WO2021149824A1 - 人工多能性幹細胞の作製方法 - Google Patents

人工多能性幹細胞の作製方法 Download PDF

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WO2021149824A1
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剛士 田邊
健太 須藤
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アイ ピース， インコーポレイテッド
剛士 田邊
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    • C12N2533/50—Proteins
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Definitions

  • the present invention relates to cell technology and relates to a method for producing induced pluripotent stem cells.
  • Induced pluripotent stem (iPS) cells are cells that have two characteristic abilities. One is the ability to transform into all the cells that make up the body. The other is that it has a semi-permanent proliferative ability. Since iPS cells have these two abilities, they can be applied to transplantation therapy without rejection by producing iPS cells from their own somatic cells and converting them into target somatic cells. Therefore, iPS cells are considered to be a promising technology for regenerative medicine.
  • Typical methods for producing iPS cells include a method using a retrovirus / lentivirus and a method using an episomal vector.
  • Somatic cells can be infected with retroviruses and lentiviruses to introduce genes encoding reprogramming factors into the cells.
  • retroviruses and lentiviruses can insert reprogramming factors into the genome of somatic cells, inducing stable intracellular expression of reprogramming factors.
  • the method using retrovirus / lentivirus has the following problems.
  • the insertion of reprogramming factors into the genome of somatic cells damages existing genes and promoters and can cause canceration of the cells.
  • the reprogramming factor inserted into the genome may reactivate after transforming iPS cells into somatic cells. Therefore, cells for transplantation derived from iPS cells have a risk of canceration.
  • reactivation of the introduced reprogramming factor is observed in somatic cells, and it has been confirmed that it becomes cancerous (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • the episomal vector is circular DNA and self-amplifies in the nucleus (see, for example, Patent Document 1). It has been thought that episomal vectors are not integrated into the genome in principle, but recent studies have shown that fragments of episomal vectors are scattered on the genome of iPS cells prepared using episomal vectors. It is reported that it will be inserted. Therefore, there is a problem that the reprogramming gene can remain in the cell. For example, if C-MYC or KLF4 remains in cells, it causes canceration. It costs a lot of money to test whether a reprogramming gene remains in a cell. It is not possible to show that all cells in the transplanted cell pool have no insertion of the episomal plasmid into the genome and no residue.
  • Non-Patent Document 2 a method for producing iPS cells using RNA has been proposed (see, for example, Non-Patent Document 2). .).
  • One of the objects of the present invention is to provide an efficient method for producing induced pluripotent stem cells without being limited to a method for introducing a reprogramming factor.
  • the RNA comprises RNA encoding a reprogramming factor, in which the double-stranded RNA is substantially.
  • a method for producing induced pluripotent stem cells that have been removed from the cell.
  • RNA may be purified by HPLC.
  • the RNA may further contain RNA encoding a dominant negative variant of p53.
  • the RNA encoding the reprogramming factor may include at least one selected from the group consisting of OCT3 / 4 RNA, SOX2 RNA, KLF4 RNA, and C-MYC RNA. ..
  • the RNA encoding the reprogramming factor may include RNA of OCT3 / 4 and RNA of the transcriptional activation domain (TAD) of MYOD linked to RNA of OCT3 / 4.
  • TAD transcriptional activation domain
  • RNA may be introduced into cells by the lipofection method.
  • cells may be adhered to the substrate by introduction.
  • the substrate may be coated with a substrate capable of culturing induced pluripotent stem cells.
  • the cell may be a fibroblast.
  • the cell may be a blood cell.
  • the blood cells do not have to be expanded-cultured endothelial progenitor cells.
  • blood cells may be expanded and cultured in a blood cell medium for 10 days or less before RNA is introduced.
  • the blood cell may be at least one selected from the group consisting of mononuclear cells, T cells, B cells, monocytes, macrophages, blood stem cells, dendritic cells, and granulocytes. ..
  • the blood cells may be derived from peripheral blood or umbilical cord blood.
  • the blood cells may be derived from adult blood.
  • the above method may further include culturing RNA-introduced blood cells in a blood cell medium and then culturing in a stem cell induction medium.
  • the cells may be cells contained in urine.
  • the cell may be a bladder epithelial cell.
  • the above method may further include collecting cells into which RNA is introduced from urine.
  • the cells may be of human origin.
  • the cells may be derived from primate animals other than humans.
  • FIG. 6 is a dot plot by a flow cytometer showing the results of Example 1. It is a photograph which shows the analysis result of the gene expression which concerns on Example 1. It is a photograph which shows the analysis result of the gene expression which concerns on Example 1. It is a dot plot by the flow cytometer which shows the result of the comparative example 1.
  • FIG. It is a figure which shows the result of the dot blot analysis of the RNA of p53P275S using the anti-double-stranded RNA antibody J2 in Example 2.
  • FIG. It is a graph which shows the number of iPS cell-like colonies which concerns on Example 2.
  • FIG. It is a micrograph which shows the result of Example 3. 6 is a dot plot by a flow cytometer showing the results of Example 3. It is a micrograph which shows the result of the comparative example 2. It is a graph which shows the result of Example 4. It is a graph which shows the gene expression which concerns on Example 5. It is a micrograph which shows the result of Example 6. It is a micrograph which shows the result of Example 6. 6 is a dot plot by a flow cytometer showing the results of Example 6. It is a micrograph which shows the result of Example 7. It is a micrograph which shows the result of Example 7. 6 is a dot plot by a flow cytometer showing the results of Example 7.
  • FIG. 5 is a photograph of urine-derived cells into which a reprogramming factor has been introduced according to Example 10.
  • FIG. 5 is a photograph of urine-derived cells into which a reprogramming factor has been introduced according to Example 11. It is a dot plot by a flow cytometer which concerns on Example 12.
  • FIG. 3 is a photograph of urine-derived cells into which a reprogramming factor has been introduced according to Example 13.
  • FIG. 3 is a photograph of urine-derived cells into which a reprogramming factor has been introduced according to Example 13.
  • the method for producing induced pluripotent stem cells (iPS cells) includes preparing cells and introducing RNA into the cells.
  • RNA introduced into cells may include RNA encoding a reprogramming factor and RNA encoding a dominant negative variant of p53.
  • the RNA introduced into the cell is, for example, a single-strand RNA, and the double-stranded RNA is substantially removed. Further, it is preferable that the RNA introduced into the cell is substantially free of impurities such as short RNA and impurities.
  • the single-stranded RNA introduced into the cell may be purified and / or concentrated in order to substantially remove the double-stranded RNA. Examples of the method for purifying the single-stranded RNA to be introduced into cells include a purification method using high performance liquid chromatography (HPLC). For example, HPLC removes 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, or 90% or more of double-stranded RNA.
  • the RNA introduced into the cell may be treated with a ribonuclease that degrades the double-stranded RNA in order to substantially remove the double-stranded RNA.
  • the RNA introduced into the cell is, for example, mRNA.
  • P53 is a cancer-suppressing protein.
  • the dominant negative variant of p53 is not particularly limited as long as it can compete with the wild-type p53 protein endogenous to somatic cells and inhibit the function of the wild-type p53 protein.
  • Examples of dominant negative variants of p53 are p53P275S, which is a point mutation of proline at position 275 (position 278 in the case of humans) located in the DNA binding region of mouse p53 to serine, and position 14-301 (human) of mouse p53.
  • p53DD lacking the amino acid at positions 11-304, p53S58A in which serine at position 58 (61 in the case of humans) of mouse p53 was point-mutated to alanine, and position 135 of human p53 (mouse).
  • p53A135V point-mutated alanine at position 135 (138 in the case of humans) of mouse p53 to valine
  • position 172 in the case of humans
  • the RNA introduced into the cell may further include RNA in the transcriptional activation domain (TAD) of MYOD that is directly linked to the full length of OCT3 / 4 RNA.
  • TAD transcriptional activation domain
  • the above RNA may be introduced into cells by the lipofection method. By using the above RNA, it is possible to reduce the dead cell rate in the process of lipofection and improve the induction efficiency. Alternatively, the above RNA may be added to the medium and the above RNA may be naturally taken up by the cells.
  • Inducing cells to iPS cells may be referred to as cell reprogramming or cell reprogramming.
  • the genetic symbols are described in humans, but are not intended to limit species by uppercase or lowercase notation. For example, capitalization of all letters does not exclude the inclusion of mouse or rat genes. However, in the examples, the gene symbols are shown according to the species actually used.
  • RNA into which RNA is introduced examples include somatic cells such as blood cells, fibroblasts, dental pulp stem cells, keratinocytes, dermal papilla cells, oral epithelial cells, and somatic stem precursor cells.
  • the cell into which RNA is introduced may be a cell contained in urine. Examples of cells contained in urine include bladder epithelial cells.
  • the cells may be of human origin or of non-human animal origin.
  • Non-human animals may be non-human primates. Examples of non-human primates include non-human primates such as chimpanzees, bonobos, gorillas, orangutans, gibbons, old world monkeys, new world monkeys, and proto-monkeys.
  • Blood cells are separated from the blood.
  • Blood is, for example, peripheral blood and umbilical cord blood, but is not limited thereto. Blood may be collected from an adult or a minor.
  • an anticoagulant such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), heparin, and biopharmacy standard blood preservation solution A (ACD-A) is used.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • ACD-A biopharmacy standard blood preservation solution A
  • Blood cells include, for example, monocytes including monocytes and lymphocytes, macrophages, blood stem cells, dendritic cells, granulocytes, neutrophils, eosinophils, and basophils. Is. Blood cells may be, for example, T cells and B cells. T cells are, for example, ⁇ T cells.
  • the blood cells do not have to contain expanded cultured endothelial progenitor cells (EPC), erythrocytes, and platelets. Alternatively, the blood cells expand in the blood cell medium for 10 days or less, 7 days or less, 5 days or less, 4 days or less, 3 days or less, 2 days or less, or 1 day or less before RNA is introduced. It may be cultured.
  • Mononuclear cells are separated from blood using a blood cell separation medium, a centrifuge, and the like.
  • a blood cell separation medium a centrifuge, and the like.
  • Ficoll GE Healthcare
  • the method for separating mononuclear cells is as follows.
  • the centrifuge To 5 mL of blood, add 5 mL of PBS to dilute, and layer 5 mL each on a medium for human lymphocyte separation in a tube. At this time, diluted blood is slowly added onto the medium along the tube wall of the tube so as not to disturb the interface.
  • the method for separating mononuclear cells when using vacutainer (registered trademark, BD) as a blood collection tube is as follows.
  • the centrifuge 4 ° C to 42 ° C, preferably 18 ° C.
  • 4 ° C to 42 ° C preferably 18 ° C.
  • 8 mL of blood is collected using a blood collection tube (vacutainer (registered trademark), BD), mixed by inversion, and mixed with an anticoagulant.
  • the balance is then adjusted and the solution is adjusted at 4 ° C to 42 ° C, preferably 18 ° C, 100 ⁇ g to 3000 ⁇ g, preferably 1500 ⁇ g to 1800 ⁇ g with a swing rotor for 1 to 60 minutes, preferably 20 minutes.
  • Centrifuge After centrifugation, the upper layer, which is the plasma layer, is removed and pipetting is performed to suspend the mononuclear cell layer and blood cells attached to the gel to obtain a suspension. Transfer the resulting suspension to another 15 mL tube.
  • 1 mL to 14 mL, preferably 12 mL of PBS is added to the suspension in a 15 mL tube, and the suspension is prepared at 4 ° C to 42 ° C, preferably 18 ° C, 100 ⁇ g to 3000 ⁇ g, preferably 200 ⁇ g.
  • a hemolytic agent PharmLyse (registered trademark), 10-fold concentration, BD
  • BD sterile water
  • CTL-UP1 sold by Cellular Technology Limited
  • PBMC-001 of Sanguine Biosciences, or the like may be used as the mononuclear cell.
  • the cryopreserved blood cells may be thawed and used using a cell cryopreservation solution such as Cerbunker 1, Stem Cerbunker GMP grade, and Stem Cerbunker DMSO-free GMP grade (Zenoac).
  • a cell cryopreservation solution such as Cerbunker 1, Stem Cerbunker GMP grade, and Stem Cerbunker DMSO-free GMP grade (Zenoac).
  • thawing mononuclear cells When thawing mononuclear cells, first, 1 mL to 15 mL, preferably 8 mL of a serum-free hematopoietic cell medium (X-VIVO® 10, Ronza) having a known composition was placed in a 15 mL tube and frozen. Place the tube containing the mononuclear cells in a warm bath at 4 ° C to 42 ° C, preferably 37 ° C to begin thawing the mononuclear cells. Then, with a little ice remaining, the tube containing the mononuclear cells is pulled out of the warm bath and the mononuclear cells are transferred to the tube containing the serum-free hematopoietic cell medium of known composition. Of these, 10 ⁇ L of mononuclear cell suspension is stained with trypan blue and counted on a hemocytometer.
