センダイウイルスは、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ／ＨＮ遺伝子、及びＬ遺伝子をコードする。ＨＮタンパク質は、センダイウイルスが細胞に付着する際に細胞表面のシアル酸を認識してウイルス粒子を細胞に繋留させる。Ｆタンパク質は、細胞外のプロテアーゼにより切断活性化されて、繋留されているセンダイウイルスのエンベロープと標的細胞の細胞膜の融合を触媒して感染を成立させる。Ｌタンパク質は、その修飾タンパク質であるＰタンパク質とともに、感染後に細胞質でウイルス核酸の複製と複製された多コピーの核酸からの転写を触媒する。
　センダイウイルスベクターにおいてＦ遺伝子を欠失させることにより、遺伝子導入細胞から感染可能なウイルス粒子が産生されることを抑制することが可能である。また、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子の少なくとも一方に変異を導入することにより、センダイウイルスベクターを温度感受性にすることが可能である。
　センダイウイルスの温度感受性（ＴＳ）変異の例としては、ＴＳ７（Ｌタンパク質のＹ９４２Ｈ／Ｌ１３６１Ｃ／Ｌ１５５８Ｉ変異）、ＴＳ１２（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異）、ＴＳ１３（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異及びＬタンパク質のＬ１５５８Ｉ変異）、ＴＳ１４（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異及びＬタンパク質のＬ１３６１Ｃ変異）、ＴＳ１５（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異及びＬタンパク質のＬ１３６１Ｃ／Ｌ１５５８Ｉ変異）等が挙げられる。
　センダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失（ΔＦ）型センダイウイルスベクターであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入したセンダイウイルスベクターである。ただし、センダイウイルスベクターの温度感受性変異は、これらに限定されない。
　センダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ（ＰＭ）／ＴＳΔＦ、ＳｅＶ１８＋／ＴＳΔＦ、又はＳｅＶ（ＨＮＬ）／ＴＳΔＦであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入したセンダイウイルスベクターである。ただし、センダイウイルスベクターの温度感受性変異は、これらに限定されない。
　細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、温度感受性センダイウイルスベクターと温度非感受性センダイウイルスベクターとの組み合わせであってもよい。あるいは、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、温度感受性センダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まなくともよい。例えば、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まなくともよい。例えば、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターと同じ以上温度感受性を有するセンダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まなくともよい。例えば、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターと同じ以上温度感受性を有するセンダイウイルスベクターのみであり、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターより温度感受性が低いセンダイウイルスベクターを含まなくともよい。
　細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、任意のリプログラミング因子を搭載する。細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、例えば、ＫＬＦのＲＮＡ、ＯＣＴのＲＮＡ、及びＳＯＸのＲＮＡをこの順序で含み、ＭＹＣのＲＮＡを含まない温度感受性センダイウイルスベクターと、ＭＹＣのＲＮＡを含み、ＫＬＦのＲＮＡ、ＯＣＴのＲＮＡ、及びＳＯＸのＲＮＡを含まない温度感受性センダイウイルスベクターと、の組み合わせである。ただし、センダイウイルスベクターに搭載するリプログラム因子の数、組み合わせ、及び順序は任意であり、特に限定されない。
　細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＫＬＦのＲＮＡを含み、ＯＣＴのＲＮＡ及びＳＯＸのＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターを含んでいてもよい。ＫＬＦのＲＮＡを含み、ＯＣＴのＲＮＡ及びＳＯＸのＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、温度感受性センダイウイルスベクターであってもよいし、温度非感受性センダイウイルスベクターであってもよい。
　ＫＬＦのＲＮＡ、ＯＣＴのＲＮＡ、及びＳＯＸのＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を有するセンダイウイルスベクターである。温度感受性変異は、例えばＴＳ７又はＴＳ１２、あるいはＴＳ１２である。
　ＫＬＦのＲＮＡ、ＯＣＴのＲＮＡ、及びＳＯＸのＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ（ＰＭ）ＫＯＳ／ＴＳ７ΔＦ又はＳｅＶ（ＰＭ）ＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦであり、あるいはＳｅＶ（ＰＭ）ＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦである。
　ＭＹＣのＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失型センダイウイルスべクターであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を有するセンダイウイルスベクターである。温度感受性変異は、例えばＴＳ１５である。
　ＭＹＣのＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１２ΔＦ、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１３ΔＦ、又はＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１５ΔＦであり、あるいはＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１５ΔＦである。
　ＫＬＦのＲＮＡを含み、ＯＣＴのＲＮＡ及びＳＯＸのＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである。ＫＬＦのＲＮＡを含み、ＯＣＴのＲＮＡ及びＳＯＸのＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、例えば、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入したセンダイウイルスベクターより温度感受性が弱く、所定の温度以上でもＫＬＦ遺伝子を発現可能である。
　ＫＬＦのＲＮＡを含み、ＯＣＴのＲＮＡ及びＳＯＸのＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ１８＋ＫＬＦ４／ＴＳΔＦである。
　複数種類のセンダイウイルスベクターを細胞に導入する際には、例えば、複数種類のセンダイウイルスベクターを同時に細胞に導入する。あるいは、ある種類のセンダイウイルスベクターを細胞に導入してから、４８時間以内に、全ての種類のセンダイウイルスベクターを細胞に導入することが好ましい。
　細胞を感染させる際のセンダイウイルスベクターの感染多重度（ＭＯＩ）は、例えば、０．１以上以上である。また、ＭＯＩは、例えば、１００以下である。
　細胞をセンダイウイルスベクターに感染させる際の温度は、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度未満、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度であってもよいし、所定の温度以上であってもよい。センダイウイルスベクターが温度感受性センダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まない場合、細胞をセンダイウイルスベクターに感染させる際の温度は、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度より低い温度、つまり、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度であることが好ましい。
　リプログラミング因子を導入される細胞は、接着培養されていてもよいし、浮遊培養されていてもよい。
　リプログラミング因子を導入される体細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ｎｉｐｐｉ）、ファイブロネクチン、及びビトロチン等の基底膜マトリックスを用いて、フィーダーフリーで培養されていてもよい。
　リプログラミング因子を導入される細胞が培養される培地としては、例えば、Ｐｒｉｍａｔｅ　ＥＳ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ)、Ｓｔｅｍｆｉｔ　ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ　ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、及びＴｅＳＲ－Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地等の幹細胞培地を使用可能である。幹細胞培地は、例えば、ディッシュ、ウェル、又はチューブ等の培養器に入れられる。
　細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、少なくとも２日、あるいは２日以上１０日以下、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度より低い温度、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度で細胞を培養してもよい。その後、所定の温度以上で細胞を培養してもよい。所定の温度以上で細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。
　細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、少なくとも２日、あるいは２日以上１０日以下、例えば、４．０℃以上以上であり、３７．０℃未満の温度で細胞を培養してもよい。その後、温度を上昇させ、３６．５℃以上であり、４０．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。温度は１回で上げてもよいし、段階的に上げてもよい。温度を上昇させた後、細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。
　細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、幹細胞様のコロニーが現れ始めるまで、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度未満、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度で細胞を培養してもよい。幹細胞様のコロニーが現れ始めた後、所定の温度以上で細胞を培養してもよい。所定の温度以上で細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。
　細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、幹細胞様のコロニーが現れ始めるまで、例えば、４．０℃以上であり、３７．０℃未満の温度で細胞を培養してもよい。幹細胞様のコロニーが現れ始めた後、温度を上昇させ、３６．５℃以上であり、４０．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。温度は１回で上げてもよいし、段階的に上げてもよい。温度を上昇させた後、細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。
