CN101892257A - 表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建，其特征在于：首先采用基因工程的方法构建pCEP4-Cre质粒，并用载体pCEP4-Cre与载体pEF-stop-eGFP共转染进入细胞，在表达Cre重组酶的情况下，将转入到细胞中的载体pEF-stop-eGFP中的Loxp卯定的终止子删除，使后接的报告基因eGFP得以表达，从而用于剪切条件性表达绿色荧光蛋白载体中的LoxP元件；其应用基因工程技术构建了一个表达Cre重组酶的质粒，并且重组质粒pCEP4-Cre可以在药物压力下独立于细胞染色体外存在，并在撤去药物压力后以每代10％的速率丢失；可有效的防止细胞基因组因插入外源基因而导致的基因突变；其使用的简便性和安全性可被广泛的应用，为人类Cre重组酶系统的检测发展起到积极的推动作用。

Description

表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建

技术领域：

本发明涉及一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建，是利用基因工程技术，建立了能够在细胞内表达Cre重组酶的质粒，用于在细胞内表达Cre重组酶并监测LoxP元件的活性，为建立Cre-LoxP重组酶系统模型提供了监测工具，同时提供了相应的制备方法，属于动物验证学领域。

背景技术：

Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心，建立人类疾病动物模型一般需要Cre重组酶以特定的模式表达，例如使用组织特异性启动子。要在细胞内监测Cre-LoxP重组酶系统的活性，需要建立能够在细胞内有效表达Cre重组酶的载体，目前人们使用的Cre重组酶载体多为病毒，但使用病毒载体多不具有安全性和简便性。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的序列SEQ IDNO：1；

本发明的另一目的在于提供一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建，用于鉴定具有LoxP元件的载体，可以很好的在猪细胞内表达Cre重组酶活性，起到对条件性表达绿色荧光蛋白载体的监测作用，避免了用病毒载体作为鉴定Cre-LoxP重组酶系统的弊端，并且pCEP4-Cre质粒可以在药物筛选(潮霉素B)的压力下以独立于细胞染色体外的游离形式存在于细胞内，避免了对基因组的插入而引起的突变。

本发明技术方案是这样实现的：一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建，其特征在于：首先采用基因工程的方法构建pCEP4-Cre质粒，并用载体pCEP4-Cre与载体pEF-stop-eGFP共转染进入细胞，在表达Cre重组酶的情况下，将转入到细胞中的载体pEF-stop-eGFP中的Loxp卯定的终止子删除，使后接的报告基因eGFP得以表达，从而用于剪切条件性表达绿色荧光蛋白载体中的LoxP元件；具体制备方法如下：

将LoxP锚定neo和一个终止序列基因，后接EF1α启动子启动的绿色荧光蛋白基因，当与pCEP4-Cre质粒转入细胞后，Cre重组酶表达，将Loxp卯定的终止子删除，使绿色荧光蛋白表达；

1pCEP4-Cre载体构建

1、1用于构建载体的Cre制备

根据Genpank上Cre基因的序列及猪密码子偏爱性设计引物，用重叠延伸PCR将Cre基因拼接出来。将PCR得到的Cre片段的5′端引入到pCDNA3.1上的HindIII酶切位点，Cre片段的3′端引入到pCDNA3.1上的EcoRI酶切位点。

1、2载体pCEP4-Cre的制备

分别用HindIII和XhoI双酶切载体pCEP4和pCDNA3.1-Cre，得到的Cre片段的5′端引入到pCEP4上的HindIII酶切位点，Cre片段的3′端引入到pCEP4上的XhoI酶切位点，并委托北京天根公司进行测序，测序完全正确。