  • X-VIVO® 10 serum-free hematopoietic cell medium
  • Blood cells may be isolated based on cell surface markers.
  • the T cells are positive for any of CD3, CD4, and CD8.
  • B cells are positive for any of CD10, CD19, and CD20.
  • Macrophages are positive for any of CD11b, CD68, and CD163.
  • the monocytes are positive for any of CD14, CD16, and CD64.
  • T cells and B cells are separated from blood cells using, for example, an automatic magnetic cell separator and immunomagnetic beads. Alternatively, pre-separated mononuclear cells may be prepared. However, blood cells that have not been separated based on cell surface markers may be used.
  • the cells into which RNA is introduced can be a PS cell matrix such as Matrigel (Corning), CELLstart (registered trademark, ThermoFisher SCIENTIFIC), vitronectin, or Laminin 511 (iMatrix-511MG or iMatrix-511 silk, nippi) PS cell culture. Feeder-free adhesion culture is performed on the substrate coated with the substrate. Laminin can be used as the preferred substrate.
  • the somatic cells into which RNA is introduced are first cultured in a medium suitable for the type of somatic cells or differentiated cells, which is not a stem cell medium.
  • a medium suitable for the type of somatic cells or differentiated cells which is not a stem cell medium.
  • the cell is a blood cell
  • the cell is StemSpan (registered trademark) H3000 (STEMCELL TECHNOLOGIES), Human Blood Cell Culture Medium Kit (Cell Applications), X-VIVO (registered trademark) 10 (Lonza), S.
  • ACF Serum-free Hematopoietic Cell Medium (Lonza), X-Vivo10 Serum-free Hematopoietic Cell Medium (Lonza), Hematopoietic Progenitor Expansion Medium DXF (Promocell), Hematopoietic Progenitor Medium (Promocell), MethoCell H4434 Classic (registered trademark, STEMCELL TECHNOLOGIES), StemPro-34 SFM (1X) (registered trademark, Thermo Fisher SCIENTIFIC), StemMACS HSC Exhibition SFEM (STEMCELL TECHNOLOGIES), StemSpan (TM) SFEM II (STEMCELL TECHNOLOGIES), CellXVivo Human M1 Macrophage Differentiation Kit (R & D SYSTEMS), and Stemline (TM) II Hematopoietic Stem cell Expansion Medium (SIGMA-AlDRICH)
  • RNA introduced into cells is pseudouridine ( ⁇ ), 5-methyluridine (5meU), N1-methylpseudouridine (me1 ⁇ ), 5-methoxyuridine (5moU), 5-hydroxymethyluridine (5hmU), 5-four.
  • RNA in which the uridine nucleoside is replaced with psoid uridine tends to be translated at a higher level and for a longer period of time than RNA in which the uridine nucleoside is not replaced with psoid uridine.
  • RNA introduced into cells may be purified by treatment with RNase III.
  • RNase III is, for example, derived from Escherichia coli. RNase III digests, for example, double-stranded RNA larger than about 12 base pairs.
  • RNA introduced into cells may be polyadenylated.
  • RNA may be prepared by polyadenylation of (IVT) RNA transcribed in vitro. Polyadenylation involves contacting IVT RNA with, for example, a poly (A) polymerase (eg, yeast RNA polymerase or E. coli poly (A) polymerase).
  • a poly (A) polymerase eg, yeast RNA polymerase or E. coli poly (A) polymerase
  • RNA may be polyadenylated during transcription in vitro by using a DNA template encoding the poly (A) end.
  • the RNA is at the poly A terminal (eg, from 50 to 200 nucleotides, eg, preferably from 100). It may contain 200, 150 to 200 nucleotides, or a poly A terminal having more than 150 nucleotides).
  • RNA introduced into cells may be capped. To improve the efficiency of expression in cells, for example, 80% or more RNA molecules contain caps.
  • RNA introduced into a cell is synthesized in vitro by incubating an uncapped primary RNA in the presence of a capping enzyme.
  • the primary RNA used in the capping enzyme reaction is synthesized by in vitro transcription (IVT) of the DNA molecule encoding the RNA to be synthesized.
  • the DNA encoding the RNA to be synthesized contains an RNA polymerase promoter to which the RNA polymerase binds and transcription begins from there.
  • RNA introduced into cells may have a 5'cap [m7G (5') ppp (5') G] structure.
  • the sequence is a sequence that stabilizes RNA and promotes transcription. 5'triphosphate may be removed from RNA having 5'triphosphate by dephosphorylation treatment.
  • the RNA introduced into the cell may have [3'O-Me-m7G (5') ppp (5') G] as Anti-Reverse Cap Analog (ARCA).
  • ARCA is a sequence inserted before the transcription start point, which improves the transcription efficiency of RNA.
  • RNA is introduced into cells by, for example, the lipofection method.
  • the lipofection method is a method in which a complex of a negatively charged nucleic acid and a positively charged lipid is formed by electrical interaction, and the complex is incorporated into the cell by endocytosis or membrane fusion. ..
  • the lipofection method has advantages such as less damage to cells, excellent introduction efficiency, easy operation, and less time.
  • RNA is introduced into cells cultured using, for example, RNA transfection reagents.
  • RNA transfection reagents for example, if the cell is a mononuclear cell, RNA may be introduced into the mononuclear cell immediately after the mononuclear cell is separated from the blood.
  • RNA transfection reagent Lipofectamine Messenger MAX (registered trademark, Thermo Fisher SCIENTIFIC) can be used.
  • RNAiMAX Thermo Fisher SCIENTIFIC
  • Lipofectamine StemTransfection Reagent Thermo Fisher SCIENTIFIC
  • Transfection ReproCELL
  • Jet Messenger Jet Messenger
  • Lipofectamin registered trademark 2000
  • Lipofectamin registered trademark 3000
  • NeonTransfection System Thermo Transfection SpeciteReagent (Thermo Transfection) Reagent
  • Amaxa registered product
  • Human T cell Nucleector (registered product) kit Lionza, VAPA-1002
  • Amaxa Human CD34 cell Nucleector (registered product) kit (Lonza, VAPA-1003
  • Re A lipofection reagent such as
  • the number of cells during RNA lipofection is, for example, 1 or more, 1 ⁇ 10 1 or more, 1 ⁇ 10 2 or more, 1 ⁇ 10 3 or more, 0.5 ⁇ 10 4 or more, 1 ⁇ 10 4 The above, or 1 ⁇ 10 5 or more.
  • the number of cells during RNA lipofection is, for example, 5 ⁇ 10 8 or less, 1 ⁇ 10 7 or less, 1 ⁇ 10 6 or less, 2 ⁇ 10 5 or less, or 0.5 ⁇ 10 4 or less. be.
  • the cells are seeded, for example, in an area of 1.0 mm 2 or greater, 1.0 ⁇ 10 2 mm 2 or greater, or 3.8 ⁇ 10 2 mm 2 or greater.
  • the cells are seeded in an area having an area of, for example, 20 ⁇ 10 3 mm 2 or less, 5, 5 ⁇ 10 3 mm 2 or less, or 2.1 ⁇ 10 3 mm 2 or less.
  • the cells into which RNA is introduced are preferably seeded in a medium or incubator at a low concentration.
  • the low concentration is, for example, 1 cell / cm 2 or more, 0.05 ⁇ 10 5 cells / cm 2 or less, 0.10 ⁇ 10 5 cells / cm 2 or less, 0.20 ⁇ 10 5 cells /.
  • cm 2 or less 0.30 ⁇ 10 5 cells / cm 2 or less, 0.40 ⁇ 10 5 cells / cm 2 or less, 0.50 ⁇ 10 5 cells / cm 2 or less, 0.60 ⁇ 10 5 cells / cm 2 below, 0.70 x 10 5 cells / cm 2 or less, 0.80 x 10 5 cells / cm 2 or less, 0.90 x 10 5 cells / cm 2 or less, 0.10 x 10 6 cells / cm 2 or less, 0.15 ⁇ 10 6 cells / cm 2 or less, 0.20 ⁇ 10 6 cells / cm 2 or less, or 0.25 ⁇ 10 6 cells / cm 2 or less.
  • low concentration means that 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, or 2 or less cells can come into contact with each other. There is a concentration at which 11 or more cells do not come into contact with each other. In addition, there may be a plurality of cell clusters in which 10 or less cells are in contact with each other.
  • the state where the entire bottom surface of the cell container is covered with cells is defined as 100% confluent, and low concentration means 6% or less confluent, 5% or less confluent, 4% or less confluent, 3% or less confluent, 2% or less confluent, 1 % Or less confluent, 0.5% or less confluent, 0.1% or less confluent, 0.05% or less confluent, or 0.01% or less confluent.
  • the low concentration is, for example, a concentration at which single cells do not come into contact with each other in the seeded cells.
  • single cells may be seeded in the wells of the well plate.
  • the well plate may be a 12-well plate or a 96-well plate.
  • the total amount of RNA at the time of lipofection per 1 mL of the culture solution is, for example, 5 ng or more, 50 ng or more, 100 ng or more, 200 ng or more, 400 ng or more, or 1 ⁇ g or more at one time. Further, the total amount of RNA at the time of lipofection per 1 mL of the culture solution is, for example, 70 ⁇ g or less, 50 ⁇ g or less, 10 ⁇ g or less, 5 ⁇ g or less, 3 ⁇ g or less, or 1 ⁇ g or less at one time.
  • the amount of RNA transfection reagent at the time of lipofection is, for example, 0.1 ⁇ L or more, 1.0 ⁇ L or more, or 5 ⁇ L or more at one time.
  • the amount of RNA transfection reagent at the time of lipofection is, for example, 500 ⁇ L or less, 100 ⁇ L or less, or 40 ⁇ L or less at one time.
  • the time for performing RNA lipofection is, for example, 0.1 hour or more, 2 hours or more, 3 hours or more, or 4 hours or more each time.
  • the time for RNA lipofection is, for example, 72 hours or less, 24 hours or less, 12 hours or less, or 6 hours or less each time.
  • RNA may be introduced into cells multiple times. RNA is introduced into cells, for example, once or more than once a day, or once every two days. RNA is introduced into cells, for example, 3 times or more, 5 times or more, 10 times or more, 20 times or more, 25 times or more, 30 times or more, or 35 times or more. Further, RNA is introduced into cells, for example, 55 times or less, 50 times or less, 45 times or less, or 40 times or less in total.
  • the cells are cultured in a medium suitable for the type of somatic cell, for example, for 1 day or more, 2 days or more, 5 days or more, or 10 days or more.
  • a medium suitable for the type of somatic cell for example, for 50 days or less, 20 days or less, 10 days or less, 7 days or less, or 3 days or less
  • the cells are in a medium suitable for the type of somatic cells. Is cultured in.
  • the blood cells are in the blood cell medium for, for example, 1 day or more, 2 days or more, 5 days or more, or 10 days or more after the RNA is first introduced into the blood cells. Be cultivated.
  • the blood cell When the cell is a blood cell, the blood cell is, for example, 50 days or less, 20 days or less, 10 days or less, 7 days or less, or 3 days or less after the RNA is first introduced into the blood cell. It is cultured in a blood cell medium.
  • Stem cell induction from a medium suitable for the type of somatic cell for example, 1 day or more, 2 days or more, 5 days or more, 10 days or more, or 20 days or more after the first introduction of RNA into somatic cells. Replace with medium.
  • the stem cell induction medium is, for example, 10% by volume or more and 30% by volume or less of serum-free supplement, 0.01% by volume or more and 10% by volume or less of albumin, 0.01% by volume or more and 10% by volume or less of insulin, 0.01% by volume. Includes% or more and 10% by volume or less of transferase.
  • a serum-free supplement for example, KnockOut Serum Replacement (registered trademark, Thermo Fisher SCIENTIFIC) can be used.
  • RNA lipofection is continued by the above method.
  • the stem cell-inducing medium does not have to contain Wnt.
  • the stem cell induction medium does not have to contain vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • the stem cell induction medium may be free of insulin-like growth factor (IGF).
  • the stem cell-inducing medium may contain agents such as B18R that alleviate the congenital antiviral response of the cells.
  • the stem cell induction medium may contain albumin.
  • the stem cell-inducing medium does not have to contain a growth factor of FGF such as bFGF and TGF such as TGF- ⁇ .
  • the stem cell induction medium may contain FGF such as bFGF at a low concentration of, for example, 4400 ng / mL or less, 100 ng / mL or less, 50 ng / mL or less, 10 ng / mL or 1 ng / mL or less.
  • FGF such as bFGF
  • the stem cell induction medium may contain TGF such as TGF- ⁇ at a low concentration of, for example, 100 ng / mL or less, 10 ng / mL or less, 5 ng / mL, or 0.5 ng / mL or less. It does not have to contain antibiotics such as penicillin and streptomycin.