　細胞にリプログラミング因子を導入し、細胞を培養した後、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種する継代を少なくとも１回実行してもよい。継代することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞のクローン同士を混合してもよい。継代することにおいて、リプログラミング因子を導入された細胞の異なるクローン同士を混合してもよい。その後、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することを、複数回実施してもよい。幹細胞が樹立するまで、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収した混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代してもよい。なお、回収した混じり合った細胞の全てを培地に播種してもよい。
　ここで、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、遺伝子発現状態で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、遺伝子発現状態で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。あるいは、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、リプログラミングの程度で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、リプログラミングの程度で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。
　あるいは、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、形態で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、形態で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。あるいは、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、大きさで区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、大きさで区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。
　またあるいは、リプログラミング因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングすることなく継代することをいう。例えば、クローニングすることなく継代する場合、リプログラミング因子を導入された細胞が形成するコロニーをピックアップしなくともよい。例えば、クローニングすることなく継代する場合、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに分離しなくともよい。例えば、継代時に、複数の異なるコロニーを形成した細胞同士を混合して、同じ培養器に播種してもよい。また、例えば、クローニングすることなく継代する場合、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する単一のコロニーをクローニングしなくともよい。例えば、継代時に、コロニー同士を混合して、同じ培養器に播種してもよい。
　例えば、リプログラミング因子を導入された細胞が接着培養されている場合、接着培養されている細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代してもよい。例えば、継代時に、培養器から細胞を剥離し、剥離して混じり合った細胞の少なくとも一部を同じ培養器に播種してもよい。例えば、剥離液で培養器から細胞を剥がし、剥がして混じり合った細胞全体を継代してもよい。例えば、コロニーを形成していない細胞を継代してもよい。リプログラミング因子を導入された細胞が浮遊培養されている場合、浮遊培養されている細胞全体を継代してもよい。
　リプログラミング因子を導入された細胞を継代する際、細胞は低濃度で培地あるいは培養器に播種されてもよい。ここで、低濃度とは、例えば、１ｃｅｌｌ／ｃｍ２以上であり、０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、１．２５×１０3ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．２５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．２５×１０２ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、あるいは０．２５×１０１ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下である。あるいは、低濃度とは、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、あるいは２個以下の細胞同士が接触可能であり、１１個以上の細胞同士が接触しない濃度である。なお、１０個以下の細胞同士が接触した細胞塊が複数あってもよい。あるいは、細胞容器底面全体が細胞で覆われた状態を１００％コンフルエントとして、低濃度とは、５％以下コンフルエント、４％以下コンフルエント、３％以下コンフルエント、２％以下コンフルエント、１％以下コンフルエント、０．５％以下コンフルエント、０．１％以下コンフルエント、０．０５％以下コンフルエント、あるいは０．０１％以下コンフルエントである。またあるいは、低濃度とは、例えば、播種された細胞においてシングルセル同士が接触しない濃度である。例えば、ウェルプレートのウェルに、シングルセルを播種してもよい。ウェルプレートは、１２ウェルプレートや９６ウェルプレートであってもよい。本発明者らの知見によれば、リプログラミング因子を導入された細胞を継代する際、低濃度で細胞を培地に播種することにより、細胞から誘導される多能性幹細胞におけるセンダイウイルスの残存を抑制することが可能である。誘導される多能性幹細胞において、センダイウイルスが残存する細胞の割合は、例えば４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下あるいは０％である。
