CN102715132A

CN102715132A - 猪繁殖与呼吸综合症病毒受体cd163敲除猪及培育方法

Info

Publication number: CN102715132A
Application number: CN2012101357943A
Authority: CN
Inventors: 赖良学; 逄大欣; 欧阳红生; 任林柱; 宋娜; 于飞飞; 杨鑫; 陈福旺; 曹宇航; 李莉
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2012-05-04
Filing date: 2012-05-04
Publication date: 2012-10-10

Abstract

本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪，同时还公开了该猪的培育方法，构建的CD163基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm-CD163是以中国实验小型猪基因组为模板，采用PCR法分别扩增猪CD163基因同源左臂和同源右臂；将克隆得到的CD163基因同源左臂和同源右臂分别亚克隆到pSSC-9载体上；培养的猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163基因敲除猪，猪体内CD163基因不表达，该猪不感染猪繁殖与呼吸综合症病毒。

Description

猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪及培育方法

技术领域：

本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪，同时还公开了该猪的培育方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

猪繁殖与呼吸综合症（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合症病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrom virus，PRRSV）引起的以流产、死胎、胎儿木乃伊化和呼吸道疾病为特征的传染病。在发病过程中会出现短暂性的两耳皮肤紫绀，故又称为“蓝耳病”。近几年，该病在国内呈现明显的高发趋势，对养猪业造成了重大损失，已成为严重威胁我国养猪业发展的重要传染病之一。完全分化的原代猪肺泡巨噬细胞是PRRSV感染的靶细胞。CD163又名M130，是富含半胱氨酸的清道夫受体家族成员之一，是单链跨膜糖蛋白分子，也是一种巨噬细胞分化的抗原。研究发现，CD163具有单核细胞-巨噬细胞特异性，在全身各种含丰富巨噬细胞的器官上高表达。该蛋白在非易感的细胞表达，能使细胞获得感染PRRSV的能力，还能产生子代病毒，抗人CD163的抗体可以阻断PRRSV的感染，表明CD163是该病毒的必需受体。因此，CD163基因的功能研究可以为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染相关研究提供理论依据，而CD163基因敲除的研究将为进一步研究CD163受体在PRRSV感染过程中发挥的具体作用奠定基础。目前CD163基因敲除的转基因动物尚未见报道。

发明内容：

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163敲除猪，猪体内CD163基因不表达，该猪不感染猪繁殖与呼吸综合症病毒。

本发明还提供了猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163敲除猪的培育方法，适用于人工制备CD163基因敲除猪。

本发明提供的猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪，其特征在于：

在敲除猪体内CD163基因不表达。

本发明所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪的培育方法，包括以下步骤：

1）PRRSV受体CD163基因敲除载体的构建

分别克隆猪CD163基因同源左臂和同源右臂序列，然后将上述同源臂亚克隆至含正向筛选基因Neo和负向筛选基因TK的pSSC-9载体，构建含正负筛选标记的CD163基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm-CD163；

1.1）用PCR扩增猪的CD163基因同源左臂和同源右臂序列

用同源臂扩增引物分别扩增CD163基因同源左臂和同源右臂序列；

1.2）将CD163基因同源左臂和同源右臂序列分别与pGM-T相连接，分别构建成pGM-T-Sarm-CD163和pGM-T-Larm-CD163；

1.3）用BamHI和HindIII酶切pGM-T-Sarm-CD163，回收CD163基因同源右臂Sarm片段；用SalI酶切pGM-T-Larm-CD163，回收CD163基因同源左臂Larm片段；将CD163基因同源左臂与同源右臂先后连接至pSSC-9载体上，构建成含正负筛选标记的CD163基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm-CD163；

2）CD163基因敲除猪胚胎成纤维细胞系的建立

将上述构建的基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm-CD163线性化后，用脂质体法转染到猪胚胎成纤维细胞中，对经抗性筛选获得的阳性细胞进行基因敲除的鉴定，对鉴定确证发生同源重组的细胞冻存；