  • the growth factor may be contained in the stem cell-inducing medium on or after the 5th day or the 7th day after the cells are cultured in the stem cell-inducing medium.
  • the stem cell induction medium may contain human serum or human plasma serum.
  • Stem cell induction media include, for example, ACTH (Sigma), Kenpaullone, leukemia suppressor (LIF), protein kinase C (PKC) inhibitor, PKC inhibitor Go6983, glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) inhibitor, etc.
  • CHIR99021 which is a GSK-3 inhibitor, fibroblast growth factor (FGF) inhibitor, PD0325901 which is a MAPK inhibitor, TGF- ⁇ inhibitor, SB-431542 which is a TGF- ⁇ receptor inhibitor, ROCK inhibitor, Akt activator, vitronectin, N2 supplement (Thermo Fisher SCIENTIFIC), B27 supplement (Thermo Fisher SCIENTIFIC), DMSO, FBS (Thermo Fisher SCIENTIFIC), FBS (Thermo Fisher SCIENTIFIC), ass selected from colbin pituitary extract (BPE) It may contain at least one to be made.
  • FGF fibroblast growth factor
  • Stem cell induction medium is, for example, AlbuMax (Thermo Fisher SCIENTIFIC), bovine serum albumin, human albumin, insulin, polyvinyl alcohol (PVA), platelet-derived growth factor (PDGF), lithium chloride (LiCl), ⁇ -mercaptoethanol, p38 inhibition. It may contain at least one selected from the group consisting of agents, Fenor Red, and Chemically Defined Lipid Concentrate (Thermo Fisher SCIENTIFIC).
  • AlbuMax Thermo Fisher SCIENTIFIC
  • bovine serum albumin bovine serum albumin
  • human albumin insulin
  • PVA polyvinyl alcohol
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • LiCl lithium chloride
  • ⁇ -mercaptoethanol p38 inhibition. It may contain at least one selected from the group consisting of agents, Fenor Red, and Chemically Defined Lipid Concentrate (Thermo Fisher SCIENTIFIC).
  • the cells are cultured in a stem cell induction medium for, for example, 1 day or more, 2 days or more, 5 days or more, 10 days or more, or 20 days or more, during which RNA is introduced by the above method.
  • the cells are cultured in a stem cell-inducing medium until iPS cell-like colony formation is observed, during which RNA is introduced by the above method.
  • the culture may be an adhesive culture or a suspension culture.
  • the period until iPS cell-like colony formation is observed is, for example, 3 days or less, 5 days or less, 7 days or less, 10 days after replacing the medium with a medium suitable for the type of somatic cell with a stem cell induction medium. Below, it is 20 days or less, or 40 days or less.
  • RNA lipofection is terminated and iPS cell-like colonies are collected.
  • the collected cells are cultured in a stem cell maintenance medium on a substrate coated with the above substrate.
  • the culture may be an adhesive culture or a suspension culture.
  • Examples of stem cell maintenance media include mTeSR (registered trademark, STEMCELL TECHNOLOGIES) and Stem Fit (registered trademark, Ajinomoto Healthy Supply).
  • Whether or not the somatic cells have been reprogrammed can be confirmed, for example, from the morphology of the cells.
  • whether or not the somatic cells have been reprogrammed is selected by a cytoflow meter from the cell surface markers TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-1, and SSEA5, which indicate that they are undifferentiated. This may be done by analyzing whether at least one surface marker is positive.
  • TRA-1-60 is an antigen specific to iPS / ES cells and is not detected in differentiated somatic cells. Since iPS cells can be produced only from the TRA-1-60 positive fraction, TRA-1-60 positive cells are considered to be the species of iPS cells.
  • RNA can be immediately introduced into isolated mononuclear cells and induced into iPS cells. Therefore, it is possible to shorten the production time of iPS cells.
  • Example 1 Recombinant protein FLT3 ligand (PEPROTECH), recombinant human TPO (PEPROTECH), recombinant human IL-6 (PEPROTECH), recombinant human G-CSF (PEPROTECH), recombinant in serum-free medium for blood cells Body human SCF (PEPROTECH) was added.
  • the centrifuge was set to 18 ° C. 5 mL to 50 mL of human adult peripheral blood or human umbilical cord blood was collected, EDTA was added to the blood and mixed gently.
  • a medium for separating human lymphocytes (Ficoll-Paque PREMIUM, GE Healthcare Japan) was dispensed into two 15 mL tubes of 5 mL each. 5 mL of PBS was added to the blood to dilute and layered 5 mL each on a medium for human lymphocyte separation in a tube. At this time, diluted blood was slowly added onto the medium along the tube wall of the tube so as not to disturb the interface.
  • the solution in the tube was centrifuged at 400 xg at 18 ° C. for 30 minutes. At this time, both acceleration and deceleration were performed slowly. After centrifugation, an intermediate layer containing mononuclear cells appeared in the tube. The intermediate layer in the tube was slowly collected with Pipetman and transferred to a new 15 mL tube. At this time, the lower layer was not absorbed. About 1 mL of the intermediate layer could be recovered from one tube. The two intermediate layers were transferred together into one tube.
  • the medium in 1 well was replaced with a serum-free medium for blood cells to which the above 6 types of recombinant proteins were added and a drug for alleviating the congenital antiviral reaction of the cells was added.
  • the amount of medium exchanged was also 1.5 mL.
  • RNAs were modified with psidouridine ( ⁇ ).
  • RNAs were substantially concentrated and purified into single-stranded RNA by HPLC.
  • the ratio of the absorbance of RNA at 260 nm to 280 nm (A 260 / A 280 ) was 1.71 to 2.1, confirming that the protein was substantially free of contamination.
  • RNA transfection by the same procedure was repeated for 5 to 7 days.
  • RNA transfection was repeated by the same procedure as above except that the medium was a stem cell-inducing medium until iPS cell-like colonization was observed as shown in FIG. 6 (a). The initially floating cells adhered to the wells over time.
  • iPS cell-like colonies were collected from the wells and a stem cell maintenance medium in a laminin-coated dish.
  • Cells were maintained and cultured in (StemFit, Ajinomoto) without using feeder cells.
  • a photograph of the cells cultured in maintenance is shown in FIG. 6 (b).
  • the maintenance-cultured cells were immunostained with an antibody against OCT3 / 4, the cells showed OCT3 / 4 positive as shown in FIG. 6 (c).
  • the maintenance-cultured cells were immunostained with an antibody against NANOG, the cells showed NANOG positivity as shown in FIG. 6 (d).
  • the cells maintained and cultured were stained with an antibody against TRA-1-60, which was labeled with an Allophycocyanin (APC) fluorescent dye. Then, using a fluorescence activated cell sorter (FACS®, BD), it was confirmed that the cells were TRA-1-60 positive, as shown in FIG.
  • FACS® fluorescence activated cell sorter
  • RNA transfected into the cell body did not remain within 24 hours.
  • FIG. 9 in iPS cells into which a reprogramming factor was introduced using a retrovirus, it was observed by semi-quantitative PCR that the OCT gene was integrated into the genome (right lane). In the RNA lipofected cells according to this example, it was confirmed that the OCT gene was not integrated into the genome (left lane).
  • RNA was introduced into mononuclear cells in the same manner as in Example 1, except that RNA introduced into mononuclear cells was not substantially concentrated and purified by HPLC into single-stranded RNA. However, as shown in FIG. 10, RNA-introduced cells did not become TRA-1-60 positive.
  • Example 2 In addition to the RNA used in Example 1, RNA encoding p53P275S was transfected into mononuclear cells. RNA encoding p53P275S was also purified. The results of dot-blot analysis of RNA of p53P275S using the anti-double-stranded RNA antibody J2 are shown in FIG. As a result, as shown in FIG. 12, the RNA encoding p53P275S was transfected into the mononuclear cells, as compared with the case where the RNA encoding p53P275S was not transfected into the mononuclear cells. Many colonies were formed.
  • DMEM containing 10% FBS was prepared as a medium for fibroblasts. Human adult-derived fibroblasts were suspended in a fibroblast medium to obtain a fibroblast suspension.
  • a 6-well dish To 1 well of a 6-well dish, 1.5 mL of PBS and 4.8 ⁇ L of a mixture of silk moth-derived laminin (iMatrix-511 silk, Nippi) were added, and the dish was placed in an incubator at 37 ° C. for 1 hour. Next, the mixture of PBS and laminin was removed from the wells using an aspirator, and 1.5 mL of a fibroblast suspension was added to one well. The number of fibroblasts in 1 well was 2.0 ⁇ 10 5 cells from 0.5 ⁇ 10 5. Then, the fibroblasts were cultured for 1 day in an incubator at 37 ° C.
  • a mixture of silk moth-derived laminin iMatrix-511 silk, Nippi
  • the amount of medium exchanged was also 1.5 mL.
  • RNA encoding p53P275S of PBS 125 ⁇ L in the tube A M 3 O of RNA, SOX2 RNA of, KLF4 of RNA, C-MYC of RNA, and mixtures of RNA LIN28 ( 100 ng / [mu] L) was added 10 2 [mu] L from 0.1 [mu] L.
  • RNAs were modified with psidouridine ( ⁇ ).
  • RNAs were polyadenylated and capped.
  • these RNAs were concentrated and purified by HPLC as in Example 1. 0.1 ⁇ L to 100 ⁇ L of lipofection reagent was added to 125 ⁇ L of PBS in tube B.
  • RNA transfection by the same procedure was repeated for 5 to 9 days. Eleven days after seeding the cells in the wells, the medium was replaced with stem cell maintenance medium.
  • FIG. 13 (a) Five to nine days after seeding the cells in the wells, as shown in FIG. 13 (a), when iPS cell-like colonies were observed, iPS cell-like colonies were collected from the wells and laminin was added. Cells were maintained and cultured in stem cell maintenance medium in a coated dish without the use of feeder cells. A photograph of the cells cultured in maintenance is shown in FIG. 13 (b).
  • the cells maintained and cultured were stained with an antibody against TRA-1-60, which was labeled with an Allophycocyanin (APC) fluorescent dye. Then, using a fluorescence activated cell sorter (FACS®, BD), it was confirmed that the cells maintained and cultured were TRA-1-60 positive, as shown in FIG.
  • FACS® fluorescence activated cell sorter
  • RNA was introduced into fibroblasts in the same manner as in Example 3, except that RNA introduced into mononuclear cells was not substantially concentrated and purified by HPLC into single-stranded RNA. However, as shown in FIG. 15, RNA-introduced cells did not form iPS cell-like colonies.
  • Example 4 Fibroblasts were introduced each RNA encoding M 3 O of RNA, SOX2 RNA of, KLF4 of RNA, C-MYC of RNA, and p53P275S. Other than that, when cells were induced by the same method as in Example 3, as shown in FIG. 16, the efficiency of iPS cell-like clamp formation was higher than that of the control in which RNA encoding p53P275S was not introduced. Improved.
  • Example 5 Results of a comprehensive comparison of gene expression of iPS cell-like cells (Blood-iPSC) prepared in Example 1 and iPS cells (CiRA-iPSC) prepared at the Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University using a microarray. Is shown in FIG. As shown in FIG. 17 (a), the iPS cell-like cells (Blood-iPSC) prepared in Example 1 and peripheral blood mononuclear cells did not have similar global gene expression. On the other hand, as shown in FIG.
  • RNA was introduced into macaque-derived fibroblasts in the same manner as in Example 3 except that macaque-derived fibroblasts were used.
  • iPS cell-like colonization was observed as shown in FIG.
  • the maintenance-cultured cells were immunostained with an antibody against Oct3 / 4
  • the cells showed Oct3 / 4 positive as shown in FIG. 19 (a).
  • the maintenance-cultured cells were immunostained with an antibody against Nanog
  • the cells showed Nanog positivity as shown in FIG. 19 (b).
  • FIG. 20 it was confirmed that the cells were TRA-1-60 positive.
  • RNA was introduced into the chimpanzee-derived fibroblasts in the same manner as in Example 3 except that the chimpanzee-derived fibroblasts were used.
  • iPS cell-like colonization was observed as shown in FIG.
  • the maintenance-cultured cells were immunostained with an antibody against Oct3 / 4
  • the cells showed Oct3 / 4 positive as shown in FIG. 22 (a).
  • the maintenance-cultured cells were immunostained with an antibody against Nanog
  • the cells showed Nanog positivity as shown in FIG. 22 (b).
  • FIG. 23 it was confirmed that the induced cells were TRA-1-60 positive.
  • Example 8 300 mL of urine from a healthy subject was collected, 6 urine was dispensed into a 50 mL falcon tube, and the tube was centrifuged at 400 G for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed from the tube, 30 mL of PBS was placed in the tube, and the tube was centrifuged at 400 G for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant was removed from the tube, 30 mL of primary medium was placed in the tube and the tube was centrifuged at 400 G for 5 minutes.