　温度感受性センダイウイルスベクターを用いた場合、継代後、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度以上で細胞を培養してよい。継代後、例えば、３６．５℃以上３８．０℃未満の温度で細胞を培養する。継代後、例えば、細胞間接着が開始するまで３６．５℃以上３８．０℃未満の温度で細胞を培養し、細胞間接着が開始した後、細胞間接着が開始するまでより高い温度、例えば、３７．５℃以上であり、４２．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。継代後、細胞間接着が開始する前から、３７．５℃以上であり、４２．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。
　リプログラミング因子を導入された細胞は、閉鎖された培養器内で培養され、継代されてもよい。閉鎖された培養器は、例えば、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしない。また、リプログラミング因子を導入された細胞を二次元培養で拡大培養してもよいし、三次元培養で拡大培養してもよい。
　リプログラミング因子を導入された細胞が多能性幹細胞に誘導され、多能性幹細胞が樹立された後、接着培養されている細胞全体を、多能性幹細胞として凍結保存してもよい。例えば、剥離液で培養器から剥がれた細胞全体を多能性幹細胞として凍結保存してもよい。また、リプログラミング因子を導入された細胞が多能性幹細胞に誘導された後、浮遊培養されている細胞全体を、多能性幹細胞として凍結保存してもよい。
　誘導された多能性幹細胞は、ＥＳ細胞に類似する肩平なコロニーを形成し、アルカリホスファターゼを発現し得る。誘導された多能性幹細胞は、未分化細胞マー力一であるＮａｎｏｇ、ＯＣＴ４、及びＳＯＸ２等を発現し得る。誘導された多能性幹細胞は、ＴＥＲＴを発現し得る。誘導された多能性幹細胞は、テ口メラーゼ活性を示し得る。
　また、細胞が多能性幹細胞に誘導されたか否かは、サイトフローメータで、未分化であることを示す細胞表面マーカーであるＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＳＳＥＡ－１、及びＳＳＥＡ５から選択される少なくとも一つの表面マーカーが陽性であるか否かを分析することにより行ってもよい。ＴＲＡ－１－６０は、ｉＰＳ／ＥＳ細胞に特異的な抗原である。ｉＰＳ細胞はＴＲＡ－１－６０陽性画分からのみできることから、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞はｉＰＳ細胞の種と考えられる。
　細胞にオリゴデンドロサイトへの誘導因子を導入する方法は、特に限定されない。誘導因子は、例えば、エレクトロポレーション法により細胞に導入される。あるいは、誘導因子は、例えば、リポフェクション法により細胞に導入される。また、あるいは、細胞には、例えば、ウイルスベクターを用いて誘導因子を導入する。誘導因子は、インテグレーションフリーで細胞に導入されてもよい。
　オリゴデンドロサイトへの誘導因子を導入される細胞は、接着培養されていてもよいし、浮遊培養されていてもよい。
　オリゴデンドロサイトへの誘導因子を導入される体細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ｎｉｐｐｉ）、ファイブロネクチン、及びビトロチン等の基底膜マトリックスを用いて、フィーダーフリーで培養されていてもよい。
　オリゴデンドロサイトへの誘導因子を導入される細胞が培養される培地としては、例えば、Ｓｔｅｍ　ｆｉｔ　（味の素）、ｍＴｅＳＲ　（Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等の幹細胞培地を使用可能である。
　誘導因子を導入された細胞を浮遊培養あるいは三次元培養する場合、例えば、ゲル培地が使用される。ゲル培地は、例えば、幹細胞培地にジェランガムを添加することにより調製される。
　ゲル培地は、ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
　あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。
　ゲル培地は、例えば、ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）等の成長因子を含んでいてもよいし、含まなくともよい。あるいは、ゲル培地は、ｂＦＧＦ等の成長因子を、４００μｇ／Ｌ以下、４０μｇ／Ｌ以下、あるいは１０μｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでいてもよい。
　また、ゲル培地は、ＴＧＦ－βを含んでいてもよいし、含まないか、ＴＧＦ－βを６００μｇ／Ｌ以下、３００μｇ／Ｌ以下、あるいは１００μｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでいてもよい。
　ゲル培地は、撹拌されなくともよい。また、ゲル培地は、フィーダー細胞を含まなくともよい。
　ゲル培地は、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでいてもよい。
　実施形態に係るオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法によれば、細胞に誘導因子を導入してから、例えば、３０日以内、２０日以内、１０日以内、あるいは７日以内に、細胞をオリゴデンドロサイトに誘導することが可能である。オリゴデンドロサイトの前駆細胞のような未成熟なオリゴデンドロサイト及び成熟なオリゴデンドロサイトは、Ｏ４、ＰＬＰ（Ｍｙｅｌｉｎ　Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｉｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）１から選択される少なくとも１つを発現する。成熟したオリゴデンドロサイトは、ＭＯＧ（Ｍｙｅｌｉｎ　Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びＰＤＧＦＲα（血小板由来増殖因子受容体α）を発現する。
　（実施例１、実施例２）
　ラミニン５１１をコートしたディッシュを、多能性幹細胞誘導用のディッシュとした。また、ヒト末梢血単核球細胞を血液培地に懸濁し、血球計算版を用いて単核球細胞の数を測定して、血液培地における単核球細胞数を調整した。その後、単核球細胞を、３７℃で１日間から７日間、多能性幹細胞誘導用のディッシュ上で二次元培養した。
