CN101550427B

CN101550427B - 一种检测Cre位点特异重组酶活性转基因报告猪重构胚构建的方法

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Publication number: CN101550427B
Application number: CN2009100665964A
Authority: CN
Inventors: 欧阳红生; 逄大欣; 李莉; 王铁东; 陈立梅; 赖良学; 任林柱; 张明军; 李占军
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2009-02-28
Filing date: 2009-02-28
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2029-02-28
Also published as: CN101550427A

Abstract

本发明提供一种检测Cre位点特异重组酶活性的转基因报告猪及培养方法，采用基因工程的方法构建LoxP位点锚定终止子，后接报告基因的打靶载体，当Cre重组酶存在的情况下，将Loxp卯定的终止子删除，使后接的报告基因得以表达，从而用于监测Cre重组酶的活性；通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出可以特异性检测Cre活性的成纤维细胞；利用体核移植技术进行克隆猪。用于在体内监测Cre重组酶的活性，为建立人类疾病模型提供了监测工具，解决了目前转基因克隆猪的技术不成熟，克隆效率较低问题。

Description

一种检测Cre位点特异重组酶活性转基因报告猪重构胚构建的方法

技术领域：

本发明提供一种检测Cre位点特异性重组酶活性的转基因报告猪，同时还公开了其培养方法，用于在体内监测Cre重组酶的活性，为建立人类疾病模型提供了监测工具，属于动物学技术领域。

背景技术：

猪是最适合人类器官移植和建立人类疾病模型的动物。建立人类疾病动物模型一般需要Cre重组酶以特定的模式表达，例如使用组织特异性启动子。要在体内监测Cre重组酶的活性，需要建立转基因报告动物，目前由于猪核移植的技术不成熟，人类疾病的模型主要是转基因鼠，但是鼠血液动力学与组织大小及相应的生理特点与人类相差较大，不能很好的复制人类疾病，目前所建立的在体内监测Cre重组酶活性的报告动物也仅仅限于鼠，未见有其他转基因报告动物报道。

发明内容：

本发明提供一种检测Cre重组酶活性的转基因报告猪，建立了条件性表达绿色荧光蛋白的转基因报告猪，可以很好地在体内监测Cre重组酶的活性，起到对特异性表达Cre重组酶的转基因猪的监测作用，避免了用鼠作为人类疾病模型的弊端。

本发明公开了上述报告猪的培养方法。

本发明检测Cre重组酶活性的转基因报告猪，其特征如下：

该转基因猪含两个LoxP锚定一个neo基因和终止子，后接绿色荧光蛋白基因，绿色荧光蛋白基因由CMV启动子启动的条件性表达载体。

采用各种报告基因各种表达方式(荧光，化学底物显色)的Cre报告猪。该报告猪在Cre重组酶存在的情况下，报告基因(荧光，LacZ等)在细胞或组织中得以表达，从而监测Cre重组酶的活性。

本发明报告猪的培养方法，包括以下步骤：

采用基因工程的方法构建LoxP位点锚定终止子，后接报告基因的打靶载体，当Cre重组酶存在的情况下，将Loxp卯定的终止子删除，使后接的报告基因得以表达，从而用于监测Cre重组酶的活性；

在细胞水平通过细胞转染及细胞筛选技术筛选出可以特异性检测Cre活性的成纤维细胞；并进行细胞水平的鉴定。

利用体细胞核移植技术进行克隆猪的构建。

本发明利用PCR及分离克隆猪细胞进行感染表达Cre重组酶的腺病毒的方法鉴定转基因猪的基因的整合及监测Cre重组酶的效果。

上述培养方法涉及的打靶载体pICE-STOP是：

以PCI-Neo为模板，通过PCR循环扩增CMV启动子；

以PBC-1为模板，通过PCR循环扩增绝缘子(insulator)；

以pEGFP-C1为模板通过PCR循环扩增eGFP基因；

将所扩增的片段酶切回收后，分别连入STOP-eGFP-ROSA26TV载体。

具体制备方法如下：

1、载体的构建：

其基本原理为LoxP锚定neo和一个终止序列基因，后接绿色荧光蛋白基因，当Cre重组酶存在时，将LoxP间序列切除，使绿色荧光蛋白表达；当Cre重组酶不存在时，由于neo基因后的终止序列绿色荧光蛋白不表达，用以在活体内检测Cre猪Cre重组酶的活性。根据其原理设计了由CMV启动子启动条件表达绿色荧光蛋白的载体。