  • the primary medium was DMEM / Ham's F12 (Gibco, 11320-033), fetal bovine serum (Gibco, 10437028, final concentration 10%), SingleQuots Kit CC-4127 REGM (Lonza, 1/1000 amount), and Prepared by adding Antibiotic-Antimycotic (Gibco, 15240062, 1/100 amount). After centrifugation, the supernatant was removed from the tube, the cells were suspended in 1 mL of primary medium, the cells were seeded in 1 well of a gelatin-coated 24-well plate, and the cells were incubated in a 37 ° C. incubator.
  • the primary medium was added to a 300 ⁇ L well, and from the 3rd day onward, the medium was replaced with a medium for epithelial cells.
  • the medium for epithelial cells was prepared by adding SingleQuots Kit CC-4127 REGM (Lonza) to the renal epithelial cell basal medium (Lonza).
  • a microscopic image of the cells after expanded culture for 6 days is shown in FIG. The cells were subcultured for the first time on the 7th day after seeding, and the cells were further expanded and cultured, and the cells were subcultured for the second time on the 7th day from the first passage.
  • a microscopic image of the cells 6 days after the 2nd passage is shown in FIG.
  • Example 9 The dish coated with laminin 511 was used as a dish for inducing pluripotent stem cells.
  • the urine-derived cells prepared in Example 8 were seeded in a dish for inducing pluripotent stem cells from 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 5 and incubated at 37 ° C.
  • the medium used was a medium for epithelial cells.
  • a mixture of transfection reagent and RNA encoding green fluorescent protein (GFP) was added to the medium, the medium was exchanged using the medium, and the medium was incubated at 37 ° C.
  • a microscopic image of the cells the next day is shown in FIG. Expression of GFP was observed, indicating that urine-derived cells can be transfected.
  • Example 10 The dish coated with laminin 511 was used as a dish for inducing pluripotent stem cells.
  • the urine-derived cells prepared in Example 8 were seeded in a dish for inducing pluripotent stem cells from 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 5 and incubated at 37 ° C.
  • the medium used was a medium for epithelial cells.
  • the next day prepare the tubes A and tubes B, M 3 O of RNA of PBS 125 ⁇ L in the tube A, SOX2 RNA of, KLF4 of RNA, C-MYC of RNA, and RNA mixtures of LIN28 (100ng / ⁇ L) It was added 10 2 [mu] L from 0.1 [mu] L.
  • RNAs were modified with psidouridine ( ⁇ ).
  • RNAs were substantially concentrated and purified into single-stranded RNA by HPLC.
  • the ratio of the absorbance of RNA at 260 nm to 280 nm was 1.71 to 2.1, confirming that the protein was substantially free of contamination.
  • dot blot analysis was performed using the anti-double-stranded RNA antibody J2, 90% or more of the double-stranded RNA was removed.
  • 0.1 ⁇ L to 100 ⁇ L of lipofection reagent was added to 125 ⁇ L of PBS in tube B.
  • the solution in tube A and the solution in tube B are mixed, the mixed solution is left at room temperature for 10 minutes, and the entire mixed solution is added to the transfection medium without using B18R or the like, and the transfection medium is added.
  • the medium was exchanged using the transfection medium and incubated at 37 ° C. Transfection was performed once daily for 10 days. Observation was performed on days 1, 5, 7, and 14 after cell seeding. As shown in FIG. 27, it was confirmed that the cell morphology changed like ES cells as the day progressed.
  • Example 11 Similar to Example 10, urine-derived cells were transfected for 10 days. From the 11th day after seeding the cells, the cells were cultured in a stem cell medium (StemFit, Ajinomoto), and on the 14th day, all the cells were peeled from the dish, and some of the collected and mixed cells were seeded in the medium. And succeeded. At the time of passage, the colonies were not picked up, the entire cells on the dish were collected, and 1 ⁇ 10 2 to 1 ⁇ 10 5 cells were seeded on the dish. A microscopic image of the cells 6 days after passage is shown in FIG. ES cell-like cells were confirmed.
  • Example 12 Similar to Example 10, urine-derived cells were transfected for 10 days. After seeding the cells, the cells were cultured in a stem cell medium (StemFit, Ajinomoto) from the 11th day, the cells were peeled from the dish on the 14th day, and some cells were analyzed by flow cytometry. FIG. 29 (a) ), It was confirmed that it was TRA-1-60 positive. Further, when the cells detached from the dish were subcultured on the 14th day and analyzed by flow cytometry 7 days later, it was confirmed that they were TRA-1-60 positive as shown in FIG. 29 (b). rice field.
  • stem cell medium Stema
  • FIG. 29 (b) rice field.
  • Example 13 Similar to Example 10, urine-derived cells were transfected for 10 days. From the 11th day after seeding the cells, the cells were cultured in a stem cell medium (StemFit, Ajinomoto), and on the 14th day, all the cells were peeled from the dish, and a part of the peeled and mixed cells was seeded and subcultured. did. StemFit® was used as the medium after passage. Seven days after passage, cells were fixed and stained with anti-OCT3 / 4 antibody and anti-NANOG antibody. In addition, chemical staining of nuclei with Hoechst® was also performed. As a result, as shown in FIG.
  • FIG. 30 (d) shows a photograph of cells stained with an anti-OCT3/4 antibody, a photograph of cells stained with an anti-NANOG antibody, and a photograph of cells stained with Hoechst (registered trademark). And, it is a composite photograph.
  • Example 17 Similar to Example 10, urine-derived cells were transfected for 10 days. From the 11th day after seeding the cells, the cells were cultured in a stem cell medium (StemFit, Ajinomoto), and on the 14th day, all the cells were peeled from the dish using Triple Select, and some of the peeled and mixed cells were peeled off. The cells were seeded in a medium and subcultured. StemFit® was used as the medium after passage. Seven days after passage, cells were fixed and stained with anti-LIN28 antibody. In addition, chemical staining of nuclei with Hoechst® was also performed. As a result, as shown in FIG.
  • FIG. 31 (d) is a photograph obtained by synthesizing a photograph of cells stained with an anti-LIN28 antibody and a photograph of cells stained with Hoechst (registered trademark).

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Abstract

本開示によれば、細胞を用意することと、細胞にＲＮＡを導入することと、を含み、ＲＮＡが、リプログラミング因子をコードするＲＮＡを含み、細胞に導入されるＲＮＡにおいて、２本鎖ＲＮＡが実質的に除去されている、人工多能性幹細胞の作製方法が提供される。

Description

人工多能性幹細胞の作製方法
　本発明は、細胞技術に関し、人工多能性幹細胞の作製方法に関する。
　人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞とは、二つの特徴的な能力を有する細胞である。一つは、体を構成するあらゆる細胞へと変化することができる能力である。もう一つは、半永久的な増殖能を有することである。ｉＰＳ細胞はこの二つの能力を有するため、自己の体細胞からｉＰＳ細胞を作製し、目的の体細胞へ変化させることで、拒絶反応のない移植治療へと応用することができる。そのためｉＰＳ細胞は、再生医療の有力な技術になると考えられている。
　ｉＰＳ細胞の誕生から現在までに、数多くのその作製方法が確立された。代表的なｉＰＳ細胞の作製方法としては、レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法、及びエピソーマルベクターを用いた方法が挙げられる。
　レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法について説明する。体細胞をレトロウイルスやレンチウイルスに感染させて、初期化因子をコードしている遺伝子を細胞内に導入することができる。さらに、レトロウイルスやレンチウイルスは、体細胞のゲノムに初期化因子を挿入することができ、初期化因子の細胞内での安定的な発現を誘導する。
　しかし、レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法には、以下の問題点がある。まず、体細胞のゲノムへの初期化因子の挿入は、既存の遺伝子やプロモーターを傷つけるため、細胞の癌化の原因になり得る。また、ゲノム上に挿入された初期化因子は、ｉＰＳ細胞を体細胞に変化させた後に再度活性化するおそれがある。そのため、ｉＰＳ細胞由来の移植用細胞には癌化のリスクがある。実際、マウスモデルにおいては、導入された初期化因子の再活性化が体細胞で見られ、癌化することが確認されている（例えば、非特許文献１参照。）。
　エピソーマルベクターは環状ＤＮＡであり、核内で自己増幅する（例えば、特許文献１参照。）。エピソーマルベクターは、原理的にはゲノムに組み込まれないと考えられてきたが、最近の研究では、エピソーマルベクターを用いて作製されたｉＰＳ細胞のゲノム上に、エピソーマルベクターの断片が散在して挿入されることが報告されている。そのため、リプログラミング遺伝子が細胞内に残存し得るという問題がある。例えばＣ－ＭＹＣやＫＬＦ４が細胞内に残存すると、癌化の原因になる。リプログラミング遺伝子が細胞内に残存しているか否かを検査するには膨大な費用が必要である。移植細胞プール中の全ての細胞にエピソーマルプラスミドのゲノムへの挿入がなく、残存がないことを示すことは不可能である。
　レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法、及びエピソーマルベクターを用いた方法には、上述した問題があるため、ＲＮＡを用いたｉＰＳ細胞の作製方法が提案されている（例えば、非特許文献２参照。）。
特許第５３７６４７８号公報
Nature 448, 313-317 Nature Biotechnol 26(3): 313-315, 2008.