　二次元培養されている単核球細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３４℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。途中から、温度を３７℃、３８℃に段階的に上げた。
　インフェクションから８日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。インフェクションから１４日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で１分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。実施例１では、１回目の継代の際、ウェルプレートから全ての細胞を剥離させ、剥離して混じり合った細胞を、区別なく次のウェルプレートに播種した。これに対し、実施例２では、１回目の継代の際、コロニーピックして、クローニングした。なお、実施例１及び実施例２ともに、継代の際、１１個以上の細胞同士が接触しないよう、細胞を播種した。
　次に、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。細胞が分裂し始めてから、培養温度を３８℃に上げた。その後、実施例１及び実施例２ともに、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際も、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。
　図１に示すように、抗センダイウイルス抗体を用いて継代を１回のみ行った細胞を染色し、実施例１に係る細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、細胞内のセンダイウイルスは消滅していた。図２に示すように、ＰＣＲによっても、実施例１に係る細胞に残存するセンダイウイルスは検出されたなかった。従来のように、１１個以上の細胞同士が接着する高い濃度で細胞を播種した場合は、細胞にセンダイウイルスが残存していた。得らえたＴＲＡ１－６０陽性細胞の免疫染色写真を図３に示す。
　また、細胞内のセンダイウイルスが消滅してから５日後に形成されたコロニー数を数えた。さらに、コロニー数を播種した細胞数で割り、クローナルエフィシエンシーを算出した。３回試験した結果を図４に示す。培地にｍＴｅＳＲ　Ｐｌｕｓを用いて１回目の継代時に全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代した場合、クローナルエフィシエンシーは約５％から約８％であり、ばらつきが小さかった。培地にｍＴｅＳＲ　Ｐｌｕｓを用いて１回目の継代の際にコロニーピックしてクローニングした場合、クローナルエフィシエンシーは１％未満になるときと、約６％になるときがあり、クローナルエフィシエンシーにばらつきがあった。培地にＳｔｅｍＦｉｔを用いて１回目の継代時に全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代した場合、クローナルエフィシエンシーは約１０％から約１５％であり、ばらつきが小さかった。培地にＳｔｅｍＦｉｔを用いて１回目の継代の際にコロニーピックしてクローニングした場合、クローナルエフィシエンシーは１％未満になるときと、約１６％になるときがあり、クローナルエフィシエンシーにばらつきがあった。
　したがって、１回目の継代時にリプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することにより、クローナルエフィシエンシーが高くなり、かつ安定することが示された。
　（実施例３）
　可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされたウェルディッシュを用意し、各ウェルに１０ｎｍｏｌ／ｍＬの濃度でＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含むフィーダーフリー培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた。
　ヒトｉＰＳ細胞を組織・培養細胞の剥離／分離／分散溶液（Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分散させ、ウェルディッシュに播種した。その後、ｉＰＳ細胞を、フィーダーフリー培地中で、５％二酸化炭素濃度及び２０％酸素濃度の気体条件下で、２４時間培養した。
　剥離剤を用いてｉＰＳ細胞をウェルから剥がし、シングルセルの懸濁液を調製した。次に、Ｈｕｍａｎ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（登録商標、ＬＯＮＺＡ）及びエピソーマルプラスミドを用いて、エレクトロポレーションにより、誘導因子として、ＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＡＳＣＬ１、ＮＫＸ２．２をｉＰＳ細胞に導入した。その後、誘導因子を導入された細胞を、ウェルディッシュに播種し、ｍＴｅＳＲで培養した。
　細胞に誘導因子を導入して３日目に、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。オリゴデンドロサイト用培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２（１Ｘ）、Ｂ２７（１Ｘ）、ペニシリン－ストレプトマイシン（１Ｘ）、ＮＥＡＡ（１Ｘ）、インシュリン（２５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、ＰＤＧＦ－ＡＡ（１０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ＩＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ＮＴ３（１ｎｇ／ｍＬ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、ビオチン（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、及びｃＡＭＰ（１μｍｏｌ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ）より調製した。さらに５日目にも、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。７日目に、ウェル中の培地を全て新鮮なオリゴデンドロサイト用培地に交換した。その後、ヒト線維芽細胞又はヒトグリア細胞の上に誘導因子を導入された細胞を播種し、２１日目まで誘導因子を導入された細胞を培養した。誘導因子を導入されてから７日目の細胞を、抗Ｏ４抗体を用いて染色した。また、誘導因子を導入されてから２１日目の細胞を、抗Ｏ４抗体、抗ＰＬＰ１抗体、及び抗ＭＯＧ抗体のそれぞれを用いて染色した。
