JP2013501505A - 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
[1] (a) Oct3/4もしくはそれをコードする核酸、(b) Klf4もしくはそれをコードする核酸、および(c) Sox2もしくはそれをコードする核酸、並びに(d1) L-Mycもしくはそれをコードする核酸および/または(d2) p53の機能阻害物質を、体細胞に接触させることを含む、iPS細胞の製造方法。
[2] さらに(e) Lin28もしくはLin28bまたはそれをコードする核酸を体細胞に接触させることを含む、上記[1]記載の方法。
[3] p53の機能阻害物質が、p53に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸である、上記[1]または[2]記載の方法。
[4] (a) Oct3/4をコードする核酸、(b) Klf4をコードする核酸、(c) Sox2をコードする核酸、(d1) L-Mycをコードする核酸および/または(d2) p53に対するshRNAをコードする核酸、並びに(e) Lin28もしくはLin28bをコードする核酸を、体細胞に導入することを含む、上記[2]または[3]記載の方法。
[5] 前記の(a)、(b)、(c)、(d1)および(e)からなる群より選択される少なくとも1つの核酸がエピソーマルベクターの形態で導入される、上記[4]記載の方法。
[6] (d2) p53に対するshRNAをコードする核酸が細胞内で自律複製できないプラスミドベクターの形態で導入される、上記[4]または[5]記載の方法。
[7] エピソーマルベクターが、50%以上の頻度で、5継代までにiPS細胞から脱落する自己消失型ベクターである、上記[5]または[6]記載の方法。
[8] エピソーマルベクターが、前記の核酸の複製に必要なベクター要素の5’側および3’側にloxP配列を同方向に配置したものである、上記[5]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9] 細胞をCreリコンビナーゼで処理する工程を含まない、上記[8]記載の方法。
[10] 体細胞がヒト由来である、上記[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11] 前記の(a)、(b)、(c)並びに(d1)および/または(d2)、あるいはさらに(e)の因子を体細胞に接触させる時点から、iPS細胞が樹立されるまでの間、細胞を非ヒト動物由来の成分の非存在下で培養することを含む、上記[10]記載の方法。
[12] ヒト細胞をフィーダー細胞として用いるか、フィーダー細胞を用いないことを特徴とする、上記[11]記載の方法。
[13] フィーダー細胞が体細胞と同一個体に由来する、上記[12]記載の方法。
[14] (a) Oct3/4をコードする核酸、(b) Klf4をコードする核酸、(c) Sox2をコードする核酸、(d1) L-Mycをコードする核酸および/または(d2) p53に対するshRNAをコードする核酸、並びに(e) Lin28もしくはLin28bをコードする核酸を含有してなる、iPS細胞誘導促進剤。
[15] 前記の(a)、(b)、(c)、(d1)および(e)からなる群より選択される少なくとも1つの核酸がエピソーマルベクターの形態である、上記[14]記載の剤。
[16] (d2) p53に対するshRNAをコードする核酸が細胞内で自律複製できないプラスミドベクターの形態である、上記[14]または[15]記載の剤。
[17] エピソーマルベクターが、50%以上の頻度で、5継代までにiPS細胞から脱落する自己消失型ベクターである、上記[15]または[16]記載の剤。
[18] エピソーマルベクターが、前記の各核酸の複製に必要なベクター要素の5’側および3’側にloxP配列を同方向に配置したものである、上記[15]〜[17]のいずれかに記載の剤。
[19] 上記[5]〜[9]のいずれかに記載の方法により得られる、前記の各核酸がゲノムに組み込まれることなく除去されたiPS細胞。
[20] ヒト由来である、上記[19]記載のiPS細胞。
[21] 上記[11]〜[13]のいずれかの方法により得られる、非ヒト動物由来の成分の混入のないヒトiPS細胞。
[22] 体細胞の製造における、上記[19]〜[21]のいずれかに記載のiPS細胞の使用。
[23] 体細胞の製造における細胞ソースとしての、上記[19]〜[21]のいずれかに記載のiPS細胞。
また導入遺伝子の組み合わせを「Y1, Y2, Y3, Y4, T1, T2, T3」と略する場合、これらの組合せは以下の表1に示すとおりである。
iPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等)由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞(例、角質化表皮細胞)、粘膜上皮細胞(例、舌表層の上皮細胞)、外分泌腺上皮細胞(例、乳腺細胞)、ホルモン分泌細胞(例、副腎髄質細胞)、代謝・貯蔵用の細胞(例、肝細胞)、境界面を構成する内腔上皮細胞(例、I型肺胞細胞)、内鎖管の内腔上皮細胞(例、血管内皮細胞)、運搬能をもつ繊毛のある細胞(例、気道上皮細胞)、細胞外マトリックス分泌用細胞(例、線維芽細胞)、収縮性細胞(例、平滑筋細胞)、血液と免疫系の細胞(例、Tリンパ球)、感覚に関する細胞(例、桿細胞)、自律神経系ニューロン(例、コリン作動性ニューロン)、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞(例、随伴細胞)、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞(例、星状グリア細胞)、色素細胞(例、網膜色素上皮細胞)、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞 (体性幹細胞も含む) であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来ストローマ(幹)細胞および歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)が挙げられる。造血幹細胞および間葉系幹細胞は骨髄、臍帯血および胎盤中に豊富に含まれる。骨髄、臍帯血および胎盤は、多くの公的および私的な血液バンクに寄託され、白血病等の血液疾患の治療に用いられているので、このような寄託された骨髄、臍帯血および胎盤もまた、体細胞ソースとして利用することができる。特に、臍帯血は出産時に得られる臍帯から容易に採取できるので、臍帯血から得られる造血幹細胞および間葉系幹細胞は、iPS細胞バンクのための好適な体細胞ソースである。また、歯髄幹細胞も、智歯や歯周病等で抜いた歯から単離、調製することができるため、入手が容易であり、今後、iPS細胞バンクのための体細胞ソースとしての利用が期待される。
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができるタンパク性因子(群)またはそれをコードする核酸(ベクターに組み込まれた形態を含む)でありうる。本発明に用いられる核初期化物質は、少なくともOct3/4、Klf4およびSox2またはそれらをコードする核酸からなり(但し、Klf4および/またはSox2はそれらの機能を代替し得ることが報告されている他の因子に置換してもよい)、p53の機能阻害物質を併用しない場合は、核初期化物質としてL-Mycまたはそれをコードする核酸、さらにLin28もしくはLin28bまたはそれをコードする核酸が組み合わされる。また、本発明に用いられる核初期化物質は、Nanogまたはそれをコードする核酸を含まないことを特徴とする。具体的には、以下の組み合わせが例示される(以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する)。
(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。)
(2) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, SV40 Large T antigen(以下、SV40LT)
(3) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E6
(4) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E7
(5) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7
(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, Bmi1
(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28
(8) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, SV40LT
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, TERT, SV40LT
(10) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, SV40LT
(11) Oct3/4, Esrrb, Sox2, L-Myc (EsrrbはEsrrgで置換可能である。)
(12) Oct3/4, Klf4, Sox2
(13) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, SV40LT
(14) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6
(15) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E7
(16) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7
(17) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, Bmil
(18) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28
(19) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, SV40LT
(20) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, TERT, SV40LT
(21) Oct3/4, Klf4, Sox2, SV40LT
(22) Oct3/4, Esrrb, Sox2 (EsrrbはEsrrgで置換可能である。)
上記において、Lin28に代えてLin28bを用いることもできる。また、EsrrbもしくはEsrrgを用いる場合(上記(11)および(22))、Klf4を併用してもよい。
また、上記(1)-(22)には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記(1)-(22)のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。
遺伝子名 マウス ヒト
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
L-Myc NM_008506 NM_001033081
核初期化物質の体細胞への導入は、該物質がタンパク性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン(PTD)もしくは細胞透過性ペプチド(CPP)融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent(Gene Therapy Systmes)、Pro-JectTM Protein Transfection Reagent(PIERCE)及びProVectin(IMGENEX)、脂質をベースとしたProfect-1(Targeting Systems)、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrain Peptide(Q biogene)及びChariot Kit(Active Motif)、HVJエンベロープ(不活化センダイウイルス)を利用したGenomONE(石原産業)等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化物質を適当な溶媒(例えば、PBS、HEPES等の緩衝液)に希釈し、導入試薬を加えて室温で5-15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で1ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリA付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
(i) エピソーマルベクターの複製に必要なベクター要素(例えば、EBNA-1遺伝子やSV40 Large T antigen遺伝子、好ましくはEBNA-1遺伝子)の5’側および3’側にloxP配列が同方向に配置されている。
(ii) 初期化因子をコードする核酸がCAGプロモーターの制御下にある。
(iii) 初期化因子をコードする核酸がウサギβ-グロビンポリA付加シグナルの制御下にある。
(iv) 初期化因子をコードする核酸とポリA付加シグナルとの間にWPRE配列を含む。
本発明は、上記の核初期化物質に加えて、p53の機能阻害物質を接触させることがより好ましい。本明細書において「p53の機能阻害物質」とは、(a)p53タンパク質の機能もしくは(b)p53遺伝子の発現を阻害し得る限り、いかなる物質であってもよい。すなわち、p53タンパク質に直接作用してその機能を阻害する物質や、p53遺伝子に直接作用してその発現を阻害する物質のみならず、p53のシグナル伝達に関与する因子に作用することにより、結果的にp53タンパク質の機能やp53遺伝子の発現を阻害する物質も、本明細書における「p53の機能阻害物質」に含まれる。好ましくは、p53の機能阻害物質は、p53遺伝子の発現を阻害する物質であり、より好ましくはp53に対するsiRNAやshRNAをコードする発現ベクターである。
p53の化学的阻害物質としては、例えば、WO 00/44364に開示されるpifithrin(PFT)-α及び-βに代表されるp53阻害剤、Stormら(Nat. Chem. Biol. 2, 474 (2006))に開示されるPFT-μ、それらの類縁体及びそれらの塩(例えば、塩酸酸、臭素酸塩等の酸付加塩など)等が挙げられるが、これらに限定されない。これらのうち、PFT-α及びその類縁体[2-(2-Imino-4,5,6,7-tetrahydrobenzothiazol-3-yl)-1-p-tolylethanone, HBr (製品名:Pifithrin-α)及び1-(4-Nitrophenyl)-2-(4,5,6,7-tetrahydro-2-imino-3(2H)-benzothiazolyl)ethanone, HBr(製品名:Pifithrin-α, p-Nitro)]、PFT-β及びその類縁体[2-(4-Methylphenyl)imidazo[2,1-b]-5,6,7,8-tetrahydrobenzothiazole, HBr(製品名:Pifithrin-α, Cyclic)及び2-(4-Nitrophenyl)imidazo[2,1-b]-5,6,7,8-tetrahydrobenzothiazole(製品名:Pifithrin-α, p-Nitro, Cyclic)]、PFT-μ[Phenylacetylenylsulfonamide(製品名:Pifithrin-μ)]は、Merck社より市販されている。