　本発明は、リプログラミング因子の導入方法に限定されずに、人工多能性幹細胞の効率的な作製方法を提供することを目的の一つとする。
　本発明の態様によれば、細胞を用意することと、細胞にＲＮＡを導入することと、を含み、ＲＮＡが、リプログラミング因子をコードするＲＮＡを含み、ＲＮＡにおいて、２本鎖ＲＮＡが実質的に除去されている、人工多能性幹細胞の作製方法が提供される。
　上記の方法において、ＲＮＡが、ＨＰＬＣで精製されていてもよい。
　上記の方法において、ＲＮＡが、ｐ５３のドミナントネガティブ変異体をコードするＲＮＡをさらに含んでいてもよい。
　上記の方法において、リプログラミング因子をコードするＲＮＡが、ＯＣＴ３／４のＲＮＡ、ＳＯＸ２のＲＮＡ、ＫＬＦ４のＲＮＡ、及びＣ－ＭＹＣのＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つを含んでいてもよい。
　上記の方法において、リプログラミング因子をコードするＲＮＡが、ＯＣＴ３／４のＲＮＡと、ＯＣＴ３／４のＲＮＡに接続されたＭＹＯＤの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）のＲＮＡと、を含んでいてもよい。
　上記の方法において、細胞にＲＮＡをリポフェクション法により導入してもよい。
　上記の方法において、導入することにおいて、細胞が基板に接着していてもよい。
　上記の方法において、基板が人工多能性幹細胞を培養できる基質でコートされていてもよい。
　上記の方法において、細胞が線維芽細胞であってもよい。
　上記の方法において、細胞が血液細胞であってもよい。
　上記の方法において、血液細胞が、拡大培養された内皮前駆細胞ではなくともよい。
　上記の方法において、血液細胞が、ＲＮＡを導入される前に、血液細胞用培地中で１０日間以下、拡大培養されてもよい。
　上記の方法において、血液細胞が、単核球細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、血液幹細胞、樹状細胞、及び顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。
　上記の方法において、血液細胞が末梢血又は臍帯血由来であってもよい。
　上記の方法において、血液細胞が成人の血液由来であってもよい。
　上記の方法において、ＲＮＡを導入された血液細胞を、血液細胞用培地中で培養し、その後、幹細胞誘導培地中で培養することをさらに含んでいてもよい。
　上記の方法において、細胞が、尿に含まれる細胞であってもよい。
　上記の方法において、細胞が、膀胱上皮細胞であってもよい。
　上記の方法が、尿からＲＮＡを導入される細胞を収集することをさらに含んでいてもよい。
　上記の方法において、細胞がヒト由来であってもよい。
　上記の方法において、細胞が、ヒト以外の霊長類動物由来であってもよい。
　本発明によれば、人工多能性幹細胞の効率的な作製方法を提供可能である。
実施例１における抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてＭ３ＯのＲＮＡをドットブロット分析した結果を示す図である。 実施例１における抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてＳＯＸ２のＲＮＡをドットブロット分析した結果を示す図である。 実施例１における抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてＣ－ＭＹＣのＲＮＡをドットブロット分析した結果を示す図である。 実施例１における抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてＫＬＦ４のＲＮＡをドットブロット分析した結果を示す図である。 実施例１における抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてＬＩＮ２８のＲＮＡをドットブロット分析した結果を示す図である。 実施例１の結果を示す顕微鏡写真である。 実施例１の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 実施例１に係る遺伝子発現の解析結果を示す写真である。 実施例１に係る遺伝子発現の解析結果を示す写真である。 比較例１の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 実施例２における抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてｐ５３Ｐ２７５ＳのＲＮＡをドットブロット分析した結果を示す図である。 実施例２に係るｉＰＳ細胞様のコロニー数を示すグラフである。 実施例３の結果を示す顕微鏡写真である。 実施例３の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 比較例２の結果を示す顕微鏡写真である。 実施例４の結果を示すグラフである。 実施例５に係る遺伝子発現を示すグラフである。 実施例６の結果を示す顕微鏡写真である。 実施例６の結果を示す顕微鏡写真である。 実施例６の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 実施例７の結果を示す顕微鏡写真である。 実施例７の結果を示す顕微鏡写真である。 実施例７の結果を示すフローサイトメーターによるドットプロットである。 実施例８に係る尿由来の細胞の写真である。 実施例８に係る尿由来の細胞の写真である。 実施例９に係る、ＧＦＰをコードするＲＮＡをトランスフェクトされた尿由来の細胞の写真である。 実施例１０に係る、リプログラミング因子を導入された尿由来の細胞の写真である。 実施例１１に係る、リプログラミング因子を導入された尿由来の細胞の写真である。 実施例１２に係る、フローサイトメーターによるドットプロットである。 実施例１３に係る、リプログラミング因子を導入された尿由来の細胞の写真である。 実施例１３に係る、リプログラミング因子を導入された尿由来の細胞の写真である。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
　実施形態に係る人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の作製方法は、細胞を用意することと、細胞にＲＮＡを導入することと、を含む。細胞に導入されるＲＮＡは、リプログラミング因子をコードするＲＮＡと、ｐ５３のドミナントネガティブ変異体をコードするＲＮＡと、を含んでいてもよい。
　細胞に導入されるＲＮＡは、例えば、１本鎖ＲＮＡであり、２本鎖ＲＮＡが実質的に除去されている。また、細胞に導入されるＲＮＡは、短鎖ＲＮＡ及び夾雑物等の不純物が実質的に除去されていることが好ましい。２本鎖ＲＮＡを実質的に除去するために、細胞に導入する１本鎖ＲＮＡを、精製及び／又は濃縮してもよい。細胞に導入する１本鎖ＲＮＡを精製する方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる精製方法が挙げられる。例えば、ＨＰＬＣによって、２本鎖ＲＮＡが、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、あるいは９０％以上除去される。あるいは、２本鎖ＲＮＡを実質的に除去するために、細胞に導入するＲＮＡを、２本鎖ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼで処理してもよい。細胞に導入されるＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡである。
　ｐ５３は、ガン抑制タンパク質である。ｐ５３のドミナントネガティブ変異体は、体細胞に内在する野生型ｐ５３タンパク質と競合的に作用して、野生型ｐ５３タンパク質の機能を阻害し得る限り特に限定されない。ｐ５３のドミナントネガティブ変異体の例としては、マウスｐ５３のＤＮＡ結合領域に位置する２７５位（ヒトの場合は２７８位）のプロリンをセリンに点変異させたｐ５３Ｐ２７５Ｓ、マウスｐ５３の１４－３０１位（ヒトｐ５３では１１－３０４位に対応）のアミノ酸を欠失させたｐ５３ＤＤ、マウスｐ５３の５８位（ヒトの場合は６１位）のセリンをアラニンに点変異させたｐ５３Ｓ５８Ａ、ヒトｐ５３の１３５位（マウスの場合は１３２位）のシステインをチロシンに点変異させたｐ５３Ｃ１３５Ｙ、マウスｐ５３の１３５位（ヒトの場合は１３８位）のアラニンをバリンに点変異させたｐ５３Ａ１３５Ｖ、マウスｐ５３の１７２位（ヒトの場合は１７５位）のアルギニンをヒスチジンに点変異させたｐ５３Ｒ１７２Ｈ、マウスｐ５３の２７０位（ヒトの場合は２７３位）のアルギニンをヒスチジンに点変異させたｐ５３Ｒ２７０Ｈ、及びマウスｐ５３の２７８位（ヒトの場合は２８１位）のアスパラギン酸をアスパラギンに点変異させたｐ５３Ｄ２７８Ｎが挙げられる。
　細胞に導入されるＲＮＡは、ＯＣＴ３／４のＲＮＡの完全長に直接接続されたＭＹＯＤの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）のＲＮＡをさらに含んでいてもよい。
　細胞に上記のＲＮＡをリポフェクション法により導入してもよい。上記のＲＮＡを用いることにより、リポフェクションの過程における死細胞率を下げ、誘導効率を向上することが可能である。あるいは、培地中に上記のＲＮＡを添加し、細胞に上記のＲＮＡが自然に取り込まれてもよい。
　なお、細胞をｉＰＳ細胞に誘導することを、細胞のリプログラミング、あるいは細胞の初期化という場合がある。本開示では、遺伝子記号はヒトで記載しているが、大文字・小文字表記によって、種を制限することを意図するものではない。例えば、全て大文字表記していても、マウス又はラットの遺伝子を含むことを排除するものではない。ただし、実施例においては、実際に使用した生物種に則って、遺伝子記号を表記している。
　ＲＮＡが導入される細胞の例としては、血液細胞、線維芽細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、及び体性幹前駆細胞等の体細胞が挙げられる。ＲＮＡが導入される細胞は、尿に含まれる細胞であってもよい。尿に含まれる細胞の例としては、膀胱上皮細胞が挙げられる。細胞は、ヒト由来であってもよいし、非ヒト動物由来であってもよい。非ヒト動物はヒト以外の霊長類であってもよい。ヒト以外の霊長類の例としては、ヒト以外の霊長類の例としては、チンパンジー、ボノボ、ゴリラ、オランウータン、テナガザル、オナガザル、広鼻猿類、及び原猿類が挙げられる。
　血液細胞は、血液から分離される。血液は、例えば末梢血及び臍帯血であるが、これらに限定されない。血液は、成年から採取されてもよいし、未成年から採取されてもよい。採血の際には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及び生物学的製剤基準血液保存液Ａ液（ＡＣＤ－Ａ）液等の抗凝固剤を用いる。
　血液細胞は、例えば、単球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）及びリンパ球を含む単核球細胞、マクロファージ、血液幹細胞、樹状細胞、顆粒球、好中球、好酸球、及び好塩基球等の有核細胞である。血液細胞は、例えばＴ細胞及びＢ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、例えばαβＴ細胞である。なお、血液細胞は、拡大培養された内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、赤血球、及び血小板を含まなくてよい。あるいは、血液細胞は、ＲＮＡを導入される前に、血液細胞用培地中で１０日間以下、７日間以下、５日間以下、４日間以下、３日間以下、２日間以下、あるいは１日間以下、拡大培養されてもよい。
　単核球細胞は、血液細胞の分離用媒体、及び遠心分離装置等を用いて、血液から分離される。血液細胞の分離用媒体としてＦｉｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。
　低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから１０μＬから５０ｍＬの血液を採血し、血液が固まらないように血液にＥＤＴＡを含むキレート剤を加えて優しく混ぜる。また、ヒトリンパ球分離用の媒体（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＲＥＭＩＵＭ、ＧＥヘルスケアジャパン）を５ｍＬずつ２本の１５ｍＬチューブに分注する。５ｍＬの血液に対して５ｍＬのＰＢＳを加えて希釈し、チューブ中のヒトリンパ球分離用の媒体の上に５ｍＬずつ重層する。この時、界面を乱さないように、希釈血液をチューブの管壁を伝わらせてゆっくりと媒体上に加える。
　チューブ中の溶液を、１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは４００×ｇで、４℃から４２℃好ましくは１８℃で５分から２時間、好ましくは３０分間遠心する。遠心後、チューブ中に白く濁った中間層が現れる。この白く濁った中間層は、単核球細胞を含んでいる。チューブ中の白く濁った中間層をピペットマンでゆっくりと回収し、新しい１５ｍＬチューブに移す。この際、下層は吸い取らないようにする。白く濁った中間層は、１本のチューブより１ｍＬ程度回収できる。２本分の中間層をまとめて１本のチューブに移す。
　回収した単核球細胞に対し、１ｍＬから４８ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、溶液をさらに１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは２００×ｇ、４℃から４２℃、好ましくは１８℃で１分から６０分、好ましくは１０分間遠心する。その後、アスピレーターを用いて溶液の上清を吸引して除去し、１ｍＬから１２ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
　採血管としてバキュテイナ（登録商標、ＢＤ）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。
　低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃、好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから、採血管（バキュテイナ（登録商標）、ＢＤ）を用いて８ｍＬ採血し、転倒混和して抗凝固剤と混和する。その後、バランスを調整し、溶液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは１５００×ｇから１８００×ｇでスイングロータで１分から６０分、好ましくは２０分間遠心する。遠心後、血漿層である上層を取り除き、ピペッティングして単核球層とゲルに張り付いている血球を懸濁して懸濁液を得る。得られた懸濁液を、別の１５ｍＬチューブに移す。
　１５ｍＬチューブの懸濁液に１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、懸濁液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで１分から６０分、好ましくは５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレーターで除去する。また、溶血剤（ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（登録商標）、１０倍濃度、ＢＤ）を滅菌水で１倍濃度に希釈する。１５ｍＬチューブ中のペレットをタッピングでほぐし、１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１ｍＬの溶血剤を加える。その後、室温で遮光し、１分間から６０分間、好ましくは１分間溶液を静置する。
　次に、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、４℃から４２℃、好ましくは室温で、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで１分から６０分、５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレーターで除去し、１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
　また、単核球細胞としては、Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ社から販売されているＣＴＬ－ＵＰ１や、Ｓａｎｇｕｉｎｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＰＢＭＣ－００１等を使用してもよい。
　あるいは、血液細胞としては、セルバンカー１、ステムセルバンカー　ＧＭＰグレード、及びステムセルバンカー　ＤＭＳＯフリー　ＧＭＰグレード（ゼノアック）等の細胞凍結保存液を用いて凍結保存された血液細胞を解凍して用いてもよい。
　単核球細胞を解凍する際には、まず、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは８ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を入れておき、凍結した単核球細胞の入ったチューブを４℃から４２℃、好ましくは３７℃の温浴槽にいれて、単核球細胞を溶かし始める。その後、少し氷が残っている状態で、単核球細胞の入ったチューブを温浴槽から引きあげ、単核球細胞を既知組成無血清造血細胞培地の入ったチューブに移す。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。