　図５に示すように、誘導因子を導入されてから７日目の細胞は、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞のマーカーであるＯ４を発現していた。また、図６に示すように、誘導因子を導入されてから２１日目の細胞は、Ｏ４、ＰＬＰ１、及びＭＯＧを発現していた。なお、誘導因子を導入されるｉＰＳ細胞が、実施例１で作製したｉＰＳ細胞であっても、実施例２で作製したｉＰＳ細胞であっても、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞のマーカーの発現は確認された。
　（実施例４）
　誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＡＳＣＬ１、ＮＫＸ６．１を用いた以外は、実施例３と同様に、ｉＰＳ細胞に誘導因子を導入した。図７に示すように、誘導因子を導入された細胞は、Ｏ４を発現していた。
　（実施例５）
　誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＡＳＣＬ１を用いた以外は、実施例３と同様に、ｉＰＳ細胞に誘導因子を導入した。図８（ａ）に示すように、誘導因子を導入された細胞は、Ｏ４を発現していた。
　（実施例６）
　誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０を用いた以外は、実施例３と同様に、ｉＰＳ細胞に誘導因子を導入した。図８（ｂ）に示すように、誘導因子を導入された細胞は、Ｏ４を発現していた。
　（実施例７）
　誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＡＳＣＬ１を用いた以外は、実施例３と同様に、ｉＰＳ細胞に誘導因子を導入した。図８（ｃ）に示すように、誘導因子を導入された細胞は、Ｏ４を発現していた。
　（実施例８）
　誘導因子としてＯＬＩＧ２を用いた以外は、実施例３と同様に、ｉＰＳ細胞に誘導因子を導入した。図８（ｄ）に示すように、誘導因子を導入された細胞は、Ｏ４を発現していた。
　（実施例９）
　誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＮＫＸ２．２を用いた以外は、実施例３と同様に、ｉＰＳ細胞に誘導因子を導入した。図８（ｅ）に示すように、誘導因子を導入された細胞は、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞のマーカーであるＯ４を発現していた。
　（実施例１０）
　可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされたウェルディッシュを用意し、各ウェルに培地を入れた。さらに、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ）で分離したヒト成人末梢血由来単核球を、ウェルディッシュに播種した。その後、単核球を、３７℃で１日間から７日間、血液培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ、登録商標、ＳＦＥＭ　ＩＩ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）で培養した。培地は、２０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３、１０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、１０ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦを含んでいた。５％二酸化炭素濃度及び２０％酸素濃度の気体条件下で、ディッシュ上で培養した。
　単核球をウェルから回収し、シングルセルの懸濁液を調製した。次に、ＣＤ３４＋細胞用Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（登録商標、ＬＯＮＺＡ）及びエピソーマルプラスミドを用いて、エレクトロポレーションにより、誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＡＳＣＬ１、ＮＫＸ２．２を単核球に導入した。その後、誘導因子を導入された細胞を、ウェルディッシュに播種し、血液培地で培養した。
　細胞に誘導因子を導入して３日目に、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。さらに５日目にも、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。７日目に、ウェル中の培地を全て新鮮なオリゴデンドロサイト用培地に交換した。その後、ヒト線維芽細胞の上に誘導因子を導入された細胞を播種し、２８日目まで誘導因子を導入された細胞を培養した。誘導因子を導入されてから２８日目の細胞を、抗Ｏ４抗体、抗ＰＬＰ１抗体、及び抗ＭＯＧ抗体のそれぞれを用いて染色した。図９に示すように、誘導因子を導入されてから２８日目の細胞は、Ｏ４、ＰＬＰ１、及びＭＯＧを発現していた。
　（実施例１１）
　可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされたウェルディッシュを用意し、各ウェルに培地（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）を入れた。さらに、ヒト新生児線維芽細胞を、ウェルディッシュに播種した。その後、線維芽細胞を、３７℃で１日間から７日間、５％二酸化炭素濃度及び２０％酸素濃度の気体条件下で、ディッシュ上で培養した。
　剥離剤を用いて線維芽細胞をウェルから剥がし、シングルセルの懸濁液を調製した。次に、Ｈｕｍａｎ　Ｄｅｒｍａｌ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（登録商標、ＬＯＮＺＡ）及びエピソーマルプラスミドを用いて、エレクトロポレーションにより、誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＡＳＣＬ１、ＮＫＸ２．２を線維芽細胞に導入した。その後、誘導因子を導入された細胞を、ウェルディッシュに播種し、１０％ＦＢＳ　ＤＭＥＭ培地で培養した。
