CN103571794B - 一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法，包括以下步骤：（1）PUMA-/-(PUMA基因敲除)小鼠或PUMA-/+小鼠成纤维细胞MEF的制备、传代、冻存；（2）DH5α大肠杆菌株转化质粒PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF4，并进行质粒小提和质粒大提；（3）逆转录病毒的包装、滴度测定与冻存；（4）PUMA基因敲除小鼠或PUMA-/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF的重编程；（5）敲降PUMA功能的人成纤维细胞的重编程。本发明的有益效果是通过在体细胞重编程步骤中抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效，同时能够保护iPS细胞基因组稳定性。
Description
技术领域
本发明属于干细胞领域，尤其是涉及一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法。
背景技术
将OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc四个转录因子同时导入小鼠皮肤成纤维细胞，可重编程形成类似于胚胎干细胞的一类新型细胞，被称为iPS细胞。2007年,iPSCs技术在人的体细胞上取得成功,iPS细胞具有胚胎干细胞的多向分化能力，是各类疾病发病机制研究和药物筛选的最佳材料；也是一些退行性疾病将来治疗的新希望。但大量研究表明，iPS细胞在重编程中诱发了相当数量的DNA损伤以及染色体结构的改变，进而导致iPS细胞具有潜在的致癌性，并且效率很低。所以在将iPS细胞应用于临床治疗之前，安全性和有效性成为该技术应用的关键。
p53，一种重要的肿瘤抑制蛋白，可通过触发细胞凋亡、调控细胞周期及加速细胞衰老方式抑制肿瘤发生。在大多数肿瘤中p53处于失活状态。研究证实沉默p53可显著地增加iPS细胞的诱导效率，不仅对病毒载体诱导技术有用，对用质粒或蛋白诱导转化技术同样有用。Marion等表示缺乏p53的iPS细胞基因组不稳定，而且不能有效地发育成嵌合体小鼠[1]，Utikal等证实暂时性而不是永久性抑制p53可促进重编程的效率[2]。但沉默p53同样会增加基因组不稳定性和肿瘤的发生性，其分子机制与其下游的p21有关。这正好验证了iPS产生具有细胞周期依赖和非细胞周期依赖两种模式。但目前的研究均忽略了在重编程过程中细胞凋亡因素。而p53也是通过调节PUMA的表达来调控细胞凋亡。
2001年,Yu[3]和Nakano等[4]两个独立的研究小组分别从结直肠癌细胞系和人类成骨细胞样细胞中分离出新的可被p53快速诱导并具有强大促凋亡作用的p53靶基因,后被鉴定为同一基因,并命名为PUMA。PUMA直接或间接地与抗凋亡Bcl-2蛋白发生相互作用,解除Bcl-2/Bcl-xL对Bax/Bak的抑制作用,Bax/Bak构象改变后在线粒体膜上形成寡聚物,使膜通透性增加、外膜电势降低、释放细胞色素C入胞质,启动caspase级联反应,最终发生细胞凋亡。生理状况下PUMA表达量较低，但在DNA损伤药物、血清饥饿和内质网应激等刺激诱导下可显著升高。本实验室和其他实验室研究表明失去PUMA可以在高剂量照射条件下，通过减少凋亡保护造血干细胞和小肠干细胞等成体干细胞[5-9]。并且在很多疾病模型中未发现失去PUMA可以促进肿瘤的发生[5-8,10-11]。我们初步实验结果表明敲除PUMA和p53一样具有促进iPS产生的作用，但根据以往报道中PUMA和p53对肿瘤发生的作用相反，其对iPS细胞重编程中基因组稳定性和致癌性的作用机制很是令人期待。PUMA作为p53下游凋亡通路的重要分子，抑制或敲除PUMA在成体干细胞中具有明显的抗放射和抑制肿瘤形成的作用，但其对iPS的产生和基因组稳定性的作用以及分子机制还不是很清楚。
参考文献
1.MarionRM,StratiK,LiH,MurgaM,BlancoR,etal.(2009)Ap53-mediatedDNAdamageresponselimitsreprogrammingtoensureiPScellgenomicintegrity.Nature460:1149-1153.
2.UtikalJ,PoloJM,StadtfeldM,MaheraliN,KulalertW,etal.(2009)ImmortalizationeliminatesaroadblockduringcellularreprogrammingintoiPScells.Nature460:1145-1148.
3.YuJ,ZhangL,HwangPM,KinzlerKW,VogelsteinB(2001)PUMAinducestherapidapoptosisofcolorectalcancercells.MolCell7:673-682.
4.NakanoK,VousdenKH(2001)PUMA,anovelproapoptoticgene,isinducedbyp53.MolCell7:683-694.
5.LabiV,ErlacherM,KrumschnabelG,ManzlC,TzankovA,etal.(2010)ApoptosisofleukocytestriggeredbyacuteDNAdamagepromoteslymphomaformation.GenesDev24:1602-1607.
6.MichalakEM,VandenbergCJ,DelbridgeAR,WuL,ScottCL,etal.(2010)Apoptosis-promotedtumorigenesis:gamma-irradiation-inducedthymiclymphomagenesisrequiresPuma-drivenleukocytedeath.GenesDev24:1608-1613.