p53のドミナントネガティブ変異体としては、体細胞に内在する野生型p53タンパク質と競合的に作用して、その機能を阻害し得る限り特に制限はないが、例えば、マウスp53のDNA結合領域に位置する275位(ヒトの場合は278位)のプロリンをセリンに点変異させたp53P275S(de Vries, A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 2948-2953 (2002))、マウスp53の14-301位(ヒトp53では11-304位に対応)のアミノ酸を欠失させたp53DD(Bowman, T., Genes Develop., 10, 826-835 (1996))などが挙げられる。その他にも、例えば、マウスp53の58位(ヒトの場合は61位)のセリンをアラニンに点変異させたp53S58A、ヒトp53の135位(マウスの場合は132位)のシステインをチロシンに点変異させたp53C135Y、マウスp53の135位(ヒトの場合は138位)のアラニンをバリンに点変異させたp53A135V、172位(ヒトの場合は175位)のアルギニンをヒスチジンに点変異させたp53R172H、270位(ヒトの場合は273位)のアルギニンをヒスチジンに点変異させたp53R270H、マウスp53の278位(ヒトの場合は281位)のアスパラギン酸をアスパラギンに点変異させたp53D278Nなどが知られており、同様に使用することができる。
本発明の別の好ましい実施態様において、p53機能阻害物質は、p53のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸である。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。p53のドミナントネガティブ変異体をコードするcDNAは、該変異体タンパク質の作製について上記した手法によりクローニングすることができる。
単離されたcDNAは、前記核初期化物質である核酸(初期化遺伝子)の場合と同様に、適当な発現ベクターに挿入され、体細胞に導入され得る。
ここでp53経路とは、p53を活性化し得るあらゆる上流のシグナルカスケードおよび活性化p53によって媒介されるあらゆる下流のシグナルカスケードを包含する意味で用いられる。したがって、p53経路阻害物質には、上記シグナル伝達経路のいずれかを阻害するいかなる物質も含まれるが、好ましい一実施態様においては、p53経路阻害物質はp53によりその転写が活性化されるp21の発現もしくは機能(Myc阻害活性)を阻害する物質であり、例えば、p21に対するsiRNA、shRNA、アンチセンス核酸、リボザイム等が挙げられる。p21の発現を阻害するこれらの核酸は、後記p53に対するsiRNA、shRNA、アンチセンス核酸、リボザイムと同様の方法により設計・合成し、体細胞に導入することができる。当該核酸は、それらを発現するベクターの形態で提供されてもよく、該ベクターは、後記p53に対するsiRNA、shRNA、アンチセンス核酸、リボザイムを発現するベクターと同様の方法により構築し、体細胞に導入することができる。
p53タンパク質の機能を阻害するその他の物質として、例えば、抗p53アンタゴニスト抗体もしくはそれをコードする核酸が挙げられる。抗p53アンタゴニスト抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール(PEG)等の蛋白質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。抗p53アンタゴニスト抗体は、p53またはその部分ペプチドを抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。また、公知の抗p53アンタゴニスト抗体として、例えば、PAb1801(Oncogene Science Ab-2)及びDO-1(Oncogene Science Ab-6)(Gire and Wynford-Thomas, Mol. Cell. Biol., 18, 1611-1621 (1998))等が挙げられる。抗p53アンタゴニスト抗体をコードする核酸は、抗p53モノクローナル抗体産生ハイブリドーマから常法により単離することができる。得られるH鎖及びL鎖遺伝子を連結して単鎖抗体をコードする核酸を作製することもできる。
p53に対するsiRNAは、配列番号1または3に示されるマウスまたはヒトのp53 cDNA配列情報に基づいて、例えば、Elbashirら(Genes Dev., 15, 188-200 (2001))の提唱する規則に従って設計することができる。siRNAの標的配列としては、原則的にはAA+(N)19であるが、AA+(N)21もしくはNA+(N)21であってもよい。また、センス鎖の5’末端がAAである必要はない。標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、5’-UTR及び開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。標的配列のGC含量も特に制限はないが、約30-約50%が好ましく、GC分布に偏りがなく繰り返しが少ない配列が望ましい。尚、下記(b2)のsiRNAもしくはshRNAを発現するベクターの設計において、プロモーターとしてpolIII系プロモーターを使用する場合、ポリメラーゼの転写が停止しないように、4塩基以上TまたはAが連続する配列は選択しないようにすべきである。
[配列番号5]
5’-TTTGACTGGATGACTGCCATGGttcaagagaCCATGGCAGTCATCCAGTCTTTTTT-3’
[配列番号6]
5’-TTTGATATCCTGCCATCACCTCttcaagagaGAGGTGATGGCAGGATATCTTTTTT-3’
[配列番号7]
5’-TTTGGCCCAAGTGAAGCCCTCCttcaagagaGGAGGGCTTCACTTGGGCCTTTTTT-3’
[配列番号8]
5’-TTTGTGAAGCCCTCCGAGTGTCttcaagagaGACACTCGGAGGGCTTCACTTTTTT-3’
[配列番号9]
5’-TTTGCCCTCCGAGTGTCAGGAGttcaagagaCTCCTGACACTCGGAGGGCTTTTTT-3’
[配列番号10]
5’-TTTGTCTGTTATGTGCACGTACttcaagagaGTACGTGCACATAACAGACTTTTTT-3’
[配列番号11]
5’-TTTGTACTCTCCTCCCCTCAATttcaagagaATTGAGGGGAGGAGAGTACTTTTTT-3’
[配列番号12]
5’-TTTGCTATTCTGCCAGCTGGCGttcaagagaCGCCAGCTGGCAGAATAGCTTTTTT-3’
[配列番号13]
5’-TTTGACGTGCCCTGTGCAGTTGttcaagagaCAACTGCACAGGGCACGTCTTTTTT-3’
[配列番号14]
5’-TTTGAAGTCACAGCACATGACGttcaagagaCGTCATGTGCTGTGACTTCTTTTTT-3’
[配列番号15]
5’-TTTGTCACAGCACATGACGGAGttcaagagaCTCCGTCATGTGCTGTGACTTTTTT-3’
[配列番号16]
5’-TTTGGAAATTTGTATCCCGAGTttcaagagaACTCGGGATACAAATTTCCTTTTTT-3’
[配列番号17]
5’-TTTGTACATGTGTAATAGCTCCttcaagagaGGAGCTATTACACATGTACTTTTTT-3’
[配列番号18]
5’-TTTGACTCCAGTGGGAACCTTCttcaagagaGAAGGTTCCCACTGGAGTCTTTTTT-3’
[配列番号19]
5’-TTTGTCCTTTGCCCTGAACTGCttcaagagaGCAGTTCAGGGCAAAGGACTTTTTT-3’
[配列番号20]
5’-TTTGATCCGCGGGCGTAAACGCttcaagagaGCGTTTACGCCCGCGGATCTTTTTT-3’
[配列番号21]
5’-TTTGACCAAGAAGGGCCAGTCTttcaagagaAGACTGGCCCTTCTTGGTCTTTTTT-3’
[配列番号22]
5’-TTTGAAAGTGGGGCCTGACTCAttcaagagaTGAGTCAGGCCCCACTTTCTTTTTT-3’
[配列番号23]
5’-TTTGTTGGGGAATAGGTTGATAttcaagagaTATCAACCTATTCCCCAACTTTTTT-3’
[配列番号24]
5’-TTTGATTCTATCTTGGGCCCTCttcaagagaGAGGGCCCAAGATAGAATCTTTTTT-3’
[配列番号25]
5’-TTTGCAuTACAgGTACgTGTGTAgtgtgctgtccTACACATGTACTTGTAGTGTTTTTT-3’
[配列番号26]
5’-TTTGCAGTuTACTTuCCGCCgTAgtgtgctgtccTATGGCGGGAAGTAGACTGTTTTTT-3’
但し、天然型RNA中のすべてのリボヌクレオシド分子を修飾型で置換すると、RNAi活性が失われる場合があるので、RISC複合体が機能できる最小限の修飾ヌクレオシドの導入が必要である。
siRNAを発現するベクターには、タンデムタイプとステムループ(ヘアピン)タイプとがある。前者はsiRNAのセンス鎖の発現カセットとアンチセンス鎖の発現カセットをタンデムに連結したもので、細胞内で各鎖が発現してアニーリングすることにより2本鎖のsiRNA(dsRNA)を形成するというものである。一方、後者はshRNAの発現カセットをベクターに挿入したもので、細胞内でshRNAが発現しdicerによるプロセシングを受けてdsRNAを形成するというものである。プロモーターとしては、polII系プロモーター(例えば、CMV前初期プロモーター)を使用することもできるが、短いRNAの転写を正確に行わせるために、polIII系プロモーターを使用するのが一般的である。polIII系プロモーターとしては、マウスおよびヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどが挙げられる。また、転写終結シグナルとして4個以上T残基が連続した配列が用いられる。
p53遺伝子の発現を阻害する他の物質として、p53に対するアンチセンス核酸やリボザイムが挙げられる。
アンチセンス核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase Hに認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、p53 mRNA中の配列だけでなく、p53遺伝子の初期転写産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてp53蛋白質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、p53 mRNAの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約15塩基程度、長いものでmRNAもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約15〜約40塩基、特に約18〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。標的配列の位置としては、5’-及び3’-UTR、開始コドン近傍などが挙げられるが、それらに限定されない。
あるいは、アンチセンス核酸やリボザイムは、siRNAの場合と同様に、それらをコードする核酸の形態で使用することもできる。
p53の機能阻害物質に加え、公知の他のiPS細胞樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をさらに高めることが期待できる。そのようなiPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤[例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA(例、HDAC1 siRNA Smartpool(登録商標)(Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等)等の核酸性発現阻害剤など]、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤[例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA(例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等)等の核酸性発現阻害剤など]、L-calcium channel agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、細胞内シグナル伝達の修飾剤[例えば、Wnt Signaling活性化剤(例えばsoluble Wnt3a)(Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008))、TGF-βの阻害剤、MEK阻害剤、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))]、他の天然もしくは合成低分子化合物(例、5’-azacytidine、thiazovivin、ビタミンC等)、ES細胞特異的miRNA(例えば、miR-302-367クラスター (Mol. Cell. Biol. doi:10.1128/MCB.00398-08、WO2009/075119)、miR-302 (RNA (2008) 14: 1-10)、miR-291-3p, miR-294およびmiR-295 (Nat. Biotechnol. 27: 459-461 (2009)))等が挙げられるが、それらに限定されない。前記において核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
他のiPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよく、該物質の物性に応じて、p53の機能阻害物質について上記したと同様のタイミングで体細胞と接触させることができる。
体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5-10% CO2/95-90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下(例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など)、10%以下(例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など)、または5%以下(例、4%以下、3%以下、2%以下など)である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上(例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など)、0.5%以上(例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.95%以上など)、または1%以上(例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など)である。