2.1）载体线性化：提取pSSC-Larm-Sarm-CD163质粒，用Sfi I酶切，然后乙醇沉淀，用无菌ddH₂O溶解；

2.2）脂质体转染：将线性化的载体按照脂质体Fugene HD转染小型猪成纤维细胞，5 % CO₂，39 ℃培养；

2.3）核供体细胞的获得：用G418筛选8-10天后，获得抗性细胞；采用PCR方法对所获得的细胞进行鉴定，得到CD163基因敲除猪成纤维细胞；该细胞即为核供体细胞；

3）利用体细胞核移植技术构建CD163基因敲除猪

采用体细胞核移植技术，以母猪做代孕母猪，构建CD163基因敲除猪。

本发明所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163基因敲除猪的培育方法，其特征在于：

CD163基因敲除载体为pSSC-Larm-Sarm-CD163，该载体含有CD163基因同源左臂和同源右臂，参见图1。

用于扩增CD163基因同源左臂和同源右臂，引物序列如下：

同源左臂的扩增引物：

PCDE2-3F：5’-ACTTTTGCTGTAGTCGCTGTTCT -3’，

PCDE3-4R：5’-ACTCCAGCATCCTCAGCATGATCGC -3’；

同源右臂的扩增引物：

PCDE5-6F：5’-AGAGTGGTAGATGGACTCACTGAAT -3’，

PCDE5-6R：5’-AGTGATCACAACTAAGTCCACCCCACT -3’。

本发明采用PCR方法对CD163基因敲除猪进行鉴定。目前已经成功获得了3头健康猪，该基因敲除猪已经过鉴定具有CD163基因缺失的特性。

本发明所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163基因敲除猪的PCR鉴定方法，用于基因敲除猪阳性细胞克隆及阳性克隆猪鉴定，其特征在于引物序列如下：

鉴定引物对1（JDYW1）：

5’-TATCAGGACATAGCGTTGGCTAC-3’，

5’-AGTTGCTTACATGCCACAGC-3’；

鉴定引物对2（JDYW2）：

5’-AGGATCTCGTCGTGACCCATGG-3’，

5’-ATGGCAGTGACAGCAGTTGGA-3’；

鉴定引物对3（NEO1）：

5’-TCTGATGCCGCCGTGTT-3’，

5’-GATGTTTCGCTTGGTGGTC-3’；

鉴定引物对4（NEO2）：

5’-AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG-3’，

5’-AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG-3’。

本发明的积极效果在于：建立猪繁殖与呼吸综合征病毒受体CD163基因敲除猪，猪体内CD163基因不表达，该猪不感染猪繁殖与呼吸综合症病毒。

附图说明：

图1为pSSC-Larm-Sarm-CD163载体图；

图2为CD163基因敲除的猪胚胎成纤维细胞（4×）；

图3为CD163基因敲除的猪胚胎成纤维细胞鉴定结果

图4. 基因敲除猪PCR鉴定。

具体实施方式

以下实施例证明本发明的效果，下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

PRRSV受体CD163基因敲除载体的构建

1 质粒形成的重要的中间质粒有pGM-T-Sarm-CD163和pGM-T-Larm-CD163。

2 实验过程以小型猪基因组为模板，采用PCR法（参见表2）分别扩增克隆猪CD163同源左臂和同源右臂；将CD163基因同源左臂和同源右臂序列分别与pGM-T相连接，分别构建成pGM-T-Sarm-CD163和pGM-T-Larm-CD163；用BamHI和hindIII酶切pGM-T-Sarm-CD163，回收CD163基因同源右臂Sarm片段；用SalI酶切pGM-T-Larm-CD163，回收CD163基因同源左臂Larm片段；将CD163基因同源左臂与同源右臂分别与含正向筛选基因Bip-Neo和负向筛选基因HSV-t的打靶载体pSSC-9相连接，构建含正负筛选标记的CD163基因敲除载体（见附图1）。扩增同源臂用的PCR引物由金斯瑞公司合成（引物序列见表1）。

表1 用于同源臂扩增的PCR引物

名称	引物序列
		PCDE2-3F	5’-ACTTTTGCTGTAGTCGCTGTTCT -3’
PCDE3-4R	5’-ACTCCAGCATCCTCAGCATGATCGC -3’
		PCDE5-6F	5’-AGAGTGGTAGATGGACTCACTGAAT -3’
PCDE5-6R	5’-AGTGATCACAACTAAGTCCACCCCACT -3’