　細胞に誘導因子を導入して３日目に、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。さらに５日目にも、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。７日目に、ウェル中の培地を全て新鮮なオリゴデンドロサイト用培地に交換した。その後、ヒト線維芽細胞の上に誘導因子を導入された細胞を播種し、２８日目まで誘導因子を導入された細胞を培養した。誘導因子を導入されてから２８日目の細胞を、抗Ｏ４抗体、抗ＰＬＰ１抗体、及び抗ＭＯＧ抗体のそれぞれを用いて染色した。図１０に示すように、誘導因子を導入されてから２８日目の細胞は、Ｏ４、ＰＬＰ１、及びＭＯＧを発現していた。
　（実施例１２）
　可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされたウェルディッシュを用意し、各ウェルに培地を入れた。さらに、ヒト成人末梢血由来Ｔ細胞を、ウェルディッシュに播種した。その後、Ｔ細胞を、３７℃で１日間から７日間、５％二酸化炭素濃度及び２０％酸素濃度の気体条件下で、ディッシュ上で拡大培養した。なお、拡大培養は、必ずしもしなくともよい。３０Ｕ／ｍＬのインターロイキン２及びヒトＴ細胞増殖刺激用ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｓ　ＣＤ３／ＣＤ２８、ＢＤ）を添加した培地無血清培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１０、Ｌｏｎｚａ）を用いた。
　Ｔ細胞をウェルから回収し、シングルセルの懸濁液を調製した。次に、Ｔｃｅｌｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎキット（登録商標、ＬＯＮＺＡ）及びエピソーマルプラスミドを用いて、エレクトロポレーションにより、誘導因子としてＯＬＩＧ２、ＳＯＸ１０、ＡＳＣＬ１、ＮＫＸ２．２を単核球に導入した。その後、誘導因子を導入された細胞を、ウェルディッシュに播種し、３０Ｕ／ｍＬのインターロイキン２及びヒトＴ細胞増殖刺激用ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｓ　ＣＤ３／ＣＤ２８、ＢＤ）を添加した無血清培地（Ｘ－ＶＩＶＯ１０、Ｌｏｎｚａ）で培養した。
　細胞に誘導因子を導入して３日目に、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。さらに５日目にも、ウェルにオリゴデンドロサイト用培地を追加した。７日目に、ウェル中の培地を全て新鮮なオリゴデンドロサイト用培地に交換した。その後、ヒト線維芽細胞の上に誘導因子を導入された細胞を播種し、２８日目まで誘導因子を導入された細胞を培養した。誘導因子を導入されてから２８日目の細胞を、抗Ｏ４抗体、抗ＰＬＰ１抗体、及び抗ＭＯＧ抗体のそれぞれを用いて染色した。図１１に示すように、誘導因子を導入されてから２８日目の細胞は、Ｏ４、ＰＬＰ１、及びＭＯＧを発現していた。
　（実施例１３）
　誘導因子にｐ５３ＤＤを加えた以外は、実施例３と同様に、ヒトｉＰＳ細胞からオリゴデンドロサイトを誘導した。結果を図１２に示す。ｐ５３ＤＤを加えると、Ｏ４陽性を示す細胞の割合が上昇した。
　（実施例１４）
　誘導因子にＲＢ遺伝子のｓｈＲＮＡを加えた以外は、実施例３と同様に、ヒトｉＰＳ細胞からオリゴデンドロサイトを誘導した。結果を図１２に示す。Ｒｂ　Ｓｈを加えると、Ｏ４陽性を示す細胞の割合が上昇した。
　（実施例１５）
　誘導因子にｃ－ＭＹＣを加えた以外は、実施例３と同様に、ヒトｉＰＳ細胞からオリゴデンドロサイトを誘導した。結果を図１２に示す。ｃ－ＭＹＣを加えると、Ｏ４陽性を示す細胞の割合が上昇した。
　（実施例１６）
　誘導因子にｐ５３ＤＤを加えた以外は、実施例１０と同様に、ヒト成人末梢血由来単核球からオリゴデンドロサイトを誘導した。結果を図１２に示す。ｐ５３ＤＤを加えると、Ｏ４陽性を示す細胞の割合が上昇した。
　（実施例１７）
　誘導因子にＲＢ　Ｓｈを加えた以外は、実施例１０と同様に、ヒト成人末梢血由来単核球からオリゴデンドロサイトを誘導した。結果を図１２に示す。Ｒｂ　Ｓｈを加えると、Ｏ４陽性を示す細胞の割合が上昇した。
　（実施例１８）
　誘導因子にｃ－ＭＹＣを加えた以外は、実施例１０と同様に、ヒト成人末梢血由来単核球からオリゴデンドロサイトを誘導した。結果を図１２に示す。ｃ－ＭＹＣを加えると、Ｏ４陽性を示す細胞の割合が上昇した。

Claims (29)

  1. 　ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞にＯＬＩＧ及びＳＯＸの組み合わせ、又はＯＬＩＧ及びＮＫＸの組み合わせを含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  2. 　前記誘導因子がＯＬＩＧ、ＮＫＸ、及びＳＯＸを含む、請求項１に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  3. 　前記誘導因子がＡＳＣＬをさらに含む、請求項１又は２に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  4. 　前記誘導因子が、細胞増殖を促進する因子をさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  5. 　ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞にＯＬＩＧ及び細胞増殖を促進する因子を含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  6. 　前記誘導因子がＳＯＸ、ＡＳＣＬ、及びＮＫＸからなる群から選択される少なくともいずれかを含む、請求項５に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  7. 　リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングせずにｉＰＳ細胞を作製することと、
    　前記ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、