レトロウイルスによるヒトiPS細胞の樹立
初期化に用いるレトロウイルスはpMXsプラスミドおよびPlat-Eパッケージング細胞(東京大学、北村俊夫博士より供与された, Morita, S. et al., Gene Ther. 7, 1063-1066(2000))を元に作製した。pMXsのマルチクローニングサイトへ種々のコンストラクトを挿入して初期化に用いるレトロウイルスベクターを作製した。挿入したコンストラクトはヒトOct3/4(図1中O)、ヒトSox2(図1中S)、ヒトKlf4(図1中K)、ヒトc-Myc(図1中M)、ヒトLin28(図1中L)、ヒトNanog(図1中N)、ヒトL-Myc(図1中U)と、それぞれの遺伝子の翻訳領域を口蹄疫ウイルスの2A配列をはさんで繋げたコンストラクト(Fig. 1では、各遺伝子の略号(上記)をハイフンで結んで記載(例: O-M-L))である。陰性コントロールとしてGFPを用いた。
初期化に使用するレトロウイルスは、前日に6 well培養プレート (Falcon) に1 well当り0.6x106細胞で播種したPlat-E細胞に、前述のレトロウイルスベクターを導入して作製した。培養液はDMEM/10% FCS (DMEM (Nacalai tesque) にウシ胎仔血清を10%加えたもの) を使用し、37℃、5% CO2で培養した。ベクターの導入のためにFuGene6 transfection reagent (Roche) 4.5 μLをOpti-MEM I Reduced-Serum Medium (Invitrogen) 100 μLに入れ、室温で5分間静置した。その後、各発現ベクターを1.5 μg加え、さらに室温で15分静置してからPlat-Eの培養液に加えた。2日目にPlat-Eの上清を新しい培地に換え、3日目に培養上清を回収して0.45 μm sterile filter (Whatman)で濾過し、polybrene (Nacalai) を4 μg/mLとなるように加えてウイルス液とした。
実験には新生児白人の皮膚より樹立した線維芽細胞(Cell Applications) にレンチウイルスでマウスSlc7a1を導入した細胞を使用した。この線維芽細胞はDMEM/10% FCSを培養液として使用し、100 mm培養ディッシュで37℃、5% CO2の条件で培養し、維持した。初期化因子導入の前日に、培地を除き、PBS 5 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらDMEM/10% FCSを加えて懸濁し、1.3x105細胞を6 well培養プレート (Falcon) の1 wellへ播いておいた。
翌日に、Plat-E細胞を用いて産生したレトロウイルスをそれぞれ混和して、感染させた。24時間後に培地を交換して感染を終了した。感染開始から6日目にプレートの培地を除き、PBS 1 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらDMEM/10% FCSを加えて懸濁し、5x105細胞を、あらかじめフィーダー細胞を蒔いておいた100 mm dishに蒔いた。フィーダー細胞にはマイトマイシンCで処理して、細胞分裂を止めたSNL細胞を用いた。翌日に霊長類ES細胞用培地(リプロセル)に4 ng/mLとなる様にbFGF (Wako) を加えた培地に交換し、以後2日おきに培地交換を続けた。35日目にヒトES細胞様のコロニーを数えた。コロニーの写真とコロニー数を図1に、またコロニー数をカウントした結果のまとめを図2に示す。いずれの遺伝子の組み合わせにおいても、c-Mycの代わりにL-Mycを用いたほうが、ヒトiPSコロニー(ES様コロニー)の樹立効率が格段に高かった。またc-Myc、L-Mycのいずれを用いた場合も、Nanogを含む6遺伝子(図2中6 factors)よりもNanogを除いた5遺伝子(Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28、およびc-MycまたはL-Myc;図2中ctrl))を用いたほうが樹立効率が高かった。またL-Mycを用いた場合は、L-Myc-Lin28の順でつないでも(図2中U-L)、つないでいない場合(5遺伝子別々に導入した場合:図2中ctrl)に比して樹立効率は低下しなかった。
エピソーマルプラスミドによるヒトiPS細胞の樹立(1)
初期化に用いるプラスミドはpCX-EGFP(大阪大学、岡部勝博士より供与された, FEBS Letters, 407, 313-319, 1997)を元に作製した。はじめにEGFPの下流にウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)配列を挿入した。細胞内でこのベクターを複製させるためのカセットはpCEP4 (Invitrogen) のEBNA-1の両端にloxP配列を挿入して作製した。このEBNA-1とoriPを含むカセットを、前述のWPREを挿入したpCX-EGFPのBamHIサイトへ組み込み、これをpCXLE-EGFPと名付けた。このpCXLE-EGFPをEcoRIで処理し、EGFPの代わりに種々のコンストラクトを挿入して初期化に用いるプラスミドを作製した。挿入したコンストラクトは1)ヒトOct3/4、2)ヒトSox2およびヒトKlf4の各翻訳領域を口蹄疫ウイルスの2A配列をはさんで繋げたコンストラクト、3)ヒトKlf4、ヒトSox2およびヒトOct3/4の各翻訳領域を口蹄疫ウイルスの2A配列をはさんで繋げたコンストラクト、4)ヒトc-Myc、ヒトLin28およびNanogの各翻訳領域を口蹄疫ウイルスの2A配列をはさんで繋げたコンストラクラクト、および5)SV40 Large T antigenの5種であり(各コンストラクトはCAGプロモーターおよびウサギβ-グロビンpolyA配列の制御下にある)、それぞれpCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hKSO、pCXLE-hMLN、pCX-SV40LTと名付けた(pCX-SV40LTはWPRE配列、EBNA-1カセットおよびloxP配列のいずれも有してないプラスミドである)。
実験には36歳白人女性の顔の皮膚より樹立した線維芽細胞 (Cell Applications, Lot1388) を使用した。この線維芽細胞はDMEM/10% FCS (DMEM (Nacalai tesque) にウシ胎児血清を10%加えたもの) を培養液として使用し、100 mm 培養ディッシュで37℃、5% CO2の条件で培養し、維持した。プラスミド導入時には、培地を除き、PBS 5 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらDMEM/10% FCSを加えて懸濁し、6x105細胞を15 mL遠心チューブに回収した。800 rpmで5分間遠心して上清を除いた。プラスミド全量3 μg(pCXLE-hOct4 0.5 μg、pCXLE-hSK 1 μg、pCXLE-hKSO 0.5 μg、pCXLE-hMLN 0.5 μg、pCX-SV40LT 0.5 μg)を、Microporator(エアブラウン)を用いて細胞に導入した。導入時の条件は100 μLチップを用い、1650 V, 10 ms, 3回のパルスで行った。導入後の細胞はあらかじめDMEM/10% FCSを3 mL入れておいた6 well培養プレート (Falcon) へ移し、37℃、5% CO2の条件で6日間培養した。その後培地を除き、PBS 2 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらDMEM/10% FCSを加えて懸濁し、2x105の細胞を、あらかじめフィーダー細胞を蒔いておいた100 mm dishに蒔いた。フィーダー細胞としてはマイトマイシンC処理をしたMEFを使用した。翌日に霊長類ES細胞用培地(リプロセル)に4 ng/mLとなる様にbFGF (Wako) を加えた培地に交換し、以後2日おきに培地交換を続けた。26日目にヒトES細胞様コロニーが1個出現した。樹立時の写真を図3(左)に、3継代目のコロニーの写真を図3(右)に示す。2x105の細胞から1個のES様コロニーが樹立できた。
エピソーマルプラスミドによるヒトiPS細胞の樹立(2)
初期化に用いるプラスミドとして、実施例2におけるpCX-SV40LT以外の4種のプラスミド:pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hKSO、pCXLE-hMLNを用いた。
実験には36歳白人女性の顔の皮膚より樹立した線維芽細胞 (Cell Applications, Lot1388) を使用した。この線維芽細胞はDMEM/10% FCS (DMEM (Nacalai tesque) にウシ胎児血清を10%加えたもの) を培養液として使用し、100 mm 培養ディッシュで37℃、5% CO2の条件で培養し、維持した。プラスミド導入時には、培地を除き、PBS 5 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらDMEM/10% FCSを加えて懸濁し、6x105細胞を15 mL遠心チューブに回収した。800 rpmで5分間遠心して上清を除いた。プラスミド全量3 μg(pCXLE-hOct4 1 μg、pCXLE-hSK 1 μg、pCXLE-hKSO 0.5 μg、pCXLE-hMLN 0.5 μg)をMicroporator(エアブラウン)を用いて細胞に導入した。導入時の条件は100 μLチップを用い、1650 V, 10 ms, 3回のパルスで行った。導入後の細胞はあらかじめDMEM/10% FCSを3 mL入れておいた6 well培養プレート (Falcon) へ移し、37℃、5% CO2の条件で6日間培養した。その後培地を除き、PBS 2 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらDMEM/10% FCSを加えて懸濁し、1x105の細胞をあらかじめフィーダー細胞を蒔いておいた100 mm dishに蒔いた。フィーダー細胞としてはマイトマイシンC処理をしたMEFまたはSNL76/7を使用した。翌日に霊長類ES細胞用培地(リプロセル)に4 ng/mLとなる様にbFGF (Wako) を加えた培地に交換し、以後2日おきに培地交換を続けた。フィーダーとしてMEFを用いた場合、24日目にヒトES細胞様コロニーが1個出現した。樹立時の写真を図4(左)に、2継代目のコロニーの写真を図4(右)に示す。1x105の細胞から1個のES様コロニーが樹立できた。なお、フィーダーとしてSNL76/7を用いた場合はiPSコロニーは樹立できなかった。
エピソーマルプラスミドによるヒトiPS細胞の樹立(3)
実施例2及び3に示したように、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28およびNanogの6遺伝子、またはこれにSV40 large Tを加えた7遺伝子をエピソーマルプラスミドにて細胞に導入した場合は、1〜2x105の細胞から0個〜1個程度しかiPS細胞を樹立することができなかった。この誘導効率の低さに関しては、同じ7遺伝子を導入したScience, 324, 797-801 (2009) にも記載されている。そこで樹立効率の改善を目的として、実施例1の予備実験で良好な結果を得たL-Myc(L-Myc-Lin28連結コンストラクト)を使用し、また不要と判断されたNanogは用いないこととした。さらに、ヒトp53に対するshRNAをコードするDNA(5’-GACTCCAGTGGTAATCTACttcaagagaGTAGATTACCACTGGAGTC-3’(配列番号32):下線部がp53のターゲット配列。大文字がdsRNAを形成する部分。以下、単にp53 shRNAという)も使用した。
実施例2にて作製したpCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLNに加え、1)実施例2にて作製したpCXLE-EGFPをEcoRIで処理し、EGFPの代わりにヒトL-MycおよびヒトLin28の各翻訳領域を口蹄疫ウイルスの2A配列をはさんで繋げたコンストラクラクトを挿入したプラスミド(pCXLE-hUL)と、2)pCXLE-hOct4のBamHIサイトへp53に対するshRNA発現コンストラクト(U6プロモーターにより駆動される)を挿入したプラスミド(pCXLE-hOct4-shp53)とを作製し、使用した。またコントロールとしてpCXLE-EGFPを用いた。pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULの構造を図30に示す(図中、pCXLE-hOct4-shp53はpCXLE-hOct3/4-shp53と記載される)。
実験には21歳日本人女性の皮膚より樹立した線維芽細胞 (JCRB, TIG113) にレンチウイルスでマウスSlc7a1を導入した細胞を使用した。この線維芽細胞はDMEM/10% FCS (DMEM (Nacalai tesque) にウシ胎児血清を10%加えたもの) を培養液として使用し、100 mm 培養ディッシュで37℃、5% CO2の条件で培養し、維持した。プラスミド導入時には、培地を除き、PBS 5 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen)を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらDMEM/10% FCSを加えて懸濁し、6x105細胞を15 mL遠心チューブに回収した。800 rpmで5分間遠心して上清を除いた。表2に示す各プラスミド(トータル3 μg)をMicroporator(エアブラウン)を用いて細胞に導入した。導入時の条件は100 μLチップを用い、1650 V, 10 ms, 3回のパルスで行った。導入後の細胞はあらかじめDMEM/10% FCSを3 mL入れておいた6 well培養プレート (Falcon) へ移し、37℃、5% CO2の条件で7日間培養した。その後培地を除き、PBS 2 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらDMEM/10% FCSを加えて懸濁し、1.5x105の細胞をあらかじめフィーダー細胞を蒔いておいた100 mm dishに蒔いた。フィーダー細胞としてはマイトマイシンC処理をしたMEFまたはSNL76/7を使用した。翌日に、霊長類ES細胞用培地(リプロセル)に4 ng/mLとなる様にbFGF (Wako) を加えた培地に交換し、以後2日おきに培地交換を続けた。28日目に出現したヒトES細胞様のコロニーをカウントした。コロニーの写真を図5に、またコロニー数をカウントした結果を表2および図6(フィーダーがMEFの場合)に示す。
エピソーマルプラスミドによるヒトiPS細胞の樹立(4)
初期化に用いるプラスミドとして、実施例4と同じpCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN、pCXLE-hUL、pCXLE-hOct4-shp53の5種類のプラスミドと、コントロールとしてpCXLE-EGFPを用いた。