表2 用于扩增同源臂的PCR反应条件

3 结果经酶切和测序鉴定，成功构建了CD163基因敲除载体pSSC-Larm-Sarm-CD163。

4 结论成功的构建了用于CD163基因敲除的打靶载体pSSC-Larm-Sarm-CD163。

实施例2

CD163基因敲除的猪胚胎成纤维细胞的构建

1 质粒 pSSC-Larm-Sarm-CD163

2 细胞小型猪胚胎成纤维细胞

3 实验过程

3.1 载体线性化：提取pSSC-Larm-Sarm-CD163质粒，用Sfi I酶切，然后乙醇沉淀，用无菌ddH₂O溶解。

3.2 细胞转染：将线性化的载体按照脂质体Fugene HD（Invitrogen）说明书转染小型猪成纤维细胞，细胞在5% CO₂，39 ℃条件下培养。

转染前一天将原代培养的胚胎成纤维细胞用无抗生素的培养液复苏至60mm平皿中，当细胞达到70-80 ％融合时即可进行细胞转染。转染24 h后，细胞经胰酶消化1：21传代。转染48 h后，加入G418选择培养基（浓度为300μg/ml）。待有细胞单个克隆集落出现时，去掉培养液，用39 ℃的PBS洗1遍，将自制的玻璃细胞克隆环套在细胞集落上，加适量的胰酶于克隆环内，消化约1分钟后，加入筛选培养基终止反应。用移液器小心吹打细胞后转入24孔板扩大培养，待长满以后，转入6孔细胞培养板中扩大培养。待细胞长满以后，一部分细胞用于细胞鉴定，一部分细胞冻存或核移植。

3.3 核供体细胞的获得及扩繁：将上述获得的具有抗性的细胞克隆，采用PCR方法（引物序列见表3）对所获得的细胞进行鉴定，并将鉴定正确的阳性细胞克隆扩繁，得到CD163基因敲除猪的成纤维细胞。细胞在5 % CO₂，39 ℃条件下培养。鉴定正确的阳性细胞即为核供体细胞。

表3 用于鉴定转基因细胞的PCR引物

上述鉴定引物均使用以下PCR扩增反应条件，用于鉴定阳性细胞（表4）。

表4 用于鉴定转基因细胞的PCR反应条件

4 结果

4.1 细胞毒性实验检测结果

通过对非转染细胞进行G418毒性检测，结果表明G418浓度在150-400 μg/mL时对猪胎儿成纤维细胞有一定毒性作用。细胞的药物筛选浓度，应以细胞7天内全部死亡为标准，最终确定筛选浓度为300 μg/mL。

4.2 转染用DNA的准备

将构建好的打靶载体pSSC-Larm-Sarm-CD163大量提取质粒。用Sfi I对其进行酶切，用1/10体积3M乙酸钠和2倍体积无水乙醇沉淀线性化DNA。12000 r/min离心10 min，收集沉淀，70 %乙醇洗涤后，无菌条件下自然风干，加入无菌ddH₂O溶解质粒备用。

4.3 阳性细胞筛选结果

猪胚胎成纤维细胞，经脂质体Fugene HD转染后，G418筛选10天左右，得到了抗性细胞。

4.4 阳性细胞的鉴定

提取筛选获得的细胞基因组DNA，采用PCR方法（见表3和表4）对所获得的细胞进行鉴定，结果证明细胞克隆1和细胞克隆2为CD163基因敲除的阳性细胞，即在基因水平检测到该细胞的CD163基因被上述构建的打靶载体序列替换。

5 结论成功的获得了CD163基因敲除的猪胚胎成纤维细胞（图2），该细胞已经从基因水平进行了鉴定（图3）：左图: 1.Maker2000；2-4.NEO1引物；5-7.NEO2引物；2、5.对照成纤维细胞；3、6.克隆细胞1；4、7克隆细胞2；右图：1.Maker2000；2-4. JDYW1引物；5-7. JDYW2引物；2、5.对照成纤维细胞；3、6.克隆细胞1；4、7克隆细胞2。