1.1用于构建载体的绝缘子(insulator)、CMV启动子、绿色荧光蛋白基因的制备分别根据绝缘子、CMV启动子、绿色荧光蛋白的序列，并结合真核表达载体STOP-eGFP-ROSA26TV和pMD18-T-simple的多克隆位点，并考虑克隆后能保持正确的阅读框架，在基因两端设计酶切位点，在绝缘子基因5′端引入AatII酶切位点，3′端引入KpnI酶切位点；在CMV启动子基因5′端引入KpnI酶切位点，3′端引入PacI酶切位点；在绿色荧光蛋白的两端引入ASCI酶切位点，委托生工(上海)公司合成针对上述基因的靶序列的引物(见表1)，采用PCR的方法扩增出三段基因.别连接入STOP-eGFP-ROSA26TV载体，获得条件性表达绿色荧光蛋白的载体，命名为pICE-STOP。构建示意图见图1.

表1引物序列

经过酶切鉴定与测序后，采用北京天根公司的大提试剂盒，对载体进行大提质粒，用于细胞转染。

2、条件性表达EGFP转基因报告猪成纤维细胞的构建：

本发明将构建的条件性表达绿色荧光蛋白的pICE-STOP载体线性化后，利用脂质体LipofectamineTM2000转染小型猪胚胎成纤维细胞，用G418筛选5～7天后，获得抗性细胞。采用一系列的方法对所获的细胞在基因水平(PCR)、转录水平(RT-PCR)和翻译水平(Cre重组酶的验证实验)进行鉴定，获得了条件性表达绿色荧光蛋白的转基因猪的成纤维细胞，在细胞水平监测了Cre重组酶的特异性表达，为以后获得转基因报告猪，提高转基因猪的效率奠定了基础。

3、利用体细胞核移植技术构建转基因报告猪

本发明采用体细胞核移植技术，以红色杜洛克母猪做代孕母猪，构建条件性表达绿色荧光蛋白的转基因报告猪，产生转基因报告猪的品系为黑色中国小型猪。(图2)

4、对转基因报告猪的鉴定

本发明采用1、PCR，2、分离转基因报告猪的尾部细胞，并感染表达Cre重组酶，从而验证转基因报告猪的功能。3、利用RT-PCR的方法进一步验证Cre重组酶切除终止子以后，绿色荧光蛋白的表达情况，从而验证转基因报告猪的功能。

以下试验例证明本发明的效果：

试验例1

检测Cre重组酶活性的转基因报告猪-基因整合

1、试验过程：取其转基因克隆猪的脐带，提取基因组，利用PCR扩增绿色荧光蛋白，证明其目的基因的整合。

2、试验结果：PCR结果(图3)表明，目的基因整合到克隆猪的基因组中。

3、结论：本实验所构建的克隆猪为转基因克隆猪。

试验例2

检测Cre重组酶活性的转基因报告猪-基因表达

1、病毒：所有表达Cre重组酶的腺病毒与对照病毒均购自北京赛诺基因有限公司。

2、试验过程：取克隆猪尾，分离成纤维细胞后感染表达Cre重组酶的重组腺病毒，荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达。

3、试验结果：取其两头克隆猪分离尾部成纤维细胞，感染Cre重组腺病毒以后，进行荧光显微镜的观察结果(如图4)，结果表明构建的转基因猪分离的尾部成纤维细胞在感染Cre腺病毒以后有绿色荧光蛋白的表达。

4、结论：本试验构建的转基因报告猪通过初步鉴定可以监测Cre重组酶的活性，为人类疾病模型的建立起到监测的作用。

试验例3

检测Cre重组酶活性的转基因报告猪-基因转录水平的检测

1、表达Cre重组酶腺病毒感染转基因报告猪尾部成纤维细胞

2、试验过程：取克隆猪尾，分离成纤维细胞后感染表达Cre的重组腺病毒，提取细胞RNA，用绿色荧光蛋白的引物做RT-PCR。

3、试验结果：在804bp处有目的条带的出现，证明，Cre重组酶切除loxP锚定的终止子后，绿色荧光蛋白得以转录与表达。(如图5)

本发明的积极效果在于：目前由于猪核移植的技术不成熟，人类疾病的模型主要是转基因鼠，但是鼠血液动力学与组织大小及相应的生理特点与人类相差较大，不能很好的复制人类疾病。目前所建立的在体内监测Cre重组酶活性的报告动物也仅仅限于鼠，未见有其他转基因报告动物报道。