実験には6歳日本人女性の皮膚より樹立した線維芽細胞 (JCRB, TIG120) および8カ月齢日本人男性の皮膚より樹立した線維芽細胞 (JCRB, TIG121) のそれぞれにレンチウイルスでマウスSlc7a1を導入した細胞を使用した。これらの線維芽細胞はDMEM/10% FCS (DMEM (Nacalai tesque) にウシ胎児血清を10%加えたもの) を培養液として使用し、100 mm 培養ディッシュで37℃、5% CO2の条件で培養し、維持した。プラスミド導入時には、培地を除き、PBS 5 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen)を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらDMEM/10% FCSを加えて懸濁し、6x105細胞を15 mL遠心チューブに回収した。800 rpmで5分間遠心して上清を除いた。表3に示すプラスミド(トータル3 μg)をMicroporator(エアブラウン)を用いて細胞に導入した。導入時の条件は100 μLチップを用い、1650 V, 10 ms, 3回のパルスで行った。導入後の細胞はあらかじめDMEM/10% FCSを3 mL入れておいた6 well培養プレート (Falcon) へ移し、37℃、5% CO2の条件で7日間培養した。その後培地を除き、PBS 2 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらDMEM/10% FCSを加えて懸濁し、1x105の細胞をあらかじめフィーダー細胞を蒔いておいた100 mm dishに蒔いた。フィーダー細胞としてはマイトマイシンC処理をしたMEFまたはSNL76/7を使用した。翌日に、霊長類ES細胞用培地(リプロセル)に4 ng/mLとなる様にbFGF (Wako) を加えた培地に交換し、以後2日おきに培地交換を続けた。28日目に出現したヒトES細胞様のコロニーをカウントした。コロニーの写真を図7(TIG120を用いた場合)および図8(TIG121を用いた場合)に、またコロニー数をカウントした結果を表3、図9(TIG120を用い、フィーダーとしてMEFを用いた場合)および図10(TIG121を用い、フィーダーとしてMEFを用いた場合)に示す。
フィーダー細胞としてMEFを用いた場合とSNL76/7(MSTO)を用いた場合とを比較した結果を図11に示す(TIG120を用いた場合)。いずれのフィーダーを用いた場合もiPSコロニー(ES様コロニー)を樹立することができたが、MEFを使ったほうがより多くのコロニーを樹立することができた。
iPSコロニーにおける外来遺伝子の存在の有無の確認(1)
エピソーマルプラスミドで初期化遺伝子を導入して樹立した5種類の異なるiPS細胞を用いて、外来遺伝子のゲノム中への組み込みの有無等を調べた。
6 well培養プレート (Falcon) でほぼコンフルエントとなったiPS細胞を、PBS 2 mLを加えて洗浄した。PBSを除いた後、ゲノム回収バッファー(50 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS, 50 μg/mL proteinase K)を400 μL加えて細胞を溶かし、1.5 mLチューブに回収した後、細胞ライセートを55℃で一晩インキュベートした。ここにPCI(フェノール、クロロホルムおよびイソアミルアルコールを25:24:1で混和させたもの)を150 μL加えて、15分間混和した。これを13200 rpm、10分間遠心し、上層の水層を回収した。ここにエタノール1 mLを加えて、混和後に析出してきたものを別のチューブへ回収し、これをlong DNAとした。析出物を取り除いた後の液を13200 rpm、15分間遠心した。これで沈澱してきたものをshort DNAとした。いずれのDNAも70% エタノールで洗浄し、TEバッファーに溶かしてPCRの鋳型とした。PCRにはTaKaRa EX Taq (宝酒造) を使用し、一回の反応にlong DNA 50 ng、short DNA 250 ngをそれぞれ鋳型として用いた。プライマーは以下の組み合わせを使用した。
Klf4の検出; hKlf4-S1016 ACC CAT CCT TCC TGC CCG ATC AGA(配列番号33)
hKlf4-AS1170 ATC ACA AGT GTG GGT GGC GGT CCT(配列番号34)
c-Mycの検出; hMyc-S547 GCC GCC GCC TCA GAG TGC ATC GAC(配列番号35)
hMyc-AS947 CGA GTG GAG GGA GGC GCT GCG TAG(配列番号36)
pCEP4由来の; pEP4-SF1 TTC CAC GAG GGT AGT GAA CC(配列番号37)
OriPの検出 pEP4-SR1 TCG GGG GTG TTA GAG ACA AC(配列番号38)
OriPの検出時には元となった線維芽細胞のゲノム(50 ng)に導入したプラスミドを200, 20, 2 fg加えたもの(図12中「+plasmid」)をコントロールとして同時にPCRを行った。結果を図12に示す。いずれのiPS細胞においても、外来遺伝子(Tg)由来のKlf4およびc-Myc、並びにベクター成分のOriPは、long DNA(図12中L)およびshort DNA(図12中S)のどちらからも検出されなかったことから、導入したエピソーマルプラスミドは細胞から脱落したものと予想された。
エピソーマルプラスミドによるヒトiPS細胞の樹立(5)
様々な年齢の日本人及び白人男女の皮膚より樹立した線維芽細胞(HDF) を体細胞ソースとして用い、実施例5と同様にしてOct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28の5遺伝子およびp53 shRNAを、pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULを用いて導入した。フィーダー細胞はMSTOおよびMEFのいずれかを用いた。また線維芽細胞はマウスSlc7a1を導入した細胞、導入しなかった細胞のいずれも用意した。遺伝子導入27〜32日目に出現したヒトES細胞様のコロニーをカウントした結果(n=1〜5)をまとめて表4に示す。
一過性発現プラスミドによるp53shRNAの導入
p53遺伝子は癌抑制遺伝子として知られており、p53の長期的な機能阻害は発癌のリスクを高める可能性がある。そこで、p53 shRNAを一過性の発現ベクター(EBNA-1とoriPを有さない通常のプラスミドベクター:以下プラスミドベクター)により発現させた場合でも、エピソーマルベクター同様にiPS細胞が樹立できるかどうかを検討した。
まず予備実験として、エピソーマルベクターとプラスミドベクターの遺伝子発現の消失の程度に差があるかどうかを検討した。実験には、pCX-EGFP(大阪大学、岡部勝博士より供与された, FEBS Letters, 407, 313-319, 1997)、実施例2で作製したpCXLE-EGFP、およびpCXLE-EGFPからloxP配列を除いたプラスミドであるpCXE-EGFPを用いた。各プラスミドをHDF1419に導入し、導入後6日目および14日目にGFPの発現を観察した。なお導入時の条件はMicroporatorにより、100 μLチップを用いて 1650 V, 10 ms, 3回のパルスで行った。結果を図13に示す。いずれのプラスミドでも6日目にGFPによる蛍光が認められたが、発現量はpCX-EGFPが他の2つに比べ低かった。14日目になるとまだ蛍光が認められるもののpCX-EGFPの発現量は他の2つに比較し顕著に低かった。以上によりプラスミドベクターはエピソーマルベクターと比べて遺伝子発現の消失が早いことが確認された。
次にp53 shRNAをプラスミドベクターで導入した場合にもiPS細胞が樹立できるかどうかを検討した。導入には以下のプラスミドベクターまたはエピソーマルベクターを用いた。
(a) pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN
(b) pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hMLN、pSilencer-shp53
(pSilencer-shp53はpSilencerTM(Ambion)のU6プロモーターの下流にp53 shRNAを組み込んだもの)
(c) pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL
(d) pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL、pSilencer-shp53
導入にはそれぞれ0.75 μg((b)および(d))もしくは1 μg((a)および(c))のベクターを用い、合計3 μgを使用した。
体細胞として36歳白人女性の皮膚より樹立した線維芽細胞(HDF1388)を、またフィーダー細胞としてMEFを用い、実施例5と同様にしてiPS細胞の樹立を行った。なお導入時の条件はMicroporatorにより、100 μLチップを用いて 1650 V, 10 ms, 3回のパルスで行った。導入27日目に出現したヒトES細胞様のコロニーをカウントした結果を図14に示す。上記(a)と(b)(図14中、+M-L-NのEpiとTrans)、(c)と(d)(図14中、+U-LのEpiとTrans)のどちらの比較においても、p53 shRNAをエピソーマルベクターで導入した場合とプラスミドベクターで導入した場合とで樹立コロニー数に大差は無く、プラスミドベクターによる導入でも十分にiPS細胞が樹立できることが分かった。
HLAホモ健常人由来歯髄幹細胞からのiPS細胞の樹立
HLA-A、HLA-B、HLA-CwおよびHLA-DRB1の4遺伝子座がホモの健常人由来の歯髄幹細胞(DP74株およびDP94株)は、岐阜大学、國貞隆弘博士、手塚健一博士より提供を受けた。このDP74株およびDP94株は、J. Dent. Res., 87(7): 676-681 (2008) およびWO 2010/013359に記載の方法に基づき樹立された。両細胞株の上記4つのHLA遺伝子型と、そのアレル頻度(この4つのHLA遺伝子型を持つアレル(ハプロタイプ)の、日本人の全アレルにおける頻度)を表5に示す。
pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULをDP74およびDP94に導入して樹立したiPS細胞の写真を図15に示す。また、導入28日目に出現したヒトES細胞様のコロニーをカウントした結果を図16および図17に示す(数値は3回の実験の平均値と標準偏差を示す)。DP74株 (図16) およびDP94株 (図17) のいずれの場合もOct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28の5遺伝子およびp53 shRNA(pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hUL)を導入した場合が最も樹立効率が高く、HDFと同様の良好な結果が得られた。
iPSコロニーにおける外来遺伝子の存在の有無の確認(2)
予備検討としてpCXLE-EGFPをHDFに導入し、EGFPの発現がどのように消失していくかを検討した。導入後1週目〜4週目まで毎週、1×104個の細胞におけるEGFPの発現量(蛍光強度)をFACS解析した。結果を図18に示す。EGFPの発現量および発現細胞数は週を追うごとに減少し、遺伝子導入から4週後にはGFP陽性細胞はわずか2.4%に減少していた。
次に、pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULをHDFに導入して作製した、樹立直後のiPSクローン18種類を用いて、外来遺伝子の存在の有無を確認した。
0.2 mLチューブにゲノム回収バッファー(TaKaRa Ex Taq用バッファーに167 μg/mL proteinase Kを加えたもの)を5 μL分注しておき、遺伝子導入から30日目の個々のiPS細胞のコロニーを物理的にディッシュから剥してこのチューブに回収した。回収後、チューブを55℃で3時間インキュベートして細胞ライセートを得た。H2Oを10 μL加えたのちに95℃で3分間加熱してProteinase Kを失活させた。これをそのままリアルタイムPCRの鋳型として用いた。PCRにはSYBR Premix EX Taq II (宝酒造) を使用した。エピソーマルベクターのコピー数を計算するためにEBNA-1用のPCRプライマー対を、また、細胞数を見積もるために内在のFBXO15遺伝子座用の別のプライマー対をデザインした。
EBNA-1プライマー(エピソーマルベクターの検出用)
EBNA-183F ATC AGG GCC AAG ACA TAG AGA TG(配列番号39)
EBNA-243R GCC AAT GCA ACT TGG ACG TT(配列番号40)
Fbx15プライマー(内在性アレルの検出用)
hFbx15-2F GCC AGG AGG TCT TCG CTG TA(配列番号41)
hFbx15-2R AAT GCA CGG CTA GGG TCA AA(配列番号42)
Fbx15の増幅量から反応液中の細胞数を求め、これでEBNA-1の増幅量を補正することで、1×104細胞あたりのエピソーマルベクターのコピー数を算出した。結果を図19に示す。18クローンの平均値は1×104細胞あたりわずか20.3±13.7コピーであったことから、遺伝子導入30日経過後は極めて僅かの外来遺伝子(エピソーマルベクター)しか残っていないことが明らかとなった。
次に、細胞を継代培養する以外は同じ実験を行った。
1× Ex Taqバッファー (Takara) および167 μg/ml プロテイナーゼKからなる新鮮な細胞溶解液を調製した。樹立したiPS細胞を解析するために、60 mmディッシュ中で培養した細胞を、CTK処理によるフィーダー細胞除去後に、セルスクレイパーを用いて集めた。該細胞をチューブに入れて遠心した後、細胞ペレットを200 μlの溶解液で溶解した。55℃で3時間インキュベーションした後、95℃でプロテイナーゼKを失活させ、ライセートを定量的PCR解析に用いた。増幅標準には、FBXO15とEBNA-1の両方のアンプリコンを有するpCXLE-hFbx15-cont2プラスミドを用いた。
DP由来epi-iPS細胞の結果を図31Aに示す。トランスフェクションの6日後に、細胞あたり約200コピーのエピソーマルベクターが検出された。対照的に、試験した7クローン中5クローンにおいて、EBNA-1 DNAは全く検出できなかった。残りの2クローンにおいては、それぞれ-0.001および2コピーが検出された(図31A)。後者のクローンは、おそらくプラスミドが染色体中に組み込まれているだろう。
線維芽細胞由来のepi-iPS細胞の結果を図31Bに示す。404C-2および409B-2を含むいくつかのクローンにおいて、エピソーマルベクターは全く検出できなかった。これらのデータから、epi-iPSCクローンの大部分においてエピソーマルベクターが自然消失していることが示された。
iPSコロニーにおける外来遺伝子の発現の有無の確認
pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULをHDFに導入して作製した、樹立後5から9継代目のiPSクローン9種類を用いて、外来遺伝子の発現の有無を確認した。