7.YuH,ShenH,YuanY,XuFengR,HuX,etal.(2010)DeletionofPumaprotectshematopoieticstemcellsandconferslong-termsurvivalinresponsetohigh-dosegamma-irradiation.Blood115:3472-3480.
8.ShaoL,SunY,ZhangZ,FengW,GaoY,etal.(2010)DeletionofproapoptoticPumaselectivelyprotectshematopoieticstemandprogenitorcellsagainsthigh-doseradiation.Blood115:4707-4714.
9.QiuW,Carson-WalterEB,LiuH,EpperlyM,GreenbergerJS,etal.(2008)PUMAregulatesintestinalprogenitorcellradiosensitivityandgastrointestinalsyndrome.CellStemCell2:576-583.
10.JeffersJR,ParganasE,LeeY,YangC,WangJ,etal.(2003)Pumaisanessentialmediatorofp53-dependentand-independentapoptoticpathways.CancerCell4:321-328.
11.VillungerA,MichalakEM,CoultasL,MullauerF,BockG,etal.(2003)p53-anddrug-inducedapoptoticresponsesmediatedbyBH3-onlyproteinspumaandnoxa.Science302:1036-1038.
发明内容
本发明的目的是通过在体细胞重编程步骤中抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效，同时能够保护iPS细胞基因组稳定性。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法，包括以下步骤：
（1）PUMA-/-(PUMA基因敲除)或PUMA-/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF的制备、传代、冻存；
（2）DH5α大肠杆菌株转化质粒PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF4，并进行质粒小提和质粒大提；
（3）逆转录病毒载体的包装、滴度测定与冻存：将携带有PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因子的质粒引入包装细胞Plat-E细胞中，回收在培养上清液中产生的逆转录病毒载体，并进行滴度测定与冻存；
（4）PUMA-/-或PUMA-/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF的重编程
将步骤（3）中的携带有PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因子的逆转录病毒载体感染步骤（1）得到的PUMA-/-或PUMA-/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF，并用饲养层细胞支持培养感染的PUMA-/-或PUMA-/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF，连续培养，出现的克隆为PUMA-/-或PUMA-/+小鼠iPS细胞；
（5）敲降PUMA功能的人成纤维细胞的重编程
将人PUMAshRNA（载体Plk0.1）和携带有人PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因子的质粒引入包装细胞Plat-E中，回收在培养上清液中产生的病毒载体，并将回收的病毒载体感染人成纤维细胞，并用饲养层细胞支持培养感染的人成纤维细胞，培养7天后，用条件培养基培养，连续培养，出现的克隆为敲降PUMA功能的人iPS细胞。
进一步，所述步骤（1）中的具体步骤为：取8-10周的PUMA-/-或PUMA-/+小鼠，按2：1的雌雄比例合笼，处死孕期为13.5天的孕鼠，将小鼠胚胎从子宫中剥离，去除头和内脏组织，将单个胚胎的躯干，剪碎至糊状，胰酶消化，FM重悬，培养24-48h后，将MEF细胞按常规方法进行传代，2×FM冻存液冻存P0代、P1或P2代细胞。
进一步，所述步骤（3）的具体步骤为：每100mm皿接种8x106-1x107个Plat-E细胞，融合度达到90%时，将培养皿中的细胞培养液换成5ml新鲜DMEM+10%FBS，制备质粒和lipofectamine2000混合液，10μllipofectamine2000与500μlOPTI-MEM混合，室温放置5min，携带有PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因子的质粒各10μg与500μlOPTI-MEM混合，室温放置5min，将上述两种液体轻轻混合，室温静置20min，将混合液逐滴加入100mm皿中，1ml/皿，混匀，培养6-8h后换新鲜的DMEM+10%FBS分别在培养后48h和72h收集逆转录病毒上清并浓缩，收集的部分逆转录病毒进行滴度测定。