　血液細胞は、細胞表面マーカーに基づいて分離されてもよい。Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８のいずれかが陽性である。Ｂ細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０のいずれかが陽性である。マクロファージは、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、ＣＤ１６３のいずれかが陽性である。単球は、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４のいずれかが陽性である。Ｔ細胞及びＢ細胞は、例えば、自動磁気細胞分離装置及び免疫磁気ビーズを用いて、血液細胞から分離される。あるいは、予め分離された単核球細胞を用意してもよい。ただし、細胞表面マーカーに基づいて分離されていない血液細胞を用いてもよい。
　ＲＮＡを導入される細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、ビトロネクチン、あるいはＬａｍｉｎｉｎ５１１（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ＭＧ又はｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ、ｎｉｐｐｉ）等の基底膜マトリックス等のｉＰＳ細胞を培養できる基質でコートされている基板上で、フィーダーフリーで接着培養される。ラミニンが好ましい基質として使用され得る。
　ＲＮＡを導入される体細胞は、まず、幹細胞培地ではない、体細胞あるいは分化細胞の種類に適した培地中で培養される。例えば、細胞が血液細胞である場合、細胞はＳｔｅｍＳｐａｎ（登録商標）Ｈ３０００（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）、Ｈｕｍａｎ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｘ―ＶＩＶＯ（登録商標）１０（Ｌｏｎｚａ）、ＳｔｅｍＳｐａｎ（登録商標）ＡＣＦ　（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）、Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１５　Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｏｎｚａ）、Ｘ－Ｖｉｖｏ１０　Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｃｅｌｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　（Ｌｏｎｚａ）、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＤＸＦ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ　Ｈ４４３４　Ｃｌａｓｓｉｃ（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４　ＳＦＭ（１Ｘ）（登録商標、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、ＳｔｅｍＭＡＣＳ　ＨＳＣ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉａ，　ｈｕｍａｎ（登録商標、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）、ＳｔｅｍＳｐａｎ（登録商標）ＳＦＥＭ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）、ＳｔｅｍＳｐａｎ（登録商標）ＳＦＥＭ　ＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）、ＣｅｌｌＸＶｉｖｏ　Ｈｕｍａｎ　Ｍ１　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ）、及びＳｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）ＩＩ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ　（ＳＩＧＭＡ－ＡｌＤＲＩＣＨ）等の血液細胞用無血清培地中で接着培養される。ただし、ＲＮＡを導入される体細胞は、浮遊培養されてもよい。
　細胞に導入されるＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）、５－メチルウリジン（５ｍｅＵ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５－ヒドロキシメチルウリジン（５ｈｍＵ）、５－フォーミルウリジン（５ｆＵ）、５－カルボキシメチルエステルウリジン（５ｃａｍＵ）、チエノグアノシン（ｔｈＧ）、Ｎ４－メチルシチジン（ｍｅ４Ｃ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５－メチオキシチジン（５ｍｏＣ）、５－ヒドロキシメチルシチジン（５ｈｍＣ）、５－ヒドロキシシチジン（５ｈｏＣ）、５－フォルムシチジン（５ｆＣ）、５－カルボキシシチジン（５ｃａＣ）、Ｎ６－メチル－２－アミノアデノシン（ｍ６ＤＡＰ）、ジアミノプリン（ＤＡＰ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２'－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍまたはｍ２'－ＯＵ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、及びＮ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つで修飾されていてもよい。例えば、ＲＮＡにおけるウリジンヌクレオシドの１以上又は全てが、プソイドウリジンに置換されていてもよい。ウリジンヌクレオシドをプソイドウリジンに置換したＲＮＡは、ウリジンヌクレオシドをプソイドウリジンに置換していないＲＮＡと比較して、高いレベルで、長時間、翻訳される傾向にある。
　細胞に導入されるＲＮＡは、ＲＮａｓｅＩＩＩで処理されることによって、精製されていてもよい。ＲＮａｓｅＩＩＩは、例えば大腸菌由来である。ＲＮａｓｅＩＩＩは、例えば、約１２塩基対よりも大きな２本鎖ＲＮＡを消化する。
　細胞に導入されるＲＮＡは、ポリアデニル化されていてもよい。ＲＮＡは、インビトロで転写される（ＩＶＴ）ＲＮＡのポリアデニル化によって調製されてもよい。ポリアデニル化は、例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（例えば、酵母ＲＮＡポリメラーゼ又は大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を用いてＩＶＴ　ＲＮＡを接触させることを含む。あるいは、ＲＮＡは、ポリ（Ａ）末端をコードするＤＮＡテンプレートを用いることによって、インビトロで転写される間にポリアデニル化されてもよい。ＲＮＡが、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて、又はＤＮＡテンプレートのＩＶＴの間にポリアデニル化されるかどうかにかかわらず、ＲＮＡは、ポリＡ末端（例えば、５０から２００ヌクレオチド、例えば、好ましくは１００から２００、１５０から２００ヌクレオチド、又は１５０ヌクレオチド超を有するポリＡ末端）を含んでいてもよい。
　細胞に導入されるＲＮＡは、キャップ化されていてもよい。細胞における発現の効率を向上するために、例えば、８０％以上のＲＮＡ分子がキャップを含有する。例えば、細胞に導入されるＲＮＡは、キャッピング酵素の存在下で、キャップ化されていない一次ＲＮＡをインキュベートすることによって、インビトロで合成される。また、例えば、キャッピング酵素反応において用いられる一次ＲＮＡは、合成されるべきＲＮＡをコードするＤＮＡ分子のインビトロでの転写（ＩＶＴ）によって合成される。合成されるべきＲＮＡをコードするＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有し、これに、ＲＮＡポリメラーゼが結合して、そこから転写が開始する。
　細胞に導入されるＲＮＡは、５'ｃａｐ［ｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇ］構造を有していてもよい。当該配列はＲＮＡを安定化させ、転写を促進させる配列である。５'ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅをもつＲＮＡからは、脱リン酸化処理により５'ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを取り除いてもよい。細胞に導入されるＲＮＡは、Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｃａｐ　Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）として［３'Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇ］を有していてもよい。ＡＲＣＡは転写開始点より前に挿入される配列であり、ＲＮＡの転写効率が向上する。
　ＲＮＡは、例えば、リポフェクション法により細胞に導入される。リポフェクション法とは、陰性荷電物質である核酸と、陽性荷電脂質と、の複合体を、電気的な相互作用により形成し、複合体をエンドサイトーシスや膜融合により細胞内に取り込ませる方法である。リポフェクション法は、細胞へのダメージが少なく、導入効率に優れており、操作が簡便であり、時間がかからない等の利点を有する。
　ＲＮＡは、例えば、ＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて培養されている細胞に導入される。例えば、細胞が単核球である場合、血液から単核球を分離した直後に、単核球にＲＮＡを導入してもよい。
　ＲＮＡトランスフェクション試薬としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（登録商標、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）が使用可能である。あるいは、ＲＮＡトランスフェクション試薬としては、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＳｔｅｍＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ(Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ)、ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ）、ｍＲＮＡ－Ｉｎ（ＭＴＩ－ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ　ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）、Ｊｅｔ　Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）３０００、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ　ＲＮＡ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｆｅｃｔ）、ＮｅｘｔＦｅｃｔ（登録商標）ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏｏＳｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ　Ｔ　ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００２）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ　ＣＤ３４　ｃｅｌｌ　Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００３）、及びＲｅｐｒｏＲＮＡ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のリポフェクション試薬を利用してもよい。
　ＲＮＡリポフェクションの際の細胞数は、例えば、１個以上、１×１０１個以上、１×１０２個以上、１×１０３個以上、０．５×１０4個以上、１×１０4個以上、あるいは１×１０５個以上である。また、ＲＮＡリポフェクションの際の細胞数は、例えば、５×１０８個以下、１×１０７個以下、１×１０６個以下、２×１０５個以下あるいは０．５×１０４個以下である。
　細胞は、例えば、１．０ｍｍ２以上、１．０×１０２ｍｍ２以上、あるいは３．８×１０２ｍｍ２以上の面積の領域内に播種される。また、細胞は、例えば、２０×１０３ｍｍ２以下、５、５×１０３ｍｍ２以下、あるいは２．１×１０３ｍｍ２以下の面積の領域内に播種される。
　ＲＮＡを導入される細胞は、低濃度で培地あるいは培養器に播種されることが好ましい。ここで、低濃度とは、例えば、１ｃｅｌｌ／ｃｍ２以上であり、０．０５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．２０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．３０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．４０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．５０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．６０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．７０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．８０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．９０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．１０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．１５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、０．２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下、あるいは０．２５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２以下である。あるいは、低濃度とは、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、あるいは２個以下の細胞同士が接触可能であり、１１個以上の細胞同士が接触しない濃度である。なお、１０個以下の細胞同士が接触した細胞塊が複数あってもよい。あるいは、細胞容器底面全体が細胞で覆われた状態を１００％コンフルエントとして、低濃度とは、６％以下コンフルエント、５％以下コンフルエント、４％以下コンフルエント、３％以下コンフルエント、２％以下コンフルエント、１％以下コンフルエント、０．５％以下コンフルエント、０．１％以下コンフルエント、０．０５％以下コンフルエント、あるいは０．０１％以下コンフルエントである。またあるいは、低濃度とは、例えば、播種された細胞においてシングルセル同士が接触しない濃度である。例えば、ウェルプレートのウェルに、シングルセルを播種してもよい。ウェルプレートは、１２ウェルプレートや９６ウェルプレートであってもよい。
　１ｍＬの培養液あたり、リポフェクションの際のＲＮＡの合計量は、例えば１回あたり５ｎｇ以上、５０ｎｇ以上、１００ｎｇ以上、２００ｎｇ以上、４００ｎｇ以上、あるいは１μｇ以上である。また、１ｍＬの培養液あたり、リポフェクションの際のＲＮＡの合計量は、例えば１回あたり７０μｇ以下、５０μｇ以下、１０μｇ以下、５μｇ以下、３μｇ以下、あるいは１μｇ以下である。
　リポフェクションの際のＲＮＡトランスフェクション試薬の量は、例えば１回あたり０．１μＬ以上、１．０μＬ以上、あるいは５μＬ以上である。また、リポフェクションの際のＲＮＡトランスフェクション試薬の量は、例えば１回あたり５００μＬ以下、１００μＬ以下、あるいは４０μＬ以下である。
　ＲＮＡリポフェクションを実施する時間は、例えば１回あたり０．１時間以上、２時間以上、３時間以上、あるいは４時間以上である。また、ＲＮＡリポフェクションを実施する時間は、例えば１回あたり７２時間以下、２４時間以下、１２時間以下、あるいは６時間以下行う。
　細胞へのＲＮＡの導入は、複数回行ってもよい。細胞へのＲＮＡの導入は、例えば、１日に１回又は１回以上、あるいは２日に１回行う。細胞へのＲＮＡの導入は、例えば合計３回以上、５回以上、１０回以上、２０回以上、２５回以上、３０回以上、あるいは３５回以上行う。また、細胞へのＲＮＡの導入は、例えば合計５５回以下、５０回以下、４５回以下、あるいは４０回以下行う。