本发明利用体细胞核移植技术构建了监测Cre重组酶活性的转基因报告猪，为人类疾病模型发展起到积极的推动作用。

附图说明

图1pICE-STOP载体构建示意图、

图2为克隆猪照片；

图3PGR鉴定目的基因的整合

图4Cre重组酶切除stop序列以后，绿色荧光蛋白的表达情况；

图5RT-PCR分析绿色荧光蛋白的表达；

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。

实施例1

Insulator，CMV启动子，绿色荧光蛋白基因的扩增

以PCI-Neo为模板，加入引物C1、C2通过PCR循环扩增CMV启动子，全长序列1022bp

以PBC-1为模板，加入引物I1、I2通过PCR循环扩增insulator，全长2450bp

以pEGFP-C1为模板，加入引物E1、E2通过PCR循环扩增eGFP基因，全长序列804bp.

将所扩增的序列连接在PMD-18T-Simple(takara公司)，并委托北京天根公司进行测序，将测序正确的片段酶切后，分别连入STOP-eGFP-ROSA26TV载体，经酶切鉴定和测序正确以后，命名为pICE-STOP，扩大培养后，采用天根公司的大提质粒试剂盒大提质粒之后，用NheI单酶切线性化，用于细胞转染。载体构建示意图如图1

实施例2

细胞的转染与筛选

采用脂质体介导DNA的胚胎成纤维细胞的转染，操作步骤。按lipofectin2000(Invitrogen)说明书进行。转染前一天将原代培养的胚胎成纤维细胞用无抗生素的培养液复苏至60mm平皿中，当细胞达到70～80％融合时即可进行细胞转染。转染24小时后，细胞经胰酶消化1:21传代。转染48小时后，加入G418选择培养基(浓度为300μg/ml)。待有细胞单个克隆集落出现时，去掉培养液，用39℃的PBS洗1遍，将自制的玻璃细胞克隆环套在细胞集落上，加适量的胰酶于克隆环内，消化约1分钟后，加入筛选培养基终止反应。用移液器小心吹打细胞后转入24孔板扩大培养，待长满以后，转入6孔细胞培养板中扩大培养。待细胞长满以后，一部分细胞用于细胞鉴定，一部分细胞冻存。

实施例3

细胞水平的鉴定-

1、PCR检测

以获得的neo基因阳性细胞基因组为模板，利用引物C1和E2扩增，所扩增序列包括CMV启动子，Loxp-neo-stop-Loxp序列，EGFP基因。证明目的基因完全整合入猪胚胎成纤维细胞的基因组中。

2、荧光观察

为了验证所构建的条件性表达绿色荧光蛋白的报告细胞系是否可以有效的监测Cre重组酶的活性，将所筛选出的细胞克隆，扩大培养以后，感染表达Cre重组酶的腺病毒，以验证所构建报告细胞系的有效性。

3、RT-PCR

所获得的细胞克隆感染腺病毒三天后，提取细胞总的RNA进行RT-PCR反应，进一步鉴定绿色荧光蛋白的表达。

4、细胞流式检测

细胞克隆感染表达Cre腺病毒72小时后，进行细胞流式的检测。进一步鉴定绿色荧光蛋白的表达

5整合位点的鉴定

提取细胞基因组，采用hightail PCR(high-efficiency thermal asymmetricinterlaced PCR)的方法进行，

引物设计如下表：

表2hightail PCR引物设计

将PCR产物用胶回收试剂盒回收以后，连接到PMD-18T上，通过转化，获得重组菌后，送北京天跟公司测序。待序列测序完毕在NCBI上，与猪的基因组和所构建的载体序列进行比较分析。找出测序结果中含有一部分载体序列并含有一部分猪的基因组的序列，从而分析所构建载体整合到猪基因组的位置。

实施例4

采用体细胞核移植技术，构建条件性表达绿色荧光蛋白的转基因报告猪。具体步骤如下：

1、猪卵母细胞的采集和成熟培养及去核操作

从屠宰场收集猪的卵巢，置于25-37℃含有双抗生理盐水的保温瓶中，在2小时内返回实验室。用37℃含双抗的生理盐水洗涤数次，将卵巢置于37℃水浴锅中。用带有18号针头的20ml注射器抽吸卵巢上2-8mm的卵泡，在实体显微镜下用捡卵针挑选出细胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，在成熟培养基中培养成熟以后，采用盲吸的方法去除卵丘细胞，准备核移植。