实施例3

通过体细胞核移植制备基因敲除猪

1 细胞所构建的CD163基因敲除猪胚胎成纤维细胞。　

2 动物健康的杜洛克母猪（红色），长白猪（白色）。

3 实验过程采用体细胞核移植技术，构建CD163基因敲除猪。

3.1 从屠宰场收集猪的卵巢，置于25-37 ℃含有双抗生理盐水的保温瓶中，在2 h内返回实验室。用37 ℃含双抗的生理盐水洗涤数次，将卵巢置于37 ℃水浴锅中。用带有18号针头的20 mL注射器抽吸卵巢上2-8 mm的卵泡，在实体显微镜下用捡卵针挑选出细胞质均匀，并包裹有两层以上致密卵丘细胞的卵丘－卵母细胞复合体（COCs），在成熟培养基中成熟以后，采用盲吸的方法去除卵丘细胞，准备核移植。

3.2 将所构建的条件性表达绿色荧光蛋白的猪胚胎成纤维细胞从液氮罐中取出，迅速进行复苏。复苏后的细胞完全汇合后用于核移植操作。在进行核移植操作前，将供体细胞从培养箱中取出，进行消化吹打制成细胞悬液。将细胞悬液分装到1.5 mL的离心管中，用含10 %血清的TL-HEPES洗一遍，然后250 g离心10 min，重选在0.5mL的DPBS中，备用。放入4 ℃冰箱内备用。进行核移植操作前20 min将细胞从冰箱中取出放入38.5 ℃培养箱中温热。用时用移液枪吸取离心管底部10 uL的细胞悬液加入已经做好的操作滴内，覆盖上石蜡油。

3.3 在显微操作台上的培养皿中的中间的滴内放去核的卵母细胞，每次放10-15个，另外几个放入供体细胞。首先用内径为10-15 μm的注核针吸取小而圆的供体细胞，然后移动操作台使卵母细胞处在视野下面，用固定针固定卵母细胞，用注核针拨动卵母细胞，找到去核时在透明带留下的针口，将注射针插入到透明带下，将供体细胞注入卵母细胞的卵周隙内，构成一个卵—供体细胞复合体，而后缓慢抽出注核针，并对透明带进行整理，使体细胞与卵母细胞膜相互接触，便于随后重组胚的融合。

3.4 将操作完毕的重构复合体移入融合液，洗涤三次，然后移入融合槽中，使去核卵母细胞和供体细胞的接触面与电流方向垂直，然后进行电击。激活后的复合体迅速移入NCSU-23培养液中洗涤3-5次。然后放置入培养箱中，38.5 ℃，5%CO₂，100%湿度培养箱中培养。

3.5 卵-供体细胞复合体在15 μM calcium ionomycin (Calbiochem, San Diego, CA) 中孵育20 min，然后放入含1.9 mM 6-二甲基氨基嘌呤（DMAP）的CR2培养基中孵育3-4 h，然后在含有TL-HEPES的35 mm的培养皿中洗一遍之后，在含有放置含有3 mg/mL BSA 的CR2的培养基中孵育48 h，孵育过后，转移到含0.4 % BSA的NCSU23的培养集中继续孵育24 h，之后培养，采用含10%的NCSU23的培养基培养。

3.6 选择发情合适的母猪，进行麻醉以后。用清水清洗手术部位及四周，消毒后盖上创巾布并暴露手术部位，用手探入腹腔，寻找到子宫和卵巢，固定输卵管，将装有胚胎的外径为2-3 mm的玻璃管慢慢从输卵管口插入，经过1-2个弯曲之后小心将胚胎吹入输卵管内，并慢慢撤出玻璃管，我们在移植过程中只对一侧输卵管进行胚胎移植。将输卵管伞重新包住卵巢，回复子宫和输卵管到腹腔，并撒入抗生素抗菌消炎。常规缝合腹腔，术后将受体母猪单独隔离，连续4天使用抗生素消炎。每天仔细观察记录受体猪的生理情况，做好发情观察。