6-wellプレートの1ウェルのiPS細胞から全RNAを抽出し、このうち1 μgをプライマーdT(20) および逆転写酵素Rever Tra Ace(TOYOBO)を用いてmRNAを相補鎖DNAへと逆転写した。反応物の最終容量は、20 μLであった。この逆転写物にH2Oを60 μL加えた。そのうちの1 μL(12.5 ngのRNA量に相当)を鋳型として、以下の表6に記載した、外来性遺伝子の発現量と内在性遺伝子の発現量を合わせた発現量(トータル発現量)測定用、および外来性遺伝子発現量測定用のプライマーセットを用いて、SYBR Green IIを指標として導入遺伝子ごとに定量PCRを行った。増幅のための条件は以下の通りであった。95℃/30秒で1サイクル、次に(94℃/10秒、60℃/10秒、72℃/30秒)を50サイクル。
ヒトEpi-iPS細胞の特性解析
1) マイクロアレイ解析およびCGHアレイ解析
pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULを皮膚由来線維芽細胞(TIGおよびHDF)に導入して樹立したヒトiPS細胞、ヒトES細胞、および導入に用いたTIGおよびHDFの遺伝子発現パターンに違いがあるかどうか調べるために、DNAマイクロアレイ解析を行った。解析はCell, 131, 861-872 (2007) に記載の手法にて行った。各細胞間の相関係数を表7に示す。
また、CGHアレイ解析を行った結果を図24に示す。導入に用いたTIG細胞と比較した結果、特に大きな異常は認められなかった。また、幾つかについてはGバンド染色による核型解析を行ったが、異常は認められなかった。
なお、以上の実験には以下のアレイとスキャナを用いて行った。
・アレイ ヒトGE用:G4112F Whole Human Genome Microarray Kit, 4 x 44K(Agilent)
・アレイ ヒトCGH用:G4426B#14950 Human Genome CGH Microarray Kit 4x44K(Agilent)
・スキャナ:DNA Microarray Scanner, Model G2539A
2) RT-PCR解析
Epi-iPS細胞におけるOCT3/4、SOX2、NANOGおよびESG1等の多能性幹細胞マーカーの発現を調べた。DP由来epi-iPS細胞の結果を図32Aに示し、線維芽細胞由来epi-iPS細胞の結果を図32Bに示す。RT-PCR解析の結果、epi-iPSCクローンはこれらの遺伝子を、hESCやレトロウイルスにより誘導されたiPSCクローンに匹敵するレベルで発現していることが明らかとなった。
3) バイサルファイトシークエンス解析
フィーダー細胞を除去した後、iPS細胞からゲノミックDNAを抽出し、以前に記載したようにして解析した (K.Takahashi et al, Cell 131, 861 (Nov.30, 2007))。
NANOGのプロモーター領域中のCpG部位のDNAメチル化レベルは親HDFおよびDP細胞では高かったが、epi-iPSおよびES細胞では低かった(図33)。
4) テラトーマ形成
インビボでのepi-iPSCの分化能を調べた。CTK溶液を用いて細胞を集め、遠心した。細胞ペレットをDMEM/F12に再懸濁した。コンフルエントな60 mmディッシュから細胞の半分をSCIDマウス(CREA, 日本)の精巣に注射した。注射から8〜12週間後に腫瘍を切除し、PBS中で4% パラホルムアルデヒドを用いて固定した。パラフィン包埋した組織を切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。結果を図34に示す。組織学的試験から、これらの腫瘍はテラトーマであり、神経上皮、軟骨、筋肉および腸管様上皮を含む、三胚葉系列の全ての組織を含んでいることが確認された(図34A, B)。
5) インビトロ分化
BMPアンタゴニストとアクチビン/Nodal阻害剤による二重SMAD阻害 (M.Eiraku et al, Cell Stem Cell 3, 519 (2008)) と組み合わせた胚様体様の凝集体の無血清培養(SFEB)法を用いて、ドーパミン産生ニューロンへのインビトロ指向性分化を実施した。
ドーパミン産生ニューロンの誘導のために、以下の分化培地を調製した: 5% Knockout Serum Replacement (KSR; Invitrogen)、2 mM グルタミン、0.1 mM 非必須アミノ酸および0.1 mM 2-メルカプトエタノールを補充したDMEM/F12。Accumax (Invitrogen) 中でiPS細胞を単一細胞に解離させ、96-ウェル低細胞接着プレート (LIPIDURE-COAT PLATE A-U96, NOF Corporation)を用いて、10 μM Y-27632、2 μM ドルソモルフィンおよび10 μM SB431542 (Sigma) を補充した分化培地中に、9000細胞/150 μl/ウェルの密度で再凝集させた。培養5日後に、細胞凝集体を100 ng/ml FGF-8および20 ng/ml Wnt1で刺激した。8日目から、200 ng/ml SHHを培地に加えた。12日目に、凝集した細胞を回収して、200 ng/ml SHHを含むNB培地 (B27サプリメントを含有するNeurobasal培地; Invitrogen) 中、ポリオルニチン/ラミニンでコーティングした60 mmディッシュに移した。その後15日目に、培地を1 ng/ml FGF-20および12.5 ng/ml bFGFを含むNB培地に変更した。22日目に細胞を集め、2 ng/ml GDNF、20 ng/ml BDNF、 400 μM dbcAMPおよび200 μM アスコルビン酸を補充したNB培地中、8-ウェルチャンバープレート上に、ウェルあたり2 × 105個の密度で播種した。29日目に、分化した細胞を免疫染色分析のために固定した。ネスチン (Chemicon)、Ki67 (Novocastra)、Pax6 (Covance)、βIII-チューブリン (Covance Research Products)、チロシンヒドロキシラーゼ(Chemicon)、MAP2ab (Sigma) およびVAMT-2 (PelFreeze) に対する1次抗体を用いた。Alexa488、Alexa594またはCy5を結合した2次抗体を適切に用いた。核を可視化するために、200 ng/mlの4’,6’-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)を最後の洗浄の際に加えた。
結果を図35に示す。大部分の細胞が未熟な神経マーカーであるネスチンを発現していた(図35B-A)。まだ増殖中でKi67陽性の細胞もあった(図35B-B,C,D)。未熟な神経細胞集団はPax6陽性であったのに対し、より成熟した細胞集団は、SHHやFGF8等の誘導因子で処理した後、ドーパミン産生ニューロンのマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)を発現した(図35B-E, 35B-F)。また、TH陽性細胞は神経マーカーのTuj1およびMAP2ab、並びにドーパミントランスポーターであるVMAT2と共局在していた (図35A-E,F,G, 35B-G,H,I.J,K)。従って、epi-iPSCはドーパミン産生ニューロンに分化する能力を有している。Y3混合物(pCXLE-hOct4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL)を用いて樹立したepi-iPSCについても、同様の解析(RT-PCR、コピー数分析、核型分析およびテラトーマ形成)を行った。その結果、Y4混合物(pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL)を用いて樹立したepi-iPSCに比して遜色ないepi-iPSCであることが示された。各epi-iPSCクローンの解析リストを表8に示す。
異種成分不含(Xeno-free)条件下でのiPS細胞の樹立および培養
エピソーマルベクターを用いて樹立したiPS細胞を再生医療分野で利用するためには、Xeno-free条件下でのiPS細胞の樹立および維持が重要なポイントである。そこで以下の検討を行った。
1)歯髄幹細胞株のフィーダー細胞としての使用
遺伝子導入に用いたヒト皮膚由来線維芽細胞(HDF)をフィーダー細胞として用いた場合でも、ヒトiPS細胞を樹立・維持できることが知られている(Takahashi et al., PLoSone, vol.4, issue 12, e8067 (2009))。自己のフィーダー細胞を用いることで、Xeno-free条件下でのiPS細胞の維持が可能となるため、臨床応用における意義は大きい。そこで歯髄幹細胞株DP74をフィーダー細胞として用いることができるかどうかを検討した。iPS細胞はpCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULをHDFに導入して樹立したヒトiPS細胞を用い、培養液は通常の霊長類ES細胞用培地(リプロセル)に4 ng/mLとなる様にbFGF (Wako) を加えた培地(以下リプロセル培地)を用いた。1継代後の細胞の写真を図25に示す。フィーダー細胞としてMSTOを用いた場合と比較して遜色なくES様形態が維持された。
2)Xeno-free条件下でのiPS細胞の維持(1)
Xeno-free培地であるTeSR2(Stemcell Technologies)およびXeno-freeのプレートコーティング剤であるCELLstart (GIBCO) を用い(feeder細胞は使わず)、完全なXeno-free条件下でiPS細胞が維持できるかどうかを検討した。iPS細胞はpCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULをHDFに導入して樹立したヒトiPS細胞を用いた。1継代後の細胞の写真を図26に示す。リプロセル培地では細胞形態が変化し始めているが、TeSR2を用いた場合では未分化な形態を維持していた。
3)Xeno-free条件下でのiPS細胞の維持(2)
Xeno-free培地であるTeSR2(Stemcell Technologies)およびKSR-XF(KnockOut DMEM(Invitrogen)に15% KnockOut SR XenoFree(Invitrogen), 2 mM GlutaMAX-I(Invitrogen), 0.1 mM 非必須アミノ酸(Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol(Invitrogen)および8 ng/mL bFGF(Wako)を加えたもの)を用い、フィーダー細胞としてDP74株を用いてiPS細胞が維持できるかどうかを検討した。iPS細胞はpCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULをHDFに導入して樹立したヒトiPS細胞を用いた。1継代後の細胞の写真を図27に示す。いずれのXeno-free培地を用いた場合も、ES様形態が維持された。
Xeno-free条件下での遺伝子導入
iPS細胞樹立後だけでなく、樹立前、すなわち体細胞に初期化遺伝子を導入する段階も、同様にXeno-free条件が可能かどうか検討を行った。
予備検討として、Microporatorを用いてDP74にpCXLE-EGFPを導入した。Xeno-free培地としてStemPro MSC-SFM (Invitrogen)を用いた。
DP74はStemPro MSC-SFM (Invitrogen) を培養液として使用し、CELLstartでコートした100 mm 培養ディッシュで37℃、5% CO2の条件で培養し、維持した。pCXLE-EGFP導入時には、培地を除き、PBS 5 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、Xeno-freeの細胞剥離用液であるTripLE select (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらStemPro MSC-SFMを加えて懸濁し、15 mL遠心チューブに回収した。800 rpmで5分間遠心して上清を除いた。再びStemPro MSC-SFMに懸濁した後、6x105細胞を1.5 mLチューブに回収した。800 rpmで5分間遠心して上清を除いた。pCXLE-EGFP(3 μg)をMicroporatorを用いて細胞に導入した。導入時の条件は100 μLチップを用い、1850 V, 20 ms, 1回のパルスか、または1200 V, 30 ms, 2回のパルスで行った。導入後の細胞はあらかじめCELLstartでコートして、StemPro MSC SFMを3 mL入れておいた6 well培養プレート (Falcon) へ移し、37℃、5% CO2の条件で7日間培養した。結果を図28に示す。Xeno-free培地(StemPro MSC-SFM)を用いた場合は、1850 V, 20ms, 1回の条件では導入効率が低かった。しかし1200 V, 30 ms, 2回の条件に変更することにより、細胞生存率と導入効率は上昇した。従って、この条件で以降の遺伝子導入を行うことにした。
初期化に用いるプラスミドとして、pCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULの3種類のプラスミドを用いた。実験には歯髄幹細胞DP74株を使用した。DP74株はStemPro MSC-SFMを培養液として使用し、CELLstartでコートした100 mm 培養ディッシュで37℃、5% CO2の条件で培養し、維持した。プラスミド導入時には、培地を除き、PBS 5 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、TripLE select (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらStemPro MSC-SFMを加えて懸濁し、15 mL遠心チューブに回収した。800 rpmで5分間遠心して上清を除いた。再びStemPro MSC-SFMに懸濁した後、6x105細胞を1.5 mLチューブに回収した。800 rpmで5分間遠心して上清を除いた。3種のプラスミド(各1 μg、合計3 μg)をMicroporatorを用いて細胞に導入した。導入時の条件は100 μLチップを用い、1200 V, 30 ms, 2回のパルスで行った。導入後の細胞はあらかじめCELLstartでコートして、StemPro MSC-SFMを3 mL入れておいた6 well培養プレート (Falcon) へ移し、37℃、5% CO2の条件で7日間培養した。そののち培地を除き、PBS 2 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、TripLE select (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらStemPro MSC-SFMを加えて懸濁し、15 mL遠心チューブに回収した。800 rpmで5分間遠心して上清を除いた。再びStemPro MSC-SFMに懸濁した後、1x105の細胞を、表9に示す各種条件で100 mm dishに蒔いた。翌日に表9に示す培地に交換し、以後2日おきに培地交換を続けた。導入後26日目に出現したヒトES細胞様のコロニーの写真を図29に示す。
ヒト末梢血単核細胞からのiPS細胞の樹立