进一步，所述步骤（4）的具体步骤为：将PUMA-/-或PUMA-/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF，种在100mm的皿中，第2天，根据所测病毒滴度，计算病毒载体所用的量，将步骤（3）中得到的携带有PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因子的逆转录病毒载体加入到100mm皿中，并加入polybrene至终浓度为6μg/ml或加入5ml逆转录病毒载体+1mlFBS+6μl的8μg/ml的polybrene，感染12h后，换为新鲜的DMEM培养基，细胞长满培养皿后，将感染的PUMA-/-或PUMA-/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF细胞，按常规方法消化传代至铺有饲养层细胞的培养皿中，细胞密度为1x105/孔，培养基为小鼠ES培养基，连续培养，出现的克隆为PUMA-/-或PUMA-/+小鼠iPS细胞。
进一步，所述步骤（5）的具体步骤为：将人PUMAshRNA（载体Plk0.1）和携带有人PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因子的质粒引入包装细胞Plat-E中，回收在培养上清液中产生的病毒载体，并将回收的病毒载体感染人成纤维细胞，人成纤维细胞的培养基为EMDM+10%FBS，连续两天，两次病毒转染，感染第三天后更换为人成纤维细胞培养液，细胞长满后，转移至铺好饲养层细胞的100mm培养皿中，利用人成纤维培养基培养转天后换为人ES培养基：人成纤维细胞培养基=1：1的混合培养基，转天换为完全的人ES培养基，培养7天后，加条件培养基，条件培养基为用人ES培养基培养饲养层细胞一天的培养基，20天左右出现的克隆为敲降PUMA功能的人iPS细胞。
本发明具有的优点和积极效果是：由于采用上述技术方案，在小鼠胚胎成纤维细胞和人成纤维细胞上的实验结果说明敲除或敲降PUMA基因，均能提高体细胞重编程效率，与野生型的iPS细胞的形成率相比具有显著性差异，P＜0.05，并且敲除或敲降PUMA基因的iPS细胞的基因组是稳定的，与野生型iPS细胞相比无显著性差异，而敲除p53和p21基因后，相应的iPS细胞的染色体的突变率与野生型iPS细胞相比有显著性差异，P＜0.05；抑制PUMA功能，在重编程过程中能提高诱导效率和保护基因组稳定性，为揭开iPS细胞在重编程过程中产生的基因组不稳定性问题提供一个新的突破口，并为探寻保持iPS细胞基因组稳定性的方法提供理论依据。
附图说明
图1小鼠iPS细胞的碱性磷酸酶染色照片，缩小5倍；
图2小鼠iPS细胞形成率的柱状图；
图3PUMA-/-小鼠iPS细胞表达ES标记基因的荧光显微镜图；在10倍镜下观察结果，放大倍数：100倍；
图4畸胎瘤三个胚层的组织H.E.染色显微镜图；在10倍镜下观察结果，放大倍数：100倍；
图5嵌合鼠照片图；
图6染色体突变率的柱状图；
图7敲降PUMA功能的人iPS细胞的PUMA蛋白表达的蛋白印迹图；
图8敲降PUMA功能的人iPS细胞形成率的柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但并不限定本发明。
实施例1PUMA-/-小鼠胚胎成纤维细胞MEF的制备、传代、冻存
（1）取8-10周的PUMA-/-小鼠，傍晚按2：1的雌雄比例合笼，次日早上发现有阴道栓的雌鼠单笼饲养，中午胚胎发育0.5天记为E0.5或0.5dpc；取小鼠胚胎前一天高压灭菌镊子和剪刀。
（2）处死孕期为13.5天（E13.5）的孕鼠，将小鼠放到75%的酒精中浸泡后，放于无菌超净台中，将处死的孕鼠，用大剪刀剪开腹腔，取出两侧子宫，并将子宫放于无菌的100mm塑料有盖培养皿中。
（3）将取出的子宫放到无菌的PBS中，计胚胎数。
（4）将小鼠胚胎一步一步从子宫中剥离出来：先去子宫，再去卵黄膜、胎盘和羊膜，每一步都用PBS洗一遍。
（5）将剥离出来的胚胎，放到新的PBS中，去除头和内脏组织。
（6）将单个胚胎的躯干移到一个加入少量PBS的培养皿中，用小剪刀将所有的躯干剪碎至糊状。
（7）将剪碎的组织移到一个新的15ml离心管中，加0.05%胰酶5ml，放37℃水浴锅，晃动5min，消化30min。加入10ml的FM中和，FM指DMEM+10%FBS的混合液，1000rpm，离心5min。
（8）弃掉上清，用FM重悬细胞，按1个胚胎种一个100mm的培养皿，每皿加FM10ml，放37℃，5%CO2培养箱培养，记为P0。
（9）24-48h后细胞生长密度接近100%后，将上述MEF细胞按常规方法进行传代，吸掉细胞上清，用PBS洗一遍，加入0.05%胰酶1ml覆盖皿即可，37℃消化3min。加入两倍体积的FM中和胰酶后，用枪反复吹打，直至所有的贴壁细胞都脱落。
（10）1000rpm，离心5min，弃掉上清，用FM重悬后，按1：3传至100mm细胞培养皿内，每皿的培养基为10ml，此时记为P1。
（11）24-36h后，MEF细胞生长密度再次达到100%后，按步骤（9）、（10）传代，记为P2。
（12）将P0代、P1或P2代的细胞按常规方法消化，离心。弃掉上清，用少量FM重悬成单细胞后，计数。