2、pEF-stop-eGFP载体构建

将已有质粒pGKneotpAlox2中两loxp位点间的序列切下连接到pEF-GFP质粒中eGFP的启动子EF1α后。

所述的LoxP元件是在细胞水平通过细胞转染及荧光显微观察可以特异性检测条件性表达绿色荧光蛋白载体中的LoxP元件。

通过以下试验例证明本发明的效果：

试验例1pCEP4-Cre、pEF-stop-eGFP载体瞬时转染猪胚胎成纤维细胞的检测---荧光检测

1成纤维细胞系  将所构建的载体pCEP4-Cre和pEF-stop-eGFP瞬时转染中国长白猪胚胎成纤维细胞。

2试验过程  培养细胞至70～80％左右进行转染，将1号孔细胞瞬时转染pEF-stop-eGFP质粒做为阴性对照、2号孔细胞瞬时共转染pCEP4-Cre和pEF-stop-eGFP、质粒、3号孔细胞瞬时转染pEF-GFP质粒做为阳性对照、4号孔细胞作为空白对照。并用含10％FBS血清的培养基培养。5％CO2培养箱中培养24H、48H时，在荧光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。

3试验结果  单独转染pEF-stop-eGFP质粒的阴性对照细胞不表达绿色荧光蛋白，共转染pCEP4-Cre和pEF-stop-eGFP质粒的细胞中Cre重组酶切除Loxp卯定的终止子以后，绿色荧光蛋白表达。结果如下

见图1Cre重组酶切除stop序列以后，绿色荧光蛋白的表达情况。

试验例2pCEP4-Cre、pEF-stop-eGFP载体瞬时转染猪胚胎成纤维细胞的检测---RT-PCR检测

1成纤维细胞系  将所构建的载体pCEP4-Cre和pEF-stop-eGFP瞬时转染中国长白猪胚胎成纤维细胞。

2试验过程  分别取转染48H后的细胞RNA做为模板，利用绿色荧光蛋白的引物进行RT-PCR鉴定，同时设立不加模板只加水的空白对照；以转染pEF-GFP载体的细胞提取总RNA作为模板，利用绿色荧光蛋白引物所扩序列作为阳性对照；转染pEF-stop-eGFP载体的细胞提取总的RNA，利用绿色荧光蛋白引物所扩序列作为阴性对照。

3试验结果pCEP4-Cre、pEF-stop-eGFP载体瞬时共转染的细胞、Cre重组酶切除stop序列以后，RT-PCR检测绿色荧光蛋白的表达，而瞬时转染pEF-stop-eGFP载体的细胞提取总的RNA，进行RT-PCR实验无绿色荧光蛋白的表达，进一步确定绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明，pCEP4-Cre、pEF-stop-eGFP载体瞬时共转染的细胞RNA为模板经PCR在804bp处出现特异性条带，证明绿色荧光蛋白基因得以转录。

结果如图2。

M、MarkerIII 1、细胞克隆2、细胞克隆3、阳性对照

4、阴性对照5、空白对照

本发明的积极效果在于应用基因工程技术构建了一个表达Cre重组酶的质粒，并且重组质粒pCEP4-Cre可以在药物压力下独立于细胞染色体外存在，并在撤去药物压力后以每代10％的速率丢失；可有效的防止细胞基因组因插入外源基因而导致的基因突变；其使用的简便性和安全性可被广泛的应用，为人类Cre重组酶系统的检测发展起到积极的推动作用。

附图说明

图1Cre重组酶切除stop序列以后，绿色荧光蛋白的表达情况；

A、C为猪胚胎成纤维细胞瞬时共转染pCEP4-Cre和pEF-stop-eGFP后24H、48H荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。B、D分别A、C为细胞对照

图2RT-PCR分析绿色荧光蛋白的表达；

M：ladder、1，2、以细胞的RNA为模板的RT-PCR产物

3、阳性对照4、阴性对照5、空白对照

图3pCEP4-Cre载体构建图；

具体实施方式

下面结合附图和实施例旨在对本发明做进一步描述，而不是以任何方式限制本发明；在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。