3 μgの発現プラスミド (1 μgのpCXLE-hOct4-shp53、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hUL) を、Nucleofector (Lonza) とHuman T cell kitを製造者の指示に従って用い、新たに単離した末梢血単核細胞 (5.0x106) に、エレクトロポレーションにより導入した。プログラムV-24の条件を用いた。6時間後、トランスフェクトした血液細胞をサイトカイン (IL-6、sIL-6R、SCF、TPO、Flit3/4リガンドおよびIL-2) および抗CD3/CD28抗体で刺激した。2日後に、細胞をMEFフィーダーで覆った6-ウェルプレート上に播種した。次いで、図36aに示すように、播種後培養培地を、IL-6、sIL-6R、SCF、TPO、Flit3/4リガンドおよびIL-2を補充したX-vivo 10から、hES培地に徐々に変更した。29日目にコロニーの写真を撮影した(図36b)。平坦なhESC様の形態を有するヒトiPSコロニーを樹立することができた。
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
本願は、米国仮特許出願第61/232,402号および第61/307,306号を基礎としており、それらの内容は、ここで参照することにより本願に組み込まれるものである。
Claims (23)
- (a) Oct3/4もしくはそれをコードする核酸、(b) Klf4もしくはそれをコードする核酸、および(c) Sox2もしくはそれをコードする核酸、並びに(d1) L-Mycもしくはそれをコードする核酸および/または(d2) p53の機能阻害物質を、体細胞に接触させることを含む、iPS細胞の製造方法。
- さらに(e) Lin28もしくはLin28bまたはそれをコードする核酸を体細胞に接触させることを含む、請求項1記載の方法。
- p53の機能阻害物質が、p53に対するsiRNA、shRNAおよびそれらをコードするDNAからなる群より選択される核酸である、請求項1または2記載の方法。
- (a) Oct3/4をコードする核酸、(b) Klf4をコードする核酸、(c) Sox2をコードする核酸、(d1) L-Mycをコードする核酸および/または(d2) p53に対するshRNAをコードする核酸、並びに(e) Lin28もしくはLin28bをコードする核酸を、体細胞に導入することを含む、請求項2または3記載の方法。
- 前記の(a)、(b)、(c)、(d1)および(e)からなる群より選択される少なくとも1つの核酸がエピソーマルベクターの形態で導入される、請求項4記載の方法。
- (d2) p53に対するshRNAをコードする核酸が細胞内で自律複製できないプラスミドベクターの形態で導入される、請求項4または5記載の方法。
- エピソーマルベクターが、50%以上の頻度で、5継代までにiPS細胞から脱落する自己消失型ベクターである、請求項5または6記載の方法。
- エピソーマルベクターが、前記の核酸の複製に必要なベクター要素の5’側および3’側にloxP配列を同方向に配置したものである、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 細胞をCreリコンビナーゼで処理する工程を含まない、請求項8記載の方法。
- 体細胞がヒト由来である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の(a)、(b)、(c)並びに(d1)および/または(d2)、あるいはさらに(e)の因子を体細胞に接触させる時点から、iPS細胞が樹立されるまでの間、細胞を非ヒト動物由来の成分の非存在下で培養することを含む、請求項10記載の方法。
- ヒト細胞をフィーダー細胞として用いるか、フィーダー細胞を用いないことを特徴とする、請求項11記載の方法。
- フィーダー細胞が体細胞と同一個体に由来する、請求項12記載の方法。
- (a) Oct3/4をコードする核酸、(b) Klf4をコードする核酸、(c) Sox2をコードする核酸、(d1) L-Mycをコードする核酸および/または(d2) p53に対するshRNAをコードする核酸、並びに(e) Lin28もしくはLin28bまたはそれをコードする核酸を含有してなる、iPS細胞誘導促進剤。
- 前記の(a)、(b)、(c)、(d1)および(e)からなる群より選択される少なくとも1つの核酸がエピソーマルベクターの形態である、請求項14記載の剤。
- (d2) p53に対するshRNAをコードする核酸が細胞内で自律複製できないプラスミドベクターの形態である、請求項14または15記載の剤。
- エピソーマルベクターが、50%以上の頻度で、5継代までにiPS細胞から脱落する自己消失型ベクターである、請求項15または16記載の剤。
- エピソーマルベクターが、前記の各核酸の複製に必要なベクター要素の5’側および3’側にloxP配列を同方向に配置したものである、請求項15〜17のいずれか1項に記載の剤。
- 請求項5〜9のいずれか1項に記載の方法により得られる、前記の各核酸がゲノムに組み込まれることなく除去されたiPS細胞。
- ヒト由来である、請求項19記載のiPS細胞。
- 請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法により得られる、非ヒト動物由来の成分の混入のないヒトiPS細胞。
- 体細胞の製造における、請求項19〜21のいずれか1項に記載のiPS細胞の使用。
- 体細胞の製造における細胞ソースとしての、請求項19〜21のいずれか1項に記載のiPS細胞。
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Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013528397A (ja) * | 2010-06-15 | 2013-07-11 | セルラー ダイナミクス インターナショナル, インコーポレイテッド | 少量の末梢血からの人工多能性幹細胞の作製 |
WO2014192312A1 (ja) * | 2013-05-31 | 2014-12-04 | 国立大学法人 東京医科歯科大学 | 正常な内向きのカリウム電流特性を有するiPS細胞由来心筋モデル細胞 |
JP2017513498A (ja) * | 2014-04-24 | 2017-06-01 | ボード・オブ・リージエンツ,ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム | 養子細胞治療製品を製造するための誘導多能性幹細胞の適用 |
JPWO2016117510A1 (ja) * | 2015-01-20 | 2017-10-26 | 京都府公立大学法人 | 神経系細胞の製造方法 |
JP2019528771A (ja) * | 2016-10-05 | 2019-10-17 | フジフィルム セルラー ダイナミクス,インコーポレイテッド | 多能性幹細胞からhlaホモ接合免疫細胞への指向分化方法 |
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Families Citing this family (85)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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EP3409762A1 (en) | 2008-03-17 | 2018-12-05 | The Scripps Research Institute | Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells |
EP2268796A1 (en) * | 2008-03-17 | 2011-01-05 | Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Vectors and methods for generating vector-free induced pluripotent stem (ips) cells using site-specific recombination |
WO2010013845A1 (en) * | 2008-07-30 | 2010-02-04 | Kyoto University | Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells |
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EP2480657B1 (en) * | 2009-09-24 | 2018-01-17 | Kyoto University | Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells |
CN102741394B (zh) | 2009-10-16 | 2016-05-04 | 斯克里普斯研究所 | 多能细胞的诱导 |
AU2010315166B2 (en) | 2009-11-04 | 2015-01-22 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Episomal reprogramming with chemicals |
WO2011102531A1 (en) | 2010-02-16 | 2011-08-25 | Kyoto University | Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells |
WO2011119942A1 (en) * | 2010-03-25 | 2011-09-29 | Vistagen Therapeutics, Inc. | Induction of ips cells using transient episomal vectors |
WO2011123572A1 (en) | 2010-03-31 | 2011-10-06 | The Scripps Research Institute | Reprogramming cells |
ES2685171T3 (es) | 2010-06-14 | 2018-10-05 | The Scripps Research Institute | Reprogramación de células a un nuevo destino |
US9447408B2 (en) | 2010-09-14 | 2016-09-20 | Kyoto University | Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells |
CA2814713A1 (en) * | 2010-10-14 | 2012-04-19 | University Of Central Florida Research Foundation, Inc. | Cardiac induced pluripotent stem cells and methods of use in repair and regeneration of myocardium |
US9732319B2 (en) | 2010-12-22 | 2017-08-15 | Fate Therapeutics, Inc. | Cell culture platform for single cell sorting and enhanced reprogramming of iPSCs |
WO2012136841A1 (en) * | 2011-04-08 | 2012-10-11 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method for rejuvenating cells |
JP5761826B2 (ja) | 2011-04-08 | 2015-08-12 | 国立大学法人大阪大学 | 改変ラミニンおよびその利用 |
US10865383B2 (en) | 2011-07-12 | 2020-12-15 | Lineage Cell Therapeutics, Inc. | Methods and formulations for orthopedic cell therapy |
WO2013022022A1 (ja) * | 2011-08-08 | 2013-02-14 | 国立大学法人京都大学 | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 |
WO2013074916A1 (en) | 2011-11-18 | 2013-05-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Car+ t cells genetically modified to eliminate expression of t- cell receptor and/or hla |
US20130157368A1 (en) * | 2011-12-20 | 2013-06-20 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Induced pluripotent stem cells prepared from human kidney-derived cells |
US20130157365A1 (en) * | 2011-12-20 | 2013-06-20 | Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc | Induced pluripotent stem cells from human umbilical cord tissue-derived cells |
US10119150B2 (en) * | 2012-05-13 | 2018-11-06 | Allele Biotechnology & Pharmaceuticals, Inc. | Feeder-free Derivation of human-induced pluripotent stem cells with synthetic messenger RNA |
US10155929B2 (en) * | 2012-05-13 | 2018-12-18 | Allele Biotechnology & Pharmaceuticals, Inc. | Feeder-free derivation of human-induced pluripotent stem cells with synthetic messenger RNA |
SG11201407917PA (en) | 2012-05-23 | 2015-01-29 | Univ Kyoto | Highly efficient method for establishing artificial pluripotent stem cell |
CN102965393B (zh) * | 2012-11-06 | 2015-08-26 | 上海交通大学 | 人诱导多能干细胞的制备方法及其用途 |
EP2951290B1 (en) | 2013-02-01 | 2017-11-29 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Method for generating retinal pigment epithelium (rpe) cells from induced pluripotent stem cells (ipscs) |
WO2015006725A2 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Cedars-Sinai Medical Center | Generation of induced pluripotent stem cells from normal human mammary epithelial cells |