（13）每2×106个细胞加入0.5mlFM，根据FM量，缓慢加入预先配制的等量的2×FM冻存液混匀。
（14）按每管1ml的量加入冻存管内，拧紧盖子，标记细胞代数，标号及冻存日期。
（15）放入冻存盒中-80℃过夜，之后转入液氮罐中保存。
实施例2DH5α大肠杆菌株转化质粒PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc、PMX-KLF4，并进行质粒小提和质粒大提
LB培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，溶于900mlH2O中，调整pH至7.2-7.4，加水补齐至1L，高温高压灭菌保存。
LB固体培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，琼脂15g，加水至1L，高温高压灭菌，温度降至50℃左右，加抗生素，倒入100mm皿，20ml/皿，冷却凝固后4℃保存。
抗生素：氨苄青霉素配置成100mg/mL（1000×）氨苄青霉素(Amp)溶液，-20℃保存。
DH5α大肠杆菌株，购自Takara。
质粒：PMX－Oct4、PMX－Sox2、PMX－c-Myc、PMX－KLF4购自addgene。
2.1细菌转化步骤
（1）高压后的LB培养基待冷却至50℃左右加入Amp溶液，终浓度为100μg/mL。
（2）从-80℃中取出DH5α大肠杆菌株，至于冰上，将之前准备好的连接体系8μL（一般加入的连接体系不大于感受态的1/10），加入感受态中，轻弹几下，使之混合均匀，静置与冰上30min。将感受态置于42℃水浴90s，而后再置于冰上静置5min。加入1mLLB37℃180rmp/min摇1h。将体系离心去上清，90μLLB培养基重悬。
（3）将DH5α大肠杆菌涂布于Amp抗性LB平板，在37℃培养箱过夜培养，观察克隆。2.2质粒小提（参考TIANprepMiniPlasmidKit说明书）
（1）细菌活化：吸取冻存的菌液8μl或挑取菌落置于5ml无菌LB培养基中（加抗生素Amp），37℃摇床中（200rpm）活化8h。
（2）柱平衡步骤：向吸附柱CP3中加入500μl平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（3）取1-5ml活化的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1min，尽量吸尽上清。
（4）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1，用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
（5）向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转8次使菌体充分裂解。
（6）向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm离心10min，离心管底部形成沉淀。
（7）将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
（8）向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
（9）重复上述步骤（8）。
（10）将吸附柱CP3放回收集管中，12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
（11）将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加80μl去离子水（70℃），室温放置2min，12,000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
（12）用Nanodrop测定OD值（OD260/OD280比值应在1.8-2.0）。
（13）-20℃保存。
2.3质粒大提（参考QiagenPlasmidMaxiKit说明书）
（1）细菌活化：吸取冻存的菌液8μl或挑取菌落置于5ml无菌LB培养基中（加抗生素Amp），37℃摇床中（200rpm）活化8h。
（2）取500μl-1ml活化的菌液加入到400ml新鲜菌液中，37℃摇床中（200rpm）培养16h。
（3）收集菌液，放置于250ml离心杯中，4℃6,000×g离心15min。
（4）用10mlP1重悬菌沉淀。
（5）加入10mlP2，混匀，室温放置5min。
（6）加入预冷的10mlP3，立即混匀，冰上静置20min。
（7）4℃20,000×g离心30min，收集上清。
（8）4℃20,000×g离心15min，收集上清。
（9）用10mlQBT润柱子（QIAGEN-tip500）。
（10）将上清液加入到QIAGEN-tip上，通过重力作用流尽。
（11）加入QC30ml。
（12）用15mlQF洗脱DNA（QF最好加热至65℃，提高洗脱效率）。
（13）在洗脱的DNA中加入10.5ml异丙醇，混匀，4℃20,000×g离心30min。
（14）去除上清，加入5ml70%的乙醇清洗沉淀，4℃20,000×g离心10min。
（15）去除乙醇，室温晾干5min（沉淀从白色变成透明），用无菌去离子水溶解DNA沉淀。
（16）用Nanodrop测定OD值。
（17）-20℃保存。
实施例3逆转录病毒的包装、滴度测定与冻存