    　を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  8. 　リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングせずに播種し、ｉＰＳ細胞を作製することと、
    　前記ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、
    　を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  9. 　リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から剥離し、剥離した細胞の少なくとも一部を混合して播種し、ｉＰＳ細胞を作製することと、
    　前記ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、
    　を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  10. 　リプログラミング因子を導入された細胞を培養器から回収し、回収した細胞の少なくとも一部を混合して播種し、ｉＰＳ細胞を作製することと、
    　前記ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、
    　を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  11. 　リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーのそれぞれをピックアップせずにｉＰＳ細胞を作製することと、
    　前記ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、
    　を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  12. 　リプログラミング因子を導入された細胞であって、異なるシングルセル由来の細胞同士混合して播種してｉＰＳ細胞を作製することと、
    　前記ｉＰＳ細胞にＯＬＩＧを含む誘導因子を導入することと、
    　を含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  13. 　前記播種することにおいて、前記リプログラミング因子を導入された細胞同士を混合する、請求項９、１０、及び１２のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  14. 　前記播種することにおいて、前記リプログラミング因子を導入された細胞のクローン同士を混合する、請求項９、１０、１２、及び１３のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  15. 　前記リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに分離することを含まない、請求項７から１４のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  16. 　前記播種することにおいて、前記リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに混合する、請求項９、１０、１２、１３、及び１４のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  17. 　前記リプログラミング因子を導入された細胞が形成する単一のコロニーをクローニングすることを含まない、請求項７から１６のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  18. 　前記リプログラミング因子を導入された細胞であって、培養器に付着している細胞を回収し、回収した細胞の少なくとも一部を培地に播種する、請求項７から１７のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  19. 　前記リプログラミング因子を導入された細胞を遺伝子発現状態で区別することなく播種する、請求項７から１８のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  20. 　前記リプログラミング因子を導入された細胞をリプログラミングの程度で区別することなく播種する、請求項７から１９のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  21. 　前記誘導因子がＳＯＸ、ＡＳＣＬ、及びＮＫＸからなる群から選択される少なくともいずれかを含む、請求項７から２０のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  22. 　体細胞にＯＬＩＧ、ＳＯＸ、ＡＳＣＬ、ＮＫＸを含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  23. 　前記誘導因子が、細胞増殖を促進する因子をさらに含む、請求項２２に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  24. 　体細胞にＯＬＩＧ及び細胞増殖を促進する因子を含む誘導因子を導入することを含む、オリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  25. 　前記誘導因子がＳＯＸ、ＡＳＣＬ、及びＮＫＸからなる群から選択される少なくともいずれかを含む、請求項２４に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  26. 　前記体細胞がｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞でない、請求項２２から２５のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  27. 　前記体細胞が血液細胞である、請求項２２から２６のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  28. 　前記体細胞が単核球である、請求項２２から２６のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
  29. 　前記体細胞が線維芽細胞である、請求項２２から２６のいずれか１項に記載のオリゴデンドロサイト及びその前駆細胞の作製方法。
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