CN103571794B (zh) * | 2013-07-19 | 2016-01-20 | 中国医学科学院血液病医院(血液学研究所) | 一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法 |
CN103725710B (zh) * | 2013-12-25 | 2015-10-28 | 北京济福霖生物技术有限公司 | 一种可自我删除游离载体及其应用 |
CN103740756B (zh) * | 2013-12-25 | 2015-08-05 | 中国农业大学 | 一种可调控删除的非病毒游离载体及其构建方法 |
CN103740757B (zh) * | 2014-01-21 | 2016-04-20 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种利用重编程制备猪神经干细胞的方法 |
CN104830906B (zh) | 2014-02-12 | 2018-09-04 | 北京维通达生物技术有限公司 | 一种重编程获得功能性人肝脏实质细胞的方法 |
PT3114214T (pt) | 2014-03-04 | 2024-01-03 | Fate Therapeutics Inc | Métodos de reprogramação melhorados e plataformas de cultura celular |
US10344285B2 (en) | 2014-04-09 | 2019-07-09 | Dna2.0, Inc. | DNA vectors, transposons and transposases for eukaryotic genome modification |
US20170107498A1 (en) * | 2014-06-05 | 2017-04-20 | Cedars-Sinai Medical Center | Novel and efficient method for reprogramming immortalized lymphoblastoid cell lines to induced pluripotent stem cells |
US10767165B2 (en) * | 2015-01-30 | 2020-09-08 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Reprogramming method for producing induced pluripotent stem cells (iPSC) |
KR102648489B1 (ko) | 2015-04-06 | 2024-03-15 | 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 | Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna |
EP3332020B1 (en) * | 2015-08-07 | 2023-12-20 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established under The Will of J. David Gladstone | Method of determining cellular protein homeostasis |
CA2997763A1 (en) | 2015-09-08 | 2017-03-16 | Cellular Dynamics International, Inc. | Macs-based purification of stem cell-derived retinal pigment epithelium |
EP3347456B1 (en) | 2015-09-08 | 2023-12-27 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Method for reproducible differentiation of clinical-grade retinal pigment epithelium cells |
EP3359671B1 (en) | 2015-10-08 | 2021-08-18 | Dna Twopointo Inc. | Dna vectors, transposons and transposases for eukaryotic genome modification |
JP7263005B2 (ja) | 2015-10-16 | 2023-04-24 | フェイト セラピューティクス,インコーポレイテッド | 基底状態の多能性の誘導及び維持に関するプラットフォーム |
JP6976939B2 (ja) | 2015-10-20 | 2021-12-08 | フジフィルム セルラー ダイナミクス,インコーポレイテッド | 遺伝的プログラミングによる多系統造血前駆細胞の作製 |
CN109072198B (zh) | 2016-04-22 | 2022-08-26 | 国立大学法人京都大学 | 产多巴胺神经祖细胞的制备方法 |
EP3448401B1 (en) * | 2016-04-29 | 2021-10-27 | Virogin Biotech Canada Ltd | Hsv vectors with enhanced replication in cancer cells |
GB201608944D0 (en) * | 2016-05-20 | 2016-07-06 | Ospedale San Raffaele And Fond Telethon | Gene Tharapy |
US10221395B2 (en) | 2016-06-16 | 2019-03-05 | Cedars-Sinai Medical Center | Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells |
US11572545B2 (en) | 2016-06-16 | 2023-02-07 | Cedars-Sinai Medical Center | Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells |
CA3029582A1 (en) | 2016-07-01 | 2018-01-04 | Research Development Foundation | Elimination of proliferating cells from stem cell-derived grafts |
EP3491134B1 (en) | 2016-08-01 | 2023-10-11 | University of Pittsburgh - of The Commonwealth System of Higher Education | Human induced pluripotent stem cells for high efficiency genetic engineering |
EP3510151A4 (en) | 2016-09-09 | 2020-04-15 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | HIGH-THROUGHPUT PRECISION GENE EDITING |
WO2018067826A1 (en) | 2016-10-05 | 2018-04-12 | Cellular Dynamics International, Inc. | Generating mature lineages from induced pluripotent stem cells with mecp2 disruption |
US11458225B2 (en) | 2016-11-09 | 2022-10-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | 3D vascularized human ocular tissue for cell therapy and drug discovery |
US20190352670A1 (en) * | 2017-02-01 | 2019-11-21 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for Increasing Efficiency of Gene Editing in Cells |
CN106939299B (zh) * | 2017-02-04 | 2022-11-15 | 滨州医学院 | microRNA重编程体细胞为神经干细胞的制备方法及应用 |
US11530388B2 (en) | 2017-02-14 | 2022-12-20 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Methods of engineering human induced pluripotent stem cells to produce liver tissue |
US20200123501A1 (en) | 2017-04-18 | 2020-04-23 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Antigen-specific immune effector cells |
EP3621630A4 (en) | 2017-06-14 | 2021-03-10 | The Children's Medical Center | HEMATOPOIETIC STEM AND PRECURSOR CELLS FROM HEMOGENIC ENDOTHELIAL CELLS BY EPISOMAL PLASMID GENERAL TRANSFER |
WO2019204817A1 (en) | 2018-04-20 | 2019-10-24 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Method for differentiation of ocular cells and use thereof |
SG11202104401RA (en) | 2018-11-19 | 2021-05-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary | Biodegradable tissue replacement implant and its use |
EP3887518A2 (en) | 2018-11-28 | 2021-10-06 | Board of Regents, The University of Texas System | Multiplex genome editing of immune cells to enhance functionality and resistance to suppressive environment |
KR20210096648A (ko) | 2018-11-29 | 2021-08-05 | 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 | 자연 살해 세포의 생체외 확장을 위한 방법 및 이의 용도 |
CN109679918A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-04-26 | 合肥中科干细胞再生医学有限公司 | 一种便捷的人诱导性多能干细胞的制备方法 |
CN109666650A (zh) * | 2019-01-04 | 2019-04-23 | 北京航空航天大学 | 一种细胞重编程方法 |
CN109913494A (zh) * | 2019-02-12 | 2019-06-21 | 北京呈诺医学科技有限公司 | 一种新的ips细胞的诱导方法 |
JP2023511408A (ja) | 2020-01-23 | 2023-03-17 | ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション | ヒト多能性幹細胞からのストロマフリーt細胞分化法 |
MX2022015002A (es) | 2020-05-29 | 2023-03-03 | Fujifilm Cellular Dynamics Inc | Bicapa del epitelio pigmentario de la retina y fotorreceptores y uso de los mismos. |
AU2021280343A1 (en) | 2020-05-29 | 2022-12-08 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Retinal pigmented epithelium and photoreceptor dual cell aggregates and methods of use thereof |
CN116829721A (zh) * | 2020-07-20 | 2023-09-29 | 细胞研究私人有限公司 | 一种产生诱导多能干细胞的方法、诱导多能干细胞和使用所述诱导多能干细胞的方法 |
CN114149974A (zh) * | 2020-09-08 | 2022-03-08 | 是光隽恒(北京)生物科技有限公司 | 诱导间充质干细胞成为多能干细胞的方法 |
IL302728A (en) | 2020-11-13 | 2023-07-01 | Catamaran Bio Inc | Genetically modified natural killer cells and methods of using them |
US20220162288A1 (en) | 2020-11-25 | 2022-05-26 | Catamaran Bio, Inc. | Cellular therapeutics engineered with signal modulators and methods of use thereof |
GB202101107D0 (en) * | 2021-01-27 | 2021-03-10 | Oxford Genetics Ltd | Method of genome editing |
WO2022251443A1 (en) | 2021-05-26 | 2022-12-01 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Methods to prevent rapid silencing of genes in pluripotent stem cells |
WO2022251499A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-12-01 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods to generate macular, central and peripheral retinal pigment epithelial cells |
EP4346928A1 (en) | 2021-05-28 | 2024-04-10 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Biodegradable tissue scaffold with secondary matrix to host weakly adherent cells |