3.1逆转录病毒的产生
（1）40℃水浴复苏Plat-E细胞，复苏后，将细胞置于37℃，5%CO2培养箱中培养，当汇合度达到70-80%时，1：3传代。
（2）消化对数生长期的Plat-E细胞，计数。（当一个T75培养瓶中的Plat-E细胞汇合度达到80-90%时，可以传到2个100mm皿中）。
（3）按每100mm皿8x106-1x107接种细胞。
（4）17-20h左右，观察细胞汇合度是否到90%。
（5）将培养皿中的细胞培养液换成5ml新鲜DMEM+10%FBS。
（6）配备质粒和lipofectamine2000混合液（每100mm皿）比例如下：
a)10μllipofectamine2000+500μlOPTI-MEM，室温放置5min；
b)目的质粒10μg（PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF4）+500μlOPTI-MEM，室温放置5min；将上述两种液体a和b轻轻混合，室温静置20min。
（7）将混合液逐滴加入100mm皿中，1ml/皿，混匀，37℃，5%CO2培养箱培养。
（8）培养8h后换新鲜的DMEM+10%FBS，37℃，5%CO2培养箱培养。
（9）分别在培养后48h和72h收集逆转录病毒上清，用0.45μm的小滤器过滤。直接用于实验或按需要浓缩冻存。
（10）浓缩：使用AmiconUltra-15centrifugalfilterdevices(100KNMWL)进行浓缩。4,000rpm4℃离心40min，浓缩100倍。吸取浓缩液，直接用于实验或分装冻存于-80℃。
3.2病毒滴度（TU）测定：
（1）在6孔板中铺293T细胞，1x105/孔。
（2）第2天，按(原液，1：10，1：100，1：1000，1：10000)的方案对病毒进行稀释，将病毒加入孔中，并加入polybrene（聚凝胺）至终浓度为6μg/ml。继续在培养箱中培养。
（3）感染后48h，收集感染的细胞，用流式检测GFP阳性率。按如下公式进行计算梯度：GFP+细胞%×Day1接种的293T细胞数×稀释倍数×病毒原液体积（ml）计算病毒滴度（TU/ml）。例如：如果1：1000孔中的GFP阳性率为10%，而病毒原液体积为100μl，则病毒滴度为：10%x105x1000x0.1=106TU/ml。MOI=病毒滴度/病毒液体积/感染细胞数。
（4）根据滴度及MOI，确定是否要浓缩病毒。一般情况下，若感染常规细胞系（或较容易感染的细胞），MOI为5-10；若感染造血祖细胞，MOI为10-20；若感染造血干细胞（较难感染的细胞），MOI为20-50。做iPS时一般采用MOI为5-10。
实施例4PUMA-/-小鼠胚胎成纤维细胞MEF的重编程
（1）将P2代PUMA-/-小鼠胚胎成纤维细胞MEF细胞解冻1X106种在100mm的皿中，第2天，观察细胞，根据所测病毒滴度（一般按MOI为10），计算每一个病毒所用的量，根据用量复苏病毒。将复苏的携带有PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF4个转录因子的逆转录病毒加入到100mm皿中，并加入polybrene至终浓度为6μg/ml。
（2）病毒感染12h后，进行换液，换为新鲜的DMEM培养基。
（3）感染48h后，复苏饲养层细胞。
（4）第3天时，将感染的MEF细胞，按常规方法消化传代至铺有饲养层细胞的100mm皿中，细胞密度为1x105/孔，培养基为小鼠ES培养基。
（5）以后每3天换液一次。
（6）第12天时，开始出现PUMA-/-小鼠iPS克隆，支持克隆的生长。
（7）第15天，将克隆挑出。
（8）传代培养的细胞放37℃，5%CO2培养箱培养，每天换液，大约3天扩增传代一次。P3代以后可以冻存。
实施例5PUMA-/-小鼠iPS细胞的培养、传代与冻存
5.1PUMA-/-小鼠iPS细胞的培养
（1）将灭菌的0.1%Gelatin（明胶）铺于35mm皿中（Gelatin的量为覆盖培养皿底部即可），0.5h后吸出Gelatin。
（2）复苏冻存的饲养层细胞，将冻存的饲养层细胞快速放入39℃的水浴锅内快速融化。
（3）加入DMEM培养基，1000rpm离心5min，弃掉上清。
（4）加入DMEM+10%FBS培养基中重悬细胞，用台盼蓝计数，饲养层细胞的接种密度为2-4×104/cm2，复苏后过夜。
（5）第二天，复苏PUMA-/-小鼠iPS细胞：复苏时加入小鼠ES培养基，1000rpm，离心5min，弃掉上清。
（6）重新加入小鼠ES培养基，用2ml的吸管，轻轻吹打，放入预先铺上饲养层细胞的培养皿中。
（7）第三天给复苏的PUMA-/-小鼠iPS细胞换液，隔一天PUMA-/-小鼠iPS细胞长的足够大时，传代。
5.2PUMA-/-小鼠iPS细胞的传代
（1）吸出培养基，加PBS洗一遍，加适量0.025%胰酶（量不用太多，覆盖培养皿底部即可）消化3min。
（2）显微镜下观察，见饲养层细胞已经开始松动，加入两倍体积的PBS。
（3）将所有的液体吸出，加入少量小鼠ES培养基，用移液管或枪尖吹下细胞，放入离心管中，1000rpm离心5min。
（4）弃上清，用小鼠ES培养基重悬细胞，传至预先铺有饲养层细胞的培养皿中，传代的数量根据细胞的数量为1：3-1：12。
5.3PUMA-/-小鼠iPS细胞的冻存
（1）细胞长到足够大以及出现未分化细胞时，可通过胰酶的方法将细胞从培养皿上消化下来。