　体細胞に最初にＲＮＡを導入してから、例えば１日以上、２日以上、５日以上、あるいは１０日以上の間、細胞は、体細胞の種類に適した培地中で培養される。また、体細胞に最初にＲＮＡを導入してから、例えば５０日以下、２０日以下、１０日以下、７日以下、あるいは３日以下の間、細胞は、体細胞の種類に適した培地中で培養される。細胞が血液細胞である場合、血液細胞に最初にＲＮＡを導入してから、例えば１日以上、２日以上、５日以上、あるいは１０日以上の間、血液細胞は、血液細胞用培地中で培養される。また、細胞が血液細胞である場合、血液細胞に最初にＲＮＡを導入してから、例えば５０日以下、２０日以下、１０日以下、７日以下、あるいは３日以下の間、血液細胞は、血液細胞用培地中で培養される。
　体細胞に最初にＲＮＡを導入してから、例えば１日以上、２日以上、５日以上、１０日以上、あるいは２０日以上経過後、培地を、体細胞の種類に適した培地から幹細胞誘導培地に置換する。幹細胞誘導培地は、例えば、１０体積％以上３０体積％以下の無血清サプリメント、０．０１体積％以上１０体積％以下のアルブミン、０．０１体積％以上１０体積％以下のインシュリン、０．０１体積％以上１０体積％以下のトランスフェリンを含む。無血清サプリメントとしては、例えば、ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）が使用可能である。培地を体細胞の種類に適した培地から幹細胞誘導培地に置換する際、細胞は基板上に接着したままでよく、細胞を基板から剥離しなくともよい。培地を体細胞の種類に適した培地から幹細胞誘導培地に置換した後、上記の方法により、ＲＮＡリポフェクションを継続する。
　幹細胞誘導培地は、幹細胞誘導培地は、Ｗｎｔを含まなくともよい。幹細胞誘導培地は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含まなくともよい。幹細胞誘導培地は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）を含まなくともよい。幹細胞誘導培地は、Ｂ１８Ｒ等の細胞の先天性抗ウイルス反応を緩和する薬剤を含んでいてもよい。幹細胞誘導培地は、アルブミンを含んでいてもよい。幹細胞誘導培地は、ｂＦＧＦ等のＦＧＦ等及びＴＧＦ－β等のＴＧＦの増殖因子を含まなくともよい。あるいは、幹細胞誘導培地は、ｂＦＧＦ等のＦＧＦを、例えば４４００ｎｇ／ｍＬ以下、１００ｎｇ／ｍＬ以下、５０ｎｇ／ｍＬ以下、１０ｎｇ／ｍＬあるいは１ｎｇ／ｍＬ以下以下の低濃度で含んでいてもよい。また、幹細胞誘導培地は、ＴＧＦ－β等のＴＧＦを例えば１００ｎｇ／ｍＬ以下、１０ｎｇ／ｍＬ以下、５ｎｇ／ｍＬ、あるいは０．５ｎｇ／ｍＬ以下の低濃度で含んでいてもよい。ペニシリン及びストレプトマイシン等の抗生物質を含まなくともよい。なお、細胞を幹細胞誘導培地中で培養を開始して後、５日目以降、又は７日目以降において、幹細胞誘導培地に増殖因子を含めてもよい。幹細胞誘導培地は、ヒト血清又はヒト血漿血清を含んでいてもよい。幹細胞誘導培地をこのように調製することにより、誘導効率を向上させることが可能である。
　幹細胞誘導培地は、例えば、ＡＣＴＨ（Ｓｉｇｍａ）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤、ＰＫＣ阻害剤であるＧｏ６９８３、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ－３）阻害剤、ＧＳＫ－３阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤であるＰＤ０３２５９０１、ＴＧＦ－β阻害剤、ＴＧＦ－β受容体阻害剤であるＳＢ－４３１５４２、ＲＯＣＫ阻害剤、Ａｋｔ活性化剤、ビトロネクチン、Ｎ２サプリメント(Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ)、Ｂ２７サプリメント(Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ)、ＤＭＳＯ、ＦＢＳ(Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ)、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）、及びアスコルビン酸からなる群から選択される少なくとも一つを含んでいてもよい。
　幹細胞誘導培地は、例えば、ＡｌｂｕＭａｘ(Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ)、ウシ血清アルブミン、ヒトアルブミン、インシュリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、β-メルカプトエタノール、ｐ３８阻害剤、フェーノルレッド、、及びＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ(Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ)からなる群から選択される少なくとも一つを含んでいてもよい。
　細胞は、幹細胞誘導培地中で、例えば１日以上、２日以上、５日以上、１０日以上、あるいは２０日以上の間、培養され、その間、上記の方法によりＲＮＡを導入される。また、細胞は、幹細胞誘導培地中で、ｉＰＳ細胞様のコロニー形成が認められるまで、培養され、その間、上記の方法によりＲＮＡを導入される。培養は、接着培養であっても、浮遊培養であってもよい。ｉＰＳ細胞様のコロニー形成が認められるまでの期間は、例えば、培地を体細胞の種類に適した培地から幹細胞誘導培地に置換してから、３日以下、５日以下、７日以下、１０日以下、２０日以下、あるいは４０日以下である。
　幹細胞誘導培地中でｉＰＳ細胞様のコロニー形成が認められた場合、ＲＮＡリポフェクションを終了し、ｉＰＳ細胞様のコロニーを採取する。採取された細胞は、上記の基質をコートされた基板上で、幹細胞維持培地中で培養される。培養は、接着培養であっても、浮遊培養であってもよい。幹細胞維持培地の例としては、ｍＴｅＳＲ（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）及びＳｔｅｍ　Ｆｉｔ（登録商標、味の素ヘルシーサプライ）が挙げられる。
　体細胞がリプログラミングされたか否かは、例えば、細胞の形態から確認することができる。あるいは、体細胞がリプログラミングされたか否かは、サイトフローメータで、未分化であることを示す細胞表面マーカーであるＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＳＳＥＡ－１、及びＳＳＥＡ５から選択される少なくとも一つの表面マーカーが陽性であるか否かを分析することにより行ってもよい。ＴＲＡ－１－６０は、ｉＰＳ／ＥＳ細胞に特異的な抗原であり、分化した体細胞では検出されない。ｉＰＳ細胞はＴＲＡ－１－６０陽性画分からのみできることから、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞はｉＰＳ細胞の種と考えられる。
　本実施形態によれば、細胞のゲノムを傷つけることなく、インテグレーションフリーで、あるいは外来性遺伝子が残存していないｉＰＳ細胞を作製することが可能である。また、従来においては、初期化される細胞が血液細胞である場合、内皮前駆細胞の拡大培養を行い、拡大培養された内皮前駆細胞にＲＮＡを導入する必要があった。これに対し、本実施形態によれば、内皮前駆細胞を拡大培養する必要がなく、例えば、単離された単核球細胞に直ちにＲＮＡを導入して、ｉＰＳ細胞に誘導することが可能であるため、ｉＰＳ細胞の作製時間を短縮することが可能である。
　（実施例１）
　血液細胞用無血清培地に組換え体タンパク質ＦＬＴ３リガンド（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）、組換え体ヒトＴＰＯ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）、組換え体ヒトＩＬ－６（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）、組換え体ヒトＧ－ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）、組換え体ヒトＳＣＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）を添加した。
　遠心機を１８℃に設定した。５ｍＬから５０ｍＬのヒト成人末梢血又はヒト臍帯血を採取し、血液にＥＤＴＡを加えて優しく混ぜた。また、ヒトリンパ球分離用の媒体（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＲＥＭＩＵＭ、ＧＥヘルスケアジャパン）を５ｍＬずつ２本の１５ｍＬチューブに分注した。５ｍＬのＰＢＳを血液に加えて希釈し、チューブ中のヒトリンパ球分離用の媒体の上に５ｍＬずつ重層した。この時、界面を乱さないように、希釈血液をチューブの管壁を伝わらせてゆっくりと媒体上に加えた。
　チューブ中の溶液を、４００×ｇ、１８℃で３０分間遠心した。この際、加速、減速ともゆっくり行った。遠心後、チューブ中に単核球を含んでいる中間層が現れた。チューブ中の中間層をピペットマンでゆっくりと回収し、新しい１５ｍＬチューブに移した。この際、下層は吸い取らないようにした。中間層は、１本のチューブより１ｍＬ程度回収できた。２本分の中間層をまとめて１本のチューブに移した。
　回収した単核球細胞に対し、１２ｍＬのＰＢＳを加えて、溶液をさらに２００×ｇ、１８℃で１０分間遠心した。その後、アスピレーターを用いて溶液の上清を吸引して除去し、上記の血液細胞用培地を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得た。
　６ウェルディッシュの１ウェルに対して、１．５ｍＬのＰＢＳと４．８μＬのカイコ由来ラミニン（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ、ニッピ）の混合液を加え、３７℃のインキュベーター中にディッシュを１時間置いた。次に、アスピレーターを用いてＰＢＳとラミニンの混合液をウェルから除去し、１ウェルに１．５ｍＬの単核球細胞懸濁液を加えた。１ウェルにおける単核球細胞の数は、０．５×１０５から５．０×１０７個であった。その後、３７℃のインキュベーター中で単核球細胞を培養した。一部の単核球細胞は浮遊していた。
　その後、１ウェル中の培地を、血液細胞用無血清培地に上記の６種類の組換え体タンパク質に加えて、細胞の先天性抗ウイルス反応を緩和する薬剤を加えた培地に交換した。交換した培地の量も１．５ｍＬであった。
　チューブＡとチューブＢを用意し、チューブＡ中の１２５μＬのＰＢＳにＭ３ＯのＲＮＡ、ＳＯＸ２のＲＮＡ、ＫＬＦ４のＲＮＡ、Ｃ－ＭＹＣのＲＮＡ、及びＬＩＮ２８のＲＮＡの混合物（１００ｎｇ／μＬ）を０．１μＬから１０２μＬ加えた。これらのＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）で修飾されていた。また、これらのＲＮＡは、ＨＰＬＣで実質的に１本鎖ＲＮＡに濃縮精製されていた。ＲＮＡの２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度の比（Ａ２６０／Ａ２８０）は、１．７１から２．１であり、タンパク質が実質的に混入していないことが確認された。また、抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてドットブロット分析したところ、２本鎖ＲＮＡは９０％以上除去されていた。抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてＭ３ＯのＲＮＡをドットブロット分析した結果を図１に、抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてＳＯＸ２のＲＮＡをドットブロット分析した結果を図２に、抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてＣ－ＭＹＣのＲＮＡをドットブロット分析した結果を図３に、抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてＫＬＦ４のＲＮＡをドットブロット分析した結果を図４に、抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてＬＩＮ２８のＲＮＡをドットブロット分析した結果を図５に示す。チューブＢ中の１２５μＬのＰＢＳに０．１μＬから１００μＬのリポフェクション試薬を加えた。次に、チューブＡ中の溶液とチューブＢ中の溶液を混合し、混合液を１０分間室温で放置し、全量の混合液を１ウェル中の血液細胞用培地に加えた。その後、３７℃のインキュベーター中にディッシュを１日間置いて、細胞にＲＮＡをトランスフェクトした。以後、同様の手順によるＲＮＡトランスフェクションを５日から７日間繰り返した。
　ウェルに細胞を播種してから８日から１０日後に、ウェル内の血液細胞用培地を１．５ｍＬの幹細胞誘導培地に置換した。その後、培地が幹細胞誘導培地であること以外の上記と同様の手順により、図６（ａ）に示すようにｉＰＳ細胞様のコロニー形成が認められるまで、ＲＮＡトランスフェクションを繰り返した。当初浮遊していた細胞は、時間の経過とともにウェルに接着した。
　ウェルに細胞を播種してから２０日から３０日後に、ｉＰＳ細胞様のコロニー形成が認められた時点で、ｉＰＳ細胞様のコロニーをウェルから採取し、ラミニンがコートされたディッシュ中の幹細胞維持培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、味の素）中で、細胞をフィーダー細胞を用いずに維持培養した。維持培養された細胞の写真を図６（ｂ）に示す。維持培養された細胞をＯＣＴ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図６（ｃ）に示すように、細胞はＯＣＴ３／４陽性を示した。また、維持培養された細胞をＮＡＮＯＧに対する抗体で免疫染色したところ、図６（ｄ）に示すように、細胞はＮＡＮＯＧ陽性を示した。
　また、維持培養された細胞をＴＲＡ－１－６０対する抗体であって、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）蛍光色素で標識された抗体で染色した。その後、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ（登録商標）、ＢＤ）を用いて、図７に示すように、細胞がＴＲＡ－１－６０陽性であることを確認した。
　図８に示すように、ＲＮＡをトランスフェクトされた後の細胞を半定量ＰＣＲで解析したところ、細胞体にトランスフェクトされたＲＮＡは２４時間以内に残存しなくなることが確認された。また、図９に示すように、レトロウイルスを用いてリプログラミング因子を導入されたｉＰＳ細胞においては、ＯＣＴ遺伝子がゲノムにインテグレーションしていることが半定量ＰＣＲで観察された（右のレーン）が、本実施例に係るＲＮＡリポフェクションされた細胞においては、ＯＣＴ遺伝子がゲノムにインテグレーションしていないことが確認された（左のレーン）。
　（比較例１）
　単核球細胞に導入されるＲＮＡをＨＰＬＣで実質的に１本鎖ＲＮＡに濃縮精製しなかった以外は、実施例１と同様に、単核球細胞にＲＮＡを導入した。しかし、図１０に示すように、ＲＮＡを導入された細胞は、ＴＲＡ－１－６０陽性にならなかった。
　（実施例２）
　実施例１で使用したＲＮＡに加えて、ｐ５３Ｐ２７５ＳをコードするＲＮＡを単核球細胞にトランスフェクトした。ｐ５３Ｐ２７５ＳをコードするＲＮＡも精製されていた。抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてｐ５３Ｐ２７５ＳのＲＮＡをドットブロット分析した結果を図１１に示す。その結果、図１２に示すように、ｐ５３Ｐ２７５ＳをコードするＲＮＡを単核球細胞にトランスフェクトしたほうが、ｐ５３Ｐ２７５ＳをコードするＲＮＡを単核球細胞にトランスフェクトしなかった場合と比較して、ｉＰＳ細胞様のコロニーが多数形成された。
　（実施例３）
　１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを線維芽細胞用培地として用意した。線維芽細胞用培地に、ヒトの成人由来の線維芽細胞を懸濁して、線維芽細胞懸濁液を得た。
　６ウェルディッシュの１ウェルに対して、１．５ｍＬのＰＢＳと４．８μＬのカイコ由来ラミニン（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ、ニッピ）の混合液を加え、３７℃のインキュベーター中にディッシュを１時間置いた。次に、アスピレーターを用いてＰＢＳとラミニンの混合液をウェルから除去し、１ウェルに１．５ｍＬの線維芽細胞懸濁液を加えた。１ウェルにおける線維芽細胞の数は、０．５×１０５から２．０×１０５個であった。その後、３７℃のインキュベーター中で線維芽細胞を１日間培養した。
　次に、培地を幹細胞誘導培地に交換した。交換した培地の量も１．５ｍＬであった。