实施例1pCEP4-Cre载体的构建

根据Genpank上Cre基因的序列及猪密码子偏爱性设计引物，用重叠延伸PCR将Cre基因拼接出来

将PCR得到的Cre片段的5′端引入到pCDNA3.1上的HindIII酶切位点，Cre片段的3′端引入到pCDNA3.1上的EcoRI酶切位点

分别用HindIII和XhoI双酶切载体pCEP4和pCDNA3.1-Cre，得到的Cre片段连接线性的pCEP4(invitrogen公司)，并委托北京天根公司进行测序，测序完全正确的用于片段的连接试验，采用天根公司的大提质粒试剂盒大提质粒之后，用于细胞转染。

实施例2pEF-stop-eGFP载体的构建

将pGKneotpAlox2中含有loxp的片段在其两端酶切后，连入pEF-GFP载体，经酶切鉴定和测序以后，采用天根公司的大提质粒试剂盒大提质粒之后，用于细胞转染。

实施例3细胞的转染

本发明采用脂质体介导DNA的胚胎成纤维细胞的转染，操作步骤。按FuGENEHD(Invitrogen)说明书进行。转染前一天将原代培养的胚胎成纤维细胞用无抗生素的培养液复苏至4个60mm平皿中，当细胞达到70～80％汇合时即可进行细胞转染。

实施例4细胞水平鉴定-荧光观察

为了验证所构建的载体是否可以有效的发挥Cre重组酶的活性，将转染的细胞培养24H、48H时使用荧光显微镜观察。

实施例5细胞水平鉴定-RT-PCR

转染后48H所获得的细胞，提取细胞总的RNA进行RT-PCR反应，进一步鉴定绿色荧光蛋白的表达。提取RNA和RT-PCR反应均采用Bioer Technology的Simply P总RNA提取试剂盒提取试剂盒和一步法RT-PCR反应试剂盒。具体操作步骤参照说明书。RT-PCR反应的引物为绿色荧光蛋白的上游和下游引物：

E1.5’-GGC GCG CCC GCC ACC ATG GTG AGC AAG；

E2.5’-GGC GCG CCT TAT CTA GAT CCG GTG GAT.

以瞬时转染pEF-stop-eGFP载体的细胞总RNA为模板，利用绿色荧光蛋白引物所扩序列作为阴性对照，同时设立不加模板只加水的空白对照，以瞬时转染pEF-GFP载体的细胞总RNA为模板，利用绿色荧光蛋白引物所扩序列作为阳性对照。

Application Project

 

-------------------

 

<120>Title：表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建

 

<130>AppFileReference：案卷参考号

 

<160>1

 

<210>1

 

Sequence

 

--------

 

<213>OrganismName：人造序列

 

<400>PreSequenceString：1

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cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata    8040

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt    8100

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ggctattggc cattgcatac gttgtatcta tatcataata tgtacattta tattggctca    11220

tgtccaatat gaccgccat                                                 11239

 

<212>Type：DNA

 

<211>Length：11239

 

SequenceName：pCEP4-Cre序列

Claims (3)

1.一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的序列SEO ID NO：1。

2.一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建，其特征在于：首先采用基因工程的方法构建pCEP4-Cre质粒，并用载体pCEP4-Cre与载体pEF-stop-eGFP共转染进入细胞，在表达Cre重组酶的情况下，将转入到细胞中的载体pEF-stop-eGFP中的Loxp卯定的终止子删除，使后接的报告基因eGFP得以表达，从而用于剪切条件性表达绿色荧光蛋白载体中的LoxP元件；具体制备方法如下：

将LoxP锚定neo和一个终止序列基因，后接EF1α启动子启动的绿色荧光蛋白基因，当与pCEP4-Cre质粒转入细胞后，Cre重组酶表达，将Loxp卯定的终止子删除，使绿色荧光蛋白表达；

3.根据权利要求2所述的一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建，其特征在于pCEP4-Cre载体在动物细胞中，能够游离于细胞染色体外，不整和到细胞基因组中，同时该载体表达的Cre重组酶能够切除动物细胞的基因组中或基因组外的loxp元件。

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