（2）放入离心管中，1000rpm离心5min。
（3）弃掉上清，加入小鼠ES细胞冻存液重悬，放入2ml冻存管中，放入程序性降温冻存盒中，放入-80℃，隔天放入液氮中。细胞冻存的数量，由细胞数量确定。
实施例6敲降PUMA功能的人成纤维细胞的重编程
针对PUMA的shRNA的PUMAshRNA的序列如下:
克隆编号01:TTGGCTCATTTGCTCTTCACG(SEQIDNO:1)；
克隆编号02:ATGAGATTGTACAGGACCCTC(SEQIDNO:2)；
克隆编号03:AGTCCCATGATGAGATTGTAC(SEQIDNO:3)；
克隆编号04：TCTCTAAACCTATGCAATG(SEQIDNO:4)；
克隆编号05：TGTCTCCGCCGCTCGTACT(SEQIDNO:5)；
克隆编号06：TGAGGTCGTCCGCCATCCG(SEQIDNO:6)；
克隆编号07：AATTGGGCTCCATCTCGGG(SEQIDNO:7)。
其中附图7和附图8中的shPUMA#1代表PUMAshRNA的克隆编号01，序列为:TTGGCTCATTTGCTCTTCACG;shPUMA#2代表PUMAshRNA的克隆编号02，序列为:ATGAGATTGTACAGGACCCTC。PUMAshRNA和siRNA购自openbiosystem。
具体步骤为：
（1）人PUMAshRNA（载体Plk0.1）和人PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc、PMX-KLF转录因子的病毒载体包装步骤如以上所述实施例3逆转录病毒的包装步骤所述。
（2）人成纤维细胞的培养基为EMDM+10%FBS，培养和传代参照PUMA-/-小鼠的MEF细胞。
（3）将步骤（1）中的四种逆转录病毒和人PUMAshRNA（载体Plk0.1）慢病毒一起转入人成纤维细胞，连续两天，两次病毒转染。
（4）第三天洗掉病毒培养液，换为人成纤维细胞培养液。
（5）第四天，接种饲养层细胞于培养皿中。
（6）第五天，将诱导的人成纤维细胞培养在铺好的饲养层细胞上，利用人成纤维培养基培养。
（7）第六天将培养基换为人ES培养基：人成纤维细胞培养基=1：1的混合培养基。
（8）第七天换为完全的人ES培养基。
（9）在饲养层细胞上培养7天后，加条件培养基，条件培养基为用人ES培养基培养饲养层细胞一天的培养基。隔天换液一次。
（10）在20天左右出现敲降PUMA功能的人iPS细胞克隆，记为第一代敲降PUMA功能的人iPS细胞。
（11）25天左右用机械方法将克隆挑出;
（12）第一代-第三代敲降PUMA功能的人iPS细胞代利用机械方法传代，之后可换为1mg/ml的dispase(分散酶)化学消化传代，冷冻。
试验例1小鼠iPS细胞碱性磷酸酶染色试验
（1）重编程14天时，将已经有克隆的培养皿中的培养液洗掉，用PBS洗两次。在2%多聚甲醛中固定2min，用PBS洗2次。
（2）加入显色液避光显色15min。
（3）再用PBS洗2次。
（4）计数紫色克隆数，克隆效率就是克隆数除以转染细胞数。
显色液来自StemTAGTMAlkalinePhosphataseActivityAssayKit(Colorimetric)，主要成分是p-Nitrophenol（对硝基苯酚）。
如图1和图2所示，WT代表野生型，p53-/-、p21-/-、PUMA-/-分别代表敲除相应基因形成的iPS细胞。从图中可以看出，敲除p53-/-、p21-/-、PUMA-/-都能提高iPS细胞形成率，但与野生型的iPS细胞相比，PUMA-/-小鼠iPS细胞形成率最高。
试验例2PUMA-/-小鼠iPS细胞的多能性基因鉴定
4%多聚甲醛PFA配制：1)称取4gPFA（有毒，注意防护），置于三角烧瓶或烧杯中。2)加入50-80mlDPBS（杜氏磷酸缓冲液），加热至60℃左右，磁力搅拌使粉末完全溶解。3)通常加入几滴1NNaOH可以使溶液清亮。4)最后补足PBS于100ml，充分混匀。
（1）第一天，按常规方法将冻存的饲养层细胞，放入39℃的水浴锅中，快速解冻，按上述细胞密度接种于铺有0.1%的Gelatin（明胶）的12孔板中。
（2）第二天将培养的PUMA-/-小鼠iPS细胞按人ES细胞方法进行传代，将消化好的细胞传至预先铺有饲养层细胞的12孔板中。
（3）细胞大约3天时状态比较好（分化细胞较少，细胞足够大），将长好的PUMA-/-小鼠iPS细胞用PBS洗涤2次，每次5min。
（4）4%多聚甲醛室温固定15min。
（5）PBS洗涤3次，每次5min。
（6）用含0.1%的Triton-X-100透膜10min。
（7）PBS浸泡5min。
（8）将几个孔中加入山羊血清工作液，室温封闭15min。
（9）吸出山羊血清工作液后，每孔分别加入稀释好的anti-Sox2(1:300)，anti-SSEA-1(1:500)，anti-Nanog(1:100)，anti-Oct4(1:200)抗体工作液50μl，4℃过夜。
（10）吸出液体，然后用PBS洗涤3次，每次5min。
（11）每孔再加入相对应的二抗AlexaFLuor488DonkenyAnti-rabbitIgG或Alexa555-conjugatedgoatanti-mouseIgM/IgG(1:1000)，室温避光孵育1h。
（12）吸出液体，PBS洗涤3次，每次5min。
（13）DAPI复染，5min。
（14）PBS洗涤两次，然后用蒸馏水冲洗后晾干。