KR20240055811A (ko) | 2021-09-10 | 2024-04-29 | 애질런트 테크놀로지스, 인크. | 프라임 편집을 위한 화학적 변형을 갖는 가이드 rna |
CA3231501A1 (en) | 2021-09-13 | 2023-03-16 | Steven Kattman | Methods for the production of committed cardiac progenitor cells |
CN113862221B (zh) * | 2021-10-27 | 2024-04-30 | 上海爱萨尔生物科技有限公司 | 外周血单个核细胞的培养液及培养方法 |
US20240003871A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Ipsc-derived astrocytes and methods of use thereof |
CN115044590B (zh) * | 2022-06-30 | 2023-08-15 | 昆明理工大学 | p53基因突变体及其表达的蛋白在制备诊断和治疗肥厚型心肌病的药物中的应用 |
WO2024073776A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Methods for the production of cardiac fibroblasts |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007069666A1 (ja) * | 2005-12-13 | 2007-06-21 | Kyoto University | 核初期化因子 |
WO2007080591A2 (en) * | 2006-01-11 | 2007-07-19 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Adult stem cell-derived connective tissue progenitors for tissue engineering |
JP2008528038A (ja) * | 2005-01-31 | 2008-07-31 | エス セル インターナショナル ピーティーイー リミテッド | 胚性幹細胞の指示された分化及びその利用 |
WO2008144580A2 (en) * | 2007-05-17 | 2008-11-27 | Oregon Health & Science University | Primate stem cells produced by somatic cell nuclear transfer |
WO2009057831A1 (ja) * | 2007-10-31 | 2009-05-07 | Kyoto University | 核初期化方法 |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4937190A (en) | 1987-10-15 | 1990-06-26 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Translation enhancer |
ATE380548T1 (de) | 1999-01-29 | 2007-12-15 | Univ Illinois | Verwendung von p53 inhibitoren zur behandlung von nebenerscheinungen bei der krebstherapie |
KR20070058607A (ko) | 1999-05-18 | 2007-06-08 | 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 | 엔벨로프 유전자 결손 파라믹소과 바이러스 벡터 |
US8278104B2 (en) * | 2005-12-13 | 2012-10-02 | Kyoto University | Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2 |
AU2008231020B2 (en) | 2007-03-23 | 2013-09-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Somatic cell reprogramming |
WO2009075119A1 (ja) | 2007-12-10 | 2009-06-18 | Kyoto University | 効率的な核初期化方法 |
EP2268796A1 (en) | 2008-03-17 | 2011-01-05 | Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Vectors and methods for generating vector-free induced pluripotent stem (ips) cells using site-specific recombination |
CN101550406B (zh) | 2008-04-03 | 2016-02-10 | 北京大学 | 制备多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途 |
ES2587395T3 (es) | 2008-06-04 | 2016-10-24 | Cellular Dynamics International, Inc. | Procedimientos para la producción de células IPS usando un enfoque no vírico |
CA2969377C (en) * | 2008-06-13 | 2019-12-03 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Programming and reprogramming of cells |
CA2695590C (en) | 2008-06-27 | 2018-01-09 | Kyoto University | Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells |
WO2010013845A1 (en) | 2008-07-30 | 2010-02-04 | Kyoto University | Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells |
KR101372752B1 (ko) | 2008-07-31 | 2014-03-14 | 고꾸리츠 다이가꾸호오징 기후다이가꾸 | 유도된 다능성 줄기 세포의 효율적인 확립 방법 |
US20110003365A1 (en) | 2009-05-29 | 2011-01-06 | Kyoto University | Method of preparing induced pluripotent stem cells deprived of reprogramming gene |
CA2770412C (en) | 2009-08-07 | 2018-09-11 | Kyoto University | Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells |
CN102803476A (zh) | 2009-09-14 | 2012-11-28 | 程临钊 | 血细胞重编程产生多潜能干细胞和多功能干细胞 |
WO2011102531A1 (en) | 2010-02-16 | 2011-08-25 | Kyoto University | Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells |
WO2011119942A1 (en) | 2010-03-25 | 2011-09-29 | Vistagen Therapeutics, Inc. | Induction of ips cells using transient episomal vectors |
EP2601289B1 (en) | 2010-08-04 | 2017-07-12 | Cellular Dynamics International, Inc. | Reprogramming immortalized b cells |
WO2013022022A1 (ja) | 2011-08-08 | 2013-02-14 | 国立大学法人京都大学 | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 |
SG11201407917PA (en) | 2012-05-23 | 2015-01-29 | Univ Kyoto | Highly efficient method for establishing artificial pluripotent stem cell |
-
2010
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-
2014
- 2014-11-04 US US14/533,080 patent/US9404124B2/en active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008528038A (ja) * | 2005-01-31 | 2008-07-31 | エス セル インターナショナル ピーティーイー リミテッド | 胚性幹細胞の指示された分化及びその利用 |
WO2007069666A1 (ja) * | 2005-12-13 | 2007-06-21 | Kyoto University | 核初期化因子 |
WO2007080591A2 (en) * | 2006-01-11 | 2007-07-19 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Adult stem cell-derived connective tissue progenitors for tissue engineering |
WO2008144580A2 (en) * | 2007-05-17 | 2008-11-27 | Oregon Health & Science University | Primate stem cells produced by somatic cell nuclear transfer |
WO2009057831A1 (ja) * | 2007-10-31 | 2009-05-07 | Kyoto University | 核初期化方法 |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
CALAO M. ET AL.: "Direct effects of Bmi1 on p53 protein stability inactivates oncoprotein stress responses in embryona", ONCOGENE[ONLINE], JPN6013015421, August 2012 (2012-08-01), ISSN: 0002496839 * |
CELL DEATH AND DIFFERENTIATION, vol. 13, JPN6013015422, 2006, pages 1027 - 1036, ISSN: 0002496840 * |
CELL STEM CELL, vol. 3, no. 5, JPN6013015414, 2008, pages 475 - 479, ISSN: 0002496835 * |
CELL, vol. 103, JPN6013015428, 2000, pages 321 - 330, ISSN: 0002496842 * |
EXP.MOL.MED., vol. 42, no. 8, JPN6013015419, 2010, pages 574 - 582, ISSN: 0002496838 * |
NATURE, vol. 460, JPN6013015426, 27 August 2009 (2009-08-27), pages 1132 - 1136, ISSN: 0002496841 * |
SCIENCE, vol. 324, JPN6013015417, May 2009 (2009-05-01), pages 797 - 801, ISSN: 0002496837 * |
STEM CELLS, vol. 26, JPN6013015416, 2008, pages 1998 - 2005, ISSN: 0002496836 * |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013528397A (ja) * | 2010-06-15 | 2013-07-11 | セルラー ダイナミクス インターナショナル, インコーポレイテッド | 少量の末梢血からの人工多能性幹細胞の作製 |
US10260048B2 (en) | 2010-06-15 | 2019-04-16 | FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. | Generation of induced pluripotent stem cells from small volumes of peripheral blood |
WO2014192312A1 (ja) * | 2013-05-31 | 2014-12-04 | 国立大学法人 東京医科歯科大学 | 正常な内向きのカリウム電流特性を有するiPS細胞由来心筋モデル細胞 |
JPWO2014192312A1 (ja) * | 2013-05-31 | 2017-02-23 | 国立大学法人 東京医科歯科大学 | 正常な内向きのカリウム電流特性を有するiPS細胞由来心筋モデル細胞 |
JP2017513498A (ja) * | 2014-04-24 | 2017-06-01 | ボード・オブ・リージエンツ,ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム | 養子細胞治療製品を製造するための誘導多能性幹細胞の適用 |
JPWO2016117510A1 (ja) * | 2015-01-20 | 2017-10-26 | 京都府公立大学法人 | 神経系細胞の製造方法 |
JP2019528771A (ja) * | 2016-10-05 | 2019-10-17 | フジフィルム セルラー ダイナミクス,インコーポレイテッド | 多能性幹細胞からhlaホモ接合免疫細胞への指向分化方法 |
JP2022078215A (ja) * | 2016-10-05 | 2022-05-24 | フジフィルム セルラー ダイナミクス,インコーポレイテッド | 多能性幹細胞からhlaホモ接合免疫細胞への指向分化方法 |
JP7212615B2 (ja) | 2016-10-05 | 2023-01-25 | フジフィルム セルラー ダイナミクス,インコーポレイテッド | 多能性幹細胞からhlaホモ接合免疫細胞への指向分化方法 |
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