4 实验结果

移植的5头长白猪中，移植30天后用B超检查，有3头可见明显胎儿，腹部明显隆起，并顺利产下3头小猪（表5）。

表5 猪胚胎移植及基因敲除猪出生记录

实施例4

CD163基因敲除猪的鉴定

1 试验过程将克隆猪脐带剪下以后，用含双抗的PBS清洗数遍，洗去血污及赃物。然后利用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型，目录号：DP304）提取基因组。所提取的基因组用于PCR扩增，PCR反应见表3和表4。以打靶载体pSSC-Larm-Sarm-CD163作为阳性对照，以非转基因的基因组和水为阴性对照。

2 试验结果用PCR方法扩增克隆猪的基因组，PCR产物在1 % 琼脂糖凝胶上电泳，结果如附图4所示：1.Maker 2000；2-4. JDYW1引物；5-7. JDYW2引物；2、5.对照猪样品；3、6.克隆猪胞1；4、7克隆猪1。3头小猪均扩增出与预期一致的DNA片段，且阴性对照均未扩增出目的片段。

3 结论在基因水平证实上述制备的克隆猪为CD163基因敲除猪。

<110> 吉林大学

<120> 猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪及培育方法

<140> 201210135794.3

<141> 2012－05－04

<170> PatentIn Version 3.5

<160> 12

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增CD163基因同源左臂的引物序列

<400> ACTTTTGCTGTAGTCGCTGTTCT

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增CD163基因同源左臂的引物序列

<400> ACTCCAGCATCCTCAGCATGATCGC

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增CD163基因同源右臂的引物序列

<400> AGAGTGGTAGATGGACTCACTGAAT

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于扩增CD163基因同源右臂的引物序列

<400> AGTGATCACAACTAAGTCCACCCCACT

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于CD163基因敲除猪阳性细胞克隆及阳性克隆猪鉴定的引物序列

<400> TATCAGGACATAGCGTTGGCTAC

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> AGTTGCTTACATGCCACAGC

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> AGGATCTCGTCGTGACCCATGG

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> ATGGCAGTGACAGCAGTTGGA

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> TCTGATGCCGCCGTGTT

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> GATGTTTCGCTTGGTGGTC

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<400> AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG

Claims

1.一种猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪，其特征在于：

在敲除猪体内CD163基因不表达。

2.权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163敲除猪的培育方法，包括以下步骤：

1）PRRSV受体CD163基因敲除载体的构建

1.1）用PCR扩增猪的CD163基因同源左臂和同源右臂序列

2）CD163基因敲除猪胚胎成纤维细胞系的建立

3）利用体细胞核移植技术构建CD163基因敲除猪

3. 根据权利要求2所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163基因敲除猪的培育方法，其特征在于：

4. 权利要求2或3所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163基因敲除猪的培育方法，其特征在于：

用于扩增CD163基因同源左臂和同源右臂，引物序列如下：

同源左臂的扩增引物：

PCDE2-3F：5’-ACTTTTGCTGTAGTCGCTGTTCT -3’，

PCDE3-4R：5’-ACTCCAGCATCCTCAGCATGATCGC -3’；

同源右臂的扩增引物：

PCDE5-6F：5’-AGAGTGGTAGATGGACTCACTGAAT -3’，

PCDE5-6R：5’-AGTGATCACAACTAAGTCCACCCCACT -3’。

5. 权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合症病毒受体CD163基因敲除猪的PCR鉴定方法，其特征在于，用于基因敲除猪阳性细胞克隆及阳性克隆猪鉴定的引物序列如下：

鉴定引物对1（JDYW1）：

5’-TATCAGGACATAGCGTTGGCTAC-3’，

5’-AGTTGCTTACATGCCACAGC-3’；

鉴定引物对2（JDYW2）：

5’-AGGATCTCGTCGTGACCCATGG-3’，

5’-ATGGCAGTGACAGCAGTTGGA-3’；

鉴定引物对3（NEO1）：

5’-TCTGATGCCGCCGTGTT-3’，

5’-GATGTTTCGCTTGGTGGTC-3’；

鉴定引物对4（NEO2）：

5’-AGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG-3’，

5’-AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG-3’。