2、供体细胞的制备

将所构建的条件性表达绿色荧光蛋白的猪胚胎成纤维细胞从液氮罐中取出，迅速进行复苏。复苏后的细胞完全汇合后用于核移植操作。在进行核移植操作前，将供体细胞从培养箱中取出，进行消化吹打制成细胞悬液。将细胞悬液分装到1.5ml的离心管中，用含10％血清的TL-HEPES洗一遍，然后250g离心10分钟，重选在0.5ml的DPBS中，备用。放入4℃冰箱内备用。进行核移植操作前20min将细胞从冰箱中取出放入38.5℃培养箱中温热。用时用移液枪吸取离心管底部10ul的细胞悬液加入已经做好的操作滴内，覆盖上石蜡油。

4、卵母细胞的注核操作

在显微操作台上的培养皿中的中间的滴内放去核的卵母细胞，每次放10-15个，另外几个放入供体细胞。首先用内径为10-15μm的注核针吸取小而圆的供体细胞，然后移动操作台使卵母细胞处在视野下面，用固定针固定卵母细胞，用注核针拨动卵母细胞，找到去核时在透明带留下的针口，将注射针插入到透明带下，将供体细胞注入卵母细胞的卵周隙内，构成一个卵-供体细胞复合体，而后缓慢抽出注核针，并对透明带进行整理，使体细胞与卵母细胞膜相互接触，便于随后重组胚的融合。

5、融合

将操作完毕的重构复合体移入融合液，洗涤三次，然后移入融合槽中，使去核卵母细胞和供体细胞的接触面与电流方向垂直，然后进行电击。激活后的复合体迅速移入NCSU-23培养液中洗涤3-5次。然后放置入培养箱中，38.5℃，5％CO2，100％湿度培养箱中培养。

6、激活和胚胎培养

卵-供体细胞复合体在15μM calcium ionomycin(Calbiochem，San Diego，CA)中孵育20分钟，然后放入含1.9mM 6-二甲基氨基嘌呤(DMAP)的CR2培养基中孵育3-4 小时，然后在含有TL-HEPES的35mm的培养皿中洗一遍之后，在含有放置含有3mg/ml BSA的CR2的培养基中孵育48小时，孵育过后，转移到含0.4％BSA的NCSU23的培养集中继续孵育24小时，之后培养，采用含10％的NCSU23的培养基培养。

7、胚胎移植

选择发情合适的母猪，进行麻醉以后。用清水清洗手术部位及四周，消毒后盖上创巾布并暴露手术部位，用手探入腹腔，寻找到子宫和卵巢，固定输卵管，将装有胚胎的外径为2~3mm的玻璃管慢慢从输卵管口插入，经过1~2个弯曲之后小心将胚胎吹入输卵管内，并慢慢撤出玻璃管，在移植过程中只对一侧输卵管进行胚胎移植。将输卵管伞重新包住卵巢，回复子宫和输卵管到腹腔，并撒入抗生素抗菌消炎。常规缝合腹腔，术后将受体母猪单独隔离，连续4天使用抗生素消炎。每天仔细观察记录受体猪的生理情况，做好发情观察。

8、试验结果：在2009年1月3日，杜洛克(红毛)怀孕116天，顺利产下11头黑色中国小型实验猪。其中三头为木乃伊胎，一头为死胎，其余7头表型正常、健康。平均体重为：0.862kg.平均体重为：1.212kg。结果如图2：a：从左到右依次为死胎、三木乃伊胎。b，c：均为克隆中国实验小型猪；d：母猪杜洛克(红毛)小猪：中国实验小型猪(黑色)

结论：本发明掌握了克隆猪的制备技术，成功制备了监测Cre重组酶活性的转基因报告猪。

实施例5

克隆猪的鉴定

1、PCR鉴定

提取脐带的基因组，将脐带剪下以后，用含双抗的PBS清洗数遍，洗去血污及赃物。然后利用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)目录号：DP304提取基因组。所提取的基因组用于PCR反应，引物为绿色荧光蛋白的上下游引物。通过PCR循环扩增eGFP基因，全长序列804bp.作为阳性对照，同时，以非转基因的基因组和水为阴性对照。