（15）荧光显微镜下观察试验结果。
如图3所示，图A1标记的是Oct4基因，图A2标记的是Nanog基因，图A3标记的是Sox2基因，图A4标记的是SSEA-1基因，PUMA-/-小鼠iPS细胞能像ES细胞一样表达4个标记基因。
试验例3畸胎瘤形成实验
（1）选取核型鉴定为正常染色体的PUMA-/-小鼠iPS细胞，核型鉴定正常染色体的比例大于80%为可用的PUMA-/-小鼠iPS细胞，传代培养扩增核型鉴定合格的PUMA-/-小鼠iPS细胞，扩增至约两个100mm皿。
（2）用trypsin（胰蛋白酶）消化细胞。
（3）将消化好的PUMA-/-小鼠iPS细胞收集到15ml离心管中，1000rpm离心5min，弃掉上清。
（5）加入KnockoutDMEM重悬细胞，并计数，调至终浓度为2x106/100μl左右。
（7）用1ml注射器吸取100μl细胞悬液，注射到SCID小鼠腹股沟皮下。
（8）1个月左右可见SCID小鼠皮下形成畸胎瘤。
（9）将长畸胎瘤的小鼠处死后，用剪刀小心的在肿瘤四周将肿瘤剥离下来（注意不要碰到肿瘤组织，以免破坏肿瘤的结构）。
（10）将切下的肿瘤组织，放入10%甲醛溶液中固定24h后，进行石蜡包埋和组织切片。
（11）将组织切片进行H.E染色来确定肿瘤的组织形态。
如图4所示，图4A为外胚层，图4B为中胚层，图4C为内胚层，PUMA-/-小鼠iPS细胞能使小鼠形成正常的畸胎瘤。
试验例4嵌合体小鼠形成试验
（1）第一天下午5点左右给8-10周的雌性BDF1小鼠腹腔注射10UPMSG催卵。
（2）48h后给予打过PMSG的母鼠继续打10UHCG，并立刻将打过的母鼠置于公鼠笼内进行交配。同时将ICR母鼠置于结扎的公鼠笼内，进行交配。
（3）第四天上午去检查母鼠阴道口是否有阴道栓，并将具有阴道栓的小鼠收集，备用。
（4）第五天检查ICR母鼠阴道口是否有阴道栓，然后将具有阴道栓的母鼠视为代孕母鼠取出备用。
（5）取3.5天的囊胚：用CO2猝死方法杀死具有阴道栓的BDF1母鼠，取出子宫后将0.5ml囊胚培养基（H-CZB）用1ml针筒注射入子宫腔内冲出囊胚，并移入培养箱中进行培养。
（6）准备iPS细胞进行囊胚注射：细胞状态最好的时候，消化贴壁离心，去除饲养层细胞并吹打成单细胞后，用少量DMEM重悬，放于冰上备用。
（7）10-15个多功能干细胞被注射到扩张的E3.5囊胚（来自BDF1×BDF1）中，体外恢复5min之后，放入37°C，5%CO2的培养箱中恢复3h。
（8）将恢复后的好的囊胚移植到假孕见栓2.5天的小鼠（ICR）子宫内，每侧子宫移植15个左右的胚胎。
（9）移植后19天时，假孕小鼠会生下嵌合体小鼠（毛色黑白相间），如图5所示，通过毛色对比观察小鼠的嵌合率，从而确定iPS的多能性。因为iPS细胞来自C57背景（毛色为黑色），而囊胚来自ICR小鼠（毛色为白色），如果嵌合体黑色比例较高，说明iPS嵌合率较高，即iPS分化的细胞类型更多。
试验例5细胞核型鉴定
准备配置：1)低渗液配制：0.4%氯化钾用时放入37℃水中预热。2)固定液配制：甲醇：冰醋酸=3：1，现用现配。3)G显带消化液配制：胰酶(SigmaG4507-5G)30mg，加入0.9%生理盐水（orD-Hanks）50ml中，用时37℃水浴30min。
具体步骤为：
（1）当iPS细胞大小合适时，约传代2天时，加入0.25g/ml的秋水仙素处理细胞3.5h。
（2）配低渗液：0.4%氯化钾现用现配，每个细胞系用5mL，并在水浴锅中预热胰酶（每个细胞系约500μl胰酶）和低渗液。
（3）加入0.025%的胰酶消化，加入小鼠干细胞培养液进行中和，将中和后的细胞吹打为单细胞，800rpm离心5min后，弃上清，收获细胞。
（4）将收获的细胞中加入预热的低渗液51ml，37℃中，低渗5min，同时配固定液：甲醇与冰醋酸按3：1配，现用现配，每个细胞系为7mL。
（5）预固定，加固定液7滴，轻轻以气泡冲匀，800rpm离心5min。
（6）固定：去上清，加入固定液4ml，轻轻以气泡冲匀，固定40min，800rpm离心5min，去上清，加固定液2ml，第二次固定20min（这两步固定都可以4℃或室温过夜）。
（7）滴片：800离心5min，去上清，加入新鲜固定液4滴，气泡冲匀，即可进行滴片2-3张。
（8）滴片时将细胞悬液1-2滴，滴到预先遇冷过的4℃冰水或干燥的洁净玻片上，晾干。
（9）放入65℃烤箱中烘烤过夜。
（10）染色：第二天取出烤干的载玻片加入1滴Giemsa原液，15s后，加入2滴稀释后的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液的稀释为：1份磷酸缓冲液原液加上9份等体积的蒸馏水），并用吸耳球吹打均匀后，进行染色，染色时间为室温10min，10min后用流水轻轻清洗，室温晾干后进行核型分析，在一组实验中，我们随机选择20个以上的细胞中期分裂相进行观察并统计核型的正确率，核型正确率大于80%的为核型正常可用的细胞。
（11）核型显带：将配好的消化液放入37℃水浴中30min，并加入3%Tris1.5ml（PH=7.6）。
（12）放入烤后的片子，30s-50s（每个地方条件不一样，较干燥的地方时间较短)后，取出片子迅速放入干净清水中洗掉胰酶，用Giemsa染液室温10min。然后用流水轻轻清洗，室温晾干后就可以进行核型分析，结果如图6所示，PUMA-/-小鼠iPS细胞基因组的稳定性与野生型的iPS细胞相比无显著性差异P＜0.05，p53-/-和p21-/-的iPS细胞的基因组的稳定性和野生型的iPS细胞相比有显著性差异P＜0.05，试验结果说明，敲除PUMA基因能够保护小鼠iPS细胞的基因组稳定性。