　チューブＡとチューブＢを用意し、チューブＡ中の１２５μＬのＰＢＳにｐ５３Ｐ２７５ＳをコードするＲＮＡ、Ｍ３ＯのＲＮＡ、ＳＯＸ２のＲＮＡ、ＫＬＦ４のＲＮＡ、Ｃ－ＭＹＣのＲＮＡ、及びＬＩＮ２８のＲＮＡの混合物（１００ｎｇ／μＬ）を０．１μＬから１０２μＬ加えた。これらのＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）で修飾されていた。また、これらのＲＮＡは、ポリアデニル化されており、キャップ化されていた。また、これらのＲＮＡは、実施例１と同様にＨＰＬＣで濃縮精製されていた。チューブＢ中の１２５μＬのＰＢＳに０．１μＬから１００μＬのリポフェクション試薬を加えた。次に、チューブＡ中の溶液とチューブＢ中の溶液を混合し、混合液を１０分間室温で放置し、全量の混合液を１ウェル中の培地に加えた。その後、３７℃のインキュベーター中にディッシュを１日間置いて、細胞にＲＮＡをトランスフェクトした。以後、同様の手順によるＲＮＡトランスフェクションを５日から９日間繰り返した。ウェルに細胞を播種してから１１日後、培地を幹細胞維持培地に交換した。
　ウェルに細胞を播種してから５日から９日後、図１３（ａ）に示すように、ｉＰＳ細胞様のコロニー形成が認められた時点で、ｉＰＳ細胞様のコロニーをウェルから採取し、ラミニンがコートされたディッシュ中の幹細胞維持培地中で、細胞をフィーダー細胞を用いずに維持培養した。維持培養された細胞の写真を図１３（ｂ）に示す。
　また、維持培養された細胞をＴＲＡ－１－６０対する抗体であって、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）蛍光色素で標識された抗体で染色した。その後、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ（登録商標）、ＢＤ）を用いて、図１４に示すように、維持培養された細胞がＴＲＡ－１－６０陽性であることを確認した。
　（比較例２）
　単核球細胞に導入されるＲＮＡをＨＰＬＣで実質的に１本鎖ＲＮＡに濃縮精製しなかった以外は、実施例３と同様に、線維芽細胞にＲＮＡを導入した。しかし、図１５に示すように、ＲＮＡを導入された細胞は、ｉＰＳ細胞様のコロニーを形成しなかった。
　（実施例４）
　線維芽細胞に、Ｍ３ＯのＲＮＡ、ＳＯＸ２のＲＮＡ、ＫＬＦ４のＲＮＡ、Ｃ－ＭＹＣのＲＮＡ、及びｐ５３Ｐ２７５ＳをコードするＲＮＡのそれぞれを導入した。その他は、実施例３と同様の方法で、細胞を誘導したところ、図１６に示すように、ｐ５３Ｐ２７５ＳをコードするＲＮＡを導入しなかったコントロールと比較して、ｉＰＳ細胞様のクランプ形成の効率が向上した。
　（実施例５）
　実施例１で作製したｉＰＳ細胞様の細胞（Ｂｌｏｏｄ－ｉＰＳＣ）と、京都大学ｉＰＳ細胞研究所で作製されたｉＰＳ細胞（ＣｉＲＡ－ｉＰＳＣ）の遺伝子発現を、マイクロアレイを用いて網羅的に比較した結果を図１７に示す。図１７（ａ）に示されたとおり、実施例１で作製したｉＰＳ細胞様の細胞（Ｂｌｏｏｄ－ｉＰＳＣ）と、末梢血単核球とは、グローバルな遺伝子発現が似ていなかった。一方、図１７（ｂ）に示されたとおり、実施例１で作製したｉＰＳ細胞様の細胞（Ｂｌｏｏｄ－ｉＰＳＣ）と、京都大学ｉＰＳ細胞研究所で作製されたｉＰＳ細胞（ＣｉＲＡ－ｉＰＳＣ）とは、グローバルな遺伝子発現が非常に似ていることが明らかになった。この結果から、ＲＮＡで樹立された血液由来のｉＰＳ細胞様の細胞は、これまでに樹立されたｉＰＳ細胞と非常に似た遺伝子発現プロファイルを持っていることが確認された。
　（実施例６）
　マカク由来の繊維芽細胞を用いた以外は、実施例３と同様の方法で、マカク由来の繊維芽細胞にＲＮＡを導入した。その結果、図１８に示すようにｉＰＳ細胞様のコロニー形成が認められた。維持培養された細胞をＯｃｔ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図１９（ａ）に示すように、細胞はＯｃｔ３／４陽性を示した。また、維持培養された細胞をＮａｎｏｇに対する抗体で免疫染色したところ、図１９（ｂ）に示すように、細胞はＮａｎｏｇ陽性を示した。また、図２０に示すように、細胞がＴＲＡ－１－６０陽性であることを確認した。
　（実施例７）
　チンパンジー由来の繊維芽細胞を用いた以外は、実施例３と同様の方法で、チンパンジー由来の繊維芽細胞にＲＮＡを導入した。その結果、図２１に示すようにｉＰＳ細胞様のコロニー形成が認められた。維持培養された細胞をＯｃｔ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図２２（ａ）に示すように、細胞はＯｃｔ３／４陽性を示した。また、維持培養された細胞をＮａｎｏｇに対する抗体で免疫染色したところ、図２２（ｂ）に示すように、細胞はＮａｎｏｇ陽性を示した。また、図２３に示すように、誘導細胞がＴＲＡ－１－６０陽性であることを確認した。
　（実施例８）
　健常者の尿を３００ｍＬ採取し、５０ｍＬファルコンチューブに６本ずつ尿を分注して、４００Ｇで５分間、チューブを遠心した。遠心後、チューブから上清を除き、３０ｍＬのＰＢＳをチューブに入れ、４００Ｇで５分間、チューブを遠心した。遠心後、チューブから上清を除き、３０ｍＬのプライマリー培地をチューブに入れ、４００Ｇで５分間、チューブを遠心した。プライマリー培地は、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ'ｓ　Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、１１３２０－０３３）に、ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、１０４３７０２８、終濃度１０％）、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ　Ｋｉｔ　ＣＣ－４１２７　ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ、１０００分の１量）、及びＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ、１５２４００６２、１００分の１量）を添加して調製した。遠心後、チューブから上清を除き、１ｍＬのプライマリー培地で細胞を懸濁し、ジェラチンコートした２４ウェルプレートの１ウェルに細胞を播種し、３７℃のインキュベーターで細胞をインキュベートした。細胞播種後２日間はプライマリー培地を３００μＬウェルに添加し、３日目以降からは上皮細胞用培地を用いて培地交換した。上皮細胞用培地は、腎上皮細胞基本培地（Ｌｏｎｚａ）にＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ　Ｋｉｔ　ＣＣ－４１２７　ＲＥＧＭ　（Ｌｏｎｚａ）を添加して調製した。６日間拡大培養した後の細胞の顕微鏡画像を図２４に示す。播種から７日目に細胞を１回目の継代をし、さらに細胞を拡大培養し、１回目の継代から７日目に細胞を２回目の継代をした。２回目の継代から６日目の細胞の顕微鏡画像を図２５に示す。
　（実施例９）
　ラミニン５１１をコートしたディッシュを、多能性幹細胞誘導用のディッシュとした。多能性幹細胞誘導用のディッシュに、実施例８で用意した尿由来の細胞を１×１０４個から１×１０５個播種し、３７℃でインキュベートした。培地は上皮細胞用培地を用いた。翌日、トランスフェクション試薬と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＲＮＡとの混合物を培地に添加し、当該培地を用いて培地交換を行い、３７℃でインキュベートした。その翌日の細胞の顕微鏡画像を図２６に示す。ＧＦＰの発現が認められたことから、尿由来の細胞にトランスフェクションを行えることが示された。
　（実施例１０）
　ラミニン５１１をコートしたディッシュを、多能性幹細胞誘導用のディッシュとした。多能性幹細胞誘導用のディッシュに、実施例８で用意した尿由来の細胞を１×１０４個から１×１０５個播種し、３７℃でインキュベートした。培地は上皮細胞用培地を用いた。翌日、チューブＡとチューブＢを用意し、チューブＡ中の１２５μＬのＰＢＳにＭ３ＯのＲＮＡ、ＳＯＸ２のＲＮＡ、ＫＬＦ４のＲＮＡ、Ｃ－ＭＹＣのＲＮＡ、及びＬＩＮ２８のＲＮＡの混合物（１００ｎｇ／μＬ）を０．１μＬから１０２μＬ加えた。これらのＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）で修飾されていた。また、これらのＲＮＡは、ＨＰＬＣで実質的に１本鎖ＲＮＡに濃縮精製されていた。ＲＮＡの２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度の比（Ａ２６０／Ａ２８０）は、１．７１から２．１であり、タンパク質が実質的に混入していないことが確認された。また、抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてドットブロット分析したところ、２本鎖ＲＮＡは９０％以上除去されていた。チューブＢ中の１２５μＬのＰＢＳに０．１μＬから１００μＬのリポフェクション試薬を加えた。次に、チューブＡ中の溶液とチューブＢ中の溶液を混合し、混合液を１０分間室温で放置し、全量の混合液を、Ｂ１８Ｒ等を利用せずトランスフェクション用培地に添加し、当該トランスフェクション用培地を用いて培地交換を行い、３７℃でインキュベートした。トランスフェクションは１０日間、１日に１回行った。細胞播種後、１、５、７、１４日目に観察を行った。図２７に示すように、日が進むにつれてＥＳ細胞様に細胞の形態が変化したことが認められた。
　（実施例１１）
　実施例１０と同様に、尿由来の細胞にトランスフェクションを１０日間行った。細胞を播種して１１日目から幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、味の素）で細胞を培養し、１４日目に全ての細胞をディッシュから剥がし、回収して混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代した。継代の際には、コロニーをピックアップせず、ディッシュ上の細胞全体を回収し、１×１０２個から１×１０５個の細胞をディッシュに播種した。継代してから６日目の細胞の顕微鏡画像を図２８に示す。ＥＳ細胞様の細胞が確認された。
　（実施例１２）
　実施例１０と同様に、尿由来の細胞にトランスフェクションを１０日間行った。細胞を播種して１１日目から幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、味の素）で細胞を培養し、１４日目に細胞をディッシュから剥がし、一部の細胞をフローサイトメトリーで分析したところ、図２９（ａ）に示すように、ＴＲＡ－１－６０陽性であることが確認された。また、１４日目にディッシュから剥がされた細胞を継代し、７日後にフローサイトメトリーで分析したところ、図２９（ｂ）に示すように、ＴＲＡ－１－６０陽性であることが確認された。
　（実施例１３）
　実施例１０と同様に、尿由来の細胞にトランスフェクションを１０日間行った。細胞を播種して１１日目から幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、味の素）で細胞を培養し、１４日目に全ての細胞をディッシュから剥がし、剥がして混じり合った細胞の一部を播種して継代した。継代後の培地にはＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）を用いた。継代してから７日後、細胞を固定し、抗ＯＣＴ３／４抗体及び抗ＮＡＮＯＧ抗体を用いて、細胞を染色した。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）による核の化学染色も行った。その結果、図３０に示すように、多能性幹細胞の特異的マーカーであるＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧの発現が細胞核で確認された。したがって、尿由来の細胞から、ＲＮＡを利用して多能性幹細胞を誘導できることが示された。なお、図３０（ｄ）は、抗ＯＣＴ３／４抗体を用いて染色した細胞の写真と、抗ＮＡＮＯＧ抗体を用いて染色した細胞の写真と、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）を用いて染色した細胞の写真と、を合成した写真である。
　（実施例１７）
　実施例１０と同様に、尿由来の細胞にトランスフェクションを１０日間行った。細胞を播種して１１日目から幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、味の素）で細胞を培養し、１４日目にトリプルセレクトを用いて全ての細胞をディッシュから剥がし、剥がして混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代した。継代後の培地にはＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）を用いた。継代してから7日後、細胞を固定し、抗ＬＩＮ２８抗体を用いて、細胞を染色した。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）による核の化学染色も行った。その結果、図３１に示すように、多能性幹細胞の特異的マーカーであるＬＩＮ２８の発現が細胞核で確認された。したがって、尿由来の細胞から、ＲＮＡを利用して多能性幹細胞を誘導できることが示された。なお、図３１（ｄ）は、抗ＬＩＮ２８抗体を用いて染色した細胞の写真と、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）を用いて染色した細胞の写真と、を合成した写真である。

Claims (21)

  1. 　細胞を用意することと、
    　前記細胞にＲＮＡを導入することと、
    　を含み、
    　前記ＲＮＡが、リプログラミング因子をコードするＲＮＡを含み、
    　前記ＲＮＡにおいて、２本鎖ＲＮＡが実質的に除去されている、
    　人工多能性幹細胞の作製方法。
  2. 　前記ＲＮＡが、ＨＰＬＣで精製されている、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ＲＮＡが、ｐ５３のドミナントネガティブ変異体をコードするＲＮＡをさらに含む、請求項１又は２に記載の人工多能性幹細胞の作製方法。
  4. 　前記リプログラミング因子をコードするＲＮＡが、ＯＣＴ３／４のＲＮＡ、ＳＯＸ２のＲＮＡ、ＫＬＦ４のＲＮＡ、及びＣ－ＭＹＣのＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記リプログラミング因子をコードするＲＮＡが、ＯＣＴ３／４のＲＮＡと、前記ＯＣＴ３／４のＲＮＡに接続されたＭＹＯＤの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）のＲＮＡと、を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記細胞に前記ＲＮＡをリポフェクション法により導入する、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記導入することにおいて、前記細胞が基板に接着している、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記基板が人工多能性幹細胞を培養できる基質でコートされている、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記細胞が線維芽細胞である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記細胞が血液細胞である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記血液細胞が、拡大培養された内皮前駆細胞ではない、請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記血液細胞が、前記ＲＮＡを導入される前に、血液細胞用培地中で１０日間以下、拡大培養される、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 　前記血液細胞が、単核球細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、血液幹細胞、樹状細胞、及び顆粒球からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記血液細胞が末梢血又は臍帯血由来である、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　前記血液細胞が成人の血液由来である、請求項１０から１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　前記ＲＮＡを導入された血液細胞を、血液細胞用培地中で培養し、その後、幹細胞誘導培地中で培養することをさらに含む、請求項１０から１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　前記細胞が、尿に含まれる細胞である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
  18. 　前記細胞が、膀胱上皮細胞である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
  19. 　尿から前記ＲＮＡを導入される細胞を収集することをさらに含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
  20. 　前記細胞がヒト由来である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 　前記細胞が、ヒト以外の霊長類動物由来である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
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