2、感染表达Cre重组酶的腺病毒实验

为了监测所构建的转基因克隆猪是否可以有效的监测Cre重组酶的活性，将分离出的尾部成纤维细胞，以MOI值为800的量，感染Cre-Ad，并以非转基因猪的成纤维细胞作为对照，感染72小时以后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。

3、RT-PCR实验检测绿色荧光蛋白的表达情况

将感染Cre-Ad的转基因猪的尾部成纤维细胞，提取细胞总的RNA进行RT-PCR反应，进一步鉴定绿色荧光蛋白的表达。提取RNA和RT-PCR反应均采用Bioer Technology的Simply P总RNA提取试剂盒提取试剂盒和一步法RT-PCR反应试剂盒。

RT-PCR反应的引物为绿色荧光蛋白的上游和下游引物：

E1.5’-GGC GCG CCC GCC ACC ATG GTG AGC AAG；

E2.5’-GGC GCG CCT TAT CTA GAT CCG GTGGAT.

利用绿色荧光蛋白的引物进行RT-PCR鉴定，同时以感染对照病毒的细胞克隆作为阴性对照同时设立不加模板只加水的阴性对照，以载体pICE-STOP为模板，利用绿色荧光蛋白引物所扩序列作为阳性对照。

Claims

1.一种重组胚的构建方法，其具体步骤如下：

1).猪卵母细胞的采集和成熟培养及去核操作

从屠宰场收集猪的卵巢，置于25-37℃含有双抗生理盐水的保温瓶中，在2小时内返回实验室，用37℃含双抗的生理盐水洗涤数次，将卵巢置于37℃水浴锅中，用带有18号针头的20ml注射器抽吸卵巢上2-8mm的卵泡，在实体显微镜下用捡卵针挑选出细胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体，在成熟培养基中培养成熟以后，采用盲吸的方法去除卵丘细胞，准备核移植；

2).供体细胞的制备

将所构建的条件性表达绿色荧光蛋白的猪胚胎成纤维细胞从液氮罐中取出，迅速进行复苏，复苏后的细胞完全汇合后用于核移植操作，在进行核移植操作前，将供体细胞从培养箱中取出，进行消化吹打制成细胞悬液，将细胞悬液分装到1.5ml的离心管中，用含10％血清的TL-HEPES洗一遍，然后250g离心10分钟，重悬在0.5ml的DPBS中，备用，放入4℃冰箱内备用，进行核移植操作前20min将细胞从冰箱中取出放入38.5℃培养箱中温热，用时用移液枪吸取离心管底部10ul的细胞悬液加入已经做好的操作滴内，覆盖上石蜡油；

3).卵母细胞的注核操作

在显微操作台上的培养皿中的中间的滴内放去核的卵母细胞，每次放10-15个，另外几个放入供体细胞，首先用内径为10-15μm的注核针吸取小而圆的供体细胞，然后移动操作台使卵母细胞处在视野下面，用固定针固定卵母细胞，用注核针拨动卵母细胞，找到去核时在透明带留下的针口，将注射针插入到透明带下，将供体细胞注入卵母细胞的卵周隙内，构成一个卵-供体细胞复合体，而后缓慢抽出注核针，并对透明带进行整理，使供体细胞与卵母细胞膜相互接触，便于随后重组胚的融合；

4).融合

将操作完毕的重构复合体移入融合液，洗涤三次，然后移入融合槽中，使去核卵母细胞和供体细胞的接触面与电流方向垂直，然后进行电击，激活后的复合体迅速移入NCSU-23培养液中洗涤3-5次，然后放置入培养箱中，38.5℃，5％CO₂，100％湿度培养箱中培养；

其中，步骤2)中所述条件性表达绿色荧光蛋白的猪胚胎成纤维细胞构建方法如下：将构建的条件性表达绿色荧光蛋白的pICE-STOP载体线性化后，利用脂质体LipofectamineTM2000转染小型猪胚胎成纤维细胞，用G418筛选5～7天后，获得抗性细胞，采用一系列的方法对所获的细胞在基因水平、转录水平和翻译水平进行鉴定，获得了条件性表达绿色荧光蛋白的转基因猪的成纤维细胞，所述载体pICE-STOP构建方法如下：以PCI-Neo为模板，通过PCR循环扩增CMV启动子；以PBC-1为模板，通过PCR循环扩增绝缘子；以pEGFP-C1为模板通过PCR循环扩增eGFP基因；将所扩增的片段酶切回收后，分别连入STOP-eGFP-ROSA26TV载体。