试验例6人iPS细胞形成率的测定
（1）稀释抗体：TRA-1-60抗体（1:300）和AlexaFluor555-conjugated二抗（1:500）稀释到人ES培养基里。
（2）含有克隆的6孔板中，吸掉培养基，PBS洗一遍，每孔加入0.5ml含有抗体的人ES培养基，37°C，5%CO2培养箱中孵育1h。
（3）吸掉培养基，每孔加入1mlPBS洗一遍。
（4）每孔加入1ml人ES培养基，在倒置荧光显微镜下计数阳性克隆数。iPS形成效率就是将克隆数除以电转细胞数。
如图7所示，慢病毒shPUMA#1和shPUMA#2能敲降人iPS细胞的PUMA基因的表达，如图8所示，将慢病毒shPUMA#1和shPUMA#2敲降人PUMA基因后，能够提高人iPS细胞的形成率，且人iPS细胞的形成率与人PUMA功能的抑制程度成正比。
用慢病毒shRNA抑制人PUMA的表达但对基因组的稳定性没有影响，敲降PUMA功能在小鼠iPS细胞核型鉴定实验结果中表明其对iPS细胞基因组稳定性具有很好的保护作用。以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
Claims (3)
1.一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)PUMA-/-小鼠胚胎成纤维细胞MEF的制备、传代、冻存；
(2)DH5α大肠杆菌株转化质粒PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF4，并进行质粒小提和质粒大提；
(3)逆转录病毒载体的包装、滴度测定与冻存：将携带有PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因子的质粒引入包装细胞Plat-E细胞中，回收在培养上清液中产生的逆转录病毒载体，并进行滴度测定与冻存；
(4)PUMA-/-小鼠胚胎成纤维细胞MEF的重编程
将PUMA-/-小鼠胚胎成纤维细胞MEF，种在100mm的皿中，第2天，根据所测病毒滴度，计算病毒载体所用的量，将步骤(3)中得到的携带有PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因子的逆转录病毒载体加入到100mm皿中，并加入polybrene至终浓度为6μg/ml或加入5ml逆转录病毒载体+1mlFBS+6μl的8μg/ml的polybrene，感染12h后，换为新鲜的DMEM培养基，细胞长满培养皿后，将感染的PUMA-/-小鼠胚胎成纤维细胞MEF细胞，按常规方法消化传代至铺有饲养层细胞的培养皿中，细胞密度为1x105/孔，培养基为小鼠ES培养基，连续培养，出现的克隆为PUMA-/-小鼠iPS细胞
(5)敲降PUMA功能的人成纤维细胞的重编程
将人PUMAshRNA和携带有人PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因子的质粒引入包装细胞Plat-E中，回收在培养上清液中产生的病毒载体，并将回收的病毒载体感染人成纤维细胞，人成纤维细胞的培养基为EMDM+10％FBS，连续两天，两次病毒转染，感染第三天后更换为人成纤维细胞培养液，细胞长满后，转移至铺好饲养层细胞的100mm培养皿中，利用人成纤维培养基培养转天后换为人ES培养基：人成纤维细胞培养基＝1：1的混合培养基，转天换为完全的人ES培养基，培养7天后，加条件培养基，条件培养基为用人ES培养基培养饲养层细胞一天的培养基，20天左右出现的克隆为敲降PUMA功能的人iPS细胞。
2.根据权利要求1所述的抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的具体步骤为：取8-10周的PUMA-/-小鼠，按2：1的雌雄比例合笼，处死孕期为13.5天的孕鼠，将小鼠胚胎从子宫中剥离，去除头和内脏组织，将单个胚胎的躯干，剪碎至糊状，胰酶消化，FM重悬，培养24-48h后，将MEF细胞按常规方法进行传代，2×FM冻存液冻存P0代、P1或P2代细胞。
3.根据权利要求1-2任一项所述的抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法，其特征在于：所述步骤(3)的具体步骤为：每100mm皿接种8x106-1x107个Plat-E细胞，融合度达到90％时，将培养皿中的细胞培养液换成5ml新鲜DMEM+10％FBS，制备质粒和lipofectamine2000混合液，10μllipofectamine2000与500μlOPTI-MEM混合，室温放置5min，携带有PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因子的质粒各10μg与500μlOPTI-MEM混合，室温放置5min，将上述两种液体轻轻混合，室温静置20min，将混合液逐滴加入100mm皿中，1ml/皿，混匀，培养6-8h后换新鲜的DMEM+10％FBS分别在培养后48h和72h收集逆转录病毒上清并浓缩，收集的部分逆转录病毒进行滴度测定。
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